Yöntem makalesi

Canlı Çekim Kardiyak ve Nöronal Dokuda Ryanodin Reseptörü 2 Düzeneğinin Tek Moleküllü Analizi

DOI:

10.3791/68408

⸱

15 Temmuz 2025

 , 
1Department of Chemistry, University of Kentucky

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, doğal reseptör organizasyonunu koruyan, hassas stokiyometri kantitasyonu ve reseptör montajı, işlevi ve hastalık araştırmalarında geniş uygulamaları mümkün kılan vezikül tabanlı, tek moleküllü bir görüntüleme yöntemi sunmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reseptör montajını anlamak, fizyolojik süreçlerdeki işlevlerinin ve düzenlemelerinin altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için kritik öneme sahiptir. Geleneksel in vitro tek moleküllü çalışmalar, heterolog ekspresyon sistemlerinden proteinleri izole etmeye dayanırken, genellikle hücre yüzey proteinlerinin organizasyonu ve montajında yer alan in vivo fizyolojik karmaşıklığı yakalayamazlar. Bu protokol, nano ölçekli veziküller içinde kapsüllenmiş GFP etiketli Ryanodin Reseptörü 2 (RyR2) moleküllerini incelemek için Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM) kullanır. Hayvandan hızlı bir şekilde ekstrakte edilen organlardan üretilen bu veziküller, ekstraksiyon sırasında reseptörün montaj durumunun etkili bir şekilde anlık görüntüsünü sağlayarak, hayvanın fizyolojik ortamındaki değişikliklere yanıt olarak alt birim stokiyometrisi ve reseptör organizasyonunun ayrıntılı analizini sağlar. Bu yaklaşım, reseptör stokiyometrisinin bir okumasını sağlamak için TIRFM ve kademeli fotobleaching analizini kullanır. Tek molekül seviyesindeki görüntüleme reseptörleri, canlı bir hayvanda bir araya getirilen reseptör popülasyonları içindeki heterojenliğin saptanmasını kolaylaştırır ve hastalık durumlarıyla ilişkili montaj değişikliklerinin izlenmesini sağlar. Sonuç olarak, bu yöntem, reseptör düzeneklerinin dağılımını ve fizyolojik ortamlarındaki değişikliklerle korelasyonlarını belirlemek için güçlü bir araç sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membran reseptörleri, insan vücudundaki fizyolojik süreçlerde çok önemli roller oynar1. Birincil işlev, hücre içi sinyal olaylarını başlatmak için hücre dışı uyaranların transferi yoluyla hücreler arasındaki iletişime aracılık etmektir. Sinyallemedeki temel rolleri nedeniyle, mevcut terapötiklerin yaklaşık% 70'i membran reseptörlerini hedef alır2. Bunlar genellikle çoklu stokiyometriile heteromerik formlarda bir araya getirilmiş çoklu alt birimlerden oluşan oligomerik yapılardır 3,4. Reseptörlerin fonksiyonel kompleksler halinde nasıl organize olduğunu anlamak, sağlık ve hastalıktaki rollerini aydınlatmak için kritik öneme sahiptir 5,6. İmmünopresipitasyon ve western blotlama gibi geleneksel biyokimyasal yöntemler, reseptör alt popülasyonlarındaki heterojenliği gizleyen ortalama topluluk ölçümleri sağlar7. Buna karşılık, tek moleküllü teknikler, bireysel reseptörlerin doğrudan gözlemlenmesine izin vererek, reseptör popülasyonları 8,9,10 içindeki heterojenliğin nicelleştirilmesini sağlar. Tek moleküllü teknikler, membran reseptör düzeneğini, stokiyometriyi ve oligomerizasyonu ölçmek için standart hale gelmiştir11,12. Bu yaklaşım, izole protein veya hücre kültürü koşulları kullanılarak fizyolojik olarak ilgili birçok membran reseptörüne yaygın olarak uygulanmıştır. Tek moleküllü çalışmalar öncelikle proteinlerin hücresel bir ortamdan izole edilebildiği in vitro ekspresyon sistemlerine dayanır. Bununla birlikte, canlı bir sistem içindeki karmaşıklık, bu tür heterolog ifade sistemlerinde tam olarak yansıtılmaz.

