Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Mycobacterium Türlerinden Setiltrimetilamonium Bromid Tekniği ile Tam Genom Deoksiribonüklein Asit Ekstraksiyonu

1.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68409

⸱

12 Aralık 2025

 , 
1DST/NRF Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, South African Medical Research Council (SAMRC), Centre for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, mikobakterilerden yüksek kaliteli DNA çıkarmak için CTAB yöntemini tanımlar; bu yöntem, onların dayanıklı, mikolik asit açısından zengin hücre duvarlarının getirdiği zorlukları aşmaktadır. Bu süreç, enzimatik sindirim, CTAB ile hücre lizisi ve organik ekstraksiyon ile etanol çökeltilemesiyle DNA arındırmasını içerir. Bu yöntem, moleküler çalışmalar için uygun DNA üretir ve mikobakteriyel araştırmalar için güvenilirdir.

Özet

Verimli ve güvenilir DNA çıkarımı, moleküler biyolojide temel bir adımdır ve PCR, dizileme ve genomik analizler gibi sonraki uygulamalar için yüksek kaliteli genetik materyal sağlar. Ancak, mikobakterilerin lipidler ve mikolik asitler açısından zengin benzersiz hücre duvarı bileşimi, verimli DNA izolasyonu için önemli zorluklar yaratmaktadır. Setiltrimetilamoniyum bromid (CTAB) yöntemi, hem hızlı hem de yavaş büyüyen suşlar dahil olmak üzere mikobakteriyel türlerden yüksek saflıkta DNA çıkarma etkinliği nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu teknik, lizozim ve proteinaz K kullanılarak bakteriyel hücrelerin enzimatik bozulmasını, ardından hücre bileşenlerinin CTAB ile lizizlenmesini içerir; CTAB polisakkaritler ve proteinlerle seçici bir şekilde bağlanır ve bir kompleks oluşturur. DNA saflatması ve konsantrasyonu, organik çözücü ekstraksiyonu ve etanol çökeltmesi ile sağlanır. Verilerimize göre, CTAB protokolü yüksek miktarda DNA (200 - 1000 ng/μL) üretiyor; bu da jel elektroforezi ve NanoDrop analiziyle kanıtlanmış olarak yüksek kalitede ve minimum kontaminasyona sahip. Farklı mikobakteriyel türlerden çıkarılan DNA yüksek saflıkta olup çeşitli moleküler çalışmalar için uygundur. Bu çalışma, CTAB yönteminin prosedürel adımlarını göstermekte ve mikobakteriyel DNA çıkarımı ile ilişkili benzersiz zorlukların üstesinden gelmede faydasını vurgulamaktadır.

Giriş

Yüksek kaliteli DNA çıkarmak, moleküler biyolojide temel bir adımdır ve PCR, tüm genom dizileme ve diğer genomik çalışmalar gibi sonraki uygulamalar için gereklidir. Mycobacterium için, Mycobacterium tüberculosis'in (M. tuberculosis) gibi patojenik türleri ve Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis) gibi patojenik olmayan çevresel türleri içeren bir cins için, DNA çıkarımı kalın, lipid açısından zengin ve hidrofobik hücreduvarları nedeniyle zor olabilir 1,2,3. Bu sağlam hücre duvarı, hücreleri bozmak ve genomik DNA'yı etkili şekilde serbest bırakmak için özel liz yöntemlerinin kullanılmasını gerektirir.

