Method Article

Hasta Sare Retinasında Mikroglia Dinamikleri ve Sinapslarla Etkileşimlerin Canlı Görüntülemesi ve Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/68420

⸱

January 16th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of California, San Francisco, 2Jules Stein Eye Institute, University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, retinadaki postsinaptik nokta ve mikroglia hareketliliğini görselleştirme ve nicelleştirme yöntemini spinning disk konfokal mikroskopisi kullanarak göstermektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglia, merkezi sinir sisteminin (CNS) doku enfeksiyonu ve hasara yanıt veren yerleşik makrofajlarıdır. Mikroglia, enflamasyondaki rollerinin yanı sıra, sinaptik budama yoluyla devrelerin incelenmesinde gelişimsel bir rol oynar. Ancak, nöroinflamasyon ve nörodejenerasyonda sinaptik budama mekanizmaları bilinmemektedir. Bu protokolde, mikroglia dinamiklerini ex vivo incelemek için fare retina explant modeli kullanıyoruz. Mikroglia hareketliliğini ve postsinaptik proteinlerle etkileşimlerini incelemek için, sinapsları AAV-PSD95-RFP ile etiketlemiş ve dönen disk konfokal mikroskopisi kullanarak postsinaptik proteinlerle kolokalize edilmiş hareketli mikrogliaların timelapse videolarını kaydediyoruz. Daha sonra görüntü analiz yazılımı kullanarak mikroglia ve PSD95'in yüzey ve nokta rekonstrüksiyonlarını oluşturuyoruz. Mikroglia yer değiştirme süresi, işlem hızı ve postsinaptik noktalarla temas gibi veriler bu yüzeylerden çıkarılarak hem homeostatik durumlarda hem de nöronal hasar sonrası mikroglia davranışını anlamak mümkündür. Bu protokol, retina nörodejeneratif hastalıklarında mikroglia'nın sinaptik budamadaki rolünü incelemede faydalı olabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Devre fonksiyonu ve homeostaz, çeşitli hücre tipleri arasında yüksek derecede düzenlenmiş sinaps ateşlenmesi ve diğer benzersiz etkileşimleredayanır. 1. Merkezi sinir sisteminin (CNS) yerleşik makrofajları olarak hizmet veren mikroglia, retinada bulunan ve sinaptik budama sırasında benzersiz bir rol oynayan nöronal olmayan bir popülasyondur. MSS gelişimi sırasında, mikroglia fonksiyonsuz veya zayıf sinapsları budamak için sinirdevrelerini 2 arındırır. Gelişen beyindeki mikroglialar çevrelerini inceler ve kritik dönemlerde nöroprotektif bir rolehazırlanırlar 3. Görsel sistem gelişiminde, mikroglia, kortikal nöronlar ve internöronların gelişiminde kilit düzenleyicilerdir; ayrıca sinaptik yeniden modellenmenin kritik dönemlerinde morfolojik değişikliklergösterirler 4. Benzer şekilde, gelişmekte olan retinada, mikroglia apoptotik hücreleri temizleyerek yeni sinaptik bağlantılara yol açar; bu, bu temizlenme olayları sırasında homeostatik belirteç P2Ry12'nin yukarı regulasyonu iledoğrulanır 5. Ancak, son bulgular, mikrogliyanın gelişmekte olan görme sistemindeki sinir devresinin geliştirilmesinde kesin bir roloynamayabileceğini vurgulamaktadır ve mikroglia'nın görsel devre gelişimindeki rolü konusunda tartışmalar olduğunu vurgulamaktadır.

Yaralanma bağlamında, mikroglia morfolojisini aktif bir duruma dönüştürür ve nörodejeneratif bir rol oynayabilir. Örneğin, Alzheimer hastalığı modellerinde mikroglia, amiloid-betaplakları 7 ve SPH ile PSD958 gibi sinaptik belirteçlerin artan yutulmasını göstermiştir. Retinal nörodejenerasyonda, birçok araştırma grubu sinaptik materyalin yutulduğu mikroglia bulmuş, ancaksağlam sinapslar 9,10,11,12,13'ün aktif yutulmasına dair net bir kanıt bulunmamıştır. Örneğin, He ve ark. retinitispigmentosa 9 modelinde mikrogliaların sayısının arttığını ve içine kaplanmış sinaptik madde hacminin arttığını bulmuştur, ancak sağlam sinapsların fagositoz ile döküntü temizleme olup olmadığı net değildir. Ayrıca, geleneksel mikrogliyal sınıflandırmalar — örneğin "dinlenme vs. aktif" veya "M1 vs. M2" — modern içgörülerse aşırı basitleştirilmiş ve giderek daha yanlış bir şekilde değişiyor. Mikroglialar, ayrı kategoriler değil, durumlar gradyanındabulunur 12. Bu nedenle, Paolicelli ve ark. mikroglia morfolojisini ve aktivitesini daha iyi anlamak ve tanımlamak için eski ikili sınıflandırmalardan mikroglial durumlar için daha incelikli, titiz tanımlanmış bir isimlendirmeye geçişçağrısında bulunmuşlardır 12. Bu nedenle, mikroglia fonksiyonunu ex vivo ve in vivo değerlendirme stratejileri, hem gelişim hem de hastalık bağlamında mikroglia durumlarını ve aktivitelerini ayırt etme yeteneğini artıracaktır.

