Yöntem makalesi

Rekabetçi Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi (ELISA) Kullanılarak Katı Dokularda Siklik Guanozin Monofosfat (cGMP) Ölçümü

DOI:

10.3791/68432

⸱

3 Temmuz 2025

 ,  ,  , 
1Molecular Biology and Genetics Section, Molecular Medicine Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, rekabetçi enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) kullanarak katı dokulardaki siklik guanozin monofosfat (cGMP) konsantrasyonlarını ölçer. Protokol, katı dokunun nasıl işleneceğini, rekabetçi ELISA'nın nasıl gerçekleştirileceğini, absorbansların mililitre başına pikomollerde cGMP konsantrasyonlarına nasıl dönüştürüleceğini ve nihai konsantrasyonların doku gramı başına cGMP'nin nanomolleri olarak nasıl hesaplanacağını açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siklik guanozin monofosfat (cGMP) üreten ana yol, nitrik oksit (NO)-cGMP yoludur. Bu yolda, NO, guanozin trifosfatı cGMP'ye dönüştüren çözünür guanilil siklazın (sGC) katalitik aktivitesini uyarır. NO ilgi çekicidir, çünkü memelilerde ana vazodilatör, trombosit agregasyonunun bir inhibitörü, bağışıklık fonksiyonunun bir aracısı, bir nörotransmitter olarak işlev görür ve diğer fizyolojik rollerin yanı sıra fiziksel aktivite sırasında dayanıklılığı arttırır. NO'nun farklı dokulardaki bolluğunu ölçmek, işlevlerini aydınlatmaya yardımcı olabilir. Bununla birlikte, NO, saniyeden daha kısa yarı ömrü nedeniyle doğrudan ölçülemez. Tipik olarak, NO'nun metabolitleri, nitrat ve nitrit, NO'nun bolluğunu tahmin etmek için ölçülür. Bunun nedeni, bu moleküllerin redoks reaksiyonları yoluyla in vivo olarak birbirine dönüştürülebilmesidir. NO'nun bolluğunu tahmin etmek için daha az yaygın bir yöntem, NO'nun aşağı akışında bir sinyal molekülü olan cGMP konsantrasyonunun ölçülmesini gerektirir. Yine de, dokulardaki cGMP ölçümü, NO'nun organlardaki işlevlerini daha iyi anlama imkanı yaratmasına rağmen nadiren yapılır. Bu nedenle, katı organ ve dokulardaki cGMP konsantrasyonlarını ölçmek için bir protokole ihtiyaç vardır. Bu protokolde, toplanan domuz dokuları homojenize edildi, işlenmiş örnekler üzerinde rekabetçi ELISA uygulandı ve absorbanslar, orijinal dokunun gramı başına cGMP'nin nanomollerine dönüştürüldü. Kısacası, bu protokol, döngüsel GMP ELISA kitini kullanarak katı dokulardaki cGMP konsantrasyonlarını ölçmek için basit bir yöntemi tanımlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siklik guanozin monofosfat (cGMP), nitrik oksit (NO)-cGMP yolu yoluyla fizyolojik değişiklikleri indükleyebilen bir sinyal molekülüdür. NO-cGMP yolunda NO, guanozin trifosfatı cGMP'ye dönüştüren ve katalitik aktivitesini 1,2 artıran sitozolik bir enzim olan çözünür guanilil siklaz'a bağlanır. cGMP konsantrasyonlarındaki müteakip artış, vazodilatasyonu3 teşvik eden sinyal yollarını aktive eder ve NO'nun in vivo varlığının ana fizyolojik yanıt özelliği olan kan basıncında 4,5 bir azalmaya yol açar. Ek olarak, NO'nun bağışıklık fonksiyonunu6 etkilediği, fiziksel aktivite4 sırasında dayanıklılığı artırdığı ve trombosit agregasyonunu7 inhibe ederek kan pıhtılaşmasını önlediği bilinmektedir.