Setiltrimetilamoniyum bromid (CTAB) yöntemi, çeşitli mikobakteriyel türlerden yüksek kaliteli DNA'yı izole etmede güvenilirolduğu kanıtlanmış 4,5. CTAB, katyonik bir yüzeyaktif madde olarak, polisakkaridlere ve diğer hücre bileşenlerine bağlanarak ekstraksiyon sürecinde bunların çıkarılmasını kolaylaştırır6. Zor örneklerle bile, CTAB tabanlı protokol, özellikle enzimatik lizi, ısı muamelesi ve organik çözücü ekstraksiyonlarıyla birleştirildiğinde, sağlam ve saf DNA'nın verimli izolasyonunusağlar 7,8. CTAB yöntemi, özellikle tam genom dizileme, metagenomik ve moleküler tanı içeren araştırmalar için mikobakteriyel türlerden verimli DNA çıkarımında kritik rol oynamıştır; bu araştırmalar saf ve yüksek kaliteli DNA girişmateryali (9,10) gerektirir. Boncuk dövme veya ticari kitler gibi diğer DNA çıkarma tekniklerine kıyasla, burada sunulan CTAB protokolü, uzun okuma dizileme ve epigenetik uygulamalar için temel bir faktör olan DNA bütünlüğünü korumada belirgin bir avantaj sunar. Önceki çalışmalar, mekanik bozulma yöntemlerine kıyasla CTAB ile daha düşük DNA verimleri bildirmiş olsa da, aynı zamanda DNA kesilmesini en aza indirme ve DNA bütünlüğünükoruma yeteneğini vurgular 11,12. Saflık ve verimdeki sınırlamaları gidermek için mevcut protokol, inkubasyon sürelerinin azalması ve çeşitli örnek türleri arasında tutarlılığın artırılması ile optimize edilmiştir. Bu iyileştirme, Opperman ve ark. tarafından alınan bulgularla desteklendi; Mycobacterium avium kültürlerinden CTAB ile ekstraksiyon edilen DNA'nın 16S rRNA dizileme ve hat prob testleri gibi sonraki uygulamalar için yeterli konsantrasyon ve kaliteye sahip olduğunu göstererek, özellikle gelişmiş moleküler analizler için sağlam genomik DNA gerektiren çalışmalarda mikobakteriyel araştırmalar için çok yönlü ve ölçeklenebilir bir araç olarak CTAB protokolünün uygulanmasını destekledi13. Ayrıca, yeni nesil dizileme (NGS) genellikle 100-1000 ng yüksek kaliteli genomikDNA 14 gerektirir ve PacBio dizileme gibi uzun okuma dizilemelerinde ≥5 μg Yüksek kaliteliDNA 15 gerekir; bu nedenle yüksek kaliteli ve sağlam DNA gerektirdiğinde CTAB etkili bir yöntemolmaya devam eder 16.

Özellikle suş tanımlama ve epidemiyolojik çalışmalar için, zorlu ve lizsi zor mikroplardan verimli, tutarlı ve etkili DNA çıkarma metodolojilerinin oluşturulması, laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirlik ve güvenilirliği sağlamak içingereklidir 5,7. Bu protokol, CTAB yöntemiyle Mycobacteria'dan tam genom DNA'sının çıkarılması için detaylar sağlar. Mevcut protokol, araştırmacıların moleküler biyoloji iş akışlarında tutarlı ve güvenilir sonuçlar elde etmelerini sağlamayı amaçlar; böylece kendine özgü mikobakteriyel hücreduvarı 17'nin getirdiği zorlukları ele alarak ve onları aşabilirler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Temsil eden sonuçlar, REC: BES etik komitesi, Stellenbosch Üniversitesi (BES-2024-22504) onayı ile oluşturuldu. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Mikobakteriyel kültür süspansiyonunun hazırlanması

NOT: İncelenecek türe bağlı olarak, bu adım ya Biyogüvenlik seviye 2 (BSL-2) ya da Biyogüvenlik seviye 3 (BSL-3) laboratuvarında yapılmalıdır. Kültürün kuluçka süresi ve koşulları, mikobakteriyel türlerin farklı büyüme hızları ve fizyolojik özellikleri nedeniyle onların büyüme gereksinimlerine de bağlıdır.

  1. Sırasıyla Middlebrook 7H9 sıvı ortamında veya MGIT ortamında 5 mL veya 8 mL bakteriyel kültür hazırlayın, OADC ile takviye edilip bakteri büyümesine izin vermek için gerekli süre boyunca 37 °C'de kuluçka yapın. Yavaş büyüyen mikobakteriler 10-14 gün sürerken, hızlı büyüyen mikobakteriler yaklaşık 2-5 gün sürer.
    NOT: Başlangıç kültürü katı agar plakalarından (örneğin, Middlebrook 7H10 agar) alınmışsa, mikobakteriyel hücrelerin süspansiyonu, steril çift damıtılmış suya bir halka koloni kazıyarak hazırlanabilir.
  2. Sıvı kültürü 15 mL'lik tüplere dök.
  3. Kültürü 80 °C'de 1 saat boyunca bir kuluçka içinde ısıyla öldürün.
  4. Mycobacterium tuberculosis veya BSL-3 gerektiren diğer patojenik türler durumunda, ısıdan ölen kültürler BSL-2 laboratuvarına aktarılır.