Mikroglia fonksiyonunu hem ex vivo hem de in vivo incelemek için stratejiler mevcut olsa da, ex vivo canlı görüntülemenin birçok faydası vardır. Birincisi, kornea berraklığı veya katarakt gelişimi retina görüntülemeyi engellemez; böylece küçük süreçlerin ve sinaptik noktaların net görselleştirilmesini sağlar. Ayrıca, in vivo görüntüleme kurulumu için daha fazla teknik beceri gerektirir; bu da ex vivo hazırlıkları daha yüksek verimlilik gerektirir ve her deney başına daha fazla hayvanın görüntülenmesini sağlar. In vivo görüntülemenin sağlayabileceği teorik faydalara rağmen, boylamasına görüntüleme için mikroglia süreç hareketliliğini yakalamak için yüksek lazer gücü (100-230 μW) gereklidir 14,15. Ancak, daha düşük lazer gücü ve yeterli görüntüleme ortamıyla mikrogliaların ex vivo görüntülemesi, doğru hazırlıkla in vivo görüntüleme kalitesiyle aynı görüntüleme kalitesini sağlayabilir, ancak doku artık yerinde değildir.

Mikroglia'nın geçici göz içi basıncı (IOP) yükselmesinden sonra sayı, karmaşıklık ve süreç hareketinin arttığınıgösterdik 10. Sabit dokuda bu mikrogliyoz, sinaptik proteinlerle artan kolokalizasyonayol açar 10. Önceki çalışmalar ayrıca, sare lazerle indüklenen göz hipertansiyonu modelinde (LIOH) ve diğer nörodejeneratifmodellerde (10,16,17,18,19,20) retinal ganglion hücrelerinin (RGC) erken sinaps kaybı ve dendrit dejenerasyonu göstermiştir. Ancak, sinapsların budamasında aktif bir rol oynayıp oynamadıkları yoksa sökülmüş sinapslar da dahil olmak üzere hücresel kalıntıların temizlenmesinde daha pasif bir rol oynadıkları hâlâ bilinmemektedir. Sinaps parçalanmasının nörodejenerasyonun erken bir özelliği olduğundan, mikroglia dinamiklerini ve sinaps parçalanmasındaki rollerini anlamak kritiköneme sahiptir 8,10. Burada, mikroglia dinamiklerini ve RGC'lerin dendritleri üzerindeki uyarıcı postsinaptik yoğunluk protein-95 (PSD95) ile etkileşimini anlamak için canlı görüntüleme kullanıyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanlar, California Üniversitesi, San Francisco'da 12 saat ışık ve 12 saat karanlık ışık döngüleri altında tutuldu ve belirtilmedikçe su ile standart diyet verildi. Tüm prosedürler, Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco'daki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı. Bu protokolde kullanılan malzemeler ve aletler için Malzeme Tablosu'na bakınız. Deneysel prosedürün genel bir özeti, intravitreal enjeksiyondan görüntüleme ve analize kadar Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. AAV-PSD95-TagRFP virüs üretimi ve verimliliği

  1. PSD-95pTagRFP dizisini alarak AAV-PSD95-tagRFP oluşturun (Addgene plazmid #52671; RRID:Addgene_52671) ve GFP çıkarıldıktan sonra CMV promotorunun aşağısına AAV-CMV-GFP'ye yerleştirildi (Addgene plazmid #67634; RRID: Addgene_67634).
  2. Virüs üçlü transfekte edilmiş HEK293T ile hazırlanır, PEG/kloroform ile arıtılır ve 1012 ip/mL titr ile konsantre edilir (Negrini ve ark. tarafından tanımlandığı gibi).21.
    NOT: Bu viral üretim yöntemi genellikle ultrasantrifüjasyondan daha düşük bir titer üretir, ancak bu deneyler için seyrek enfektehücrelere sahip olmak arzu edilir 21. Bu deneylerde kullanılan kapsid/serotip versiyonu 7m8 idi (Addgene plazmidi # 64839; RRID: Addgene_64839).
    1. Tam görüntüleme protokolüne geçmeden önce AAV'nin verimliliğini test edin.
      NOT: Bu protokolü uygulayan okuyucular, RGC'lerin seyrek etiketlenmesini hedeflemelidir; çünkü amaç bireysel RGC dendritlerini tespit etmek ve izole etmektir.
  3. Başarılı transfeksiyonu doğrulayın ve ardından retinayı 1x ACSF'de %2 PFA ile sabitleyin. Sinaptik proteinler için, floresan etiketlemenin net çözünürlüğünü doğrulamak için sinyali konfokal mikroskop altında 63x hızında kontrol edin.
    NOT: Fiksasyonun daha hafif konsantrasyonu, sinaptik proteinlerin etiketlenmesini korumaya yardımcı olur. Kullanılan AAV sinaptik bileşenler için değilse, okuyucular %4 PFA kullanmayı tercih edebilir.

