Mycobacterium Türlerinden Setiltrimetilamonium Bromid Tekniği ile Tam Genom Deoksiribonüklein Asit Ekstraksiyonu

Yüksek kaliteli DNA çıkarmak, moleküler biyolojide temel bir adımdır ve PCR, tüm genom dizileme ve diğer genomik çalışmalar gibi sonraki uygulamalar için gereklidir. Mycobacterium için, Mycobacterium tüberculosis'in (M. tuberculosis) gibi patojenik türleri ve Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis) gibi patojenik olmayan çevresel türleri içeren bir cins için, DNA çıkarımı kalın, lipid açısından zengin ve hidrofobik hücre^{duvarları nedeniyle zor olabilir 1,2,3}. Bu sağlam hücre duvarı, hücreleri bozmak ve genomik DNA'yı etkili şekilde serbest bırakmak için özel liz yöntemlerinin kullanılmasını gerektirir.

Setiltrimetilamoniyum bromid (CTAB) yöntemi, çeşitli mikobakteriyel türlerden yüksek kaliteli DNA'yı izole etmede güvenilir^{olduğu kanıtlanmış 4,5}. CTAB, katyonik bir yüzeyaktif madde olarak, polisakkaridlere ve diğer hücre bileşenlerine bağlanarak ekstraksiyon sürecinde bunların çıkarılmasını kolaylaştırır⁶. Zor örneklerle bile, CTAB tabanlı protokol, özellikle enzimatik lizi, ısı muamelesi ve organik çözücü ekstraksiyonlarıyla birleştirildiğinde, sağlam ve saf DNA'nın verimli izolasyonunu^{sağlar 7,8}. CTAB yöntemi, özellikle tam genom dizileme, metagenomik ve moleküler tanı içeren araştırmalar için mikobakteriyel türlerden verimli DNA çıkarımında kritik rol oynamıştır; bu araştırmalar saf ve yüksek kaliteli DNA giriş^{materyali (9,10}) gerektirir. Boncuk dövme veya ticari kitler gibi diğer DNA çıkarma tekniklerine kıyasla, burada sunulan CTAB protokolü, uzun okuma dizileme ve epigenetik uygulamalar için temel bir faktör olan DNA bütünlüğünü korumada belirgin bir avantaj sunar. Önceki çalışmalar, mekanik bozulma yöntemlerine kıyasla CTAB ile daha düşük DNA verimleri bildirmiş olsa da, aynı zamanda DNA kesilmesini en aza indirme ve DNA bütünlüğünü^{koruma yeteneğini vurgular 11,12}. Saflık ve verimdeki sınırlamaları gidermek için mevcut protokol, inkubasyon sürelerinin azalması ve çeşitli örnek türleri arasında tutarlılığın artırılması ile optimize edilmiştir. Bu iyileştirme, Opperman ve ark. tarafından alınan bulgularla desteklendi; Mycobacterium avium kültürlerinden CTAB ile ekstraksiyon edilen DNA'nın 16S rRNA dizileme ve hat prob testleri gibi sonraki uygulamalar için yeterli konsantrasyon ve kaliteye sahip olduğunu göstererek, özellikle gelişmiş moleküler analizler için sağlam genomik DNA gerektiren çalışmalarda mikobakteriyel araştırmalar için çok yönlü ve ölçeklenebilir bir araç olarak CTAB protokolünün uygulanmasını destekledi¹³. Ayrıca, yeni nesil dizileme (NGS) genellikle 100-1000 ng yüksek kaliteli genomik^{DNA 14} gerektirir ve PacBio dizileme gibi uzun okuma dizilemelerinde ≥5 μg Yüksek kaliteli^{DNA 15} gerekir; bu nedenle yüksek kaliteli ve sağlam DNA gerektirdiğinde CTAB etkili bir yöntem^{olmaya devam eder 16}.