NO'nun doğrudan ölçülmesi, çoğu biyolojik dokuda in vivo8 saniyeden daha kısa yarı ömrü nedeniyle zorlaşır. Sonuç olarak, NO'nun fizyolojik etkilerini aydınlatmak, bolluğunu ex vivo olarak ölçmek için bir yöntem gerektirir. Bu nedenle, kullanılabilir kantitatif yöntemler NO'nun doğrudan ölçülmesini önler. Dokulardaki NO konsantrasyonlarını tahmin etmek için yaygın bir yöntem, NO'nun daha kararlı metabolitlerini ölçmektir: nitrit ve nitrat 4,5,9,10,11. NO'nun bolluğunun ölçüsü olarak nitrit ve nitrat konsantrasyonlarının kullanılmasının ana komplikasyonu, her iki metabolitin de sırasıyla bir NO öncüsü ve depolama molekülü olarak hizmet etmesidir. NO'nun metabolitleri, özellikle nitrat, bazı gıdalarda bol miktarda bulunur. Bu nedenle, cGMP konsantrasyonlarındaki değişiklikler, cGMP'nin NO'nun aşağı akışında olması, aktif NO miktarlarını tahmin etmek için yararlıdır ve NO'nun bolluğu, daha önce mevcut olan nitrit ve nitratın müdahalesi olmadan belirlenebilir.

Önceki araştırmalar, plazma12 ve trombositler13'teki cGMP konsantrasyonlarının ölçülmesine dayanıyordu, ancak daha az yaygın olarak görülen katı dokulardaki cGMP konsantrasyonlarının ölçülmesidir. Katı dokulardaki cGMP konsantrasyonlarını ölçme yeteneği, NO'nun belirli organlardaki aktivitesinin karakterizasyonuna izin verecektir. Amaç, rekabetçi ELISA kullanarak katı dokularda cGMP'yi ölçmek için basit bir yöntem belirlemekti. Rekabetçi ELISA kullanmanın bir avantajı, genellikle başka amaçlar için kullanılan bir mikroplaka okuyucu gibi, NO ile ilgilenen çoğu laboratuvarda yaygın olarak bulunan ekipmanı gerektirmesidir. Buna karşılık, diğer bazı ölçüm yöntemleri, mikroskoplar 14,15, bir sintilasyon sayacı16 veya bir lazer17 gibi NO'ya odaklanan deneyler sırasında nadiren kullanılan ekipman gerektirir. Erişilebilirliğine ek olarak, rekabetçi ELISA ile cGMP ölçümü hassastır; cGMP konsantrasyonları, cGMP/mL18'in 0.1 pikomolüne (pmol) kadar tespit edilebilir. cGMP ELISA kiti (Malzeme Tablosu) protokolü18'de yapılan küçük değişikliklerle, rekabetçi ELISA kullanılarak katı dokularda cGMP'yi ölçmek için bir yöntem oluşturulmuştur.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan işlemleri, NİDDK Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan Moleküler Tıp Dalı Hayvan Çalışma protokolüne (ASP K049-MMB-23) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Doku toplama, MedStar Sağlık Araştırma Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından belirlenen yönergeleri takip etti (protokol numarası: 2006001373 2020-017). Çalışmada 3 aylık ve 30-35 kg ağırlığında genç yetişkin Yorkshire melez domuzları (iki erkek ve iki dişi) kullanıldı. Şekil 1 , cGMP ELISA kit protokolünün adımlarını gösteren bir şemayı göstermektedir. Çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

figure-protocol-1
Şekil 1: Protokol şeması. cGMP ELISA kit protokolünün adımlarını gösteren bir şema. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Doku örneği hazırlama

NOT: Dokular toplanmadan önce bir heparin sodyum çözeltisi ile perfüze edildi ve daha sonra kullanımdan önce -80 ° C'de saklandı. Doku örneklerinin toplanmasıyla ilgili ayrıntılar için Park ve ark.19'a bakın.