2. Fare yetiştiriciliği ve AAV-PSD95-TagRFP intravitreal enjeksiyonları

  1. Erkek ve dişi CD-1 albino fareleri (süst 022) B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J (sır 005582) ile çapraz olarak CD-1 albino fareleri üreterek EGFP eksprese eden mikroglia ile CD-1 albino fareler ürettiler. Erkek ve dişi Cx3cr1 heterozigot fareleri deneylerde kullanmak için en az dört nesil geri çaprazlama bekleyin. Genetik sürüklenmeyi önlemek için 10 nesil sonra suşu CD-1 arka planına geri getirin ve yenileyin.
  2. Hayvanları (P30-P60) izofloran anestezisi ile indüksiyon odasında, %3-5 anestezik kullanarak oksijende 1 L/dakika oksijen akışında anestezi edin. Hayvanı stereomikroskopa koyun, izofluranın sürekli olarak burun koni üzerinden verildiğinden emin olun. Hayvanın anestezi altında olduğunu doğrulamak için, parmağını en az 3 kez sıkıştırarak doğrulayın.
  3. AAV enjeksiyonundan önce %0,5 proparakain damlatması ekleyin. 2 μL AAV-PSD95-RFP'yi süperotemporal limbüste her iki göze yavaşça intravitreally olarak 26s G 10 μL enjekte ederek 26s G 10 μL şırınga ile enjekte edin. İğneyi yavaşça çıkarın, böylece AAV'nin enjeksiyon bölgesinden geri akmasını önleyin. Enjeksiyondan sonra gözlere antibiyotik merhem uygulayın.
  4. NOT: İğne, vitreus odasının çevresinin yarısından fazla geçmemelidir. Bunu yaparak, iğne ucu retina ve lens zarar görebilir, bu da yamalı veya başarısız bir transfeksiyona yol açabilir. Katarakt gelişimi veya kanaması, hatalı enjeksiyon tekniğinin göstergesidir.
  5. Enjeksiyondan sonra, hayvanların uyanık olduğundan emin olun ve onları orijinal kafeslerine ve barınma odalarına geri götürün. Bir hayvanda enjeksiyon sonrası ağrı varsa, buprenorfin intraperitoneal enjeksiyonla uygulanır. AAV ifadesi için 3 hafta bekleyin. Göz içi basıncı yükseltmek (veya başka manipülasyonlar yapmak için indüklenebilir bir model kullanılıyorsa), kontrol olarak karşı taraf göz veya saf bir hayvanın gözlerini kullanarak bir gözde yüksek göz içi basıncı indükten önce 3 hafta bekleyin.

3. Ötenazi ve retinal düz montaj

  1. 1x PBS'de yapay beyinomurilik sıvısı (ACSF, pH 7.4) yeni bir çözelti hazırlamak için şu bileşenleri mM içinde içermektedir: 119 NaCl, 2.5 KCl, 1.3 MgCl2·6H2O, 2.5 CaCl2·2H2O, 1NaHPO 4, 11 glikoz ve 20 HEPES).
  2. Akut diseksiyon için kullanılmadan önce çözeltiyi en az 15 dakika oksijenlendirin. Boruyu oksijen tankına bağlayın ve gazın kaçmasını önlemek için ortasında delik bulunan bir kapak yerleştirin.
  3. Fareyi küçük bir indüksiyon odasında en az 1 mL izofloran anestezi ile ötenazi edin, ardından servikal dislokasyon uygulanır. Korneanın burun tarafını enülasyondan önce bir işaretleyiciyle işaretleyin ki retina konumu deney boyunca takip edilebilsin.
    1. Mikroboncuklu enjekte edilen veya lazerlenmiş gözleri enukleasyon yapmak için sınırlı konjonktival peritomi yapın ve makası gözün arkasına yerleştirerek gözün optik sinirin tabanından disseksiye edilmesini sağlar. Bu, hassas gözün sağlam kalmasını sağlar.
  4. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, korneaya 23 G veya 25 G iğneyle küçük bir delik açın; böylece oksijenli ACSF göze perüze geçebilir. Bu deliğe makas yerleştirerek burun ucunda bir güven kesimi yapın.
  5. Kornea ve irisin geri kalanını limbus'ta kesin.
  6. İris ve merceği çıkarın. Retina lense yapışıyorsa, forsepsle ayırın.
  7. Retinayı skleradan ayırın; forseps kullanarak RPE ile sinir retinası arasında nazikçe ayrıştırın.
  8. Retinayı, net görselleştirme ve görüntüleme için Karışık Selüloz Esterleri (MCE) membran filtre kağıdının ızgarasız tarafına yerleştirin.
  9. Retinanın diğer üç kvadrantında küçük rahatlatıcı kesikler yapın; en uzun kesik burun retinasında retina konumunu takip etmek için kullanılır.
    NOT: Retina dört yapraklı yonca gibi görünmelidir.
  10. Retinayı filtre kağıdından laboratuvar mendiline aktarın. Retinayı nemlendirmek için bir damla ACSF kullanın, ardından mendil ile filtre kağıdını kurutun. Retinanın filtre kağıdına yapışması için en az 8-10 damla tekrarlayın.
  11. Retinayı oksijenleyici bir odaya yerleştirirken karşı taraf gözü disseksiye yapın.
  12. Görüntülemeye hazır olunca, 3.10. adımda belirtildiği gibi filtre kağıdını kurutun ve retinayı Matek Petri kabına ters çevirin. Retinayı ya metal boncuklarla ya da bir halka ile ağırlıklandırın. 3-5 damla ACSF ekleyin.
    NOT: Metal boncuk banyosu veya halkadan elde edilen küçük metal boncuklar, retinanın bütünlüğünü bozmadan kaymayı önleyecek kadar büyük ve ağırlığa sahiptir.
  13. Bir halka yaparak çelik tel ve gerilmiş naylon telleri alıp yapıştırıp ağırlık ekleyerek sabit, gergin paralel tellere sahip bir yüzük elde edin.
    1. Teli 1/2 inç çapında bir silindirin etrafına sarın ve penseyle sıkıca çekin. Her halkayı silindirden kesin ve bir mengene arasında düzleştirin.
    2. Yüzünün bir yüzünü zımparalayın, pürüzlü ve düz bir taraf elde edin. 1-2 inç çapında bir şişenin açıklığına naylon teller gerin ve lastik bantlarla yerinde tutun.
    3. Yüzüğü naylon tellerin üzerine yerleştirin ve yüzüğün iç çevresine az miktarda yapıştırıcı uygulayarak naylon tellere dikkatlice yapıştırın. Daha sonra, halkayı yerinde tutmak için hafif bir ağırlık yerleştirin, örneğin bir madeni para veya ince metal tel.
    4. Kuruduktan sonra, naylon ipleri halkanın dış kenarından hassas makasla kesin. Sonuç olarak, sabit, paralel teller halkanın çapını gergin bir şekilde uzatır.
    5. Eğer naylon ip yoğunluğu halka içinde çok yüksekse, deneyin ihtiyaçlarına uygun olarak mikrodiseksiyon yaylı makasla ipleri ayrı kesin.
      NOT: Diseksiyon ve montaj işlemi sadece ~5 dakika sürecektir. Dokunun ex vivo dengeli fizyolojik koşullara yerleştirilmesi ne kadar hızlı sürerse, doku o kadar sağlıklı olur.

