Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Canlı Drosophila Wing Hayalinal Disklerde Sitonemlerin Aracılık Ettiği Hücre-Hücre Temasını Değerlendirmek için GFP Tamamlama Tabanlı Çift İfade Sistemi

897 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68411

⸱

22 Ağustos 2025

 , 
1Institut de recherches cliniques de Montréal (IRCM), 2Programmes de biologie moléculaire, Université de Montréal, 3Département de Médecine, Université de Montréal

Bu makalede

Özet

Canlı Drosophila kanadı hayali disklerindeki bitişik epitel tabakalarındaki hücreler arasındaki temasları GFP sulandırma tabanlı bir yaklaşım kullanarak ölçmek için bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Embriyonik doku büyümesi ve modellenmesi, büyük ölçüde, dokuların kendi içindeki hücre popülasyonları arasında yerel olarak değiş tokuş edilen sinyaller tarafından kontrol edilir. Sitonemler, ilk olarak Drosophila'da tanımlanan, sinyal üreten ve sinyal alan hücreler arasındaki alışverişi birbirine bağlayan ve aracılık eden bir tür sinyal filopodiasıdır. Gelişmekte olan Drosophila kanadı hayali diskinde, sitonemler, yetişkin kanadını oluşturacak olan diske uygun (DP) epitel içindeki farklı hücre popülasyonları arasında ve ayrıca DP hücreleri ile bitişik disk ilişkili dokulardaki hücreler arasında sinyal alışverişinde rol oynar. Sitonemler, yakın zar temasları oluşturmak için hedef hücrelerle sinaps yapar.

Burada, canlı kanat disklerinde GFP sulandırma yaklaşımı kullanılarak, DP hücreleri ile DP hücrelerinden disk lümeni ile ayrılan bitişik peripodial membran (PerM) epitelinin hücreleri arasındaki sitonem aracılı teması ölçmek için bir protokol sunuyoruz. GAL4-UAS ve LexA-LexAop sistemleri kullanılarak, her biri CD4'ün transmembran alanına kaynaşmış olan split-GFP'nin (spGFP1-10, spGFP11) tamamlayıcı parçaları, disk lümeninin her iki tarafında ifade edilir. Canlı kanat diski preparatlarında sulandırılmış GFP floresansının konfokal mikroskopi ile görüntülenmesi daha sonra sulandırılmış GFP floresansının lokalize edilebileceği ve ölçülebileceği görüntü yığınları oluşturmak için kullanılır. Bu sistemi kullanarak, DP-PerM hücre temasları üzerindeki etkilerini ölçmek için sitonem üreten veya hedef hücrelerde protein kodlayan veya RNA girişim transgenlerini birlikte eksprese etmek mümkündür. Diğer dokulara kolayca adapte olabilen bu sistem, böylece sitonem oluşumu veya fonksiyonu için önemli olan faktörlerin tanımlanmasını sağlar.

Giriş

Embriyonik dokuların gelişimi, bir doku içindeki uzak hücrelere sinyal veren, çoğalma (yani büyüme ve bölünme) veya belirli kaderleri benimseme kararlarını kontrol eden 'organizasyon merkezlerinde' bulunan hücreler tarafından kontrol edilir1. Bu hücre otonom olmayan sinyallemeye, dokular boyunca konsantrasyon gradyanları oluşturan ve konsantrasyona bağlı tepkiler ortaya çıkaran merkez hücrelerin düzenlenmesi tarafından üretilen ligandlar aracılık eder. Çoğu durumda, bu ligandlar, dokulardaki sinyal gönderen ve alan hücreleri birbirine bağlayan sitonemler adı verilen uzun aktin bazlı sinyal filopodia yoluyla iletilir veya alınır 2,3. İlk olarak Drosophila kanat hayali diski4'te keşfedilen sitonemler, memelilerde ve diğer omurgalılardada tanımlanmıştır 5,6,7,8,9. Sitonemlerin hücre otonom olmayan sinyallemedeki rolünün daha iyi anlaşılması, erken bir aşamada, hücrelerin dokular halinde organize olmak için nasıl iletişim kurduğunu ve bu iletişim hatlarının gelişimsel malformasyonlar ve kanser dahil olmak üzere çeşitli patolojik durumlarda nasıl değiştirildiğini deşifre etmek için çok önemlidir.