Özellikle suş tanımlama ve epidemiyolojik çalışmalar için, zorlu ve lizsi zor mikroplardan verimli, tutarlı ve etkili DNA çıkarma metodolojilerinin oluşturulması, laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirlik ve güvenilirliği sağlamak için^{gereklidir 5,7}. Bu protokol, CTAB yöntemiyle Mycobacteria'dan tam genom DNA'sının çıkarılması için detaylar sağlar. Mevcut protokol, araştırmacıların moleküler biyoloji iş akışlarında tutarlı ve güvenilir sonuçlar elde etmelerini sağlamayı amaçlar; böylece kendine özgü mikobakteriyel hücre^{duvarı 17'nin} getirdiği zorlukları ele alarak ve onları aşabilirler.

Temsil eden sonuçlar, REC: BES etik komitesi, Stellenbosch Üniversitesi (BES-2024-22504) onayı ile oluşturuldu. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Mikobakteriyel kültür süspansiyonunun hazırlanması

NOT: İncelenecek türe bağlı olarak, bu adım ya Biyogüvenlik seviye 2 (BSL-2) ya da Biyogüvenlik seviye 3 (BSL-3) laboratuvarında yapılmalıdır. Kültürün kuluçka süresi ve koşulları, mikobakteriyel türlerin farklı büyüme hızları ve fizyolojik özellikleri nedeniyle onların büyüme gereksinimlerine de bağlıdır.

1. Sırasıyla Middlebrook 7H9 sıvı ortamında veya MGIT ortamında 5 mL veya 8 mL bakteriyel kültür hazırlayın, OADC ile takviye edilip bakteri büyümesine izin vermek için gerekli süre boyunca 37 °C'de kuluçka yapın. Yavaş büyüyen mikobakteriler 10-14 gün sürerken, hızlı büyüyen mikobakteriler yaklaşık 2-5 gün sürer.
   NOT: Başlangıç kültürü katı agar plakalarından (örneğin, Middlebrook 7H10 agar) alınmışsa, mikobakteriyel hücrelerin süspansiyonu, steril çift damıtılmış suya bir halka koloni kazıyarak hazırlanabilir.
2. Sıvı kültürü 15 mL'lik tüplere dök.
3. Kültürü 80 °C'de 1 saat boyunca bir kuluçka içinde ısıyla öldürün.
4. Mycobacterium tuberculosis veya BSL-3 gerektiren diğer patojenik türler durumunda, ısıdan ölen kültürler BSL-2 laboratuvarına aktarılır.

2. Hücre duvarı sindirimi ve DNA çıkarımı

NOT: Kültür ısıyla inaktive edildikten sonra, aşağıdaki adımlar bir Biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL-2) laboratuvarında güvenli bir şekilde gerçekleştirilebilir. Amaç uzun okuma dizileme veya yüksek moleküler ağırlıklı DNA gerektiren alternatif uygulamalar için ekstraksiyon ise, geniş delikli pipet uçları kullandığınızdan emin olun ve vorteks adımlarında vortexi inversion veya pipet karışımı ile değiştirin.