2. Hücre duvarı sindirimi ve DNA çıkarımı

NOT: Kültür ısıyla inaktive edildikten sonra, aşağıdaki adımlar bir Biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL-2) laboratuvarında güvenli bir şekilde gerçekleştirilebilir. Amaç uzun okuma dizileme veya yüksek moleküler ağırlıklı DNA gerektiren alternatif uygulamalar için ekstraksiyon ise, geniş delikli pipet uçları kullandığınızdan emin olun ve vorteks adımlarında vortexi inversion veya pipet karışımı ile değiştirin.

  1. 15 mL'lik tüpü 3220 x g ile oda sıcaklığında (RT) 15-30 dakika boyunca santrifüj yapın. Şeffaf üst yüzeyi atın (tüm medyanın çıkarıldığından emin olun).
  2. Kültür pelletini 300 μL Tris-EDTA (TE) tamponunda iyice yeniden süzülür.
  3. Yeniden askılanan peleti 2 mL'lik bir tüpe aktarın.
  4. 100 μL lizozim (10 mg/mL) ekleyin ve pipetle 5 kez yukarı ve aşağı karıştırın, ardından tüpü hafifçe vurarak eşit dispersiyayı sağlayın.
  5. Karışımı 37 °C'de döner bir kuluçka makinesinde gece boyunca (~16 saat; daha kısa kuluçka süresi, lizin verimliliğini düşürebilir ve dolayısıyla düşük DNA verimine yol açabilir).
  6. Ertesi gün, 5 μL proteinaz K (10 mg/mL) ve 70 μL %10 SDS karışımı hazırlanır. Örneğin, beş örnek varsa, %10 SDS içeren 350 μL ve 25 μL Proteinaz K hazırlayın. Köpük oluşumunu önlemek için tüpü ters çevirerek karıştırın.
  7. Her numuneye 75 μL karışım ekleyin.
  8. Bir kuluçka veya ısıtma bloğunda 65 °C'de 10 dakika boyunca karıştırın, aralıklı olarak ters çevirme ile karıştırın.
  9. 100 μL 5 M NaCl ekleyin.
  10. 65 °C'de 100 μL önceden ısıtılmış CTAB/NaCl çözeltisi ekleyin.
    NOT: Maddenin viskozitesini RT aşamasında göz önünde bulundurarak, pipetleme doğruluğunu sağlamadan önce CTAB/NaCl çözeltisini 65 °C'ye ısıtın.
  11. Çözelti süt gibi olana kadar karıştırın.
  12. 65 °C'de 10 dakika boyunca bir kuluçka veya ısıtma bloğunda kuluçka yapın, aralıklı olarak ters çevirme yoluyla karıştırın.
  13. Her numuneye eşit hacim (~ 675 μL) kloroform/izoamil alkol çözeltisi (24:1) ekin ve tıklayarak karıştırın.
    NOT: Bu adımı bir duman davlumbazında yapın çünkü kloroform solulursa toksiktir ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır.
  14. Örnekleri oda sıcaklığında 12000 x g ile 10 dakika boyunca santrifüjlen.
  15. Sulu (üst) fazın 550-600 μL'sini steril 1,5 mL tüplere dikkatlice aspire edin ve uygun şekilde etiketleyin.
    NOT: Diğer katmanları rahatsız etmemeye dikkat edin. Herhangi bir katman yanlışlıkla bozulursa, tüpü tekrar santrifüj yapın.

