Method Article

Erken Doğum Sonrası Fare Beyin Gelişiminde Mikroglia Aktivasyonunu Karakterize Etmek için Akış Sitometrisi ve Tek Hücre Analizi

DOI:

10.3791/68427

⸱

October 3rd, 2025

 ,  ,  , 
1Azrieli Research Center of CHU Sainte-Justine, 2Pediatric Department, Faculty of Medicine, Université de Montréal

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, erken doğum sonrası fare beyinlerinin beyinciklerindeki mikroglial hücre durumlarını izole etmek ve karakterize etmek için akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilimini birleştirir. Mikroglia heterojenliğini ortaya çıkarmak ve serebellar gelişim ve hastalıktaki rollerinin anlaşılmasını geliştirmek için enzimatik ayrışma, Percoll santrifüjleme ve immün boyama kullanır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beynin yerleşik bağışıklık hücreleri olan mikroglia, gelişim ve hastalık sırasında bölgeye ve bağlama özgü transkripsiyonel profiller sergiler. Bu protokol, fare serebellar dokusundaki mikroglial popülasyonları incelemek için iki tamamlayıcı yöntem sunar: akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilimi.

Kullanılan ilk yöntem olan akış sitometrisi tabanlı protokol, erken doğum sonrası beyinler için optimize edilmiş olup, deney koşullarında sağlam hücre izolasyonu ve tutarlılığı sağlar. Enzimatik sindirim kullanılarak doku ayrışması ile başlar, ardından yüksek kaliteli bir nöral hücre süspansiyonu ve CD45 ve CD11b ekspresyonuna dayalı bir geçit stratejisi elde etmek için Percoll yoğunluk gradyan santrifüjleme yoluyla miyelin çıkarılması ile başlar. Canlı/ölü boyama, hücre canlılığını sağlar ve mikroglia üzerinde seçilen yüzey belirteçlerinin ekspresyonunun profilini çıkarmak için florokrom konjuge antikorlar kullanılır. Dengeleme kontrolleri, floresan eksi bir (FMO) kontrolü kullanılarak doğrulanmış geçit stratejilerine sahip lateks boncuklar kullanılarak gerçekleştirilir.

İkinci yöntem, koşullar arasında mikroglianın transkriptomik profilinin çıkarılmasını sağlayan aynı yukarı akış izolasyon adımlarını izleyerek 10X Genomics kullanılarak tek hücreli RNA dizilimini içerir. Mikroglial kümeler, gen ekspresyon analizi kullanılarak tanımlanır ve deney grupları arasında diferansiyel ekspresyon analizi yapılır. Rastgele bir orman sınıflandırıcısı, çoğullandığında yalnızca erkek ve dişi örnekleri ayırt etmek için uygulanır.

Birlikte, bu tekrarlanabilir ve uyarlanabilir protokoller, erken beyin gelişimi sırasında beyincikteki mikroglial çeşitliliği ve deneysel bozulmaları takiben potansiyel değişimini araştırmak için sağlam bir çerçeve sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erken doğum sonrası dönem, bilişsel, duygusal ve davranışsal işlevlerin temelini oluşturan karmaşık hücresel ve moleküler süreçlerle karakterize edilen, beyin gelişimi için kritik bir aşamadır1. Bununla birlikte, aksaklıklar nörogelişimsel yörüngeleri değiştirebileceğinden ve uzun vadeli nörolojik veya psikiyatrik bozukluklara yol açabileceğinden, bu dönem aynı zamanda kırılganlıkla da işaretlenir. Beynin yerleşik bağışıklık hücreleri olan mikroglia, sinaptik budama, fagositoz, bağışıklık gözetimi ve çevresel hakaretlere tepkiler yoluyla gelişmekte olan beynin şekillendirilmesinde merkezi bir rol oynar 2,3. Bu hücreler, beyin bölgesine, gelişim aşamasına ve patolojik bağlama göre değişen transkripsiyonel profilleri benimseyerek dikkate değer bir plastisite sergiler 4,5.

Gelişmekte olan beyindeki mikroglia aktivasyonunun doğru analizi, olgunlaşmamış beyin dokuları bağlamında dinamik fenotiplerini analiz edebilen sağlam ve tekrarlanabilir metodolojiler gerektirir. Akış sitometrisi, hücresel popülasyonların yüksek verimli karakterizasyonunu ve işaretleyici ekspresyonunu sağlayan güvenilir bir çözüm sunar6. Bununla birlikte, erken doğum sonrası beyinlerden mikrogliaların incelenmesinde uygulanması, dokunun hassas doğası ve verimli hücre izolasyonu ve zenginleştirme protokollerine duyulan ihtiyaç nedeniyle teknik olarak zordur 7,8.

Burada sunulan protokol, doğum sonrası 3. günden (P3) doğum sonrası 30. güne (P30) kadar serebelluma özel olarak odaklanarak, erken doğum sonrası fare beyinlerinden mikrogliayı izole etmek ve karakterize etmek için akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilimini (scRNA-seq) birleştirir.9, ayrıntılı metodolojik referansların sınırlı kaldığı bir bölge ve gelişim aşaması.

Bu iş akışı, enzimatik ayrışmayı, enkaz giderme ve hücre zenginleştirme için yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeyi ve hücre dışı ve hücre içi belirteçlerden oluşan bir panel kullanılarak immün boyamayı içerir. Mikroglia çeşitliliğini karakterize etmek için bir dizi yüzey ve hücre içi belirteç kullanılır10,11. Protokol, sabit etiketler (inflamatuar veya onarıcı) atamak yerine, ayrık işaretleyici ekspresyon profillerine dayalı olarak alt popülasyonları tanımlar. Örneğin, CD80, CD86 ve iNOS, CD206 ve Arg1, CD86 ve CD64 veya CD163 ve CD206'yı eksprese eden mikroglia, moleküler olarak farklı alt kümeler olarak tanımlanır ve analiz edilir. Bu belirteçler, farklı aktive edilmiş mikroglia durumlarını10,11 yansıtır ve ekspresyon profilleri olarak sunulur.

Bu multiparametrik geçit stratejisi, yüzey işaretleyici ifadesine dayalı olarak mikroglial alt kümelerin hassas bir şekilde tanımlanmasını sağlar ve doğum sonrası beyin gelişimi sırasında bağışıklık heterojenliğini analiz etmek için kolaylaştırılmış bir çerçeve sunar. Fenotipik profillemeyi genişletmek ve transkripsiyonel çeşitliliği ortaya çıkarmak için, hücre izolasyonunu takiben tek hücreli RNA dizilimi gerçekleştirilir. Bu çalışma, nörogelişimsel süreçlerin ve mikroglial aktivasyonun uzun vadeli etkisinin anlaşılmasını ilerletmek için tutarlı ve ölçeklenebilir bir iş akışı oluşturmaktadır. Optimize edilmiş akış sitometrisini ve scRNA-seq'i gelişimsel ve bölgesel olarak bilgilendirilmiş bir çerçeveye entegre eden bu protokol, erken yaşam mikroglial biyolojisini ve bunun nörogelişimsel sonuçlarla ilişkisini araştırmak için güçlü bir araç olarak hizmet eder.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan prosedürleri, CHU Sainte-Justine Araştırma Merkezi'nin etik komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı ve Ste-Justine Araştırma Merkezi ve Montreal Üniversitesi'nin (Montreal, Quebec, Kanada) yönergelerine ve politikalarına uygundur.