1. 15 mL'lik tüpü 3220 x g ile oda sıcaklığında (RT) 15-30 dakika boyunca santrifüj yapın. Şeffaf üst yüzeyi atın (tüm medyanın çıkarıldığından emin olun).
2. Kültür pelletini 300 μL Tris-EDTA (TE) tamponunda iyice yeniden süzülür.
3. Yeniden askılanan peleti 2 mL'lik bir tüpe aktarın.
4. 100 μL lizozim (10 mg/mL) ekleyin ve pipetle 5 kez yukarı ve aşağı karıştırın, ardından tüpü hafifçe vurarak eşit dispersiyayı sağlayın.
5. Karışımı 37 °C'de döner bir kuluçka makinesinde gece boyunca (~16 saat; daha kısa kuluçka süresi, lizin verimliliğini düşürebilir ve dolayısıyla düşük DNA verimine yol açabilir).
6. Ertesi gün, 5 μL proteinaz K (10 mg/mL) ve 70 μL %10 SDS karışımı hazırlanır. Örneğin, beş örnek varsa, %10 SDS içeren 350 μL ve 25 μL Proteinaz K hazırlayın. Köpük oluşumunu önlemek için tüpü ters çevirerek karıştırın.
7. Her numuneye 75 μL karışım ekleyin.
8. Bir kuluçka veya ısıtma bloğunda 65 °C'de 10 dakika boyunca karıştırın, aralıklı olarak ters çevirme ile karıştırın.
9. 100 μL 5 M NaCl ekleyin.
10. 65 °C'de 100 μL önceden ısıtılmış CTAB/NaCl çözeltisi ekleyin.
    NOT: Maddenin viskozitesini RT aşamasında göz önünde bulundurarak, pipetleme doğruluğunu sağlamadan önce CTAB/NaCl çözeltisini 65 °C'ye ısıtın.
11. Çözelti süt gibi olana kadar karıştırın.
12. 65 °C'de 10 dakika boyunca bir kuluçka veya ısıtma bloğunda kuluçka yapın, aralıklı olarak ters çevirme yoluyla karıştırın.
13. Her numuneye eşit hacim (~ 675 μL) kloroform/izoamil alkol çözeltisi (24:1) ekin ve tıklayarak karıştırın.
    NOT: Bu adımı bir duman davlumbazında yapın çünkü kloroform solulursa toksiktir ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır.
14. Örnekleri oda sıcaklığında 12000 x g ile 10 dakika boyunca santrifüjlen.
15. Sulu (üst) fazın 550-600 μL'sini steril 1,5 mL tüplere dikkatlice aspire edin ve uygun şekilde etiketleyin.
    NOT: Diğer katmanları rahatsız etmemeye dikkat edin. Herhangi bir katman yanlışlıkla bozulursa, tüpü tekrar santrifüj yapın.

3. DNA çökeltmesi ve elüsyonu

1. Eşit hacimde (550-600 μL) buz gibi izopropanol ekleyin ve tüpleri ters çevirerek karıştırın.
   NOT: DNA konsantrasyonu yüksekse, karıştırma sırasında beyaz çökeltme oluşabilir.
2. Tüpleri -20 °C'de 30 dakikadan 1 saate kadar kuluçka yapın.
   NOT: Daha uzun kuluçka süreleri DNA çökelmesini^{artırabilir 18} , ancak aynı zamanda tuzların kopresipitasyonuna da yol açabilir. Böylece, düşük DNA konsantrasyonu bekleniyorsa gece boyunca kuluçka yapılabilir.
3. Oda sıcaklığında en yüksek hızda (~21130 x g) santrifüj yapın ve çözünmeyen DNA'yı pellet etmek için 30 dakika boyunca kullanın.
   NOT: 1.5 tüplerin ön tarafının santrifüj rotorunda içe baktığından emin olun. Bu aşamada, DNA tüplerin alt kısmında ve arkasında çökelir. Bu, bir sonraki adımda görünmez olabilecek peleti rahatsız etmemek için önemlidir. DNA konsantrasyonu yüksekse beyaz bir çökelti veya pellet görünebilir. Bir peletin olmaması, başarısız bir çıkarma anlamına gelmez; Kalan adımlara devam edin.
4. Tüpün ön tarafından süpernatantı DNA pelletini rahatsız etmeden veya hızlı dekantasyon olmadan aspire edin, böylece pelletin bozulmamasını sağlar.
   NOT: Başlangıç kültürü küçükse ve düşük DNA konsantrasyonu bekleniyorsa süpernatantı aspire etmek daha iyidir.
5. 1000 μL buz gibi soğuk %75 etanol ekleyin.
6. Tüpleri birkaç kez ters çevirerek karıştırın.
7. 12000 × g seviyesinde 30 dakika boyunca santrifüj yapın (3. adımdaki yönelimde).
8. Tüm etanolü pelleti rahatsız etmeden aspire veya dekant yapın.
   NOT: Yüksek tuz kopresipitasyonu varsa, 5-8. adımlar tekrarlanabilir.
9. Tüplerin RT ile gece boyunca veya en az 30 dakika hava kurumasına izin verin.
10. DNA'yı yeniden süzüldürmek için her tüpe 25-50 μL TE tamponu (pH 8) ekleyin.
    NOT: DNA, aşağı akış uygulamaları EDTA'ya duyarlıysa Tris (10 mM, pH 8) tampon veya nükleazsız suda yeniden süspansiye bırakılabilir.
11. DNA pelletinin gece boyunca 4 °C'de tekrar beklemesine izin verin.
12. Kalite kontrol değerlendirmesi yapılmadan önce 2-3 gün boyunca 4 °C'de saklanın.
13. Uzun süre -80 °C'de sakla.