Sitonemler, kaynak hücrelerden hedef hücrelere ligandlar iletmek veya hedef hücrelerden kaynaklarına yakın ligandlar almak için uzanabilir 2,3. Sitonemler, sinaps benzeri yapılar oluşturdukları düşünülen ve ligand transferinin gerçekleşebileceği düşünülen hedefleriyle yakın temaslar kurarlar 3,10,11. Bu temas, kaynak ve hedef sitonemlerin uçları arasında veya sitonemler ve hücre gövdeleriarasında meydana gelebilir 3. Kapsamlı bir şekilde karakterize edilmemesine rağmen, adezyon molekülleri veya reseptör-ligand etkileşimleri yoluyla hücre yapışması, bazı durumlarda, aşağı akış sinyalleme olaylarının 12,13,14 uygun aktivasyonu için gereklidir, bu da bunu sitonem biyolojisinin önemli bir yönü haline getirir.

Birkaç çalışma, sitonem temaslılarının analizine "sinaptik ortaklar arasında GFP sulandırması" (GRASP) tekniğini uygulamıştır. Bu yöntem, karmaşık sinir sistemlerindeki sinaptik ortakları belirlemek ve haritalamak için geliştirilmiştir15. Farklı hücre popülasyonlarında, her biri bir transmembran alanının (örneğin CD4) hücre dışı bölgesine kaynaşmış, bölünmüş GFP'nin iki tamamlayıcı parçasının (spGFP1-10 ve spGFP11) ekspresyonuna dayanır. Bu iki popülasyondaki hücrelerin plazma zarları doğrudan temas ederse, spGFP'nin tamamlayıcı alanlarını yakınlığa getirir ve GFP floresansının yeniden yapılandırılmasına yol açar. Bu yaklaşım, Drosophila'da kanat diski içindeki hücreler arasında ve kanat diski ile diğer yakından ilişkili dokular arasında sitonem temaslarının varlığını tanımlamak için kullanılmıştır 12,16,17,18,19,20,21.

Bu makale, Drosophila kanadı hayali diskinin morfolojik olarak farklı iki epitel tabakası, uygun disk (DP) ve peripodial membran (PerM) arasındaki temasların karakterizasyonuna GRASP uygulamasını açıklamaktadır. Bu epitel tabakaları, bir tarafta psödostratifiye kolumnar DP hücreleri ve diğer tarafta skuamöz PerM hücreleri ile merkezi bir lümeni çevreleyen bir kese oluşturur ve her ikisi de apikal zarları lümene doğru içe bakar (Şekil 1A). İki katman 22,23,24,25 arasında yarı saydam sinyalleme için bazı kanıtlar vardır ve yakın zamanda DP21'deki apikal sitomların aracılık ettiği PerM hücrelerinin proliferasyonunu kontrol etmek için DP'den gelen sinyalleri belgeledik. Bu protokol, DP ve PerM hücrelerinin zarları üzerinde CD4'e kaynaşmış spGFP'nin tamamlayıcı parçalarını eksprese etmek için GAL4/UAS ve LexA/LexAop transgen ekspresyon sistemlerinin kullanılmasını içerir. İki hücre popülasyonu arasındaki membran temasını okumak için sulandırılmış GFP floresansını kullanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Nubbin-GAL4 sürücüsü, CD4-spGFP1-10'u özellikle DP'nin kanat kese bölgesinde eksprese etmek için kullanılır (Şekil 1A). PerM-LexA sürücüsü21, CD4-spGFP11'i özellikle PerM'de ifade etmek için kullanılır (Şekil 1A). Bu iki ekspresyon sistemi birbirinden bağımsızdır ve DP ve PerM'de farklı transgenlerin aynı anda ve spesifik ekspresyonuna izin verir (Şekil 1B,C).