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, membran reseptörlerini doğrudan kardiyak ve nöronal dokulardan türetilen nanoveziküller içinde yakalayarak fizyolojik olarak ilgili bir durumda izole eden ve görüntüleyen bir yaklaşım geliştirdik. Bu yöntem, vezikül oluşumu sırasında reseptör montaj durumunu etkili bir şekilde koruyarak, reseptörün farklı fizyolojik ortamlardaki tepkisinin önemli bir göstergesi olan reseptör alt birim stokiyometrisinin doğrudan görselleştirilmesine izin verir. Bu yaklaşım, canlı hayvanlarda karmaşık biyolojik çevre ile meydana gelen membran reseptörlerinin stokiyometrik montajını, heterolog ekspresyon veya sulandırma gerektirmeden incelememizi sağlar. Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM) kullanarak, vezikül kapsüllü reseptörlerin tek molekül çözünürlüklü görüntülemesini elde ediyoruz ve alt birim bileşimini belirlemek için fotoağartma izlerini çıkarıyoruz.

TIRFM, tek moleküllü membran protein görüntüleme için çok uygundur, çünkü cam yüzeyin ~150 nm içindeki floroforları seçici olarak uyarır ve çözelti 3,10'daki moleküllerden arka plan floresansını azaltır. Bu sınırlama, sinyal-gürültü oranını önemli ölçüde artırarak bireysel membran reseptör komplekslerinin doğru bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Floresan etiketli reseptörlerin aşamalı foto-ağartmasını analiz ederek, alt birim stokiyometrisini doğrudan belirleyebilir ve reseptör popülasyonları12 içindeki potansiyel heterojenliği değerlendirebiliriz. Bu, özellikle kalpte uyarma-kasılma eşleşmesinde çok önemli bir rol oynayan büyük bir hücre içi Ca²⁺ salım kanalı olan Ryanodin Reseptörü 2 (RyR2) için geçerlidir, burada sadece bir homo-tetramer olarak toplanır ve montajının kurulmadığı beyindeki sinaptik fonksiyonda 1,13,14. Nöronal dokularda çoklu RyR izoformlarının varlığı göz önüne alındığında, RyR2'nin beyinde kalpte olduğu gibi dört özdeş alt birimden oluşan tamamen homomerik tetramer kompleksleri oluşturup oluşturmadığı veya RyR1 veya RyR3 ile heteromerik düzeneklerin in vivo olarak meydana gelip gelmediği belirsizliğini korumaktadır 15,16,17,18.

Bu yöntem, kalbin ve beynin belirli bölgelerinden vezikülleri izole ederek, RyR2 organizasyonundaki potansiyel dokuya özgü farklılıkların araştırılmasını sağlar. RyR2'nin, ex vivo tek moleküllü alt birim stokiyometrisi için istatistiksel olarak sağlam bir temel sağlamak üzere yalnızca homotetramerler oluşturabildiği ve bilinen tetramer düzeneğinin, diğer organlardaki bilinmeyen düzenekleri araştırmak için bir kontrol görevi gördüğü kalp dokusundaki özelliklerinden yararlanıyoruz. Fizyolojik etkileşimlerini korurken reseptörleri doğal hallerinde görüntüleme yeteneği, farklı organlarda ve farklı fizyolojik koşullar altında reseptör montajını incelemek için sağlam bir çerçeve sağlar. Bu protokol, GFP etiketli RyR2'nin vezikül izolasyonu, immobilizasyonu ve tek moleküllü görüntülemesi için iş akışını tanımlar ve reseptör stokiyometrisinin hassas karakterizasyonuna izin verir. Bu teknik sadece kardiyak ve nöronal dokularda RyR2 organizasyonu hakkındaki anlayışımızı ilerletmekle kalmaz, aynı zamanda çeşitli fizyolojik ve patolojik bağlamlarda reseptör montajı ve regülasyonunu incelemek için daha geniş uygulamalar sunar 19,20,21.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Numune hazırlama