4. Dönen disk konfokal edinimi

NOT: Nem kamerasını %5CO2 ile açın ve görüntülemeden önce en az 1 saat çalıştırın. Sistem ve örneğin termal dengeye ulaşmasına izin vermek, kaymayı azaltmaya yardımcı olur.

  1. Mikrogliyaya odaklanmak için okulluk cihazını 10x hızda taramaya başlayın. Dokuyu görüntüleme alanları için tararken mikroglia kanalını referans olarak kullanın ve yalnızca parlak sinaptik nokta kolokalize olan mikrogliyalara odaklanın (10-20 μm içinde). AAV etiketleme doku genelinde homojen olmadığından, hem mikroglia hem de noktanın aynı düzlemde kolokalize olduğu alanları tarar. Bu kriterlere uygun bir alan bulunduktan sonra, odaklamak için 60x'e geçin ve kamera düğmesine tıklayarak kamera moduna geçin.
    1. Görüntüleme sistemi yazılımını kullanarak ekrana sağ tıklayarak xy-navigasyonunu bulabilirsiniz. Dokuyu 3 x 3, 5 x 5 çerçeve veya en uygun alanlar için özel bir boyut oluşturarak tarama yapabilen bir önizleme ekranı ortaya çıkar. 3 x 3 veya 5 x 5 kare boyutunu ve ekranını tek bir referans kanalı ile kullanarak sürekli fotobeyazlamayı önleyin.
      NOT: Bu protokol için mikroglia kanalını kullandık.
  2. Monte edilmiş retinayı hemen 60x objektif (NA 1.49) içeren dönen disk konfokal mikroskobu ile görüntüleyin.
  3. Örneği önizlemek için ekrana sağ tıklayın, Canlı seçeneğini seçin ve otomatik ayarlama düğmesine tıklayın; böylece sistem mevcut LUT'lara göre görünümü ayarlayabilir. Lazer ayarlarını ayarlamak için önce her kanalı ayrı ayrı seçin ve gerektiğinde lazer gücü ile pozlamayı ayarlayın. Sonra, yazılım başka kanala geçtiğinde kaydetmediği için florofora sağ tıklayarak Ayarları Mikroskopa Atayın ve özel ayarları kaydedin.
    1. Bir sonraki kanala geç ve gerektiğinde ayarlama yap. Ayarları kaydetmek için florofora sağ tıklayın. Aynı çerçevede birden fazla kanal ediniyorsanız, her kanalı ayrı ayrı ön izlemeden sonra kullanılan aynı değerleri girin. Ayarları kaydetmek için florofora sağ tıklayın.
    2. Çok kanallı satın alma için, Lambda sekmesi altında ilgi çekici kanalları seçin. Canlı görüntüleme için, ilgi duyulan hücreden ince hareketin hızlı yakalanması için tüm kanalları tek bir kanala birleştirerek her kanalın ayrı ayrı değil, aynı anda alınmasını sağlar; bu da hücrenin hızına bağlı olarak zaman geçişinde gecikme yaratabilir.
  4. İstenilen süre için bir timelapse almaya devam edin.
    1. Sol alt köşedeki zaman sekmesinde, 20 saniyelik aralıklı 5-10 dakikalık zaman geçişi girin.
    2. Sağdaki Acquisition settings sekmesinde, görüntü çözünürlüğünü 608 x 832 olarak ve piksel boyutunu 0.12 μm olarak ayarlayın.
    3. Z-ekseni boyunca ince mikroglia süreçleri ve sinaptik noktaların kabul edilebilir çözünürlüğünü sağlamak için 0,3 μm adım boyutu kullanarak 10 - 20 μm boyutunda görüntüler toplayın. Hücre takibi başarılı olmak için çerçeveler arasındaki zaman aralığını 20 - 30 saniye olarak tutun.
      NOT: Dokunun ex vivo kırılganlığı nedeniyle, deneysel retinanın önce görüntülenmesi ve bir saatten fazla olmamalıdır. Bu, kontralateral kontrol gözünün durumunu normalleştirmek içindir; göz oksijenli bir odada otururken ilk retinanın görüntülenmesi gerekir.
  5. Bu protokolü retinanın daha yüzeysel katmanlarını görüntülemek için kullanın. 20 μm'den büyük zaman geçişleri elde edildiğinde, 20 saniyelik aralıklarda ince işlem hareketini yakalamak daha zor hale gelir. Bu nedenle, sadece 20 μm yığına sığan görüntü mikrogliyaları var.