Temel genetik şema, nub-GAL4 / UAS-CD4-spGFP1-10 genotipinin larvalarını üretmek için sinekleri çaprazlamayı içerir; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. Negatif bir kontrol olarak, LexAop-CD4-spGFP11 transgenini dışarıda bırakıyoruz. Diğer transgenler (örneğin, protein kodlayan, çift sarmallı RNA), DP katmanında ( UAS dizilerinin kontrolü altında) veya PerM'de ( LexA operatörünün kontrolü altında) istenildiği gibi ifade edilebilir.

Bu, kesintiye uğratılamayan canlı bir görüntüleme protokolüdür. Malzeme hazırlığı ~ 10 dakika olarak tahmin edilmektedir. Görüntülemeden önce bir seferde 20 dakikadan fazla diseksiyon yapılmamalıdır. Görüntüleme ~ 30 dakika sürer ve ~ 1 saatten fazla sürmemelidir. Birden fazla koşul veya çok sayıda numune için, en iyi sonuçları elde etmek için prosedür birden fazla turda gerçekleştirilmelidir.

1. Malzeme hazırlama

  1. Diseksiyondan önce, cımbızları, 9 oyuklu bir cam çöküntü spot plakasını (veya larvaları toplamak ve temizlemek için uygun başka bir kap) ve p etanol ile diseksiyon için kullanılan yeniden kullanılabilir Sylgard (silikon) kaplı bir Petri kabını temizleyin.
  2. p etanol yıkama yaparak ve ardından kurutulmuş slayta bir görüntüleme ara parçası yapıştırarak mikroskop slaytları hazırlayın. 8 oyuklu şeritten tek tek kuyucukları makasla kesin ve ikiye bölün (Şekil 2A). Koruyucu desteği her iki yarının bir tarafından çıkarın ve ortada disklerin yerleştirileceği korunaklı bir alan oluşturmak için hafifçe aralıklı olarak sürgüye ara parçalar yapıştırın (Şekil 2B).
    NOT: Deneyimlerimize göre, slayta aktarılan ortamın kesin hacmi daha az kritik olduğundan, bu, numune montajını basitleştirir. Herhangi bir küçük fazla hacim, kayma sırasında boşluktan kolayca dışarı akacaktır. Sadece nispeten kısa bir süre (genellikle ~ 1 saat) görüntülediğimiz için, orta kurutma ile ilgili herhangi bir sorun yaşamadık.
  3. Canlı görüntüleme ortamını (donmuş 10 mL alikotlarda saklanan takviyesiz Schneider'in Drosophila Medium'u) çözün ve bir buz kovasında kolayca erişilebilir durumda tutun.
  4. 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 1.5 mL ortamı 20 μL 200 μg / mL Hoechst 33342 (nihai konsantrasyon 2.7 μg / mL) ile karıştırın. Tüpü buz üzerinde tutun.
    NOT: Hoechst boyasının bu özel formu, yüksek oranda zar geçirgen olduğu için kullanılır. DİKKAT: Hoechst 33342 ile çalışırken eldiven kullanılmalıdır. Aletler kullanıldıktan sonra yıkanmalıdır.