  1. Transkardiyal perfüzyon ve organ ekstraksiyonu
    1. Solunum durana kadar fareyi CO₂ kullanarak uyuşturun.
    2. Fareyi sırtüstü pozisyonda konumlandırın ve uzuvları sabitleyin.
    3. Karın boyunca orta hat kesisi yapın ve göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için göğüs kafesine doğru yanal olarak uzatın.
    4. Sol ventriküle dikkatlice bir iğne sokun ve perfüzat drenajına izin vermek için sağ atriyumu kesin.
    5. Vezikül hazırlığı için, dolaşım sistemi kandan temizlenene kadar soğuk 1x PBS ile perfüz.
    6. Kriyoseksiyon için, PBS perfüzyonundan sonra, dokuları sabitlemek için% 4 paraformaldehit (PFA) ile perfüze devam edin.
    7. Kalbi dikkatlice çıkarın ve hemen buzun üzerine yerleştirin.
    8. İnce makas kullanarak, kafa derisinin orta hattı boyunca dikkatlice kesin ve kafatasını ortaya çıkarmak için cildi geriye doğru soyun.
    9. Foramen magnumun yakınında kafatasının tabanında bir kesi yapın.
    10. İnce forseps kullanarak, kafatasını uzunlamasına çatlak boyunca dikkatlice kaldırın ve beyni açığa çıkarmak için kemik parçalarını çıkarın.
    11. Kavisli forseps kullanarak beyni nazikçe kaldırın ve kraniyal sinirleri keserek tamamen sağlam bir şekilde çıkarın.
    12. Kriyoseksiyon için kullanılıyorsa, beyni 24 saat boyunca 4 ° C'de% 4 PFA'da sabitleyin.
    13. Vezikül hazırlığı için kullanılıyorsa, daha sonraki işlemler için beyni hemen fiksasyon olmadan buzun üzerine yerleştirin.
  2. Kriyoseksiyon
    1. Beyni veya kalbi %4 PFA'dan çıkarın ve kurulayın.
    2. Tüm organı bir kriyo-kalıp içinde OCT bileşiğine gömün.
    3. Kalıbı tamamen katılaşana kadar -80 °C'lik bir dondurucuya koyarak gömülü dokuyu dondurun.
    4. Kesitlemeden önce, kriyostat odasını ve numune kafasını -20 °C'ye dengeleyin.
    5. Donmuş OCT bloğunu -80 °C dondurucudan kriyostat odasına aktarın ve 10 dakika boyunca dengelenmesine izin verin.
    6. Numune aynasını %70 etanol ile temizleyin, kurutun ve yapıştırıcı olarak ince bir OCT tabakası uygulayın.
    7. Donmuş OCT bloğunu aynaya sabitleyin ve doğru yönü sağlayın.
    8. Mandreni kriyostat numune tutucusuna yerleştirin ve bıçak konumunu ayarlayın.
    9. Doku yüzeyi açığa çıkana kadar fazla OCT'yi kesin.
    10. Dokuyu 10 μm kalınlığında bölümlere ayırın, bölümleri cam slaytlar üzerine toplayın.
    11. Bölümleri oda sıcaklığında 1 saat havayla kuruttuktan sonra, bölümlerin üzerine montaj ortamı uygulayın ve numuneyi kapatmak için bir lamel yerleştirin.
    12. Görüntüleme için slaytları 4 °C'de saklamadan önce montaj ortamının sertleşmesine izin verin.
  3. Vezikül hazırlama
    1. Kardiyak vezikül hazırlığı
      1. 1x PBS ile transkardiyal perfüzyonu takiben kalbi çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin.
      2. Steril bir neşter kullanarak, kalbin altından yaklaşık 30 mg ventriküler kası inceleyin.
      3. Vezikül bütünlüğünü korumak için dokuyu 5 mM NaN₃ ile 4-5 mL 10 mM NaHCO₃ içeren bir santrifüj tüpüne aktarın.
      4. Tamamen parçalanana kadar bir homojenizatör kullanarak dokuyu homojenize edin.
      5. Büyük kalıntıları temizlemek ve süpernatanı toplamak için homojenatı 10.000 × g'da 20 dakika santrifüjleyin.
      6. 65 dakika boyunca 37.000 × g'da ultrasantrifüjleme yapın, daha sonra süpernatanı atın ve peleti 0.6 M KCl ile 3-4 mL 20 mM Tris-maleat tamponunda (pH 6.8) yeniden süspanse edin.
      7. Çözünmüş aktomiyosini çıkarmak için ultrasantrifüjlemeyi 37.000 × g'da 65 dakika daha tekrarlayın.