3. DNA çökeltmesi ve elüsyonu

  1. Eşit hacimde (550-600 μL) buz gibi izopropanol ekleyin ve tüpleri ters çevirerek karıştırın.
    NOT: DNA konsantrasyonu yüksekse, karıştırma sırasında beyaz çökeltme oluşabilir.
  2. Tüpleri -20 °C'de 30 dakikadan 1 saate kadar kuluçka yapın.
    NOT: Daha uzun kuluçka süreleri DNA çökelmesiniartırabilir 18 , ancak aynı zamanda tuzların kopresipitasyonuna da yol açabilir. Böylece, düşük DNA konsantrasyonu bekleniyorsa gece boyunca kuluçka yapılabilir.
  3. Oda sıcaklığında en yüksek hızda (~21130 x g) santrifüj yapın ve çözünmeyen DNA'yı pellet etmek için 30 dakika boyunca kullanın.
    NOT: 1.5 tüplerin ön tarafının santrifüj rotorunda içe baktığından emin olun. Bu aşamada, DNA tüplerin alt kısmında ve arkasında çökelir. Bu, bir sonraki adımda görünmez olabilecek peleti rahatsız etmemek için önemlidir. DNA konsantrasyonu yüksekse beyaz bir çökelti veya pellet görünebilir. Bir peletin olmaması, başarısız bir çıkarma anlamına gelmez; Kalan adımlara devam edin.
  4. Tüpün ön tarafından süpernatantı DNA pelletini rahatsız etmeden veya hızlı dekantasyon olmadan aspire edin, böylece pelletin bozulmamasını sağlar.
    NOT: Başlangıç kültürü küçükse ve düşük DNA konsantrasyonu bekleniyorsa süpernatantı aspire etmek daha iyidir.
  5. 1000 μL buz gibi soğuk %75 etanol ekleyin.
  6. Tüpleri birkaç kez ters çevirerek karıştırın.
  7. 12000 × g seviyesinde 30 dakika boyunca santrifüj yapın (3. adımdaki yönelimde).
  8. Tüm etanolü pelleti rahatsız etmeden aspire veya dekant yapın.
    NOT: Yüksek tuz kopresipitasyonu varsa, 5-8. adımlar tekrarlanabilir.
  9. Tüplerin RT ile gece boyunca veya en az 30 dakika hava kurumasına izin verin.
  10. DNA'yı yeniden süzüldürmek için her tüpe 25-50 μL TE tamponu (pH 8) ekleyin.
    NOT: DNA, aşağı akış uygulamaları EDTA'ya duyarlıysa Tris (10 mM, pH 8) tampon veya nükleazsız suda yeniden süspansiye bırakılabilir.
  11. DNA pelletinin gece boyunca 4 °C'de tekrar beklemesine izin verin.
  12. Kalite kontrol değerlendirmesi yapılmadan önce 2-3 gün boyunca 4 °C'de saklanın.
  13. Uzun süre -80 °C'de sakla.

4. DNA nicelenmesi ve kalite kontrolü

NOT: DNA kalite kontrolü genellikle mikrohacim spektrofotometresi ve jel elektroforezi kullanılarak yapılır. Floresans tabanlı bir nicelik sistemi de ekstraksiyon DNA'yı nicelendirmek için kullanılabilir.

  1. Spektrofotometre yöntemi
    1. DNA konsantrasyonunu ölçün ve üreticinin talimatlarına uygun olarak kaliteyi belirleyin.
      NOT: İdeal olarak bir DNA örneği 1.7 ile 2.0 arasında 260/280 oranına sahiptir. 1.8 değeri genellikle DNA için saf olarak kabul edilir. Bu aralığın altındaki değerler, 280 nm veya yakınında güçlü şekilde emilen kalıntı protein, guanidin veya diğer reaktiflerle kontaminasyonu gösterir. 2.0-2.2 arasında 260/230 oranı idealdir. Oran beklenenden daha düşükse, bu 230 nm hızında emilen EDTA, fenol ve karbonhidratlar gibi kirleticilerin varlığını gösterebilir. Örnek için elde edilen absorbans grafiklerini de kontrol edin.
  2. Jel elektroforezi
    1. DNA bütünlüğünü değerlendirmek ve parçalanma veya bozulmanın olup olmadığını belirlemek için agaroz jelelektroforezi 19 uygulanır.
    2. UV jel dokümantasyon sistemi altında DNA'yı görselleştirmek için, SYBR Safe boya içeren %1,0 agaroz jel kullanın. Jeli 80 V'da 45 dakika çalıştırın.
      NOT: Amaç, DNA merdiveninin en yüksek bandının üzerinde net, belirgin ve yüksek moleküler ağırlıklı bantlar oluşturmaktır. Her seferinde taze 1× TAE tamponu kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

CTAB yöntemiyle (Şekil 1) kullanılan bu DNA çıkarma protokolü, M. tuberculosis, M. abscessus ve M. chelonea gibi çeşitli mikobakteriyel türlerde değerlendirildi. DNA çıkarıldı ve çıkarılan DNA'nın verimliliği, saflığı ve bütünlüğü açısından örnekler arasında karşılaştırıldı.