5. Analiz ve veri ihracatını takip etmek

  1. Mikroglia için yüzey renderasyonu
    1. Timelapse dosyasını dosya dönüştürücü yazılımını kullanarak IMS formatına dönüştürün. 4.2. adımdan elde edilen görüntü özelliklerine göre aşağıdaki voxel boyutlarını girin: x = 0,1272423 mikron, y = 0,1272423 mikron, z = 0,3 mikron.
    2. Başlatıldığında, analiz yazılımı Arena'da başlayacak. Daha önce dönüştürülmüş dosyayı açmak için Observe klasörüne tıklayın. Görüntünün 3D görünümde olduğundan emin olun.
    3. Tüm bireysel mikrogliaları tespit etmek için, Object Toolbar'daki mavi yüzey simgesine tıklayın. Algoritma ayarları altında son üç seçeneği seçin: Yüzeyleri İzle (Zamana Göre), Yüzeyleri Sınıflandır ve Nesne-Nesne İstatistikleri. Bir sonraki adıma geçmek için mavi oynatma düğmesine tıklayın.
      1. Birden fazla mikroglia durumunda, tek bir yüzey nesnesi içinde bireysel mikrogliaların bulunduğundan emin olmak için sadece bir ilgi alanı (ROI) segmentini seçin. X , y ve z parametrelerini buna göre ayarlayın, sadece ilgilenilen bireysel mikrogliaların bir yüzeyini oluşturun.
    4. Yüzey renderinginin oluşturulacağı kanalı seçin. İsterseniz, yüzey yaratımı düzgünleştirmek için Smooth seçin ve görüntünün voxel boyutuna 1:1 - 1.25 oranı kullanın. Örneğin, görüntünün voxel boyutu 0.12 x 0.12 x 0.3 μm ise, yüzey detayını 0.15 - 0.16 μm olarak ayarlayın. Eşik altında, yazılımın ilgi duyduğunuz hücreleri tespit etmesini öğretmek için Makine Öğrenimi Segmentasyonu'nu seçin.
      NOT: Bu sonraki adım, Makine Öğrenimi Segmentasyonu yoluyla eğitim verilerini Imaris AI'ya aktarmaktır.
    5. Eğitim Verileri altında, iki fırça aracını gözlemleyin: Arka plan (arka planı tespit etmek için) ve Ön Plan (örneğin gerçek sinyalini tespit etmek için). İstediğiniz fırçayı seçip Shift + Sol tıklama tuşlarıyla fırça darbeleri çizin. Ayarlar altında Interpolate Display'in seçildiğinden emin olun. Yapılan fırça darbelerinden eğitim verilerini girmek için Eğit ve Tahmin seçeneğini seçin.
      NOT: Altı darbeden fazla beslemek, yapay zekanın işlem süresini uzatır ve hücrenin yanlış yakalanmasına yol açar.
      1. Ortadaki sarı işareti kullanarak z-stack boyunca hareket edin. X, y ve z düzlemleri boyunca ve ayrıca timelapse'ın birkaç (hepsi değil) zaman diliminde birden fazla fırça darbesi çizin. Her giriş için 3-5 kısa fırça darbesi yapın, çünkü yapay zeka en iyi şekilde küçük bilgilerle öğrenir. Bu adımı her girişte yinelemeli olarak ayarlayın, ta ki hücrenin doğru bir yüzeyi oluşturulana kadar.
      2. Eğitim ekranı ile son kontrol olarak oluşturulan gerçek yüzey arasında geçiş yapmak için sarı dikdörtgeni seçin. Ayrıca zaman geçişi boyunca yüzeyin hücreyi doğru temsil ettiğini kontrol edin.
    6. Doğru yüzey renderasyonu sağlandıktan sonra bir sonraki adıma geçin. Bölünmüş nesneleri seçmeden çıkar.
    7. Histogramdaki voxel sayısını ayarlayın. Eşiği ana yüzeye bağlı olmayan küçük nesneleri kaldıracak şekilde hareket ettirin.
      NOT: Bu adım, arka plan gürültüsü nedeniyle oluşan küçük istenmeyen yüzeyleri kaldırmak için kullanılır. Amaç, ilgilenilen ana hücre gövdesine bağlı olmayan yüzeyleri kaldırmaktır.
    8. Sonra, yüzeyi gerektiği gibi düzenleyin. Ana yüzeyin parçası olmayan nesneleri veya kesilmiş kenarları makas aracıyla manuel olarak temizleyin.
    9. İstenerseniz, nesneyle ilişkilendirilebilecek bir boşluk eşiği belirleyin. Hareket eden hücre için takip algoritmasını seçin.
      NOT: Otoregresif hareket, hücre takibi için en yaygın kullanılan araçtır, çünkü timelapse boyunca sürekli hareketi takip eder.
      1. Maksimum mesafe ve maksimum boşluk boyutu, yüzeyin sapabileceği önemli noktaları belirleyen kullanıcı tarafından tanımlanmış sayılardır. Maksimum boşluk mesafesini 0.96 μm ve maksimum boşluk büyüklüğünü 3 olarak (varsayılan ayarlar) ayarlayın.