1. Beyinden hücre izolasyonu

  1. Anestezi / ötenazi prosedürlerini takiben, tüm beyni kraniyal boşluktan hızla çıkarın ve mikroglial hücre kültürü ortamı içeren 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin (bkz. Tüpü buz üzerinde tutun. Gerekirse ek fareler için aynı prosedürü tekrarlayın.
    Bu çalışmada kullanılan tüm fareler, Dr. Tremblay'in laboratuvarındaki kurum içi üreme kolonilerinden elde edildi. Deney fareleri, her ikisi de orijinal olarak Jackson Laboratories'den temin edilen B6.129-Cx3Cr1CreERT2-EYFP/WT farelerinin B6-Rosa26iDTR/WT fareleri ile çaprazlanmasıyla üretildi. Bu ıslah stratejisi, IDTR aleli için heterozigot yavrular üreterek, tamoksifen ile indüklenebilir bir Cre-loxP sistemi aracılığıyla Cx3Cr1 eksprese eden hücrelerin (öncelikle mikroglia) koşullu tükenmesini sağladı. Doku toplamadan önce, fareler intraperitoneal ketamin (150 μg/g) ve ksilazin (10 μg/g) enjeksiyonu yoluyla uyuşturuldu. Ötenazi, kurumsal hayvan bakımı ve kullanım kılavuzlarına uygun olarak derin anestezi altında dekapitasyon yoluyla gerçekleştirildi.
  2. Ya tüm beyni koruyun ya da istenirse belirli bölgelerin diseksiyonuna devam edin. Hücre canlılığını korumak için diseksiyonu mikroglial hücre kültürü ortamı içeren küçük bir Petri kabında ( Malzeme Tablosuna bakınız) buz üzerinde gerçekleştirin.
    NOT: Bu protokol tüm beyin ve beyincik için P1'den P30'a kadar doğrulanmıştır.
  3. Mikroglial hücre kültürü ortamını çıkarın ve bir Petri kabında bir neşter kullanarak beyin dokusunu ince bir şekilde kesin.
  4. Enzimatik sindirim için homojenize edilmiş dokuyu 5 mL'lik tüplere aktarın. 2 mg/mL kollajenaz D ve 14 μg/mL DNase I ile desteklenmiş 2 mL HBSS (1x) ekleyin (bkz. Tüp kapaklarını parafilm ile kapatın. Tüpleri 37 °C'lik bir su banyosunda 15 dakika inkübe edin ve tüpü her 5 dakikada bir çalkalayın. Sindirimi durdurmak için tüpleri buzun üzerine koyun.
  5. Büyük kalıntıları gidermek için homojenatı 140 μm'lik bir metal ağ filtreden geçirin ( Malzeme Tablosuna bakın). Hücreleri ayırmak için bir cam havaneli kullanın.
  6. Filtreyi mikroglial hücre kültürü ortamıyla (yıkama başına 3 mL) birkaç kez yıkayın.
  7. Süzüntüyü 10 mL'lik bir pipet kullanarak toplayın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Çözeltiyi 500 g'da 4 °C'de 7 dakika santrifüjleyin.
  8. Tüpü dikkatlice ters çevirerek süpernatanı atın. Bir rafa hafifçe kazıyarak peleti yeniden süspanse edin.
  9. Miyelin ve kalıntıları gidermek için 10 mL %37 silika bazlı kolloidal ortam çözeltisi ekleyin (bkz. Çözeltiyi 500 g'da 10 dakika boyunca 4 °C'de minimum fren kuvveti ile santrifüjleyin.
  10. 10 mL'lik bir pipet kullanarak çözeltinin üstündeki miyelin tabakasını aspire edin.
    NOT: Sürekli aspirasyon, miyelinin çözeltiye geri karışmasını önler.
  11. Hücreleri 10 mL HBSS (1x) ekleyerek yıkayın ve 4 °C'de 7 dakika boyunca 500 × g'da santrifüjleyin.
  12. Süpernatanı atın. Peleti bir rafla hafifçe kazıyarak yeniden süspanse edin, ardından 10 mL floresanla aktive olan hücre sıralama (FACS) tamponu ekleyin (bkz. Çözeltiyi 500 g'da 10 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjleyin.
  13. Süpernatanı atın, son peleti yeniden süspanse edin ve hücreleri tutun. İzole edilen hücreler artık akış sitometrisi boyama veya tek hücreli RNA dizilimi için hazırdır.
  14. Tek hücreli RNA dizileme izolasyonu için, Tripan Mavisi ile birlikte canlı ve ölü çekirdekli hücreleri ayırt etmek için tezgah üstü stabil floresan reaktifler ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak hücreleri mikroskop altında sayın (bkz. Hücrelerin mükemmel durumda olduğundan, %90'a varan canlılığa sahip olduğundan ve 1000 hücre/μL konsantrasyona ulaştığından emin olun. Sonraki adımlar bölüm 9.1'de açıklanmıştır.
    NOT: Protokol boyunca tüpleri buz üzerinde tutun. Minimum frenin belirtildiği Percoll adımı hariç, tüm santrifüj adımları maksimum frenle 4 °C'de gerçekleştirilmelidir. En iyi sonuçlar için tüm protokolü aynı gün gerçekleştirin. Tek hücreli RNA seq protokolü için, izolasyon için kullanılan tüm çözeltileri filtreleyin, adım 1.11'de ikinci yıkama için HBSS (1x) kullanın ve adım 1.12'de hücre çözeltisinin 70-100 μL'sini koruyun.

2. Akış sitometrisi hücre dışı boyama protokolü

  1. Tüm hücreleri konik tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın ( bkz. Plakayı 500 g'da 5 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  2. Süpernatanı tek hareketle çıkarmak için plakayı hızla ters çevirin.
  3. Hücre peletini 25 μL bloke edici çözelti içinde yeniden süspanse edin (bkz. Oda sıcaklığında (RT) 15 dakika inkübe edin.
  4. Hücre dışı antikor boyama karışımını hazırlamak için (bkz. Tablo 2), potansiyel agregaları uzaklaştırmak için antikor stoklarını 10.000 × g'da santrifüjleyin. Peleti bozmadan, boyama karışımını hazırlamak için süpernatanttan istenen hacmi dikkatlice aspire edin ve hacmi FACS Tamponu ile 25 μL'ye ayarlayın.
  5. Her kuyucuğa 25 μL hücre dışı antikor karışımı ekleyin. RT'de 20 dakika inkübe edin.
    NOT: Deneysel kullanımdan önce, optimal çalışma konsantrasyonunu belirlemek için tüm antikorlar serebellar (veya beyin) tek hücreli süspansiyonlar üzerinde titre edildi. Titrasyon, bir doygunluk eğrisi oluşturmak için seri seyreltmelerle gerçekleştirildi ve sinyal evrelemesi için minimum arka plana sahip bir sinyal platosuna karşılık gelen seyreltme seçildi.
  6. Karıştırmadan kuyucuklara 150 μL FACS tamponu ekleyin. Plakayı 500 × g'da 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjleyin. Süpernatanı tek hareketle çıkarmak için plakayı ters çevirin.
  7. Hücre peletini 200 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Plakayı 500 × g'da 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjleyin. Süpernatanı tek hareketle çıkarmak için plakayı ters çevirin. Aynı koşullar altında 200 μL FACS tamponu kullanarak yıkamayı bir kez daha tekrarlayın.