  1. Doku örneği işleme
    1. Prosedüre başlamadan önce bir doku pulverizatörünü, cımbızı ve kaşığı kuru buz üzerinde 10 dakika soğutun.
    2. Toz haline getirme sırasında bir kısmı kaybedilebileceği için fazla dokuyu tartın (verim yaklaşık% 90).
      NOT: Önceden, 170 mg'dan fazla başarılı sonuçlar veriyordu. İstenirse kütle arttırılabilir veya azaltılabilir. Doku kütlesinin, doku örneği asetilasyonu ve doku örneği seyreltme adımları için yeterli bir örnek hacmi ile sonuçlandığından emin olun.
    3. Dokuyu kuru buz üzerindeki pulverizatöre ekleyin.
    4. Dokuyu sıvı nitrojen ile hızlı dondurun ve sıvı nitrojenin tamamen buharlaşmasına izin verin.
    5. Pulverizatör kapağını değiştirin ve bir tokmakla 15 kez vurun.
      NOT: Pulverizatör kurulumu mevcut değilse veya kullanılamıyorsa, numune donmuş halde veya en azından buz üzerinde buzdolabında tutulurken makas veya neşter kullanılarak mümkün olduğunca küçük parçalar halinde kesilmelidir. Bu adım iyi bir homojenizasyon sağlar ve özellikle daha sert dokular için çok önemlidir.
    6. Bir boncuk homojenizatör tüpünün darasını alın ve toz haline getirilmiş dokuyu soğutulmuş kaşık ve cımbız kullanarak tüpe aktarın.
    7. Konsantrasyonları daha sonra molariteden kütle başına mol seviyesine dönüştürmek için boncuk homojenizatör tüpüne eklenen dokunun kütlesini kaydedin. Numuneyi buz üzerinde tutun.
    8. Homojenizasyon tüpüne, miligram cinsinden doku kütlesinin katlarına eşit 0.1 N hidroklorik asit mikrolitre cinsinden bir hacim ekleyin.
      NOT: Uygun seyreltmeler, ölçülen numunelerin standart eğri üzerine düşmesine neden olur. Bu seyreltmeler, deneme yanılma yoluyla farklı doku tipleri için bulunur. Önceki deneylerde, iskelet kası dokusu için 1:10 seyreltme oranı ve karaciğer dokusu için 1:5 seyreltme oranı başarılı sonuçlar vermiştir. Referans olarak, 100 mg doku seyreltilirse, 1:10 seyreltme oranı 1.000 μL 0.1 N hidroklorik asit gerektirir ve 1:5 seyreltme oranı 500 μL gerektirir.
    9. Doku örneklerini bir boncuk değirmeni homojenizatörü veya benzer bir teknik kullanarak homojenize edin.
      NOT: Homojenizasyon sırasında numuneyi ara sıra buz kullanarak soğutun. Bir boncuk değirmeni homojenizatörü mevcut değilse, hücreleri etkili bir şekilde parçalayan ve doku homojenatı oluşturan diğer homojenizasyon yöntemleri, döner homojenizatör veya ultrasonik homojenizatör kullanımı da dahil olmak üzere ikame edilebilir.
    10. Santrifüj, 4 °C'lik bir numune sıcaklığını korurken 17.000 x g hızında 30 dakika boyunca homojenize olur.
      NOT: Yetersiz seyreltilmiş iskelet kası dokusu homojenatları aşırı viskoz ve jel benzeri hale gelir. Bu en iyi santrifüjlemeden sonra görülebilir.
    11. Süpernatanı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve süpernatanı 4 °C'lik bir sıcaklığı korurken 17.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
    12. Bir süpernatan alikotunu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve numuneyi buz üzerinde tutun.
      NOT: 250 μL süpernatanın asetilasyonu başarılı sonuçlar vermiştir. Protokolü duraklatmak için bu numuneleri -80 °C'de dondurun ve 48 saate kadar saklayın. Asetilasyon işlemi için süpernatan hacminin asetilasyon gününde ölçülmesi önerilir.

2. Standart hazırlık

NOT: ELISA mikroplaka hazırlama gününde standartları hazırlayın.