2. Kanat diski diseksiyonu ve slayt hazırlama

  1. Genetik çaprazlama ve 25 ° C'de yetiştirmeyi takiben, tüpten dolaşan üçüncü instar larvaları toplayın ve bunları 9 oyuklu bir cam çöküntü spot plakasında soğuk canlı görüntüleme ortamında yıkayın.
    NOT: Sitonemler çok kırılgandır. İlerleyen adımlarda, diskler ve diseksiyon araçları arasında doğrudan temastan kaçınmaya çalışarak, disklerin etrafındaki dokuları manipüle etmeye özen gösterilmelidir. Bir seferde üç veya dört larva hazırlıyoruz, çünkü birkaç diske zarar vermek kaçınılmazdır ve bu sadece görüntüleme adımları sırasında fark edilebilir hale gelebilir.
  2. Diseksiyon mikroskobu altında, larvaları silikon kaplı bir Petri kabı üzerinde bir damla canlı görüntüleme ortamına aktarın ve iki diseksiyon forseps kullanarak diseksiyona başlayın. Bunu yapmak için, önce larvaları bir çift forseps ile vücut uzunluğunun yaklaşık üçte biri kadar (önden) sıkıştırarak baş ve ön vücut kısmını sabit tutun. İkinci forseps çiftini kullanarak, vücudu ilk forsepsin hemen arkasına sıkıştırın. Ardından, ön "yarıyı" izole etmek için larvaların arka kısmını çekin.
  3. Hayali diskler, trakea, tükürük bezleri, yağ gövdesi ve bağırsak dahil olmak üzere iç yapıları ortaya çıkarmak için kesilen ucun her iki yanında bir cımbızla sabitleyerek ve diğer çiftle başı iterek (bir çorabı ters çevirmek gibi) ön yarıyı ters çevirin.
  4. Tükürük bezlerini, yağ gövdesini ve bağırsakları dikkatlice çıkarın, trakeanın yan gövdelerini rahatsız etmemeye dikkat edin, bu da kanat disklerinin üzerine örtülmeli ve korunmalıdır.
  5. Bağlı kanat diskleri ile temizlenmiş ön yarımları, hazırlanmış bir slayt üzerindeki ara parçalar arasına yerleştirilmiş Hoechst ile bir damla temiz canlı görüntüleme ortamına dikkatlice aktarmak için forseps kullanın (Şekil 2C). Kanat disklerini, diseksiyon forsepslerinin bir bıçağını veya bir diseksiyon iğnesi tutucusuna bağlı ince bir tungsten tel kullanarak, diske bağlanan trakeanın ince dallarından nazikçe künt diseksiyon yaparak dokuların geri kalanından izole edin. Karkasın geri kalanını atın.
  6. Diseksiyon forsepslerinin bir bıçağını veya tungsten tel diseksiyon iğnesini kullanarak diskleri yönlendirin. Düzleştirilmiş gözyaşı damlası benzeri şekilleri nedeniyle, kanat diskleri DP veya PerM yukarı bakacak şekilde düşecektir. Bu protokol için, tüm diskleri PerM tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirin.
  7. Ortamı gerektiği gibi ekleyerek veya çıkararak, orta hacmi kuyuyu tamamen dolduracak şekilde, görüntüleme ara parçasının seviyesinin biraz üzerine ayarlayın. Her bir görüntüleme ara parçasının yarısının üst tarafından koruyucu desteği çıkarın ve ardından numunenin üzerine dikkatlice bir lamel indirin. Lamelin ara parçaya yapıştığından emin olmak için lamellerin görüntüleme ara parçalarına temas ettiği yere (örn. diseksiyon forsepslerinin yuvarlatılmış ucu ile) hafifçe bastırın.
    NOT: Orta seviye, hava kabarcıklarının sıkışmasını önlemek için ara parça yüksekliğinin biraz üzerinde olmalı, ancak lamel indirildiğinde önemli bir akış oluşturacak kadar yüksek olmamalıdır.