3. Hücre içi boyama

  1. Hücreleri sabitlemek ve geçirgenleştirmek için hücreleri 100 μL saponin-paraformaldehit (PFA) tamponunda yeniden süspanse edin (bkz. Işıktan korunarak RT'de 10 dakika inkübe edin.
  2. Karıştırmadan 100 μL saponin tamponu ekleyin (bkz. Plakayı 500 × g'da 6 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjleyin. Süpernatanı tek hareketle çıkarmak için plakayı ters çevirin.
  3. Hücre peletini 200 μL saponin tamponunda yeniden süspanse edin. 11 boş kuyucuğa 20 μL boncuk ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek kompanzasyon kontrollerini hazırlayın. Plakayı 500 × g'da 6 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjleyin. Süpernatanı tek hareketle çıkarmak için plakayı ters çevirin.
  4. Hücre içi antikor boyama karışımını hazırlamak için (bkz. Tablo 3), potansiyel agregaları uzaklaştırmak için antikor stoklarını 10.000 × g'da santrifüjleyin. Peleti bozmadan, boyama karışımını hazırlamak için süpernatanttan istenen hacmi dikkatlice aspire edin ve hacmi saponin tamponu ile 50 μL'ye ayarlayın.
  5. Peleti 50 μL hücre içi antikor karışımında yeniden süspanse edin ( Tablo 3'e bakınız). Boncuk kuyucuklarına her antikordan 1 μL ekleyin. RT'de 30 dakika inkübe edin.
  6. Karıştırmadan, her hücre numunesi kuyucuğuna 150 μL saponin tamponu ekleyin ve boncukları yıkamak için kompanzasyon kontrollerini içeren her kuyucuğa 100 μL FACS tamponu ekleyin. Plakayı 500 × g'da 6 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjleyin. Süpernatanı tek hareketle çıkarmak için plakayı ters çevirin.
  7. Hücre peletini 200 μL saponin tamponunda yeniden süspanse edin ve dengeleme kontrollerini 200 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Plakayı 500 × g'da 6 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjleyin. Süpernatanı tek hareketle çıkarmak için plakayı ters çevirin. Aynı koşullar altında 200 μL saponin tamponu kullanarak yıkamayı bir kez daha tekrarlayın.
  8. Hücreleri ve dengeleme kontrollerini 200 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Süspansiyonu bir FACS tüpüne aktarın ve akış sitometrisi elde edilene kadar 4 °C'de saklayın.
    NOT: Işığa duyarlı reaktifleri içeren tüm adımların minimum ışık koşullarında gerçekleştirildiğinden emin olun. Bir boncuk kuyusu, lekesiz boncuk tüpüne karşılık gelen antikor içermez.

4. Akış sitometrisi edinimi

  1. Akış sitometresini ve ardından bilgisayarı açın.
  2. Akış sitometresi yazılımını açın ve sitometre sekmesi altında Çalıştır'ı seçerek akışkan başlatmayı başlatın.
  3. Yeni klasör'ü tıklatıp bir ad atayarak yeni bir deneme klasörü oluşturun. Ardından deneyi adlandırmak için Yeni deney'e tıklayın ve bir numune ve numune tüpü eklemek için Yeni tüp'ü seçin.

5. Telafi kontrollerini ayarlayın

  1. Panelde kullanılan her florokrom için lekesiz bir kontrol ile birlikte tek lekeli dengeleme boncukları hazırlayın.
  2. Kompanzasyon tüplerini sitometreye yükleyin. İleri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) voltajlarını yaklaşık 250'ye ayarlayın.
  3. Her floresan kanalı için voltajları, negatif popülasyon eksenin ilk on yılında olacak şekilde ayarlayın.
  4. Tüp başına en az 5.000 olay alın.
  5. Tüm pozitif tepe noktaları negatif popülasyondan açıkça ayrılana ve ilgili eksende 104'ün üzerinde ortalanana kadar spektral örtüşmeyi ayarlamak için telafi matrisini kullanın.
    NOT: Sitometre ayarları veya florokrom performansı spektral örtüşmeyi önemli ölçüde etkileyebileceğinden, her deney için kompanzasyon kontrolleri yapılmalıdır. Bazı beyin dokusu uygulamalarında hücre bazlı kompanzasyon kontrolleri önerilse de, P3 fare serebellumundan elde edilebilen mikroglia sayısının daha düşük olması nedeniyle bu protokolde antikor yakalama boncukları kullanılmıştır ve bu da hücre bazlı kompanzasyonun fizibilitesini sınırlamaktadır. Antikor floresansı başlangıçta beyinden türetilen hücreler üzerinde doğrulandı ve boncuk bazlı sinyallerle karşılaştırılabilir olduğu bulundu. Doku otofloresansını değerlendirmek ve temel sinyal seviyelerini belirlemek için ilk panel optimizasyonu sırasında boyanmamış beyinden türetilmiş bir hücre süspansiyonu ekleyin. Bu kontrol, her floresan kanalındaki negatif popülasyonları uygun şekilde ayarlamak için gereklidir.

6. FMO kontrollerini hazırlayın ve edinin

  1. Her bir anahtar belirteç için, test edilen dışındaki tüm antikorları içeren bir floresan eksi bir (FMO) kontrolü hazırlayın.
  2. Tamamen boyanmış numunelerle aynı alım ayarlarını kullanarak FMO kontrollerini çalıştırın.
  3. Düşük veya çakışan popülasyonlar için geçit eşiklerini tanımlamak ve gerçek pozitifleri arka plan gürültüsünden ayırt etmek için FMO grafiklerini kullanın.
    NOT: Özellikle beyin gibi yüksek otofloresanslı dokularda doğru ve güvenilir geçit sınırlarını tanımlamak için ilk panel optimizasyonu sırasında FMO kontrolleri yapılmalıdır. Boyama paneli, cihaz ayarları veya deney koşulları değiştirilirse, FMO kontrolleri tekrarlanmalıdır. Aynı doğrulanmış panel ve sitometre ayarlarını kullanan sonraki deneyler için, biyolojik kopyalar arasında tutarlılığı sağlamak için önceden tanımlanmış geçit eşikleri yeniden kullanılabilir.

7. İzotip kontrollerini hazırlayın ve edinin

  1. Kontrol numunesini, florokrom ve konsantrasyon açısından test antikorlarına uygun izotip kontrol antikorları ile boyayın.
  2. Aynı sitometre ayarlarını kullanarak veri alın.
  3. İzotip kontrollerini yalnızca, özellikle hücre içi belirteçler veya zayıf karakterize edilmiş antikorlar durumunda, potansiyel spesifik olmayan bağlanmayı değerlendirmek için kullanın. Spesifik antikorlarla aynı bağlanma kinetiğini yansıtmadıkları için geçit için izotip kontrolleri kullanmayın.
    NOT: İzotip kontrolleri geçit için uygun değildir ve popülasyonları tanımlamak için kullanılmamalıdır. Kullanımları isteğe bağlıdır ve seçilmiş vakalarda antikor özgüllüğünü doğrulamak için ayrılmalıdır.