      8. Kardiyak vezikül çözeltisini elde etmek için son peleti 50 mM KCl ile 0.5 mL 20 mM Tris-maleat tamponunda (pH 6.8) yeniden süspanse edin ve -80 ° C'de saklayın.
    2. Beyin vezikülü hazırlığı
      1. 1x PBS ile transkardiyal perfüzyonu takiben beyni çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin.
      2. 1 mm'lik bir fare beyni koronal matrisi kullanarak beyni 1 mm'lik bölümlere ayırın.
      3. Koku ampulünden üçüncü ve dördüncü bölümleri tanımlayın ve dikkatlice inceleyin: 1) her iki yarım küreden en dıştaki kortikal tabaka; 2) Bölümün orta bölgesinde bulunan hipokampus.
      4. Arka uçtan, tabanında enine bir kesim yaparak beyinciği izole edin.
      5. Yeterli vezikül verimini sağlamak için aynı beyin bölgelerini beş fareden toplayın.
      6. 2 mL soğuk homojenizasyon tamponunda (0.32 M sükroz, 10 mM HEPES, 2 mM EDTA, proteaz inhibitörü, pH 7.4) bir Dounce homojenizatör kullanarak dokuyu hemen homojenize edin.
      7. 3 mL ilave homojenizasyon tamponu ekleyin ve büyük doku parçalarını çıkarmak için 200 × g'da 15 dakika santrifüjleyin.
      8. Süpernatanı toplayın ve nükleer fraksiyonu çıkarmak için 1,000 × g'da 4 ° C'de 4 dakika santrifüjleyin.
      9. Mitokondriyi çıkarmak için süpernatanı 10.000 × g'da 4 ° C'de 20 dakika boyunca daha fazla santrifüjleyin.
      10. Vezikülleri peletlemek için elde edilen süpernatanı 100.000 × g'da 4 ° C'de 2 saat boyunca ultrasantrifüj edin.
      11. Beyin vezikül solüsyonunu elde etmek için son vezikül peletini 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve -80 °C'de saklayın.
  4. Nanopartikül İzleme Analizi (NTA) ile nanovezikül karakterizasyonu
    1. Üreticinin talimatlarını izleyerek algılama hücresini monte edin.
    2. Enstrümanı açın ve uyumlu yazılımı başlatın.
    3. 1 mL'lik bir şırıngayı deiyonize (DI) su ile doldurun ve arka plan kirleticilerden arınana kadar sistem borusunu manuel olarak yıkayın.
    4. Nanovezikül örneğini 1x PBS'de seyrelterek hazırlayın.
    5. Seyreltilmiş nanovezikül örneğinin ~ 1 mL 'sini temiz bir 1 mL şırıngaya yükleyin ve hava kabarcığı olmadığından emin olun.
    6. Numuneyi manuel olarak algılama hücresine enjekte edin ve veziküller net bir şekilde görünene kadar odağı ayarlayın.
    7. Şırıngayı şırınga pompasına sabitleyin ve donanım panelinde akış hızını 200 μL/s'ye ayarlayın.
    8. SOP panelinde ölçüm süresini 60 sn, döngü sayısını 5 olarak ayarlayın ve sıcaklık kontrolünün etkinleştirildiğini ve 25 °C'ye ayarlandığını onaylayın. SÇP'yi Kaydet'e tıklayarak ve dosyayı uygun şekilde adlandırarak (ör. "nanovesicle_standard.sop") ayarları yeni bir SÇP olarak kaydedin.
    9. Capture (Yakala) panelinde, kamera seviyesi 13 ve ilk algılama eşiği 3 olarak seçerek cihaz ayarlarını yapılandırın.
    10. Çalıştır'a tıklayın ve önceden kaydedilmiş SOP'yi seçin. Yazılım, ayarlara göre ölçümü otomatik olarak gerçekleştirecektir.
    11. Tamamlandığında, her videoyu işlemek için Analiz Et'i tıklayın. Tüm parçacıkların net bir şekilde görülebildiğinden emin olmak için algılama eşiğini ayarlayın ve toplu analiz tamamlandıktan sonra Bitir'e tıklayın. Verileri Dışa Aktar'a tıklayarak sonucu dışa aktarın | Tüm Ölçümler'e gidin ve daha sonra kullanmak üzere CSV dosyası olarak kaydedin.
    12. Deneyi tamamladıktan sonra, artık vezikül kalmayana kadar sistemi ~ 2 mL DI su ile yıkayın.
    13. Kalan sıvıyı çıkarmak için borudan hava enjekte edin ve sistemin bir sonraki kullanım için kuru olduğundan emin olun.