3. Görüntüleme

  1. 40x/1.30 NA yağa daldırma lensi ve mikroskopi yazılımı ile donatılmış konfokal mikroskop (GFP için 488 nm dalga boyuna sahip argon iyon lazer, Hoechst için 350 nm dalga boyuna sahip UV lazer) kullanarak oda sıcaklığında görüntü örnekleri. PerM'nin en yüksek seviyesinin hemen üstünden (Hoechst floresansının azaldığı yer) DP'nin bazal tarafına kadar uzanan ve genellikle yığın başına 100'den fazla görüntüye ulaşan 1 μm adım boyutuna sahip görüntü yığınları elde edin. Zaman atlamalı filmler oluşturmak için tekrarlanan görüntü yığınları elde edin.
    NOT: ~ 1-2 saatten fazla olmayan bir slayt görüntülüyoruz.
  2. Mikroskop yazılım ayarları için, 8 bit kodlama, 2 satır ortalaması, genellikle 650 ile 750 arasında dedektör kazancı ve sinyal sızıntısını azaltmak için ayrılmış kanal izleri kullanarak görüntüler elde edin. Tüm koşullar için, her koşul üzerinde önceden testler yapılarak önceden belirlenmiş aynı lazer ve dedektör ayarlarını kullanın.
    NOT: 40x büyütmede, görüntülerimiz μm başına 5.0386 piksel çözünürlüğe sahiptir (piksel boyutu: 0.1985 x 0.1985 μm2). Kurulumumuzda, optimum konfokal mikroskop ayarları, mümkün olduğunca fazla sinyal yakalamak için mümkün olan en yüksek lazer yoğunluğunu (dokuya zarar vermeden) içerirken, aynı zamanda çok az doygunluk sağladı veya hiç doygunluk vermedi; ve negatif kontrollerde değerlendirildiği gibi mümkün olan en düşük gürültü, dedektör ofsetinin ve alım hızının (gerekirse) azaltılmasıyla elde edilir. Genellikle %5'ten daha az lazer gücü ve maksimum tarama kafası hızı (Zen yazılım ayarlarında '9') kullanırız. Tek bir görüntü yığınının elde edilmesi genellikle ~ 1 dakika 45 saniye sürer ve zaman atlamalı analizler için her 2-3 dakikada bir görüntüler alınır.

4. Görüntü analizi

  1. ImageJ yazılım paketinin maksimum yoğunluk projeksiyon işlevini kullanarak proje yığınları ( resmin üzerine tıklayın | Yığınlar | Z projesi, menüden Maksimum yoğunluk'u seçin).
  2. MIP görüntülerinde, Çokgen Seçimi'ni kullanarak kanat diski katlama modeline göre (Hoechst kanalını kullanarak) kanat torbası alanını belirleyin. Clear Outside Function (Dıştan Temizle) fonksiyonu ile GFP kanalında aynı seçimi kullanın ( Düzenle | Dışını temizle) her dış piksel değerini 0 olarak ayarlamak için.
  3. MIP görüntülerinde, GFP görüntülerini temizlemek için Hoechst kanalını kullanın, özellikle ilgili piksel değerini 0 olarak ayarlayarak her iki kanalda görünen artefakt noktaları kaldırın ( Çokgen Seçimi'ne tıklayın, ardından Düzenle | temizle'ye tıklayın).
  4. Temizlenen MIP görüntülerinde Histogram işlevini kullanın ( Analiz Et | Histogram | Liste) tüm piksel değerlerinin listesini almak ve bir elektronik tablodaki bir tabloya kopyalamak için.
  5. Negatif kontrollerde arka plan sinyalinin analizine dayalı olarak bir eşik değeri ayarlayın (ve ardından diğer örneklerde doğrulandı; tartışmaya bakın).
  6. Aşağıdaki formülü kullanarak GFP-pozitif yüzey yüzdesini hesaplayın:
    %GFP-pozitif yüzey = figure-protocol-1 × 100
  7. Her bir değeri referans koşulunun ortalamasına (1 olarak ayarlanmış) bölerek sondaki verileri normalleştirin.
    NOT: Geçerli piksel = değeri 1 olan piksel≥ değeri 0 olarak ayarlanmış silinmiş pikselleri etkin bir şekilde yok sayar. 0 piksel değerleri doğal olarak oluşmaz.
  8. Sulandırılmış GFP sinyalinin disklerin neresinde lokalize olduğunu belirlemek için, disk epitelinin apikobazal eksenine bakmak için görüntü yığınlarının XZ-yeniden dilimlerini kullanın. Fiji'de enterpolasyon olmadan yeniden dilimlemeleri gerçekleştirin ve görünürlüğü artırmak için çift doğrusal enterpolasyonlu Ölçek işlevini kullanarak Z eksenindeki görüntü yüksekliğini artırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