8. Akış sitometrisi geçit stratejisi

  1. Sıralı geçit için aşağıdaki nokta grafiklerini oluşturun:
    Enkazı hariç tutmak için FSC-A ve SSC-A
    Singlet'ları seçmek için FSC-A ve FSC-H.
    Canlı hücreleri geçmek için FSC-A ve Amcyan (canlılık boyası).
  2. CD11b (FITC) ve CD45 (AF700) kullanarak mikrogliayı CD11b+CD45+ olarak tanımlayın.
    NOT: Gelişim aşaması (P3-P15), enflamatuar bağlam ve enzimatik sindirim nedeniyle, TMEM119 ve P2RY12, mikrogliayı akış sitometrisi ile diğer miyeloid popülasyonlardan net bir şekilde ayırmak için güvenilir değildi. Daha önce doğum sonrası beyinde doğrulanan CD11b+CD45+ geçit stratejisi, bu nedenle kontaminasyonu en aza indirirken mikroglia popülasyonlarını tanımlamak için kullanıldı. Kontrol koşullarında, tipik verim, P3'ten P15'e kadar tüm beyin başına 30.000 ila 200.000 mikroglial hücre arasında değişir. Özellikle beyincik üzerine odaklanan deneyler için ortalama verim, beyin başına yaklaşık 5.000 mikroglial hücredir.
  3. Etkinleştirme işaretleri için geçit eşiklerini tanımlamak üzere FMO denetimlerini kullanın.
  4. Bağışıklıkla ilgili belirteçlerin ifadesine dayalı olarak mikroglia alt popülasyonlarını tanımlayın:
    CD80+ (Süper Parlak 436)
    CD86+ (PE)
    iNOS+ (PE-eFlor 610)
  5. Mikroglia alt kümelerini işaretleyici ifadesinin kombinasyonlarıyla daha fazla karakterize edin:
    CD206+ (APC)ardından Arg1+ (PE-Cy7)
    CD86+ (PE)ardından CD64+ (PerCP-eFluor 710)
    CD163+ (Süper Parlak 600)ardından CD206+ (APC)
    NOT: İşaretleyici kombinasyonları, mikroglial popülasyon içindeki moleküler heterojenliği tanımlamak için kullanılır. Bu alt kümeler, yalnızca işaretleyici ifadesine dayalı olarak rapor edilir ve mikroglial plastisiteyi ve bağlama bağlı fenotipleri tanıyan mevcut standartlara uygun olarak belirli fonksiyonel roller atanmaz.
  6. Deneysel örneği yükleyin. FSC'yi 300'e ve SSC'yi 200'e ayarlayın. Düşük bir akış hızı kullanın ve istediğiniz sayıda olayı kaydedin.
  7. Aldıktan sonra sitometreyi yıkayın ve verileri şu şekilde dışa aktarın: . Analiz için FSC dosyaları.
  8. Akış sitometresi yazılımını kullanarak verileri analiz edin.

9. Tek hücreli RNA dizileme örneği

  1. Akış sitometrisi için açıklanan aynı hücre izolasyon protokolünü kullanarak (bkz. adım 1.14), ayrışmış hücreleri FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Hücre stabilitesini korumak için toplama tüplerinde ve sonraki tüm işlem adımlarında FACS tamponu kullanın.
  2. Amaç bir beyin bölgesinden tüm hücre tiplerini yakalamaksa, floresanla aktive olan hücre sıralamasını (FACS) yapmayın. Bununla birlikte, deney mikroglia için zenginleştirme gerektiriyorsa, dizilemeden önce bir FACS sıralama adımı ekleyin.
  3. Tezgah üstü stabil floresan canlılık boyaları ve Tripan Mavisi kullanarak hücre canlılığını hemen değerlendirin (bkz. Hücreleri bir hemositometre kullanarak mikroskop altında sayın ( bkz.
  4. Hücre süspansiyonunun en az %90'lık bir canlılık sergilediğini doğrulayın ve tek hücreli RNA dizilimine geçmeden önce yaklaşık 1.000 hücre/μL'lik bir nihai konsantrasyona ayarlayın.
  5. Tüm numuneleri buz üzerinde tutun ve hücresel stresi ve transkripsiyonel değişiklikleri en aza indirmek için ayrışmadan hemen sonra işleyin.
  6. Üreticinin talimatlarını izleyerek numuneleri çiftler halinde çoğaltın.
    NOT: Deney maliyetlerini azaltmak için aynı deney grubundan bir erkek ve bir kadın bir havuzda toplandı.
  7. scRNAseq kitaplıklarını hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve önerilen üretici yönergelerini izleyin.
    NOT: Kütüphane hazırlığı, Montreal Üniversitesi İmmünoloji ve Kanser Araştırma Enstitüsü'nün (IRIC) Genomik Platformu tarafından gerçekleştirilmiştir.
  8. Bir dizileme sistemi kullanarak scRNA-seq kitaplıklarını şerit başına ortalama 3200M okuma derinliğine sıralayın.
    NOT: Dizileme, Montreal'deki Genome Quebec'te gerçekleştirildi.

10. Tek hücreli RNA dizileme analizi

  1. Mouse GRCm39 2024-A referans genomu ile 10X Genomics'in Cell Ranger yazılımını (v8.0.0) kullanarak benzersiz moleküler tanımlayıcı (UMI) sayım analizi gerçekleştirin. Aşağı akış analizi için Seurat R paketini (v5.1) kullanın.
  2. Mitokondriyal RNA'sı örneğin toplam RNA'nın %30'unu aşan hücreleri hariç tutarak kalite kontrolü gerçekleştirin (Şekil 1A) veya potansiyel stresli hücreleri çıkarmak için seçilen daha katı bir eşik. log10GenesPerUMI 0.75'ten büyük (Şekil 1B), benzersiz özellik sayıları ("nUMI") 500'ün altında ve hücre başına tespit edilen gen sayısı ("nGene") 300'den büyük (Şekil 1C). Ardından, R'deki "scDblFinder" paketiyle damlacıkları çıkarın. Eşikleri gösteren nUMI ve nGene'nin bir korelasyon grafiği ile, filtreleme etkisi şimdi görünür olmalıdır (Şekil 1D).
  3. Seurat'ın SelectIntegrationFeatures işlevini kullanarak numune başına 2.000 yüksek oranda değişken gen tanımlayarak parti etkilerini azaltın.
  4. Kanonik korelasyon analizini (CCA) kullanarak veri kümelerini entegre edin ve boyut azaltma için temel bileşen analizi (PCA) gerçekleştirin. RunPCA işlevini 50 ana bileşenle (PC) kullanın, verileri ölçeklendirin ve istenmeyen varyasyon kaynaklarını (örneğin, mitokondriyal içerik) geriletin. Dirsek grafiğine ve JackStraw analizine dayalı olarak tutulan bilgisayarların sayısını değerlendirin.
  5. Seurat RunUMAP işlevi aracılığıyla tekdüze manifold yaklaşımı ve projeksiyonu (UMAP) algoritmasını kullanarak kümeleri görselleştirin. FindAllMarkers işleviyle kümeye özgü gen ekspresyon profillerini tanımlayın. PanglaoDB ve CellMarker gibi seçilmiş tek hücreli kaynaklarla tanımlanmış işaretleyici genlere çapraz referans vererek transkripsiyonel imzalara dayalı kümelere açıklama ekleyin (Şekil 2). Mikroglia dahil hücre tipleri, önceden tanımlanmış yüzey işaretleyicisinden ziyade bu transkriptomik profillerden çıkarılır.

11. Cinsiyete dayalı hücre ayrımı

  1. Cinsiyete özgü genlerin ekspresyonuna dayalı olarak erkek ve dişi hücreleri tanımlayın: dört kadına özgü (Xist, Tsix, Usp9x, Eif2s3x) ve üç erkeğe özgü (Eif2s3y, Uty, Ddx3y).
  2. Seurat'ın Alt Küme işlevini kullanarak bu genlerden herhangi biri için normalleştirilmiş UMI sayılarını 1 > eksprese eden hücreleri filtreleyerek erkek ve dişi popülasyonları sınıflandırın.
  3. Erkek ve dişi hücreleri ayrı ayrı alt bölümlere ayırarak Seurat nesneleri oluşturun. Aşağı akış karşılaştırmaları için bu nesneleri bağımsız olarak saklayın ve analiz edin.
  4. FeaturePlot ve VlnPlot işlevlerini kullanarak cinsiyete özgü gen ekspresyonunu görselleştirerek sınıflandırmayı doğrulayın ve erkek ve dişi hücre popülasyonları arasında net bir ayrım sağlayın.
    NOT: Adım 12.1 ve 12.2, yalnızca numune bir erkek ve bir dişi karıştırılarak çoğullandığında gerçekleştirilmelidir.