4. DNA nicelenmesi ve kalite kontrolü

NOT: DNA kalite kontrolü genellikle mikrohacim spektrofotometresi ve jel elektroforezi kullanılarak yapılır. Floresans tabanlı bir nicelik sistemi de ekstraksiyon DNA'yı nicelendirmek için kullanılabilir.

1. Spektrofotometre yöntemi
   1. DNA konsantrasyonunu ölçün ve üreticinin talimatlarına uygun olarak kaliteyi belirleyin.
      NOT: İdeal olarak bir DNA örneği 1.7 ile 2.0 arasında 260/280 oranına sahiptir. 1.8 değeri genellikle DNA için saf olarak kabul edilir. Bu aralığın altındaki değerler, 280 nm veya yakınında güçlü şekilde emilen kalıntı protein, guanidin veya diğer reaktiflerle kontaminasyonu gösterir. 2.0-2.2 arasında 260/230 oranı idealdir. Oran beklenenden daha düşükse, bu 230 nm hızında emilen EDTA, fenol ve karbonhidratlar gibi kirleticilerin varlığını gösterebilir. Örnek için elde edilen absorbans grafiklerini de kontrol edin.
2. Jel elektroforezi
   1. DNA bütünlüğünü değerlendirmek ve parçalanma veya bozulmanın olup olmadığını belirlemek için agaroz jel^{elektroforezi 19} uygulanır.
   2. UV jel dokümantasyon sistemi altında DNA'yı görselleştirmek için, SYBR Safe boya içeren %1,0 agaroz jel kullanın. Jeli 80 V'da 45 dakika çalıştırın.
      NOT: Amaç, DNA merdiveninin en yüksek bandının üzerinde net, belirgin ve yüksek moleküler ağırlıklı bantlar oluşturmaktır. Her seferinde taze 1× TAE tamponu kullanın.

CTAB yöntemiyle (Şekil 1) kullanılan bu DNA çıkarma protokolü, M. tuberculosis, M. abscessus ve M. chelonea gibi çeşitli mikobakteriyel türlerde değerlendirildi. DNA çıkarıldı ve çıkarılan DNA'nın verimliliği, saflığı ve bütünlüğü açısından örnekler arasında karşılaştırıldı.

DNA konsantrasyonu mikobakteriyel türler arasında değişiyor ve bazı durumlarda 190-600 ng/μL ile >1000 ng/μL arasında değişiyor; bu da CTAB'ın yüksek verimli DNA çıkardığını gösteriyor. 260/280 ve 260/230 oranları sırasıyla 1.9-2.0 ve 1.8-2.2 arasında değişiyordu ve yüksek saflıkta DNA'yı gösteriyordu (Tablo 1). Spektrofotometre, 260 nm'de tek bir absorbans zirvesi gösterdi (Şekil 2B). Bu veriler, CTAB protokolünün çeşitli mikobakteriyel türlerden yüksek verimli ve yüksek saflıkta DNA çıkardığını göstermektedir. İzole DNA'nın bütünlüğünü değerlendirmek için agaroz jel elektroforezi de kullanıldı. Net, belirgin, yüksek moleküler ağırlıklı ve sağlam bir bant (Şekil 2B), genomik DNA'yı minimum bozulmayla temsil eder; bu da DNA'nın sağlam olduğunu ve sonraki uygulamalar için uygun olduğunu gösterir.

