Method Article

Tümör ve Hastalık Araştırmaları için Tutkal Bazlı Doku Mikroarray Yapısı

DOI:

10.3791/68424

⸱

August 1st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Laboratory, The Affiliated Huai'an No.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 2Department of Anesthesiology, The Affiliated Huai'an No.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 3Department of Pathology, The Affiliated Huai'an No.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Pediatrics, The Affiliated Huai'an No.1 People's Hospital of Nanjing Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, tümör ve hastalık araştırmaları için uygun bir patolojik tanı platformu sağlayan, tutkal bazlı TMA yapımı için düşük maliyetli bir üretim ve verimli doğrulama yöntemini tanımlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doku mikroarray teknolojisi (TMA), birden fazla doku örneğinin aynı anda tespiti ve analizi için yüksek verimli bir platformdur ve verimli tümör ve hastalık biyobelirteç araştırmalarını kolaylaştırır. Bununla birlikte, geleneksel TMA yapım yöntemleri genellikle operasyonel karmaşıklık, zaman alıcı prosedürler ve değişken doğruluk gibi sınırlamalarla karşı karşıyadır. Bu zorlukların üstesinden gelmek için tutkal bazlı bir TMA yapım yöntemi geliştirilmiştir ve gelişmiş doku çekirdeği fiksasyonu ve gelişmiş yapısal stabilite sunar. Sistematik doğrulama, histolojik değerlendirme (HE boyama), hedef proteinlerin immünohistokimyasal profillemesi ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) analizini içeriyordu. Sonuçlar, tutkal bazlı yöntemin mükemmel dilim bütünlüğünü koruduğunu, sinyal-gürültü oranını iyileştirdiğini ve partiden partiye tutarlı tekrarlanabilirlik sağladığını gösterdi. Yaklaşım manuel operasyonla sınırlı olsa da, orta verimli TMA üretimi için güvenilir ve uygun maliyetli bir seçenek sunar. Bu yöntem, özellikle büyük ölçekli otomasyona göre esnekliğe ve örneklem çeşitliliğine değer veren araştırma ortamları için uygundur ve TMA'nın akademik ve tanısal ortamlarda faydasını genişletir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doku Mikrodizisi (TMA), doku örneklerinianaliz etmek için yüksek verimli bir tekniktir 1,2,3. Çoklu donör doku çekirdekleri elde edilir ve donör parafin blokları, teorik olarak aynı performans koşulları altında eşzamanlı diferansiyel ve karşılaştırmalı moleküler analiz için alıcı doku bloklarına aktarılır 2,4. Bir doku mikrodizisi (TMA) oluşturmanın klasik yolu, bir donör doku örneğinden doku çekirdeklerini çıkarmak ve bunları bir alıcı parafin bloğuna sırayla düzenlemek için bir delgeç kullanmaktır. Bu yöntem, benzer derinlikteki donör parafin blokları için uygundur ve tek bir dilim üzerinde birden fazla numunenin verimli bir şekilde analiz edilmesine izin vererek, çalışmanın verimliliğini ve verilerin tutarlılığını büyük ölçüde artırır 5,6,7. Bununla birlikte, bu yöntem, gömme işlemi sırasında doku çekirdeğinin yetersiz işlenmesi de dahil olmak üzere hala belirli sınırlamalara sahiptir, bu da sonraki analizlerde numunelerin tutarsız bir şekilde boyanmasına neden olabilir8.

TMA yapımının ikinci yöntemi bant yöntemidir 9,10. Bu yöntem, bloğu, çekirdek uzunluğu11,12'den bağımsız olarak, tamamlandıktan sonra TMA'nın üst kısmı ile aynı hizada olan ters çevrilmiş dik çekirdeklerin etrafına dökerek inşaat sürecini tersine çevirir. Bununla birlikte, bu yöntem, doku çekirdeğinin uygun şekilde yerleştirilmesini ve bandın etkinliğini sağlamayı gerektirir ve ayrıca geleneksel tekniklere kıyasla işlenebilecek numune sayısını sınırlar.