12. İstatistiksel modele dayalı mikroglia sınıflandırması

  1. Bilinen grup etiketlerine sahip ~1.000 hücreden oluşan bir eğitim seti kullanarak R'de beş istatistiksel model (rastgele orman, lojistik regresyon, saf Bayes, destek vektör makinesi, karar ağacı) oluşturun.
  2. 10 kat çapraz doğrulama ve alıcı işletim karakteristiği (ROC) eğrilerini kullanarak model performansını değerlendirin (Şekil 3). Seurat'taki FindAllMarkers işlevini kullanarak sınıflandırmaya katkıda bulunan anahtar genleri tanımlayın.
  3. ROC eğrisinin (AUC) altında en yüksek alana sahip modeli seçin. Rastgele orman modeli, üstün AUC puanına göre seçildi.
  4. RandomForest R paketindeki tahmin işlevini kullanarak seçilen modeli sınıflandırılmamış hücrelere uygulayın. Birleştirmeyi kullanarak tahmin edilen sınıflandırmaları Seurat'ta önceden açıklamalı veri kümeleriyle birleştirin.
  5. FeaturePlot ve VlnPlot ile işaretleyici gen ekspresyonunu görselleştirerek sınıflandırmaları doğrulayın. Tahmin edilen hücre kimliklerinin tutarlılığını sağlamak için, sınıflandırılmış hücreleri eklemeden önce ve sonra örtüşen işaretleyici gen setinin zenginleşmelerini uygun bir istatistiksel testle (örneğin, Fisher'ın kesin testi) değerlendirin.

13. Microglia diferansiyel gen ekspresyon analizi

  1. Seurat işlevi "FindMarkers"ı kullanarak, ident.1 ilgilenilen grubu ve ident.2 referans grubunu temsil eden iki spesifik ilgi grubu arasında diferansiyel gen ekspresyonu (DEG) analizi gerçekleştirin.
    NOT: Çıktı, özd.1'de özd.2'ye göre diferansiyel olarak ifade edilen genleri listeler. Bu bağlamda, yukarı regüle edilmiş genler, kimlik.1'de kimlik.2'ye göre daha yüksek ekspresyona sahip olanlardır, aşağı regüle edilmiş genler ise kimlik.1'de daha düşük ekspresyon gösterir. Karşılaştırmaları, yanardağ grafikleri oluşturmak ve duruma özgü transkripsiyonel değişikliği yorumlamak için kullanılır.
  2. Ayarlanmış bir P değeri olan diferansiyel olarak eksprese edilen genleri (DEG'ler) tanımlayın≤ 0.05. İki spesifik grup arasındaki karşılaştırmalar için, FindAllMarkers işlevini aşağıdaki kriterlerle kullanın: hücrelerin en az %10'unda eksprese edilen genler (min.pct = 0.1) ve log2 kat değişim eşiği 0.25 (logfc.threshold=0.25). Tüm mikroglialarda çok gruplu karşılaştırmalar için aynı parametrelerle FindAllMarkers işlevini kullanın. Ayarlanmış P değeri 0.05 ≤ olan genler, önemli ölçüde farklı şekilde eksprese edilmiş olarak kabul edilir. DEG ifade modellerini görselleştirmek için EnhancedVolcano paketindeki yerleşik işlevi kullanarak bir yanardağ grafiği oluşturun (Şekil 4).
  3. Önce mikroglia'yı bulmak için kullanılan sitometri belirteçlerini, özellikle Ptprcve Itgam genlerine karşılık gelen CD45+ ve CD11b+'yı inceleyerek akışsitometrisi sonuçlarını karşılaştırın. Seurat'taki FeaturePlot işlevlerini kullanarak gen ekspresyonunu onaylayın.
  4. CD80veNOS2'nin yanı sıra Mrc1,Arg1,Fcgr1 ve CD163 dahil olmak üzere farklı mikroglial durumlarla yaygın olarak ilişkili belirteçleri değerlendirin. Hücre kümeleri arasındaki ifadelerini görselleştirmek için Seurat işlevleri FeaturePlot ve DotPlot'u kullanın.
  5. İşaretçi ifadelerini özetlemek ve popülasyon sınıflandırmasını doğrulamak için Seurat'taki DotPlot işlevini kullanarak bir nokta grafiği oluşturun.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, seçilen yüzey ve hücre içi belirteçlerin ekspresyonuna dayalı olarak fare beyin örneklerindeki mikroglial hücre popülasyonlarını karakterize etmek için akış sitometrisini etkili bir şekilde kullanır. Aşağıdaki bölümler, deneysel koşullara yanıt olarak mikroglia alt kümelerinin dağılımını ve heterojenliğini vurgulayarak iş akışının temel adımlarından elde edilen sonuçları detaylandırmaktadır.

Ücretlendirme ve geçit stratejisi doğrulaması
Floresan sinyallerini kalibre etmek ve florokromlar arasındaki spektral örtüşmeyi düzeltmek için dengeleme boncukları kullanıldı. Her florokrom için pozitif ve negatif popülasyonlar açıkça ayrıldı ve doğru kompanzasyon matrisi üretimine izin verdi. Geçit eşikleri, özellikle zayıf veya örtüşen işaretleyiciler için gerçek sinyali arka plandan ayırt etmek için panel optimizasyonu sırasında başlangıçta Floresan Eksi Bir (FMO) kontrolü kullanılarak doğrulandı. Bu eşikler daha sonra tutarlılığı sağlamak için aynı boyama paneli ve sitometre ayarları kullanılarak deneylerde yeniden kullanıldı. İzotip kontrolleri, özellikle hücre içi belirteçler için potansiyel spesifik olmayan bağlanmayı izlemek için dahil edildi, ancak geçit kararları için kullanılmadı.

Mikroglial hücre tanımlama
Canlı/ölü (Amcyan) hücre geçitleme stratejisi, ölü hücreleri başarıyla dışladı. Geçit stratejisi, CD45 (AF700) ve CD11b (FITC) ekspresyonuna dayalı olarak mikroglial hücre popülasyonlarını etkili bir şekilde izole etti. İleri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) parametreleri, mikroglia popülasyonunu nokta grafiği içinde ortalamak için optimize edildi (FSC = 300, SSC = 200) (Şekil 5).

Mikroglial hücre fenotiplemesi
Nokta grafiği analizi, yüzey ve hücre içi belirteçlerin diferansiyel ekspresyonuna dayalı olarak mikroglia alt popülasyonlarının tanımlanmasını sağladı. FlowJo yazılımında spesifik geçit stratejileri kullanılarak, CD80 (Super Bright 436), CD86 (PE) ve iNOS (PE-eFluor 610) eksprese eden bir mikroglial hücre alt kümesi tanımlandı (Şekil 6A). CD206 (APC) ve Arg1 (PE-Cy7) eksprese eden alt kümeleri tanımlamak için çift geçit de kullanıldı (Bkz. Şekil 6B). Ek popülasyonlar, CD86 (PE) ve CD64'ün (PerCP-eFluor 710) yanı sıra CD163 (Süper Parlak 600) ve CD206'nın (APC) birlikte ekspresyonu ile karakterize edildi (Şekil 6C,D). Bu fenotipik profiller, mikroglia popülasyonu içindeki işaretleyici tanımlı heterojenliği yansıtır ve bu protokolün, sabit fonksiyonel durumları çıkarmadan çoklu transkripsiyonel ve immünolojik olarak farklı alt kümeleri ayırt etme kapasitesini gösterir.