2. Görüntüleme

  1. Doku kriyoseksiyonlarının konfokal görüntülenmesi
    1. Lazer taramalı konfokal mikroskobu açın ve bağlantılı yazılımı açın.
    2. Uygun objektifi (20x hava veya 60x yağ) seçin ve hazırlanan kriyoseksiyon slaytını mikroskop tablasına yükleyin.
    3. 535/70 nm emisyon filtresine sahip 488 nm lazer çizgisi kullanarak GFP uyarımı için lazer ayarlarını yapılandırın.
    4. İğne deliği boyutu (28,9 μm), lazer yoğunluğu (%17) ve dedektör kazancı (15,3) dahil olmak üzere görüntüleme parametrelerini optimize ederek foto ağartmayı en aza indirirken sinyal-gürültü oranını artırın.
    5. Gerekirse, üst ve alt odak düzlemlerini ayarlayarak ve uygun adım boyutunu (0,275 μm) tanımlayarak bir Z yığını elde edin.
    6. Geniş alanlı görüntüler elde ederken %15 görüntü çakışması ile otomatik görüntü birleştirmeyi etkinleştirin.
    7. Arka plan gürültüsünü azaltmak için görüntü çözünürlüğünü ayarlayın ve gerekirse kare ortalaması uygulayın.
    8. Görüntüleri yakalayın ve daha fazla analiz için '.nd2' formatında kaydedin.
  2. Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) görüntüleme
    1. Membran için biyouyumlu ankraj (BAM) yöntemi ile vezikül immobilizasyonu22
      1. 35 mm cam tabanlı bulaşıkları 45 ° C'de 1 saat boyunca 5 M NaOH'de sonikleştirerek temizleyin ve ardından üç kapsamlı DI su durulayın.
      2. Bulaşıkları 45 ° C'de 1 saat daha 0.1 M HCl'de sonikleştirin, ardından üç ek DI su durulayın.
      3. Temizlenmiş cam yüzeye, amin fonksiyonel gruplarını eklemek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca etanol içinde% 2 3-aminopropiltrietoksisilan (APTES) ile muamele edin.
      4. Fazla APTES'i çıkarmak için kabı 3x DI su ve etanol ile durulayın ve kurumasını bekleyin.
      5. Çanağı 100 μM Oleyl-O(CH₂CH₂)nCO-CH₂CH₂-COO-NHS (Sunbright OE-020CS) ile 1x PBS'de 10 dakika inkübe edin.
      6. Reaksiyona girmemiş reaktifi çıkarmak için kabı PBS ile yıkayın.
      7. İstenilen konsantrasyonda vezikülleri yerleştirin ve vezikül bağlanmasına izin vermek için 15 dakika inkübe edin.
      8. Hareketsiz hale getirilmiş veziküllerin bağlı kalmasını sağlarken, bağlanmamış vezikülleri çıkarmak için kabı PBS ile nazikçe durulayın.
    2. TIRF görüntüleme kurulumu ve edinimi
      1. Ters floresan mikroskobu, 488 nm lazer kaynağı ve EMCCD kamerayı açın.
      2. Görüntüleme kontrolünü başlatmak için Metamorph ve CellSens yazılımını başlatın.
      3. Tozu ve kalan yağı temizlemek için 60x yağa daldırma hedefini (1.49 NA APO) metanol ile temizleyin.
      4. Objektif merceğine küçük bir damla kırılma indisi (RI) ile eşleşen daldırma yağı sürün.
      5. Hazırlanan vezikül kabını mikroskop tablasına yerleştirin ve optimum hizalama için ortalandığından emin olun.
      6. Epifloresan modunda uyarma ışınını objektifin arka açıklığının ortasında ortalayarak lazer ışını odağını ayarlayın.
      7. Kritik açıya ulaşılana kadar lazer geliş açısını ayarlamak için step motoru kullanın ve cam yüzeyde toplam iç yansımayı sağlayın.
      8. Z eksenini tarayarak odak düzlemini tanımlayın, ayırt edin: 1) cam alt yüzeye karşılık gelen ilk odak düzlemi; 2) vezikül ile hareketsiz hale getirilmiş yüzeye karşılık gelen ikinci odak düzlemi.
      9. Veziküller netlendikten sonra, bu düzlemde objektif konumunu kilitlemek için CellSens'te otomatik odaklama uygulayın ve görüntüleme sırasında kaymayı önleyin.
      10. Lazeri geçici olarak kapatın ve mikroskop aşamasını henüz uyarma ışığına maruz kalmamış yeni bir görüş alanına taşıyın.
      11. Lazeri aynı anda açarken kayda başlayın ve önceden maruz kalmadan tam foto ağartma işleminin yakalanmasını sağlayın.
      12. Aşağıdaki parametrelerle görüntüler elde edin: Pozlama süresi: kare başına 100 ms, Çekim modu: Görüş alanı başına 900 sürekli kare, Kazanç ayarı: 1.400.
      13. Yeterli veri toplandığından emin olmak için işlemi birden çok görünüm alanı için tekrarlayın.
      14. Daha fazla işlem için görüntü yığınlarını TIFF formatında kaydedin.