Bu çalışma, geleneksel tekniklerde var olan doku çekirdeklerinin yetersiz stabilitesi ve karmaşık operasyon gibi sorunları çözmeyi amaçlayan, TMA yapımı için yenilikçi bir tutkal yöntemi önermektedir13. Bu yöntem, birden fazla doku çekirdeğini hassas bir şekilde birbirine sabitlemek için yapıştırıcı kullanır ve basit kullanım ve güçlü numune sertliği avantajlarına sahiptir. Geleneksel kesit alma veya bant yöntemleriyle karşılaştırıldığında, tutkal yöntemi doku çekirdeklerinin tutma oranını artırabilir ve maliyetleri azaltabilir. Bu yöntem, orta örneklem büyüklüğüne sahip klinik çalışmalara uygulanabilir ve özellikle deney planının esnek bir şekilde ayarlanmasını gerektiren araştırma tasarımları için uygundur. Bununla birlikte, bu yöntemin işleme kapasitesinin ultra yüksek verim9'un taleplerini karşılamadığına dikkat edilmelidir. Bu arada, fiili başvuru sürecinde, eksiksiz bir standartlaştırılmış çalışma normları ve kalite kontrol sistemleri seti oluşturulmalıdır. Teknik işlemlerin standardizasyonunu ve sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için operatörlerin sistematik eğitim alması ve profesyonel değerlendirmelerden geçmesi gerekir. Kapsamlı analiz, bu teknolojinin operasyonel esneklik, maliyet etkinliği ve teknik güvenilirlik arasında iyi bir denge sağladığını ve özellikle kaynakların sınırlı olduğu ancak kalite kontrolünün hala garanti edilmesi gereken araştırma senaryoları için uygun olduğunu göstermektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm donör blokları, 2016 ve 2018 yılları arasında Nanjing Tıp Üniversitesi'ne bağlı Huai'an No.1 Halk Hastanesi'nde toplanan arşiv patolojik örneklerinden elde edildi. Numuneler kullanımdan önce kimliksizleştirildi ve onaylanmış protokollere uygun olarak işlendi (Nanjing Tıp Üniversitesi'ne bağlı Huai'an No.1 Halk Hastanesi etik kurulu, KY-2024-250-01).

1. Donör dokusunun değerlendirilmesi ve etiketlenmesi

  1. ≥5 mm kalınlığında ve ≥15 mm × 15 mm alana sahip doku bloklarını seçin. Kenarlarda 2 mm'lik bir güvenlik marjı sağlayın ve doku bütünlüğünü korumak için nekroz, kanama veya kalsifikasyon gösteren bölgeleri hariç tutun.
  2. Hedef alan belirleme ve işaretleme
    1. Optik mikroskop kullanarak H ve E lekeli bölümleri değerlendirin. Düşük güçlü tarama yoluyla hedef alanı bulun, ardından hücresel morfolojik özellikleri doğrulamak için yüksek güce geçin. Slaytlarda hedef alan sınırlarını işaretleyin.
    2. İşaretleme dönüşümünü tamamlamak için seçilen alanın koordinatlarını parafin bloğunun yüzeyine eşleyin.