Microglia tek hücre analizi
Hücresel heterojenliği görselleştirmek ve diğer beyin hücresi tipleri arasındaki mikroglial hücre kümelerini tanımlamak için Tekdüze Manifold Yaklaşımı ve Projeksiyonu (UMAP) kullanıldı. Her nokta tek bir hücreyi temsil eder ve küme, transkripsiyonel benzerliğe dayalı olarak renk kodludur (Şekil 2).

Deneysel koşullar altında modüle edilen genleri tanımlamak için mikroglia kümesi içinde diferansiyel ekspresyon analizi yapıldı. Düzeltilmiş P değeri 0.05 ≤ olan genlerin diferansiyel olarak eksprese edildiği kabul edildi.

Mikroglial hücrelerin bu diferansiyel olarak eksprese edilen genlerini görselleştirmek için bir volkan grafiği oluşturuldu ve hem yüksek kat değişimi hem de istatistiksel anlamlılığa sahip olanları vurguladı (Şekil 4).

Bu tek hücre sonuçlarını akış sitometri verileriyle karşılaştırmak için mikroglia belirteçleri CD45 ve CD11b'nin (Ptprc ve Itgam) ekspresyonu incelendi. Bir UMAP, farklı hücre popülasyonları içindeki ekspresyonlarını gösterir (Şekil 7).

Son olarak, mikroglial hücreler arasındaki transkripsiyonel heterojenliği karakterize etmek için seçilen bağışıklıkla ilgili belirteçlerin ekspresyonu değerlendirildi. Bir Keman grafiği, CD80 ve NOS- gibi genlerin yanı sıra Mrc1, Arg1, Fcgr1 ve CD163'ün tek hücre düzeyinde ekspresyonunu gösterir (Şekil 8). Bu işaretleyici ekspresyon modelleri, akış sitometrisine dayalı profilleme ile karşılaştırmaya izin verir ve deneysel koşullar boyunca mikroglial alt kümelerin moleküler çeşitliliğini vurgular.

figure-results-1
Şekil 1: Tek hücreli transkriptomik verilerin kalite kontrolü. (A) Mitokondriyal RNA içeriğinin hücreler arasında dağılımı. %>30 mitokondriyal RNA'ya sahip hücreler, potansiyel olarak stresli veya ölmekte olan hücreleri çıkarmak için hariç tutuldu. (B) Tutarlı bir gen-UMI oranı sağlamak ve düşük karmaşıklık kitaplıklarından gelen gürültüyü azaltmak için log10GenesPerUMI > 0.75 olan hücreler filtrelendi. (C) 500'den az tespit edilen transkripte (nUMI) veya 300'den fazla tespit edilen gene (nGENE) sahip hücreler de düşük kaliteli veya çoklu hücreleri ortadan kaldırmak için hariç tutuldu. (D) Filtreleme eşiklerinin etkisini gösteren NUMI ile nGene'nin korelasyon grafiği. Tespit edilen çiftler kaldırıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Tek hücreli transkriptomların UMAP görselleştirmesi. İki ayrı hayvandan elde edilen transkriptomik profillere dayalı olarak tek hücrelerin dağılımını gösteren UMAP grafiği. Her nokta, küme kimliğine göre renk kodlu bir hücreyi temsil eder. Mikroglial hücre kümesi, diğer hücre popülasyonları arasında tanımlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Çapraz doğrulama ile değerlendirilen Rastgele Orman sınıflandırıcısının ROC eğrisi. Gen ekspresyon profillerine dayalı olarak mikrogliayı diğer beyin hücresi tiplerinden ayırt etmek için kullanılan Rastgele Orman modelinin performansını gösteren Alıcı Çalışma Karakteristiği (ROC) eğrisi. Model, bilinen etiketlere sahip ~1000 hücreden oluşan bir set üzerinde eğitildi ve 10 kat çapraz doğrulama kullanılarak değerlendirildi. Test edilen beş istatistiksel model (Rastgele Orman, lojistik regresyon, saf Bayes, destek vektör makinesi ve karar ağacı) arasında Rastgele Orman modeli en yüksek sınıflandırma performansını elde etti. Eğrinin altındaki alan (AUC), modelin doğruluğunu yansıtır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Mikroglial hücrelerde diferansiyel gen ekspresyon analizi. Log2 kat değişikliğini temsil eden volkan grafiği ayarlanmış P-Değeri iki deney grubu arasında mikrogliada diferansiyel olarak ifade edilen genler için (kontrol ve serebellar beyin hasarı). Yukarı regüle edilmiş gen, ilgilenilen grupta (özd.1) daha yüksek oranda eksprese edilir ve aşağı regüle edilmiş genler, referans grubuna (özd.2) kıyasla daha düşük ekspresyon gösterir. Önemli ölçüde diferansiyel olarak eksprese edilen anahtar genler etiketlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Akış sitometrisi ile mikroglia tanımlaması için geçit stratejisi. (A) Doğum sonrası 3. gün (P3) faresinden alınan serebellar hücrelere uygulanan geçit stratejisi. (B) Çiftler hariç tutulacak şekilde tekliler seçildi. (C) Canlı hücreler, bir canlılık boyası kullanılarak tanımlandı; düşük FSC-A'ya sahip olaylar, kalıntıları gidermek ve sağlam hücrelerin analizini sağlamak için hariç tutuldu. (D) Mikroglia, iki farklı popülasyonla CD45+ ve CD11b+ olarak tanımlandı: hareketsiz mikroglia için CD45 düşük-CD11bint ve aktive mikroglia için CD45int -CD11byüksek. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6. Akış sitometrisi ile mikroglia marker ekspresyon profillerinin karakterizasyonu. (A) CD80, CD86 ve iNOS ekspresyonuna dayalı CD45+ CD11b+ hücrelerinin sıralı geçitlenmesi. (B) CD206'yı eksprese eden bir alt kümenin tanımlanması ve ardından Arg1 ekspresyonuna dayalı geçitleme. (C) CD86'yı eksprese eden bir alt kümenin tanımlanması ve ardından CD64 ekspresyonuna dayalı geçitleme. (D) CD163'ü eksprese eden bir alt kümenin tanımlanması ve ardından CD206 ekspresyonuna dayalı geçitleme. Bu geçit stratejileri, yüzey ve hücre içi işaretleyici ekspresyonuna dayalı olarak mikroglia popülasyonlarının fenotipik heterojenliğini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Tek hücreli RNA dizileme verilerinde Itgam ve Ptprc ekspresyonu kullanılarak mikroglia kimliğinin doğrulanması. UMAP, kümeler arasında yer alan Itgam ve Ptprc'nin gen ekspresyonu ile P15'teki serebellar hücrelerin transkripsiyonel manzarasını görüntüler. Bu kanonik miyeloid belirteçlerin birlikte ekspresyonu, mikroglia popülasyonlarının tanımlanmasını destekler ve akış sitometrisinde kullanılan belirteçlerle hizalanarak transkriptomik ve protein düzeyindeki analizler arasında çapraz doğrulama sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: Tek hücreli RNA dizilimi ile tanımlanan mikroglial hücrelerde seçilmiş bağışıklıkla ilgili genlerin ekspresyon profilleri. Keman grafikleri, CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 ve CD163 için gen ekspresyonunun bireysel mikroglial hücreler arasındaki dağılımını gösterir. Bu belirteçler genellikle bağışıklıkla ilgili süreçlerle ilişkilidir ve mikroglial popülasyonda gözlenen transkripsiyonel heterojenliği gösterir. Veriler hem kontrol hem de serebellar beyin hasarı (CBI) koşulları için gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Nöral hücre izolasyonu ve boyama için kullanılan çözeltilerin bileşimi. Bu tablo, ilgili konsantrasyonları ve bileşenleri de dahil olmak üzere, hücre izolasyonu ve boyama için gerekli çözeltilerin ayrıntılı bir bileşimini sağlar. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Hücre dışı boyama için antikor karışımı konsantrasyonları. Bu tablo, hücre dışı boyama için kullanılan antikorların ve canlı/ölü çözeltinin konsantrasyonlarını detaylandırır ve bir numune için boyama karışımındaki her antikor için gerekli hacimleri ve seyreltmeleri belirtir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: Hücre içi boyama için antikor karışımı konsantrasyonları. Bu tablo, hücre içi boyama için kullanılan antikor konsantrasyonlarını detaylandırır ve bir numune için boyama karışımındaki her antikor için gerekli hacimleri ve seyreltmeleri belirtir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, erken postnatal beyin gelişimi sırasında mikroglial hücrelerin izolasyonu ve karakterizasyonu için akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilimini (scRNA-seq) birleştiren ayrıntılı ve optimize edilmiş bir protokol sunmaktadır. Akış sitometrisi uygun maliyetli ve erişilebilir bir teknik olmaya devam ederken, tek hücreli transkriptomiklerle entegrasyonu, protein düzeyindeki işaretleyici ekspresyonunu gen düzeyindeki transkripsiyonel profillerle ilişkilendirerek tamamlayıcı bilgiler sağlar. Protokol, önemli gelişimsel zaman noktalarında mikroglial popülasyonların analizinde tekrarlanabilirlik ve güvenilirliği sağlamak için verimli ayrışma, enkaz ve miyelin giderme ve optimize edilmiş immün boyama stratejileri dahil olmak üzere olgunlaşmamış beyin dokusuna özgü teknik zorlukları ele almaktadır.