3. Görüntü işleme ve veri analizi

  1. Konfokal görüntü işleme
    1. Elde edilen konfokal görüntüleri bağlantılı yazılımda açın.
    2. Parlaklığı ve kontrastı optimize etmek için Arama Tablosu (LUT) ayarlarını yapın.
    3. Görsel tutarlılığı korumak için aynı LUT ayarlarını tüm görüntülere eşit şekilde uygulayın.
  2. TIRF video işleme ve floresan yoğunluk analizi
    1. Görselleştirme için video işleme
      1. Alınan TIRF görüntü yığınlarını (TIFF formatı) görselleştirme için ImageJ'de açın.
      2. Sinyal netliğini artırmak için parlaklığı ve kontrastı ayarlayın ve floresan veziküllerin arka plandan kolayca ayırt edilebilmesini sağlayın.
      3. Sunum veya daha fazla kalitatif analiz için ayarlanmış görüntüleri dışa aktarın.
    2. Fotobleaching basamak analizi
      1. Zaman izlerini ayıklama
        1. "getTimeTraces.m" adlı MATLAB betiğini ( Ek Dosya 1'e bakın) açın ve çalıştırın. Grafik kullanıcı arabiriminde (GUI), Film Yükle'yi tıklatın ve vezikül film yığınını içe aktarmak için TIRF görüntüleme .tiff dosyasını seçin.
        2. Tek moleküllü floresan sinyallerini otomatik olarak tanımlamak için Tepe Noktalarını Bul'a tıklayın. Sinyal bölgeleri, önizleme penceresinde dairelerle işaretlenecektir.
        3. Verileri Doldur'u tıklayın. Bu, her nokta için zaman-yoğunluk izini aşağı akış analizi için bir .xlsx dosyasına aktarır.
      2. Manuel adım sayma
        1. GUI'yi başlatmak için "simpleGraph.m" komut dosyasını çalıştırın (Ek Dosya 1'e bakın), Veri Dosyalarını Yükle'ye tıklayın ve adım 3.2.2.1.3'te oluşturulan .xlsx dosyasını seçin.
        2. Sol panelde görüntülenen her zaman izinin ağartma adımlarını inceleyin. Analiz için yalnızca aşağıdaki kriterleri karşılayan izlerin kabul edildiğinden emin olun: 1) Zaman izi en az bir farklı ağartma adımı içerir. 2) Bir adımın süresi en az 1 saniyedir. 3) Adım seviyeleri arasındaki yoğunluk farkı, beyazlatma sonrası yoğunluğun standart sapmasının en az 3 katıdır.
        3. Sağ tarafta, Adım # alanını bulun ve her iz için foto ağartma adımlarının sayısını girmek için + veya - düğmelerini kullanın.
        4. Her girişi tamamladıktan sonra, aşağıdaki izlemeye geçmek için İleri'ye tıklayın. Tüm izler işlendikten sonra, yazılım otomatik olarak her izlemenin adım sayısını kaydeden bir .txt dosyası oluşturacak ve kaydedecektir.
      3. Adım sayısı özeti
        1. GUI'yi açmak için "CombinedFiles.m" komut dosyasını çalıştırın (Ek Dosya 1'e bakın).
        2. Metin kutusuna özet çıktısı için istediğiniz adı yazın.
