Canlı Drosophila kanadı hayali disklerindeki bitişik epitel tabakalarındaki hücreler arasındaki temasları GFP sulandırma tabanlı bir yaklaşım kullanarak ölçmek için bir protokol açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Canlı Drosophila Wing Hayalinal Disklerde Sitonemlerin Aracılık Ettiği Hücre-Hücre Temasını Değerlendirmek için GFP Tamamlama Tabanlı Çift İfade Sistemi
Bu makalede
Özet
Özet
Embriyonik doku büyümesi ve modellenmesi, büyük ölçüde, dokuların kendi içindeki hücre popülasyonları arasında yerel olarak değiş tokuş edilen sinyaller tarafından kontrol edilir. Sitonemler, ilk olarak Drosophila'da tanımlanan, sinyal üreten ve sinyal alan hücreler arasındaki alışverişi birbirine bağlayan ve aracılık eden bir tür sinyal filopodiasıdır. Gelişmekte olan Drosophila kanadı hayali diskinde, sitonemler, yetişkin kanadını oluşturacak olan diske uygun (DP) epitel içindeki farklı hücre popülasyonları arasında ve ayrıca DP hücreleri ile bitişik disk ilişkili dokulardaki hücreler arasında sinyal alışverişinde rol oynar. Sitonemler, yakın zar temasları oluşturmak için hedef hücrelerle sinaps yapar.
Burada, canlı kanat disklerinde GFP sulandırma yaklaşımı kullanılarak, DP hücreleri ile DP hücrelerinden disk lümeni ile ayrılan bitişik peripodial membran (PerM) epitelinin hücreleri arasındaki sitonem aracılı teması ölçmek için bir protokol sunuyoruz. GAL4-UAS ve LexA-LexAop sistemleri kullanılarak, her biri CD4'ün transmembran alanına kaynaşmış olan split-GFP'nin (spGFP1-10, spGFP11) tamamlayıcı parçaları, disk lümeninin her iki tarafında ifade edilir. Canlı kanat diski preparatlarında sulandırılmış GFP floresansının konfokal mikroskopi ile görüntülenmesi daha sonra sulandırılmış GFP floresansının lokalize edilebileceği ve ölçülebileceği görüntü yığınları oluşturmak için kullanılır. Bu sistemi kullanarak, DP-PerM hücre temasları üzerindeki etkilerini ölçmek için sitonem üreten veya hedef hücrelerde protein kodlayan veya RNA girişim transgenlerini birlikte eksprese etmek mümkündür. Diğer dokulara kolayca adapte olabilen bu sistem, böylece sitonem oluşumu veya fonksiyonu için önemli olan faktörlerin tanımlanmasını sağlar.
Giriş
Embriyonik dokuların gelişimi, bir doku içindeki uzak hücrelere sinyal veren, çoğalma (yani büyüme ve bölünme) veya belirli kaderleri benimseme kararlarını kontrol eden 'organizasyon merkezlerinde' bulunan hücreler tarafından kontrol edilir1. Bu hücre otonom olmayan sinyallemeye, dokular boyunca konsantrasyon gradyanları oluşturan ve konsantrasyona bağlı tepkiler ortaya çıkaran merkez hücrelerin düzenlenmesi tarafından üretilen ligandlar aracılık eder. Çoğu durumda, bu ligandlar, dokulardaki sinyal gönderen ve alan hücreleri birbirine bağlayan sitonemler adı verilen uzun aktin bazlı sinyal filopodia yoluyla ile....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Nubbin-GAL4 sürücüsü, CD4-spGFP1-10'u özellikle DP'nin kanat kese bölgesinde eksprese etmek için kullanılır (Şekil 1A). PerM-LexA sürücüsü21, CD4-spGFP11'i özellikle PerM'de ifade etmek için kullanılır (Şekil 1A). Bu iki ekspresyon sistemi birbirinden bağımsızdır ve DP ve PerM'de farklı transgenlerin aynı anda ve spesifik ekspresyonuna izin verir (Şekil 1B,C).