Akış sitometrisi, seçilen yüzey ve hücre içi belirteçlerin ekspresyonuna dayalı olarak mikroglial alt kümeleri tanımlamak için kullanıldı. Fonksiyonel durumları çıkarmaktan ziyade, alt kümeler, CD80+/CD86+/iNOS+ gibi işaretleyici ekspresyon profilleri ile ayırt edildi; CD206+/Arg1+ ; CD86+/CD64+ veya CD163+/CD206+ fenotipleri. Bu işaretleyici tanımlı popülasyonlar, mikroglia bölmesi içindeki moleküler heterojenliği yansıtır ve yüksek verimli karakterizasyon için pratik bir yaklaşım sağlar. Bu yüzey işaretleyiciye dayalı sınıflandırmalar, mikroglia çeşitliliğinin tüm karmaşıklığını yakalayamasa da, özellikle yüksek boyutlu moleküler araçların mevcut olmayabileceği bağlamlarda bilgilendirici olmaya devam etmektedir. M1/M2 paradigması gibi ikili sınıflandırmalardan, son literatürde12 açıklandığı gibi, mikroglial fenotiplerin spektrum benzeri, bağlama bağlı doğası kabul edilerek kasıtlı olarak kaçınılmıştır.

Bu gözlemler, mikroglia'nın hem normal beyin olgunlaşmasında hem de çevresel veya patolojik uyaranlara yanıt olarak rolünü vurgulayan önceki çalışmalarla tutarlıdır13,14. Mikroglia heterojenliğini ayırt etme yeteneği, mikroglial hücre polarizasyonunun nörogelişimsel bozukluklara nasıl katkıda bulunabileceğine dair değerli bilgiler sunar15,16.

Tek hücreli RNA dizilimi daha yüksek çözünürlük sunmasına ve transkripsiyonel olarak farklı mikroglial hücre alt popülasyonlarının tanımlanmasına izin vermesine rağmen, maliyeti ve analitik karmaşıklığı erişilebilirliğini sınırlar. Perinatal yaralanmayı takiben doğum sonrası 15. günde toplanan mevcut veri setinde, inflamatuar yanıtın zirvesi büyük ölçüde çözülür ve bu da düşük sayıda aktive mikroglia ile sonuçlanır. Sonuç olarak, UMAP gibi boyut azaltma teknikleri, iyi ayrılmış mikroglial alt kümeleri kurtarmadı ve küme düzeyinde transkripsiyonel analiz bu protokol makalesine dahil edilmedi.

Bu protokolün önemli bir yeniliği, doğum sonrası erken aşamalarda (P3 ila P30) mikroglial hücrelerin serebellumdan izole edilmesi ve karakterize edilmesi için optimizasyonudur. Bu bölge ve yaşa özgü bağlam, düşük hücre verimi, miyelin içeriği ve artan doku kırılganlığı gibi farklı zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu kısıtlamaları ele almak için protokol, uyarlanmış bir ayrışma iş akışını, verimli döküntü ve miyelin giderimini ve küçük hacimli serebellar doku için uygun dikkatlice ayarlanmış immün boyama koşullarını entegre eder. Serebellar mikroglianın fonksiyonel ve transkripsiyonel olarak diğer beyin bölgelerindekilerden farklı olduğunun giderek daha fazla tanınmasına rağmen, bunların izolasyonu ve analizi için ayrıntılı protokoller sınırlı kalmaktadır. Mevcut yöntem, özellikle serebellar mikroglianın gelişimsel çalışmaları için uyarlanmış, güvenilir ve erişilebilir bir iş akışı sunmaktadır.

Bu makalenin temel amacı, belirli biyolojik keşifleri bildirmekten ziyade tekrarlanabilir ve uyarlanabilir bir metodolojik çerçeve sağlamaktır. İş akışı, transkripsiyonel olarak farklı mikroglial durumların daha belirgin olabileceği diğer gelişim aşamalarına veya deneysel modellere uyum için uygundur. Bu tür bağlamlarda akış sitometrisi, özellikle tamamlayıcı analizlerle entegre edildiğinde değerli bir araç olmaya devam etmektedir.

Bu protokolün en güçlü yönlerinden biri, doğum sonrası 3. günden (P3) doğum sonrası 30. güne (P30) kadar çeşitli gelişim aşamalarına uyarlanabilirliğidir. Bu, beyin olgunlaşması ilerledikçe mikroglia fenotipinin uzunlamasına analizine izin verir. Akış sitometrisi ve scRNA-seq'in birlikte kullanımı, yalnızca yüzey belirteçlerini değil, aynı zamanda mikroglial hücrelerde yer alan hücre içi sinyal yollarını ve transkripsiyon faktörlerini de incelemeyi mümkün kılar.

Bununla birlikte, enzimatik sindirim, bazı yüzey belirteçlerinin ekspresyonunu etkileyebilir ve bu da belirli deneysel hedefler için sindirim koşullarının dikkatli bir şekilde optimize edilmesini gerektirir17,18. Ek olarak, ne akış sitometrisi ne de tek hücre dizilimi, kendi doğal ortamlarındaki mikroglial hücre etkileşimlerinin uzamsal ve işlevsel nüanslarını tam olarak yakalayamayabilecek popülasyon düzeyinde veriler sağlamaz. Tek hücreli uzamsal tekniklerin dahil edilmesi, mikroglial hücrelerin uzamsal bağlamını koruyarak bu sınırlamanın giderilmesine yardımcı olabilir. Bu protokolü immünohistokimya, in vivo görüntüleme, western blot veya tek hücreli uzamsal transkriptomik gibi görüntüleme teknikleriyle birleştiren gelecekteki çalışmalar, mikroglial hücre dinamikleri hakkında tamamlayıcı bilgiler sunabilir.