        3. Birden çok simpleGraph Sonucunu tek bir dosyada birleştir'e tıklayın. Dosya tarayıcısında, adım 3.2.2.2.3'te oluşturulan bir veya daha fazla istenen .txt dosyasını seçin. Komut dosyası, tüm adım sayısı verilerini otomatik olarak derleyecek ve 1 adımlı, 2 adımlı sıklığı özetleyen birleşik bir .xlsx dosyası oluşturacaktır,... Izler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemin uygulanabilirliğini doğrulamak için, önce kardiyak ve nöronal doku kriyokesitlerinin konfokal görüntülemesi ile GFP-RyR2'nin ekspresyonunu ve lokalizasyonunu doğruladık (Şekil 1). Kardiyak dokudaki floresan sinyali, RyR2'nin kardiyomiyositlerde beklenen lokalizasyonu ile tutarlı enine çizgili bir model sergiledi, ancak beynin belirli bölgelerinde, yani korteks, hipokampus ve beyincikte bölgeye özgü ekspresyona işaret eden yüksek yoğunluk sergiledi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, model sistem olarak GFP etiketli RyR2 kullanılarak membran reseptörlerinin ex vivo kapsüllenmesi ve tek moleküllü görüntülenmesi için ayrıntılı ve tekrarlanabilir bir protokol oluşturmaktadır. Protokol, membran proteinlerinin fizyolojik bağlamını koruyarak, reseptör komplekslerinin doğrudan doğal dokudan stokiyometrik analizini mümkün kılarak mevcut yöntemleri önemli ölçüde ilerletmektedir. Geleneksel in vitro ekspresyon sistemleriyle karşılaştırıldığında, bu yaklaşı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UKY Işık mikroskobu çekirdeğine ve Biyoelektronik ve Nanotıp Merkezi'ne tesislerinin kullanımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma için destek NIH (GM138837 ve GM138882) tarafından sağlandı. Şekil 2 (https://BioRender.com/s69w811) ve Şekil 3 (https://BioRender.com/y54b47) BioRender'da oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
35 mm Çanak | No. 1.5 Lamel | 14 mm Cam ÇapıMattekP35G-1.5-14-C
Andwin Scientific  Tissue-Tek Cryomold Kalıpları/AdaptörleriFisher ScientificNC9542860
APTESMillipore Sigma440140-100ML(3-Aminopropil) trietoksisilan
Bio-Gen PRO200 Laboratuvar HomojenizatörPro Scientific1204B59
cellSENSOlympus Scientific Solutionsn/a
EMCCD kameraAndorn/aiXon Ultra 897
Etanol mutlak ≥ Moleküler biyoloji için %100 (h/h) USP (200 Kanıt)VWR71006-012
Leica CM1860Leican/akriyostat
MetaMorph GelişmişMoleküler Cihazlarn/a
Nanosight NS300 (Nanosight NTA yazılımı ile)Malvern Panalyticaln/a
Nikon AXR Ters Konfokal MikroskopNikonn/a
Olympus IX83 Motorlu Otofokus Ters Floresan MikroskobuOlympusn/aTIRFM
Paraformaldehit PBS'de %4 Kullanıma Hazır Fiksatif ReaktifVWR76221-378
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) 20x, Ultra Saf SınıfVWR97062-950
Sodyum hidroksit, boncuklar, Reaktif SınıfıVWR97064-526
SUNBRIGHT OE-020CS +NOF America Corporationn/aOleyl-O(CH2CH2)nCO-CH2CH2-COO-NHS
Tissue-Tek OCT BileşikSakuraM71484
VectaMount AQ Sulu Montaj OrtamıVektör LaboratuvarlarıH-5501-60