2. Doku çekirdeği ekstraksiyonu

  1. Delinme hazırlığı ve numune ön işlemi
    1. 2 mm çapında bir el tipi delgeç seçin ve kesici kenarının düzgünlüğünü ve kullanım kolaylığını onaylayın.
    2. Donör parafin bloğunu 15 dakika boyunca 4 °C'de soğuk bir platforma yerleştirin.
  2. İğneyi işaretli nokta ile dikey olarak hizalayın ve sınırlayıcı derinliğe ulaşmak için sabit dönme basıncı uygulayın. İşlem sırasında eğilmekten veya titreşmekten kaçının7 (Şekil 1A).
  3. Çekmek için iğneyi yavaşça saat yönünün tersine (≤2 dönüş/sn) çevirin. Doku çekirdeğini iğneden dikkatlice çıkarın ve önceden soğutulmuş 96 oyuklu bir plakanın ayrı bir kuyucuğuna aktarın. Her kuyucuktaki çekirdek konumunu kaydedin (Şekil 1B).
    NOT: Doku çekirdeğinin alt kısmı düz değilse, bir bıçakla düzleştirin. Kırptıktan sonra bütünlüğü tekrar kontrol edin.
  4. Kayıt formunda tüm donör numaralarını ve ilgili ELISA plaka kuyusu pozisyonlarını (A1-H12) önceden kaydedin. Operasyon sırasında, donör numaraları ve kuyu pozisyonları arasında sıkı bir yazışma olduğundan emin olmak için tekrar kontrol edin.
  5. Çekirdekleri hemen bütünlük açısından inceleyin. Kırılmış, bükülmüş veya >0,1 mm çap sapmaları sergileyen çekirdekleri atın.
    NOT: Çekirdek uzunluğu tutarlılığını sağlayın (varyasyon katsayısı, CV %≤5) ve yüzey çiziklerinden veya sıkıştırma artefaktlarından kaçının.

3. Doku çekirdeği fiksasyonu

  1. Doğrudan kalıp yüzeyine bir ızgara çizmek için su geçirmez bir işaretleyici kullanın, net ve eşit aralıklı çizgiler sağlayın.
    1. Etkili taban alanı 3,0 cm × 2,5 cm olan standart bir kalıp kullanın ve her iki tarafta 1,5 mm'lik boş bir sınır alanı ayırın.
    2. 0.5 mm ince noktalı su geçirmez bir işaretleyici kullanarak yatay ve dikey olarak dokuz eşit aralıklı paralel çizgi çizin ve 9 × 9 konumlandırma ızgarası (toplamda 81 kesişme noktası) oluşturun.
      NOT: Başlamadan önce, delaminasyona neden olabilecek artık parafini çıkarmak için kalıbın içini ksilen batırılmış bir pamuklu çubukla temizleyin. Çizim işlemi sırasında, düzgün çizgi kalınlığı ve net bir şekilde ayırt edilebilir kesişme noktaları sağlamak için çelik bir cetvel kullanın.
  2. 5 μL yapıştırıcı çizmek için bir pipet kullanın ve tek bir damlacık oluşturmak için önceden etiketlenmiş slaydın ortasına nazikçe yerleştirin. Doku çekirdeğini 90°'lik bir açıyla dikey olarak almak için hemen ince cımbız kullanın ve yavaşça tutkal damlasına dikey olarak bastırın (Şekil 1C).
  3. Çekirdekleri cımbız kullanarak kalıp üzerindeki ilgili ızgara kesişimlerine yerleştirin. Güvenli yapışmayı sağlamak için 5 saniye boyunca hafif basınç uygulayın (Şekil 1D).
  4. Doku çekirdeği yer değiştirirse, yapıştırıcı katılaşmadan önce (30 saniye içinde) ince cımbız kullanarak hemen ince ayar yapın ve sıfırlayın. Değerli numuneleri büyük ölçüde korurken hazırlama kalitesini korumak için katılaşmış, yanlış hizalanmış çekirdekleri atın.