Bu yöntem, inflamasyon, hipoksi veya çevresel stres etkenleri gibi erken yaşam hakaretlerinin mikroglial hücre fenotiplerini nasıl etkilediğini ve uzun vadeli nörogelişimsel sonuçlara nasıl katkıda bulunduğunu araştırmak için yeni yollar açar. Mikroglial hücre aktivasyon durumlarının kesin ve güvenilir karakterizasyonunu sağlayarak, nörogelişimsel bozuklukları önlemeyi veya hafifletmeyi amaçlayan, yaşamın erken dönemlerinde mikroglial yanıtları modüle etmek için terapötik hedeflerin tanımlanmasını kolaylaştırır.

Sonuç olarak, bu protokol erken beyin gelişimi sırasında mikroglial hücre çeşitliliğini incelemek için sağlam ve erişilebilir bir çerçeve sunar. Akış sitometrisi ve tek hücreli RNA diziliminin kombinasyonu, çeşitli gelişim aşamaları ve deneysel modeller arasında esnek uygulamaya olanak tanıyarak mikroglia biyolojisinin hem fizyolojik hem de patolojik bağlamlarda daha derinlemesine araştırılmasını kolaylaştırır.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmişlerdir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (487354) ve Fonds de Recherche du Québec (333845) tarafından desteklenmiştir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
140 &mikro; m metal örgü filtre Sigma-AldrichS3895 Serisi
15 mL tüpSarstedt62.554.205
5 mL tüpSarstedt55.526.006
96 kuyucuklu tabak konik tabanlı Sarstedt82.1583.001
Arjinaz 1 - Eşlenik Pecy7 - Klon : A1exF5Thermo Fisher Bilimsel25-3697-82
Tezgah üstü stabil floresan reaktiflerDavetliA49905 Serisi
CD11b - Konjuge Fitc - Klon : M1/70BD Pharmingen553310
CD163 - Eşlenik SB600 - Klon : TNKUPJThermo Fisher Bilimsel63-1631-82
CD206 - Eşlenik APC - Klon : C068C2Biyolojik Efsane141708
CD45 - Eşlenik A700 - Klon : 30-F11BD Pharmingen560510
CD64 - Konjugat  PerCP-eF710 - Klon : X54-5/7.1Thermo Fisher Bilimsel46-0641-82
CD80 - Eşlenik SB436 - Klon : 16-10A1Thermo Fisher Bilimsel62-0801-82
CD86 - Eşlenik Pe - Klon : GL-1Biyolojik Efsane105008
Kollajenaz DSigma– Atalay11088866001
DNase ISigma– Atalay10104159001
Fetal sığır serumu (FBS)Sigma– Aldrich F1051 Serisi
HBSS (Hank'in dengeli tuz çözeltisi) 10xWisent Bioproducts 311506CL
HemositometreVWR Uluslararası82030-470
HEPESWisent Bioproducts 330.050.EL
iNOS - Eşlenik PE- eF610 - Klon : CXNFTThermo Fisher Bilimsel61-5920-82
KartalThermo Fisher BilimselBP366-500 Serisi
KH2PO4Thermo Fisher BilimselBP362-500 Serisi
Canlı/Ölü AmcyanThermo Fisher BilimselL34957 Serisi
Mikroglial hücre kültürü ortamıYaşam TeknolojileriA12475-01 (İngilizce)
Na2HPO4Thermo Fisher BilimselBP332-500 Serisi
NaClThermo Fisher BilimselBP358-212
ParaformaldehitSigma– Aldrich P6148
Sıçan anti fare CD16 / CD32BD Biosciences 553142
SaponinSigma– Aldrich S7900 Serisi
scRNAseq kitaplıkları10X Genomik1000121
Silika bazlı kolloidal ortamThermo Fisher Bilimsel45001747
Sodyum azidThermo Fisher BilimselBP922I-500 Serisi
Tripan MavisiGibco1525006

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brain structural and functional development: Genetics and experience. Dev Med Child Neurol. 57 (Suppl 2), 4-9 (2015).">Berardi, N., Sale, A., Maffei, L. Brain structural and functional development: Genetics and experience. Dev Med Child Neurol. 57 (Suppl 2), 4-9 (2015).
  2. Microglial functional alteration and increased diversity in the challenged brain: Insights into novel targets for intervention. Brain Behav Immun Health. 16, 100301(2021).">Tremblay, M. E. Microglial functional alteration and increased diversity in the challenged brain: Insights into novel targets for intervention. Brain Behav Immun Health. 16, 100301(2021).
  3. Sublime microglia: Expanding roles for the guardians of the CNS. Cell. 158 (1), 15-24 (2014).">Salter, M. W., Beggs, S. Sublime microglia: Expanding roles for the guardians of the CNS. Cell. 158 (1), 15-24 (2014).
  4. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (Pt 5), 1138-1159 (2015).">Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (Pt 5), 1138-1159 (2015).
  5. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).">Nayak, D., Roth, T. L., Mcgavern, D. B. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
  6. Microglia in brain development and regeneration. Development. 149 (8), dev200425(2022).">Mehl, L. C., Manjally, A. V., Bouadi, O., Gibson, E. M., Tay, T. L. Microglia in brain development and regeneration. Development. 149 (8), dev200425(2022).
  7. The role of microglia in early neurodevelopment and the effects of maternal immune activation. Semin Immunopathol. 46 (1-2), 1(2024).">Mastenbroek, L. J. M., Kooistra, S. M., Eggen, B. J. L., Prins, J. R. The role of microglia in early neurodevelopment and the effects of maternal immune activation. Semin Immunopathol. 46 (1-2), 1(2024).
  8. Microglial dynamics during human brain development. Front Immunol. 9, 1014(2018).">Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Front Immunol. 9, 1014(2018).
  9. Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation. Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).">Srakocic, S., et al. Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation. Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).
  10. Current methods for the microglia isolation: Overview and comparative analysis of approaches. Cell Tissue Res. 395 (2), 147-158 (2024).">Akhmetzyanova, E. R., Rizvanov, A. A., Mukhamedshina, Y. O. Current methods for the microglia isolation: Overview and comparative analysis of approaches. Cell Tissue Res. 395 (2), 147-158 (2024).
  11. Immune phenotypes of microglia in human neurodegenerative disease: Challenges to detecting microglial polarization in human brains. Alzheimers Res Ther. 7 (1), 56(2015).">Walker, D. G., Lue, L. F. Immune phenotypes of microglia in human neurodegenerative disease: Challenges to detecting microglial polarization in human brains. Alzheimers Res Ther. 7 (1), 56(2015).
  12. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).">Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  13. Single-cell RNA sequencing of microglia throughout the mouse lifespan and in the injured brain reveals complex cell-state changes. Immunity. 50 (1), 253-271.e6 (2019).">Hammond, T. R., et al. Single-cell RNA sequencing of microglia throughout the mouse lifespan and in the injured brain reveals complex cell-state changes. Immunity. 50 (1), 253-271.e6 (2019).
  14. Immunometabolism in the brain: How metabolism shapes microglial function. Trends Neurosci. 43 (11), 854-869 (2020).">Bernier, L. P., York, E. M., Macvicar, B. A. Immunometabolism in the brain: How metabolism shapes microglial function. Trends Neurosci. 43 (11), 854-869 (2020).
  15. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nat Neurosci. 17 (1), 131-143 (2014).">Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nat Neurosci. 17 (1), 131-143 (2014).
  16. Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities. Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).">Gosselin, D., et al. Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities. Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).
  17. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), e0231132(2020).">Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), e0231132(2020).
  18. The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts. Cell Transplant. 28 (5), 638-644 (2019).">Skog, M., et al. The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts. Cell Transplant. 28 (5), 638-644 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometrySingle Cell AnalysisMicroglia ActivationPostnatal Brain DevelopmentMouse CerebellumCell IsolationRNA SequencingTissue DissociationSurface Marker ProfilingDifferential Expression

Related Articles