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taur, Y., Frishman, W. H. The cardiac ryanodine receptor (RyR2) and its role in heart disease. Card Rev. 13 (3), 142-146 (2005).
  2. Lundstrom, K. Structural genomics and drug discovery. J Cell Mol Med. 11 (2), 224-238 (2007).
  3. Levitz, J., et al. Mechanism of assembly and cooperativity of homomeric and heteromeric metabotropic glutamate receptors. Neuron. 92 (1), 143-159 (2016).
  4. Fox-Loe, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. Organelle-specific single-molecule imaging of α4β2 nicotinic receptors reveals the effect of nicotine on receptor assembly and cell-surface trafficking. J Bio Chem. 292 (51), 21159-21169 (2017).
  5. Degani-Katzav, N., Gortler, R., Gorodetzki, L., Paas, Y. Subunit stoichiometry and arrangement in a heteromeric glutamate-gated chloride channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E644-E653 (2016).
  6. Aryal, S. P., Fu, X., Masud, A. A., Neupane, K. R., Richards, C. I. Single-molecule studies of membrane receptors from brain region specific nanovesicles. Bio-protocol. 11 (10), e4018(2021).
  7. Schneeweis, L. A., et al. Comparison of ensemble and single molecule methods for particle characterization and binding analysis of a pegylated single-domain antibody. J Pharm Sci. 104 (12), 4015-4024 (2015).
  8. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. J Gen Phys. 141 (6), 737-746 (2013).
  9. Lee, J., Lee, T. H. Single-molecule investigations on histone h2a-h2b dynamics in the nucleosome. Biochem. 56 (7), 977-985 (2017).
  10. Aggarwal, V., Ha, T. Single-molecule pull-down (SiMPull) for new-age biochemistry: methodology and biochemical applications of single-molecule pull-down (SiMPull) for probing biomolecular interactions in crude cell extracts. Bioessays. 36 (11), 1109-1119 (2014).
  11. Sungkaworn, T., et al. Single-molecule imaging reveals receptor-g protein interactions at cell surface hot spots. Nature. 550 (7677), 543-547 (2017).
  12. Fu, X., et al. Brain region specific single-molecule fluorescence imaging. Anal Chem. 91 (15), 10125-10131 (2019).
  13. Anderson, K., et al. Structural and functional characterization of the purified cardiac ryanodine receptor-Ca2+ release channel complex. J Bio Chem. 264 (2), 1329-1335 (1989).
  14. Waddell, H. M. M., Mereacre, V., Alvarado, F. J., Munro, M. L. Clustering properties of the cardiac ryanodine receptor in health and heart failure. J Mol Cell Card. 185, 38-49 (2023).
  15. Peng, W., et al. Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor ryr2. Science. 354 (6310), aah5324(2016).
  16. Xiao, B., et al. Isoform-dependent formation of heteromeric Ca2+ release channels (ryanodine receptors). J Bio Chem. 277 (44), 41778-41785 (2002).
  17. Xu, L., Wang, Y., Yamaguchi, N., Pasek, D. A., Meissner, G. Single channel properties of heterotetrameric mutant ryr1 ion channels linked to core myopathies. J Biol Chem. 283 (10), 6321-6329 (2008).
  18. Chagovetz, A. A., Klatt Shaw, D., Ritchie, E., Hoshijima, K., Grunwald, D. J. Interactions among ryanodine receptor isotypes contribute to muscle fiber type development and function. Dis Model Mech. 13 (2), dmm038844(2019).
  19. Yao, J., et al. Limiting RyR2 open time prevents Alzheimer's disease-related neuronal hyperactivity and memory loss but not β-amyloid accumulation. Cell Rep. 32 (12), 108169(2020).
  20. Hiess, F., et al. Subcellular localization of hippocampal ryanodine receptor 2 and its role in neuronal excitability and memory. Comm Biol. 5 (1), 183(2022).
  21. Clowsley, A. H., et al. Analysis of RyR2 distribution in HEK293 cells and mouse cardiac myocytes using 3D MINIFLUX microscopy. bioRxiv. , (2023).
  22. Kato, K., et al. Immobilized culture of nonadherent cells on an oleyl poly(ethylene glycol) ether-modified surface. Biotech. 35 (5), 1014-1021 (2003).
  23. Yin, Q., Aryal, S. P., Song, Y., Fu, X., Richards, C. I. Quantitative single-molecule analysis of ryanodine receptor 2 subunit assembly in cardiac and neuronal tissues. Anal Chem. 96 (41), 16298-16306 (2024).
  24. Moonschi, F. H., et al. Cell-derived vesicles for single-molecule imaging of membrane proteins. Angew Chem Int Ed. 54 (2), 481-484 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Toplam Yans maKardiyak DokuResept r Birle imiKademeli FotobelemeGFP EtiketlemeNanoscale Vezik llerResept r Stokiyometrisi
Video yakında

İlgili makaleler