    10. Yüzey nesnelerinin 5.1.7. adımda filtrelendiği gibi, ana yüzeyle ilişkili olmayan izleri filtreler. Bu da histogramla ayarlanır. Eşik noktasının nereye ayarlanacağını belirleyin; filtre ayarlarından beş zaman diliminden fazla sürmeyen küçük nokta izlerinin ne zaman kaldırıldığını arayın.
    11. Sonra, isterseniz sınıflandırmalar oluşturun. Örneğin, küçük süreç hareketini veya önemli ölçüde büyük süreç veya hücre yer değiştirmesini belirlemek için 0 - 1 μm ile 1+ μm arasında yer değiştirme uzunluğunu kategorize edin.
    12. Son olarak, önceki adımdaki sınıflandırmaları kullanarak belirli olaylara uygun etiketler yerleştirin.
      NOT: Bu adım, postsinaptik sinyal için noktalar oluşturulduktan sonra en iyi şekilde kullanılır.
  2. PSD95 için spot sınıflandırma
    1. Tüm bireysel mikrogliaları tespit etmek için, Object Toolbar'daki mavi yüzey simgesine tıklayın. Algoritma ayarları altında son üç seçeneği seçin: Yüzeyleri İzle (Zamana Göre), Yüzeyleri Sınıflandır ve Nesne-Nesne İstatistikleri. Bir sonraki adıma geçmek için mavi oynatma düğmesine tıklayın.
    2. Sinaptik işaretleyici için kaynak kanalı seçin. Dilimleyiciyi ve diğer kanalları kapatıp sadece PSD95'i görselleştirin. Ctrl düğmesini ve işaretçi seçim aracını kullanarak noktanın xy çapını tahmin edin.
      1. Zaman geçişi boyunca dayanan birkaç parlak nokta seçin ( boyutları 0.6 μm ile 1.2 μm arasında değişiyor).
      2. Arka plan çıkarmayı kapatın. Eğer görüntü arka plan çıkarma gerektiriyorsa, zaman geçişi işlemeden önce Görüntü İşleme altındaki arka plan çıkarma aracını kullanın.
    3. Sonra, spot kalitesine göre bir filtre ekleyin. Histogramı sürükleyin ki tüm PSD95 noktaları timelapse boyunca doğru şekilde yakalansın.
      NOT: Kalite, nokta9'un merkezinin yoğunluğuna bağlıdır. Bu filtre, PSD95'in gerçek sinyalini, voxel filtresi veya çaplı filtre sayısına kıyasla en doğru şekilde yakalar.
    4. Sonra, gürültüden oluşan noktaları düzenleme adımıyla kaldırın. Kübe imleci veya daire imleci arasında geçiş yaparak, sırasıyla tek veya birden fazla nokta çıkar, bunlar sadece 1-2 zaman diliminde gürültü nedeniyle ortaya çıkar.
    5. İstenerseniz, nesneyle ilişkilendirilebilecek bir boşluk eşiği belirleyin. Sinaptik belirteç için uygun takip algoritmasını seçin.
      1. Maksimum mesafe ve maksimum boşluk boyutu, lekelerin sapabileceği önemli noktaları belirleyen kullanıcı tarafından tanımlanan sayılardır. Maksimum boşluk mesafesini 14,6 μm ve maksimum boşluk büyüklüğünü 3 olarak ayarlayın (varsayılan ayarlar).
    6. Nokta nesnelerin 5.2.3 adımında filtrelendiği gibi, farklı noktalarla ilişkilendirilmeyen izleri filtreler. Bu da histogramla ayarlanır. Eşiğin nereye ayarlanacağını tanımlamak için, küçük nesne izlerinin ne zaman kaldırıldığını arayın.
    7. İsterseniz sınıflandırmalar oluşturun. Örneğin, yutulmuş, temas edilen veya temas edilmemiş noktaları Yüzeye En Kısa Mesafe sınıflandırması kullanarak ayırt edin. Yüzey içinde 0 μm < herhangi bir nokta olarak kaplanmış halde, yüzeyden 0 ila 0,5 μm arasında temas edilse veya yüzeyden 0,5+ μm kadar temas edilmemiş olarak yerleştirilir.
    8. Son olarak, önceki adımdaki sınıflandırmaları kullanarak belirli olaylara uygun etiketler yerleştirin.
  3. Yüzeyler ve noktalar ilgi çeken mikroglia ve noktayı doğru şekilde temsil ettiğinde, her nesneden tüm istatistikleri istatistikler sekmesi altına aktarın. Detaylı istatistiklerin çıkarıldığından emin olun; bunlar yer değiştirme süresi, hız ve temas olaylarını gizli olarak kapsamaktadır.
    1. Alan, hacim, yer değiştirme uzunluğu ve hız gibi birçok istatistik, Imaris'ten alınmıştır. Deneyde mikroglia dinamiklerini tanımlamak için yüzey yer değiştirme uzunluğu ve hızını dışa aktarın.
      1. Yer değiştirme uzunluğunu, yüzeyin başlangıç konumu ile son konum arasındaki mesafe olarakμm 22 cinsinden ölçülür.
      2. Hızı, yüzeyin bir zaman aralığından diğerine μm/s 22 cinsinden ölçülen anlık hızı olarak tanımlayın.