DP ve PerM hücreleri arasındaki temasları ölçmek için GRASP prosedürünün kullanışlılığını test etmek için, dört farklı genotipin kanat disklerini inceledik: GFP kanalında yalnızca arka plan otofloresan seviyelerini gösterecek olan vahşi tip negatif kontrol diskleri (genotip: w1118); DP katmanında CD4-spGFP1-10'u eksprese eden, ancak tek başına GFP1-10 tarafından üretilen floresan seviyesini gösterecek olan CD4-spGFP11 transgeninden yoksun diskler (GFP1-10'un floresan26 olmaması...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Sitonemler, ligandların dağılımında, gelişmekte olan dokuların büyümesini ve organizasyonunu kontrol etmede önemli bir rol oynar. Sinyal alışverişi, sitonem uçlarının hedefleriyle yakın membran teması kurduğu yerde gerçekleşir. Bu protokolde, GRASP tekniğini kullanarak kanat diskindeki epitel tabakaları arasındaki sitonem aracılı temasları analiz etmek için basit bir yöntem tarif ediyoruz.

Burada sunulan teknik, en az dört bileşen gerektirir: bir GAL4 sürücüsü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan etmek için rekabet eden çıkarları yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Institut de Recherches Cliniques de Montréal Vakfı'ndan ve Montreal Üniversitesi Moleküler Biyoloji Programı'ndan doktora bursu alan DH'ye bir CIHR hibesi (PJT-162109) ile desteklenmiştir. Yazarlar, IRCM Mikroskopi ve Görüntüleme platformunun yardımını büyük ölçüde kabul etmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Discovery V12 diseksiyon mikroskobuZeissDiseksiyon Mikroskobu
Dumont #55 forseps, Biyoloji ipuçlarıGüzel Bilim Araçları11255-20diseksiyon forsepsleri
EP-Slik (slik20358)BDSC HakkındaPanneton ve ark. 2015 Slik'i ifade etmek için sinek suşu
FİJİSchindelin J. ve ark. (2012) Görüntü Analiz Yazılımı
Hoechst 33342 ThermoFisher BilimselH3570 canlı görüntüleme nükleer leke 
LexAop-CD4-spGFP11  BDSC Hakkında93018sinek gerginliği
LSM 700 konfokal mikroskop ZeissKonfokal mikroskop
nub-GAL4Bloomington Drosophila Stok Merkezi (BDSC)86108sinek gerginliği
PerM-LexARambaud, Joseph ve diğerleri, 2025sinek gerginliği
PYREX 9-çöküntü cam spot plaka satışıCorning Yaşam Bilimleri7220-85larvaları toplamak ve yıkamak için
Schneider'in Drosophila OrtamıThermoFisher Bilimsel21720024Canlı görüntüleme ortamı
SecureSeal görüntüleme aralıkları, 8-kuyu, 0.12 mm kalın Grace Biyo-Laboratuvarları654008Spacer
SYLGARD 184 silikon elastomer kitiSylgard3097358-1004diseksiyon plakaları yapmak için
UAS-CD4-spGFP1-10  BDSC Hakkında93017sinek gerginliği
Zen SiyahıZeissEdinme yazılımı