Temel genetik şema, nub-GAL4 / UAS-CD4-spGFP1-10 genotipinin larvalarını üretmek için sinekleri çaprazlamayı içerir; PerM-LexA/LexAop-CD4-spG....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
DP ve PerM hücreleri arasındaki temasları ölçmek için GRASP prosedürünün kullanışlılığını test etmek için, dört farklı genotipin kanat disklerini inceledik: GFP kanalında yalnızca arka plan otofloresan seviyelerini gösterecek olan vahşi tip negatif kontrol diskleri (genotip: w1118); DP katmanında CD4-spGFP1-10'u eksprese eden, ancak tek başına GFP1-10 tarafından üretilen floresan seviyesini gösterecek olan CD4-spGFP11 transgeninden yoksun diskler (GFP1-10'un floresan26 olmaması.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Sitonemler, ligandların dağılımında, gelişmekte olan dokuların büyümesini ve organizasyonunu kontrol etmede önemli bir rol oynar. Sinyal alışverişi, sitonem uçlarının hedefleriyle yakın membran teması kurduğu yerde gerçekleşir. Bu protokolde, GRASP tekniğini kullanarak kanat diskindeki epitel tabakaları arasındaki sitonem aracılı temasları analiz etmek için basit bir yöntem tarif ediyoruz.
Burada sunulan teknik, en az dört bileşen gerektirir: bir GAL4 sürücüsü.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan etmek için rekabet eden çıkarları yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Institut de Recherches Cliniques de Montréal Vakfı'ndan ve Montreal Üniversitesi Moleküler Biyoloji Programı'ndan doktora bursu alan DH'ye bir CIHR hibesi (PJT-162109) ile desteklenmiştir. Yazarlar, IRCM Mikroskopi ve Görüntüleme platformunun yardımını büyük ölçüde kabul etmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Discovery V12 diseksiyon mikroskobu | Zeiss | Diseksiyon Mikroskobu | |
| Dumont #55 forseps, Biyoloji ipuçları | Güzel Bilim Araçları | 11255-20 | diseksiyon forsepsleri |
| EP-Slik (slik20358) | BDSC Hakkında | Panneton ve ark. 2015 | Slik'i ifade etmek için sinek suşu |
| FİJİ | Schindelin J. ve ark. (2012) | Görüntü Analiz Yazılımı | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Bilimsel | H3570 | canlı görüntüleme nükleer leke |
| LexAop-CD4-spGFP11 | BDSC Hakkında | 93018 | sinek gerginliği |
| LSM 700 konfokal mikroskop | Zeiss | Konfokal mikroskop | |
| nub-GAL4 | Bloomington Drosophila Stok Merkezi (BDSC) | 86108 | sinek gerginliği |
| PerM-LexA | Rambaud, Joseph ve diğerleri, 2025 | sinek gerginliği | |
| PYREX 9-çöküntü cam spot plaka satışı | Corning Yaşam Bilimleri | 7220-85 | larvaları toplamak ve yıkamak için |
| Schneider'in Drosophila Ortamı | ThermoFisher Bilimsel | 21720024 | Canlı görüntüleme ortamı |
| SecureSeal görüntüleme aralıkları, 8-kuyu, 0.12 mm kalın | Grace Biyo-Laboratuvarları | 654008 | Spacer |
| SYLGARD 184 silikon elastomer kiti | Sylgard | 3097358-1004 | diseksiyon plakaları yapmak için |
| UAS-CD4-spGFP1-10 | BDSC Hakkında | 93017 | sinek gerginliği |
| Zen Siyahı | Zeiss | Edinme yazılımı |
Kaynaklar
- Ng, J. K., Tamura, K., Buscher, D., Izpisua-Belmonte, J. C. Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development. Curr Top Dev Biol. 41, 37-66 (1999).
- Kornberg, T. B. Cytonemes and the dispersion of morphogens. Wiley Interdiscip....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