        NOT: Temas olayları, yazarlar tarafından zaman geçişi içinde en az beş tutarlı zaman diliminde bireysel mikroglialar arasında 0 μm mesafe paylaşan sağlam postsinaptik noktalar olarak tanımlanan bir olgudur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CX3CR1-GFP sare retinalarından mikrogliya, tarif edilen protokol kullanılarak görüntülendi. AAV-PSD95-RFP enjeksiyonu sırasında farelerin değeri P30 ile P60 arasında değişiyordu ve AAV ekspresyonu için en az 21 gün geçmişti. Mikroglia ve PSD95 puncta ile etkileşimlerinin analizden önce ve sonrası temsil eden görüntüleri Şekil 2'de gösterilmiştir. Mikroglia aktivasyonunu indüklemek için, sare lazerle indüklenen göz hipertansiy...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, RGC'lerin dendritleri boyunca postsinaptik bölgelerle bireysel mikroglia etkileşiminin görselleştirilmesi ve izlenmesini sağlar. Glokom gibi nörodejeneratif bir hastalıkta, mikroglia retinanın iç pleksiform tabakasındaki (IPL) sinapslarla birlikte kolokalize olur. Mikroglia'nın sinaps sökümlemedeki rolü tam olarak anlaşılmamıştır. Ancak, mikroglia, anormal olarak sinapsları yutma, apoptoz hücrelerden pasif olarak döküntüleri temizleme veya bu mekanizmaların birleşimi gibi bi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PSD-95pTagRFP, Johannes Hell'den (Addgene plazmid #52671; RRID: Addgene_52671), kapsid versiyonu ise 7m8 John Flannery ve David Schaffer (Addgene plazmid #64839; RRID: Addgene_64839). Laboratuvarlarının dönen disk mikroskobunu kullanmamıza izin verdiği için Aparna Lakkaraju'ya ve canlı görüntüleme konusunda rehberlik için Nilsa La Cunza'ya teşekkür etmek isteriz. Ayrıca bu el yazması hakkında faydalı tartışmalar ve yorumlar için Felice Dunn, Annika Balraj ve Luca Della Santina'ya teşekkür etmek isteriz. Suling Wang'a Imaris hakkında veri analizinde yardım ettiği için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, NIH-NEI EY028148 ve Y.O.'ya EY034973, Y.O.'ya ARVO David L. Epstein ödülü ve NIH-NEI EY034973-S1 to C.F. tarafından finanse edilmiştir. Bu araştırma, kısmen NIH-NEI P30 EY002162/EY037668'nin UCSF Vision Core ortak kaynağı ve New York, NY'deki Research to Prevent Blindness tarafından sağlanan sınırsız bir hibe ile desteklenmiştir. Şekil 1 biorender.com'de oluşturulmuştur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
25 Gauge İğneAlcon8065420920
26s Gauge 10 & mikro; L ŞırıngeHamilton701RNWG
7m8Addgene64839http://n2t.net/addgene:64839
Bükülüp Kalın-Kalınma Çok Amaçlı 304 Paslanmaz Çelik TelStanford İleri MalzemelerSS3368Halka yapmak için çelik tel
Kalsiyum klorür heksahidratSigma-AldrichC5080-500G
Diseksiyon MikroskobuAmscopeRetinaları disseksiye etmek ve monte etmek için
Diseksiyon MakaslarıFST15024-10
D-(+)-GlikozSigma-AldrichG7528-250G
ForsepsDumont11252-21
HEPESSigma-AldrichH3375-500G
Imaris 10.0.2Oxford InstrumentsAnaliz yazılımı
Imaris Dosya DönüştürücüOxford Instruments
Loctite Süper Yapıştırıcı Ultra Jel KontrolüLoctite1363589Halka yapmak için yapıştırıcı
Magnezyum klorür heksahidratSigma-AldrichM9272-100G
MCE Membran filtre kağıdı (13 mm)MilliporeHABG013000.45 μ m Gözenek Boyutu
Mikroçevre OdasıTokai HitSTXG-TIZBX-SET
Nikon Eclipse Ti2-E ters mikroskopNikon
NIS UnsurlarıNikon
Neomisin ve Polimiksin B Sülfleri ve Bacitracin Çinko Oftalamik Çözelti Merhem, USPBausch + Lomb24208-780-55
Fırça Boyutu 00Amazon
Prism 8.0GraphPad
Proparakain Hidroklorür Oftalmik Çözelti USP, %0,5Sandoz61314-0016-01
PDL kaplamalı petri kabı (35 mm)MatekP35GC-1.5-14-CNo 1.5 Coverslip
PSD95_pTagRFPAddgene52671http://n2t.net/addgene:52671
Potasyum klorürSigma-AldrichP9333-500G
Sodyum KlorürSigma-AldrichS7653-1KG
Sodyum Fosfat Monobazik MonohidratSigma-AldrichS9638-25G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, Y. K., Hengen, K. B., Turrigiano, G. G., Gjorgjieva, J. Homeostatic mechanisms regulate distinct aspects of cortical circuit dynamics. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (39), 24514-24525 (2020).
  2. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  3. Rosin, J. M., et al. Embryonic microglia interact with hypothalamic radial glia during development and upregulate the TAM receptors MERTK and AXL following an insult. Cell Rep. 34 (1), 108587(2021).