DNA konsantrasyonu mikobakteriyel türler arasında değişiyor ve bazı durumlarda 190-600 ng/μL ile >1000 ng/μL arasında değişiyor; bu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Temsilci sonuçlar, mikobakteriyel türlerden DNA çıkarma ve bu organizmalardan DNA çıkarma zorluklarını ele almada CTAB yönteminin faydasını göstermektedir. Mikobakteriler, karmaşık ve lipid açısından zengin hücre duvarlarıyla iyibilinirler 2. Mevcut sonuçlar, bu tekniğin başarısına katkıda bulunan birkaç kritik yönü vurgulamaktadır; çünkü bu teknik, PCR, dizileme ve diğer genomik çalışmalar gibi sonraki uygulamalar için uygun olması gereken yüksek konsantrasyonlu,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, bu protokolün geliştirilmesi ve optimize edilmesine katkıları ve bu çalışma boyunca gösterdikleri paha biçilmez destekler için TB genomik ekibine Nabila Ismail, Melanie Grobbelaar, Emylin Costa ve Rob M Warren'a içten teşekkürlerini sunarlar. Bu çalışma ve dahil olan kişiler, Güney Afrika Tıbbi Araştırma Konseyi (SAMRC), Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) ve Stellenbosch Üniversitesi (SU) tarafından alınan hibeler ve fonlarla desteklendi. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama, analiz veya makale hazırlama süreçlerinde hiçbir rolü yoktu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL pipet uçlarıHerhangi bir tedarikçi
10 µ L pipet uçlarıHerhangi bir tedarikçi
%10 Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)Merck (Sigma-Aldrich)71736-100 ML
15 mL polipropilen tüplerHerhangi bir tedarikçi
2 ml ve 1,5 ml tüplerHerhangi bir tedarikçi
200 µ l Pipet uçlarıHerhangi bir tedarikçi
2-PROPANOL, BİOREAKTIV, MOLEKÜLER B& için;Merck (Sigma-Aldrich)I9516-1L -20 derece ve derecede depolayın; C
37 ve derece; C kuluçka makinesiHerhangi bir tedarikçi
5 M NaClMerck (Sigma-Aldrich)S6546 - 100 ML
65 derece ve derece; C kuluçka makinesiHerhangi bir tedarikçi
Agaroz jeliMerck (Sigma-Aldrich)
Bio-Rad UV jel dokümantasyon sistemi,BioRad
Santrifüj (15 ml veya 50 ml tüpler için) ve Microfuge (2 ml tüpler için)Herhangi bir tedarikçi
ANALIZ İÇİN KLOROFORM EMPARTA& reg; ACSMerck (Sigma-Aldrich)1070242500
Kloroform/izoamil alkol (24:1)Duman davlumbazında 384 ml Kloroform ve 16 ml İzoamil alkol karıştırın
CTAB/NaCl çözümüMerck (Sigma-Aldrich)52370-100 G4.1 g NaCl'i 80 ml damıtılmış suda çöz. Karıştırırken 10 g CTAB ekleyin. Isı çözeltisi 65 derece ve derece; C kuluçka makinesi. Damıtılmış suyla hacmi 100 ml'ye ayarlayın. Oda sıcaklığında 6 aya kadar sakla.
DNA 1 Kb merdivenThermo Fisher Scientific
ETİL ALKOL, SAF, 200 PROOF, MOL& için;Merck (Sigma-Aldrich)E7023-500ML75 ml mutlak etanol ve 25 ml damıtılmış su karıştırın
Lizozim (10 mg/ml)Merck (Sigma-Aldrich)10837059001Liyofilize lizozimi (oda sıcaklığına getirilmiş) distile suyla 10 mg/ml olarak yeniden yapılandırıyor
Middlebrook 7H9 medyasıMerck (Sigma-Aldrich)M0178Sıvı ortamı hazırlamak için üreticinin yönergelerine uyun
MIDDLEBROOK OADC ZENGINLEŞTIRME 6 x 100 ml F BD212240
Mikobakteri Büyüme Göstergesi Tüpü (MGIT) medyasıBD245122
NanoDrop sistemiThermo Fisher Scientific
P10 pipetiHerhangi bir tedarikçi
P1000 pipetiHerhangi bir tedarikçi
P200 pipetiHerhangi bir tedarikçi
Proteinaz K, rekomb, PCR grd 2x250mg Merck (Sigma-Aldrich)3115801001Liyofilize Proteinaz K şişesini damıtılmış su ile 10 mg/ml'ye yeniden yapılandırın. Aliquotları 2 ml tüplerde -20 derece ve derecede dondurun; C
SYBR-güvenliThermo Fisher Scientific
Tris/EDTA (TE) tampon pH 8.0Merck (Sigma-Aldrich)8890-OP veya 382499997
VortexHerhangi bir tedarikçi