Ancak, özellikle lizleri daha zor olan bazı tüberküloz dışı mycobacterium (NTM) türlerinde (Şekil 3) optimal olmayan sonuçlar da gözlemlenmiştir. Düşük DNA verimi (<50 ng/μL) elde edildi ve saflık oranları ideal aralığın altındaydı; bu da kalıntı proteinler ve polisakkaridler gibi bazı kirleticilerin varlığını gösteriyor (Tablo 2). Jel elektroforez profilleri, bulaşmış bantlar (örneğin, 2,3 ve 7 kuyusu, Şekil 3B) göstermiştir; bu da DNA bozulmasının polisakkaritler ve diğer hücre duvarı bileşenlerinden kaynaklanan eksik liz veya kontaminasyon ya da optimal olmayan büyüme koşullarından kaynaklandığını göstermektedir. Bu sorunlar, 65 °C'de kuluçka süresinin optimize edilmesi, lizin verimliliğini artırarak ve safsızlıkları temizlemek için ekstra etanol yıkamaları yapılarak aşılabilir.

Bu temsilci sonuçlar, CTAB tabanlı DNA çıkarma yönteminin mikobakteriyel türlerden yüksek kaliteli DNA çıkarma konusundaki dayanıklılığını ve etkinliğini göstermektedir. Bu teknik, çoğu sonraki moleküler uygulama için uygun yüksek verim ve saf DNA sağlar.

Şekil 1: Mycobacterium türleri için CTAB DNA çıkarma protokolünün şematik temsili. Kültürler ısıyla inaktive edilir ve hücre kalıntıları santrifüjle pelletlenir. Hücre duvarı, gece boyunca lizozimle sindirimle lizozimle lizize edilir ve DNA salgılanır. Proteinler ve lipidler, proteinaz K ve SDS kullanılarak çıkarılır. CTAB eklenir ve polisakkaridler ile diğer safsızlıklardan nükleik asit ayrımı artırarak DNA verimini artırmak için 65 °C'ye kadar ısıtılır. Kloroform-izoamil alkol karışımı, sulu tabakadaki DNA'yı izole eder. Santrifüjlemenin ardından, DNA izopropanol ile çökeltir, %75 buz gibi soğuk etanol ile arındırılır ve TE tamponu veya nükleaz içermeyen suda elüasyon edilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Çeşitli Mycobacterium türlerinden çıkarılan iyi genomik DNA'nın kalitesi ve miktarı. (A) 260'ta tek bir absorbans zirvesine bir örnek. (B) DNA (2 μL) %1 agaroz jeliyle SYBR-güvenli boya ile boyanmış ve UV jel dokümantasyon sistemi kullanılarak görselleştirilmiş, sağlam yüksek moleküler ağırlıklı bantlar gösterilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Çeşitli Mycobacterium türlerinden alınan zayıf genomik DNA'nın kalitesi ve miktarı. (A) 260'ta zayıf emilim, 230 ve 280'de zirveye örnek. (B) DNA, %1 agaroz jeli ve SYBR-güvenli boya üzerine yüklendi ve UV dokümantasyon sistemi kullanılarak görselleştirildi; bu görüntü slear (örneğin 2,3 ve 7 kuyular) veya bant yok (örneğin, 12 kuyusu). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Yüksek kaliteli çıkarılmış DNA'nın temsil eden verileri.

Tablo 2: Düşük kaliteli çıkarılmış DNA'nın temsil eden verileri.

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.