  1. ELISA tampon hazırlama
    1. 90 mL ultra saf su içeren bir cam şişeye çözülmüş 10x ELISA tampon konsantresi ekleyin.
      NOT: Kalan 10x ELISA tampon konsantresini hazırlanan ELISA tamponu ile durulamaya ve tamponu cam şişeye geri koymaya özen gösterin. 4 °C'de 2 aya kadar saklayın.
  2. Standart stok hazırlama
    1. Standart şişeye 1 mL ELISA tamponu ekleyin ve çözünmesi için çalkalayın.
      NOT: 4 °C'de 6 haftaya kadar saklayın.
  3. Standart seri seyreltme
    1. Bir tüp standart B'yi ve dokuz tüpü standart 0'dan standart 8'e kadar etiketleyin.
    2. Standart B etiketli tüpe 9.9 mL ELISA tamponu ekleyin.
    3. 100 μL standart stoğu (300 pmol / mL cGMP) standart B tüpüne aktarın ve iyice girdap yapın.
    4. Standart B tüpündeki 1.000 μL'lik çözeltiyi standart 1 tüpe aktarın.
    5. Standart 0 etiketli tüpe ve standart 2 ila standart 8 etiketli tüplere 500 μL ELISA tamponu ekleyin.
    6. Standart 1'i girdaplayın ve ardından 500 μL çözeltiyi standart 1'den standart 2'ye aktarın.
    7. Standart 2'yi girdaplayın ve ardından 500 μL çözeltiyi standart 2'den standart 3'e aktarın.
    8. 500 μL'yi standart n-1'den standart n'ye aktarmaya devam edin, her eklemeden sonra standartları iyice girdapladığınızdan emin olun.
    9. Standart 8'den 500 μL çözelti atın.
      NOT: Optimum bir standart eğri için belirtilen yerlerde standartları girdapladığınızdan emin olun. 0 ila 8 arasındaki standartlar 500 μL hacmindedir. Standartları kullanana kadar 4 °C'de saklayın. Seyreltildikleri gün standartları kullanın.

3. Asetilasyon

NOT: Asetilasyon reaksiyonu sırasında, cGMP molekülünün 2' hidroksil grubuna bir asetil grubu eklenir, bu da cGMP'nin yapısını değiştirir ve antikorların bağlanma afinitesinde bir artışa yol açar ve test duyarlılığını ~ 10 kat artırır. 1.0 pmol / mL'den fazla cGMP içeren numunelerde, asetilasyon olmadan ölçümler alınabilir ve bu adım atlanabilir. Asetilasyon ihtiyacı, duruma göre deneysel olarak belirlenmelidir.

  1. Potasyum hidroksit hazırlama
    1. 4 M'lik bir çözelti oluşturmak için potasyum hidroksit şişesine 10 mL ultra saf su ekleyin.
      NOT: Potasyum hidroksit çözüldüğü için şişenin kapağını kapatmayın. Aylarca oda sıcaklığında saklayın.
  2. Doku örneği asetilasyonu
    1. Numunenin 250 μL'lik bir alikotuna 50 μL (5:1) 4 M potasyum hidroksit ekleyin ve ilaveyi hızla 12,5 μL (20:1) asetik anhidrit ile takip edin.
    2. 15 saniye boyunca girdap.
    3. Numuneye 12,5 μL 4 M potasyum hidroksit ekleyin ve kısaca girdaplayın.
    4. İsteğe bağlı: İskelet kası örnekleri asetilasyon adımlarını izleyerek katılaşırsa, örnekleri 10 dakika boyunca 17.000 x g'da santrifüjleyin.
  3. Standartların asetilasyonu
    1. Standart 0 etiketli tüpe 100 μL 4 M potasyum hidroksit ve hemen ardından 25 μL asetik anhidrit ekleyin.
    2. 15 saniye boyunca standardı girdaplayın.
    3. Standarda 25 μL 4 M potasyum hidroksit ekleyin ve kısaca girdaplayın.
    4. Kalan numaralandırılmış standartlar için bu adımları yineleyin.
      NOT: Tutarlı sonuçlar elde etmek için tüm numuneleri ve standartları aynı süre boyunca vorteksleyin.