  4. Wang, X., Li, K., Guo, L., Liu, X., Guo, Y., Zhang, W. The influence of changes in microglia development on the plasticity of the developing visual cortex circuit in juvenile mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (4), 45(2025).
  5. Blume, Z. I., Lambert, J. M., Lovel, A. G., Mitchell, D. M. Microglia in the developing retina couple phagocytosis with the progression of apoptosis via P2RY12 signaling. Dev Dyn. 249 (6), 723-740 (2020).
  6. Brown, T. C., et al. Microglia are dispensable for experience-dependent refinement of mouse visual circuitry. Nat Neurosci. 27 (8), 1462-1467 (2024).
  7. Huang, Y., et al. Microglia use TAM receptors to detect and engulf amyloid β plaques. Nat Immunol. 22 (5), 586-594 (2021).
  8. Ding, X., et al. Loss of microglial SIRPα promotes synaptic pruning in preclinical models of neurodegeneration. Nat Commun. 12 (1), 2030(2021).
  9. He, J., et al. Microglia mediate synaptic material clearance at the early stage of rats with retinitis pigmentosa. Front Immunol. 10, 912(2019).
  10. Yu, A., Fang, C., Tan, L. X., Lakkaraju, A., Della Santina, L., Ou, Y. Microglia target synaptic sites early during excitatory circuit disassembly in neurodegeneration. iScience. 28 (4), 112201(2025).
  11. Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
  12. Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: a field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  13. Yu, Z., Gutu, A., Kim, N., O'Shea, E. K. Synapse weakening-induced caspase-3 activity confers specificity to microglia-mediated synapse elimination. bioRxiv. , (2024).
  14. Miller, E. B., Zhang, P., Ching, K., Pugh, E. N., Burns, M. E. In vivo imaging reveals transient microglia recruitment and functional recovery of photoreceptor signaling after injury. Proc Natl Acad Sci USA. 116 (33), 16603-16612 (2019).
  15. Wahl, D. J., Ng, R., Ju, M. J., Jian, Y., Sarunic, M. V. Sensorless adaptive optics multimodal en-face small animal retinal imaging. Biomed Opt Express. 10 (1), 252(2019).
  16. Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. Selective vulnerability of specific retinal ganglion cell types and synapses after transient ocular hypertension. J Neurosci. 36 (35), 9240-9252 (2016).
  17. Della Santina, L., et al. Disassembly and rewiring of a mature converging excitatory circuit following injury. Cell Rep. 36 (5), 109463(2021).
  18. Ramírez, A. I., et al. Microglial changes in the early aging stage in a healthy retina and an experimental glaucoma model. Prog Brain Res. 256, 125-149 (2020).
  19. de Hoz, R., et al. Bilateral early activation of retinal microglial cells in a mouse model of unilateral laser-induced experimental ocular hypertension. Exp Eye Res. 171, 12-29 (2018).
  20. Soliño, M., Yu, A., Della Santina, L., Ou, Y. Large-scale survey of excitatory synapses reveals sublamina-specific and asymmetric synapse disassembly in a neurodegenerative circuit. iScience. 26 (8), 107262(2023).
  21. Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house AAV vector production based on chloroform extraction. Curr Protoc Neurosci. 93 (1), e103(2020).
  22. Imaris reference manual. , https://lims.gzzoc.com/files/instrument/20240722/2024072212391299299_ImarisManual.pdf (2024).
  23. Joseph, A., Power, D., Schallek, J. Imaging the dynamics of individual processes of microglia in the living retina in vivo. Biomed Opt Express. 12 (10), 6157(2021).
  24. Wu, W., et al. In vivo imaging in mouse spinal cord reveals that microglia prevent degeneration of injured axons. Nat Commun. 15 (1), 8837(2024).
  25. Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microglia DynamicsSynaptic PruningRetinal ExplantSpinning Disk MicroscopyMicroglia MotilityPSD95 LabelingTime Lapse ImagingSynapse InteractionNeuroinflammationSurface Rendering

Related Articles