4. Kaset kurulumu ve parafin gömme

  1. Doku kasetini çelik kalıbın üzerine dikey olarak yerleştirin ve sıkıştırma uygulamadan göbek uçlarıyla temas sağlayın. Kaseti manyetik cl kullanarak sabitleyinamps dört köşede de ve dikişleri erimiş parafin ile kapatın.
  2. Erimiş parafini zikzak şeklinde 45°'lik bir açıyla demleyin ve 1 mL/s'lik bir akış hızını koruyun. Parafin seviyesinin çekirdek uçlarını 2 mm aştığından emin olun (Şekil 1E).
  3. Sert bir destek tabakası oluşturmak için bloğu 4 °C'lik bir soğuk plaka üzerinde 5 dakika boyunca hızla soğutun. İç gerilimi azaltmak için bloğu 20 dakika boyunca 22 °C'lik bir ortama aktarın. Son olarak, yüzeyi nazikçe düzleştirmek ve büzülme izlerini ortadan kaldırmak için 40 °C'lik bir ısı tabancası kullanın.
  4. Parafini yumuşatmak için hafifçe ısıtın, ardından bloğu gevşetmek için kaset kenarları boyunca dikkatlice kesin. Doku çekirdeklerinin bütünlüğünü sağlamak için kaseti yavaşça kaldırın ve kalan parafini çıkarın (Şekil 1F).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, tutkal yöntemi kullanılarak yüksek kaliteli doku mikrodizileri oluşturulmuştur. Yöntemin etkinliğini doğrulamak için, H&E boyama, spesifik proteinlerin immünohistokimyasal tespiti ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) analizi dahil olmak üzere bir dizi deney gerçekleştirildi. İnşaat sürecinin kritik bir bileşeni, görsel inceleme ile değerlendirilen, beklenen konumlarda ve birbirinden uzak mesafelerde doku çekirdek noktalarının varlığıdır. TMA bloklarının görsel olarak incelenmesi, çekirdekle...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doku mikrodizileri (TMA) oluşturmak için yenilikçi bir yöntem olan yapıştırıcı yöntemi, yapım prosedürlerinin kolaylığı ve maliyet etkinliği nedeniyle önemli avantajlar göstermiştir. Gelişmiş aletlere14,15 dayanan geleneksel iğne dizisi yöntemiyle karşılaştırıldığında, tutkal yöntemi, yalnızca temel aletlerle yapılabilen yapıştırma yoluyla numune sabitlemesini mümkün kılar ve teknik eşiği büyük ölçüde azaltır. Geleneksel gömme yö...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu deneye destekleri ve katkıları için ekip üyelerine teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Meme kanseri HER2 Tespit kitiAnbiping2502001Meme kanseri HER2 Tespit kiti
CDHR4 antikoruAbcamab166914CDHR4 antikoru
CDK1 antikoruAbcamab265590CDK1 antikoru
CRTAC1 antikoruAbcamab254691CRTAC1 antikoru
DNASE1L3 antikoruAbcamab203669DNASE1L3 antikoru
Gömme makinesiPSJ MEDICALBM450AGömme makinesi
Tam otomatik doku kurutucuLeica BiosystemsASP3005Tam otomatik doku kurutucu
Cam mikroskop slaytlarıCitotest250124A1Cam mikroskop slaytları
TutkalTIZO200Tutkal
GPR146 antikoruAbcamab117104GPR146 antikoru
IGSF10 antikoruAbcamab197671IGSF10 antikoru
ITIH1 antikoruAbcamab233032ITIH1 antikoru
Düşük Profilli Mikrotom Bıçakları ThermoFisher3052835Düşük Profilli Mikrotom Bıçakları
Marker kalemDeliSK109Marker kalem
MikrotomLeica BiosystemsHistoCore BIOCUTMicrotome
Parafin mumuSolarbioYA0012Parafin mumu
SMAD9 antikoruAbcamab262940SMAD9 antikoru
TARBP1 antikoruAbcamab115896TARBP1 antikoru
ZCCHC24 antikoruAbcamab88756ZCCHC24 antikoru