Kaynaklar

  1. Ng, J. K., Tamura, K., Buscher, D., Izpisua-Belmonte, J. C. Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development. Curr Top Dev Biol. 41, 37-66 (1999).
  2. Kornberg, T. B. Cytonemes and the dispersion of morphogens. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (6), 445-463 (2014).
  3. Daly, C. A., Hall, E. T., Ogden, S. K. Regulatory mechanisms of cytoneme-based morphogen transport. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 119(2022).
  4. Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs. Cell. 97 (5), 599-607 (1999).
  5. Hall, E. T., et al. Cytoneme delivery of Sonic Hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a Dispatched-BOC/CDON co-receptor complex. Elife. 10, e61432(2021).
  6. Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning. Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).
  7. Stanganello, E., et al. Filopodia-based Wnt transport during vertebrate tissue patterning. Nat Commun. 6, 5846(2015).
  8. Hall, E. T., et al. Cytoneme signaling provides essential contributions to mammalian tissue patterning. Cell. 187 (2), 276-293.e23 (2024).
  9. Zhang, C., Brunt, L., Ono, Y., Rogers, S., Scholpp, S. Cytoneme-mediated transport of active Wnt5b-Ror2 complexes in zebrafish. Nature. 625 (7993), 126-133 (2024).
  10. Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
  11. Wood, B. M., et al. Cytonemes with complex geometries and composition extend into invaginations of target cells. J Cell Biol. 220 (5), e202101116(2021).
  12. Gonzalez-Mendez, L., Seijo-Barandiaran, I., Guerrero, I. Cytoneme-mediated cell-cell contacts for Hedgehog reception. Elife. 6, e24045(2017).
  13. Du, L., Sohr, A., Li, Y., Roy, S. GPI-anchored FGF directs cytoneme-mediated bidirectional contacts to regulate its tissue-specific dispersion. Nat Commun. 13 (1), 3482(2022).
  14. Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624(2014).
  15. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) defines cell contacts and synapses in living nervous systems. Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).
  16. Yang, S., et al. Competitive coordination of the dual roles of the Hedgehog co-receptor in homophilic adhesion and signal reception. Elife. 10, e65770(2021).
  17. Patel, A., et al. Cytonemes coordinate asymmetric signaling and organization in the Drosophila muscle progenitor niche. Nat Commun. 13 (1), 1185(2022).
  18. Chen, W., Huang, H., Hatori, R., Kornberg, T. B. Essential basal cytonemes take up Hedgehog in the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144 (17), 3134-3144 (2017).
  19. Huang, H., Kornberg, T. B. Myoblast cytonemes mediate Wg signaling from the wing imaginal disc and Delta-Notch signaling to the air sac primordium. Elife. 4, e06114(2015).
  20. Hatori, R., Kornberg, T. B. Hedgehog produced by the Drosophila wing imaginal disc induces distinct responses in three target tissues. Development. 147 (22), dev195974(2020).
  21. Rambaud, B., et al. Slik sculpts the plasma membrane into cytonemes to control cell-cell communication. EMBO J. 44 (8), 2186-2210 (2025).
  22. Gibson, M. C., Schubiger, G. Peripodial cells regulate proliferation and patterning of Drosophila imaginal discs. Cell. 103 (2), 343-350 (2000).
  23. Gibson, M. C., Lehman, D. A., Schubiger, G. Lumenal transmission of decapentaplegic in Drosophila imaginal discs. Dev Cell. 3 (3), 451-460 (2002).
  24. Pallavi, S. K., Shashidhara, L. S. Egfr/Ras pathway mediates interactions between peripodial and disc proper cells in Drosophila wing discs. Development. 130 (20), 4931-4941 (2003).
  25. Pallavi, S. K., Shashidhara, L. S. Signaling interactions between squamous and columnar epithelia of the Drosophila wing disc. J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3363-3370 (2005).
  26. Pedelacq, J. D., Cabantous, S. Development and applications of superfolder and split fluorescent protein detection systems in biology. Int J Mol Sci. 20 (14), 3479(2019).
  27. Panneton, V., et al. Regulation of catalytic and non-catalytic functions of the Drosophila Ste20 kinase Slik by activation segment phosphorylation. J Biol Chem. 290 (34), 20960-20971 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Sitonem Aracılı TemasDrosophila Kanat DiskiCanlı GörüntülemeKonfokal MikroskopiSplit GFP SistemiPeripodial MembranDoku Büyüme SinyalizasyonuProtein Ekspresyonu
Canlı Drosophila Wing Hayalinal Disklerde Sitonemlerin Aracılık Ettiği Hücre-Hücre Temasını Değerlendirmek için GFP Tamamlama Tabanlı Çift İfade Sistemi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.