Kaynaklar

  1. FBouso, J. M., Planet, P. J. Complete non-tuberculous mycobacteria whole genomes using an optimized DNA extraction protocol for long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 793(2019).
  2. Daffé, M., Marrakchi, H. Unraveling the structure of the mycobacterial envelope. Microbiol Spectr. 7 (4), 7.4.1(2019).
  3. Wayne, L. G., Sohaskey, C. D. Nonreplicating persistence of Mycobacterium tuberculosis. Annu Rev Microbiol. 55 (1), 139-163 (2001).
  4. Mohammadi, S., et al. Optimal DNA isolation method for detection of non-tuberculous mycobacteria by polymerase chain reaction. Adv Biomed Res. 6 (1), 133(2017).
  5. Van Soolingen, D., et al. Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains: Evaluation of an insertion sequence-dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis. J Clin Microbiol. 29 (11), 2578-2586 (1991).
  6. Wilson, K. Preparation of genomic DNA from bacteria. Curr Protoc Mol Biol. 56 (1), 2.4.1-2.4.5 (2001).
  7. Van Embden, J. D., et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: Recommendations for a standardized methodology. J Clin Microbiol. 31 (2), 406-409 (1993).
  8. Wang, W. -F., et al. Genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis isolates and construction of a Beijing lineage reference genome. Genome Biol Evol. 12 (2), 3890-3905 (2020).
  9. Epperson, L. E., Strong, M. A scalable, efficient, and safe method to prepare high quality DNA from mycobacteria and other challenging cells. J Clin Tuberc Other Mycobact Dis. 19, 100150(2020).
  10. Warren, R., et al. Safe Mycobacterium tuberculosis DNA extraction method that does not compromise integrity. J Clin Microbiol. 44 (1), 254-256 (2006).
  11. Amaro, A., Duarte, E., Amado, A., Ferronha, H., Botelho, A. Comparison of three DNA extraction methods for Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium subsp. avium. Lett Appl Microbiol. 47 (1), 8-11 (2008).
  12. Arslan, N., Demiray-Gurbuz, E., Ozkutuk, N., Esen, N., Özkütük, A. A. Comparison of four different DNA isolation methods from MGIT culture for long-read whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis. Jundishapur J Microbiol. 17 (9), e148070(2024).
  13. Opperman, C. J., et al. Mycobacterium avium DNA extraction: Implications for NTM identification and amplicon sequencing. South Afr J Infect Dis. 40 (1), 5(2025).
  14. Froenicke, L. Illumina and Aviti sample and library requirements. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/illumina-aviti-sample-and-library-requirements (2015).
  15. Froenicke, L. PacBio Revio and Sequel II library prep & sequencing. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/pacbio-revio-and-sequel-ii-library-prep-sequencing (2016).
  16. Dippenaar, A., et al. Droplet-based whole genome amplification for sequencing minute amounts of purified Mycobacterium tuberculosis DNA. Sci Rep. 14, 9931(2024).
  17. Doig, C. The efficacy of the heat-killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
  18. Li, Y., et al. A systematic investigation of key factors of nucleic acid precipitation toward optimized DNA/RNA isolation. Biotechniques. 68 (4), 191-199 (2020).
  19. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N.Y. (2012).
  20. Van Soolingen, D., Hermans, P. W., De Haas, P. E., Van Embden, J. D. Insertion element IS1081-associated restriction fragment length polymorphisms in Mycobacterium tuberculosis complex species: A reliable tool for recognizing Mycobacterium bovis BCG. J Clin Microbiol. 30 (7), 1772-1777 (1992).
  21. Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
  22. Dippenaar, A., et al. Exploring the potential of Oxford Nanopore Technologies sequencing for Mycobacterium tuberculosis sequencing: An assessment of R10 flowcells and V14 chemistry. PLOS ONE. 19 (6), e0303938(2024).
  23. Chang, A., et al. Metagenomic DNA sequencing to quantify Mycobacterium tuberculosis DNA and diagnose tuberculosis. Sci Rep. 12, 16972(2022).
  24. Forbes, J. D., Knox, N. C., Ronholm, J., Pagotto, F., Reimer, A. Metagenomics: The next culture-independent game changer. Front Microbiol. 8, 1069(2017).
  25. Marshall, J. E., et al. Methods of isolation and identification of non-tuberculous mycobacteria from environmental samples: A scoping review. Tuberculosis. 138, 102291(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

DNA EkstraksiyonuCTAB Y ntemiT m Genom DNA sH cre Duvar LizisiProteinaz KLizozim lemiOrganik Solvent EkstraksiyonuAgaroz Jel ElektroforeziTris EDTA Tamponu
Mycobacterium Türlerinden Setiltrimetilamonium Bromid Tekniği ile Tam Genom Deoksiribonüklein Asit Ekstraksiyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.