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bingle, L., Fonseca, F. P., Farthing, P. M. Constructing tissue microarrays: Protocols and methods considering potential advantages and disadvantages for downstream use. Oral Biol Mol Tech Appl. Seymour, G. J., Cullinan, M. P., Heng, N. C. K. , 429-438 (2017).
  2. Chung, L. K., et al. Tissue microarray analysis for epithelial membrane protein-2 as a novel biomarker for gliomas. Brain Tumor Pathol. 35 (1), 1-9 (2018).
  3. Torata, N., et al. Tissue tablet method: An efficient tissue banking procedure applicable to both molecular analysis and frozen tissue microarray. Hum Pathol. 45 (1), 143-152 (2014).
  4. Koo, M., Squires, J. M., Ying, D., Huang, J. Making a tissue microarray. Biobank Methods Protocols. Yong, W. H. , 313-323 (2019).
  5. Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).
  6. Vogel, U. F., Bueltmann, B. D. Simple inexpensive, and precise paraffin tissue microarrays constructed with a conventional microcompound table and a drill grinder. Am J Clin Pathol. 126 (3), 342-348 (2006).
  7. Pires, A. R. C., Andreiuolo, F. M., de Souza, S. R. TMA for all: A new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custom-built needles. Diagn Pathol. 1 (1), 14(2006).
  8. Zlobec, I., Koelzer, V. H., Dawson, H., Perren, A., Lugli, A. Next-generation tissue microarray (ngTMA) increases the quality of biomarker studies: An example using CD3, CD8, and CD45RO in the tumor microenvironment of six different solid tumor types. J Transl Med. 11 (1), 104(2013).
  9. Glinsmann-Gibson, B., et al. Recommendations for tissue microarray construction and quality assurance. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 28 (4), 325-330 (2020).
  10. Chen, N., Zhou, Q. Constructing tissue microarrays without prefabricating recipient blocks: A novel approach. Am J Clin Pathol. 124 (1), 103-107 (2005).
  11. Pires, A. R. C., de Souza, S. R. Hypodermic needle without recipient paraffin block technique. Methods Mol Biol. 664, 53-61 (2010).
  12. Vogel, U. F., Bültmann, B. Application of a novel and low-cost technique to construct paraffin tissue microarrays out of paraffinised needle biopsy specimens from patients with breast cancer. J Clin Pathol. 63 (7), 640-643 (2010).
  13. Qin, P., Li, L., Zhao, L., Bian, P., Xiong, Z. Constructing high-density tissue microarrays with a novel method and a self-made tissue-arraying instrument. Pathol Res Pract. 245, 154430(2023).
  14. Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A next-generation tissue microarray (ngTMA) protocol for biomarker studies. J Vis Exp. (91), e51893(2014).
  15. Barrette, K., van den Oord, J. J., Garmyn, M. Tissue microarray. J Invest Dermatol. 134 (9), 1-4 (2014).
  16. Sexton, T., Kucera, G. L., Levine, E. A., Watabe, K., O'Neill, S. S. Optimization of tissue microarrays from banked human formalin-fixed paraffin embedded tissues in the cancer research setting. Biopreserv Biobank. 17 (5), 452-457 (2019).
  17. Harfouch, R. M., et al. Optimization of tissue microarray technique for breast cancer patients: A short communication. Ann Med Surg. 85 (10), 5299-5303 (2023).
  18. Choi, C. H., et al. Construction of high-density tissue microarrays at low cost by using self-made manual microarray kits and recipient paraffin blocks. Korean J Pathol. 46 (6), 562-568 (2012).
  19. Kim, K. H., et al. In-house manual construction of high-density and high-quality tissue microarrays by using homemade recipient agarose-paraffin blocks. Korean J Pathol. 47 (3), 238-244 (2013).
  20. Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nat Biotechnol. 38 (3), 333-342 (2020).
  21. Bingham, V., et al. Topographic analysis of pancreatic cancer by TMA and digital spatial profiling reveals biological complexity with potential therapeutic implications. Sci Rep. 14 (1), 11361(2024).
  22. Casadonte, R., Longuespée, R., Kriegsmann, J., Kriegsmann, M. MALDI IMS and cancer tissue microarrays. Adv Cancer Res. 134, 173-200 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tissue MicroarrayGlue Based TMATumor ResearchDisease BiomarkersCore FixationHistological EvaluationHE StainingImmunohistochemistryFISH AnalysisSlice Integrity
Video Coming Soon

Related Articles