Canlı Drosophila Wing Hayalinal Disklerde Sitonemlerin Aracılık Ettiği Hücre-Hücre Temasını Değerlendirmek için GFP Tamamlama Tabanlı Çift İfade Sistemi

Summary

Canlı Drosophila kanadı hayali disklerindeki bitişik epitel tabakalarındaki hücreler arasındaki temasları GFP sulandırma tabanlı bir yaklaşım kullanarak ölçmek için bir protokol açıklıyoruz.

Abstract

Embriyonik doku büyümesi ve modellenmesi, büyük ölçüde, dokuların kendi içindeki hücre popülasyonları arasında yerel olarak değiş tokuş edilen sinyaller tarafından kontrol edilir. Sitonemler, ilk olarak Drosophila'da tanımlanan, sinyal üreten ve sinyal alan hücreler arasındaki alışverişi birbirine bağlayan ve aracılık eden bir tür sinyal filopodiasıdır. Gelişmekte olan Drosophila kanadı hayali diskinde, sitonemler, yetişkin kanadını oluşturacak olan diske uygun (DP) epitel içindeki farklı hücre popülasyonları arasında ve ayrıca DP hücreleri ile bitişik disk ilişkili dokulardaki hücreler arasında sinyal alışverişinde rol oynar. Sitonemler, yakın zar temasları oluşturmak için hedef hücrelerle sinaps yapar.

Burada, canlı kanat disklerinde GFP sulandırma yaklaşımı kullanılarak, DP hücreleri ile DP hücrelerinden disk lümeni ile ayrılan bitişik peripodial membran (PerM) epitelinin hücreleri arasındaki sitonem aracılı teması ölçmek için bir protokol sunuyoruz. GAL4-UAS ve LexA-LexAop sistemleri kullanılarak, her biri CD4'ün transmembran alanına kaynaşmış olan split-GFP'nin (spGFP1-10, spGFP11) tamamlayıcı parçaları, disk lümeninin her iki tarafında ifade edilir. Canlı kanat diski preparatlarında sulandırılmış GFP floresansının konfokal mikroskopi ile görüntülenmesi daha sonra sulandırılmış GFP floresansının lokalize edilebileceği ve ölçülebileceği görüntü yığınları oluşturmak için kullanılır. Bu sistemi kullanarak, DP-PerM hücre temasları üzerindeki etkilerini ölçmek için sitonem üreten veya hedef hücrelerde protein kodlayan veya RNA girişim transgenlerini birlikte eksprese etmek mümkündür. Diğer dokulara kolayca adapte olabilen bu sistem, böylece sitonem oluşumu veya fonksiyonu için önemli olan faktörlerin tanımlanmasını sağlar.

Introduction

Embriyonik dokuların gelişimi, bir doku içindeki uzak hücrelere sinyal veren, çoğalma (yani büyüme ve bölünme) veya belirli kaderleri benimseme kararlarını kontrol eden 'organizasyon merkezlerinde' bulunan hücreler tarafından kontrol edilir¹. Bu hücre otonom olmayan sinyallemeye, dokular boyunca konsantrasyon gradyanları oluşturan ve konsantrasyona bağlı tepkiler ortaya çıkaran merkez hücrelerin düzenlenmesi tarafından üretilen ligandlar aracılık eder. Çoğu durumda, bu ligandlar, dokulardaki sinyal gönderen ve alan hücreleri birbirine bağlayan sitonemler adı verilen uzun aktin bazlı sinyal filopodia yoluyla ile....

Protocol

Nubbin-GAL4 sürücüsü, CD4-spGFP1-10'u özellikle DP'nin kanat kese bölgesinde eksprese etmek için kullanılır (Şekil 1A). PerM-LexA sürücüsü²¹, CD4-spGFP11'i özellikle PerM'de ifade etmek için kullanılır (Şekil 1A). Bu iki ekspresyon sistemi birbirinden bağımsızdır ve DP ve PerM'de farklı transgenlerin aynı anda ve spesifik ekspresyonuna izin verir (Şekil 1B,C).

Temel genetik şema, nub-GAL4 / UAS-CD4-spGFP1-10 genotipinin larvalarını üretmek için sinekleri çaprazlamayı içerir; PerM-LexA/LexAop-CD4-spG....

Results

DP ve PerM hücreleri arasındaki temasları ölçmek için GRASP prosedürünün kullanışlılığını test etmek için, dört farklı genotipin kanat disklerini inceledik: GFP kanalında yalnızca arka plan otofloresan seviyelerini gösterecek olan vahşi tip negatif kontrol diskleri (genotip: w¹¹¹⁸); DP katmanında CD4-spGFP1-10'u eksprese eden, ancak tek başına GFP1-10 tarafından üretilen floresan seviyesini gösterecek olan CD4-spGFP11 transgeninden yoksun diskler (GFP1-10'un floresan²⁶ olmaması.......

Discussion

Sitonemler, ligandların dağılımında, gelişmekte olan dokuların büyümesini ve organizasyonunu kontrol etmede önemli bir rol oynar. Sinyal alışverişi, sitonem uçlarının hedefleriyle yakın membran teması kurduğu yerde gerçekleşir. Bu protokolde, GRASP tekniğini kullanarak kanat diskindeki epitel tabakaları arasındaki sitonem aracılı temasları analiz etmek için basit bir yöntem tarif ediyoruz.

Burada sunulan teknik, en az dört bileşen gerektirir: bir GAL4 sürücüsü.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Discovery V12 diseksiyon mikroskobu	Zeiss		Diseksiyon Mikroskobu
Dumont #55 forseps, Biyoloji ipuçları	Güzel Bilim Araçları	11255-20	diseksiyon forsepsleri
EP-Slik (slik20358)	BDSC Hakkında	Panneton ve ark. 2015	Slik'i ifade etmek için sinek suşu
FİJİ		Schindelin J. ve ark. (2012)	Görüntü Analiz Yazılımı
Hoechst 33342	ThermoFisher Bilimsel	H3570	canlı görüntüleme nükleer leke
LexAop-CD4-spGFP11	BDSC Hakkında	93018	sinek gerginliği
LSM 700 konfokal mikroskop	Zeiss		Konfokal mikroskop
nub-GAL4	Bloomington Drosophila Stok Merkezi (BDSC)	86108	sinek gerginliği
PerM-LexA		Rambaud, Joseph ve diğerleri, 2025	sinek gerginliği
PYREX 9-çöküntü cam spot plaka satışı	Corning Yaşam Bilimleri	7220-85	larvaları toplamak ve yıkamak için
Schneider'in Drosophila Ortamı	ThermoFisher Bilimsel	21720024	Canlı görüntüleme ortamı
SecureSeal görüntüleme aralıkları, 8-kuyu, 0.12 mm kalın	Grace Biyo-Laboratuvarları	654008	Spacer
SYLGARD 184 silikon elastomer kiti	Sylgard	3097358-1004	diseksiyon plakaları yapmak için
UAS-CD4-spGFP1-10	BDSC Hakkında	93017	sinek gerginliği
Zen Siyahı	Zeiss		Edinme yazılımı