4. Doku örneği seyreltme

  1. Bir mikrosantrifüj tüpüne önceden belirlenmiş oranlarda ELISA tamponu ve bir alikot asetillenmiş numune ekleyin.
    NOT: Her numune için iki farklı seyreltme gereklidir. Ölçülen cGMP konsantrasyonlarının standart eğri üzerine düşmesine neden olan seyreltme oranları deneme yanılma yoluyla bulunur. Yüzde figure-protocol-2figure-protocol-3










figure-protocol-4



    3. figure-protocol-5
    4. figure-protocol-6
      figure-protocol-7
    5. figure-protocol-8figure-protocol-9
    1. figure-protocol-10
    2. figure-protocol-11
      figure-protocol-12
    3. figure-protocol-13
    4. figure-protocol-14
    1. figure-protocol-15
      figure-protocol-16

    2. figure-protocol-17

    1. figure-protocol-18

    2. figure-protocol-19

    3. figure-protocol-20

    4. figure-protocol-21

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diyet sodyum klorür (0.15 mmol / kg) veya 15N etiketli nitrat (0.15 mmol / kg) ile muamele edilen Yorkshire evcil domuzları, chow'da bir bolus olarak art arda beş gün boyunca günde bir kez uygulanan bir heparin sodyum (% 0.9 sodyum klorür) ile perfüze edildi. Koleksiyonun tüm detayları daha önce yayınlanmıştı19. Dört Yorkshire evcil domuzunun gluteus kaslarındaki ve karaciğerlerindeki cGMP konsantrasyonları, açıklanan ELISA protokolüne uygun olarak ölçüldü. Karaciğer dokuları 1: 5 seyreltme oranında ve gluteus kasları 1: 10 seyreltme oranında seyreltildi ve proteinleri çökeltmek için 0.1 N hidroklorik asit (HCl) ile seyreltildi. HCl ile seyreltilmiş homojenatlar asetillendi ve daha sonra hem karaciğer hem de gluteus kas örnekleri için 1: 2 ve 1: 3 seyreltme oranında ELISA tamponu ile seyreltildi. cGMP konsantrasyonları yukarıda tarif edildiği gibi ölçüldü. Absorbanslar, hazırlanan numunenin mililitresi başına cGMP pikomollerine ve daha sonra yukarıdaki protokolde belirtildiği gibi doku gramı başına (nmol / g doku) cGMP nanomollerine dönüştürüldü.

Karaciğer dokularında ölçülen cGMP konsantrasyonları, yukarıdaki koşullar altında optimal deneysel sonuçlar vermiştir. Domuz karaciğerinde kontrol ve nitrat ile tedavi edilen gruptaki cGMP konsantrasyonları sırasıyla 0.0202 nmol/g ± 0.003 nmol/g doku ve 0.0364 nmol/g ± 0.011 nmol/g dokudur (Şekil 3). Birkaç değer sonuçların güvenilirliğini onaylar. 0.466 ila 0.475 arasında değişen boşluklar çıkarılmış B0 kuyucuklarının absorbansları, 0.3 AU ila 1.0 AU aralığına girer ve Ellman reaktifi ile yeterli mikroplaka gelişimini doğrular. Standart eğrinin yüksek kalitesi, hem standart 1'den standart 8'e kadar absorbanslardaki artımlı artışlar hem de 0,99'luk bir belirleme katsayısı ile doğrulanan standart eğrinin doğrusallığı ile sergilenir. Ölçülen her kuyu için yüzde figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, rekabetçi ELISA kullanarak katı dokulardaki cGMP konsantrasyonlarını ölçmek için gereken adımlar hakkında talimatlar sağlar. cGMP konsantrasyonlarındaki değişiklikler, dokulardaki NO'nun bolluğundaki farklılıkları gösterebilir. Solid dokulardaki bu farklılıkların araştırılması ile çeşitli organlardaki NO ile ilgili bilgiler aydınlatılabilir.

Protokolde, doku örnekleri ilk olarak ELISA'ya hazırlık olarak homojenize edildi. Bu, bir katı doku kütlesinin hızlı dondurulması ve ardından toz haline getirilmesiyle başladı. Homojenizasyon adımından önce dokuların parçalanması, boncuk homojenizatörünün hücreleri parçalamasına yardımcı olmak içindir. Dokular, diğer yöntemlerde kullanılan bir teknik olan proteinleri çökeltmek için 0.1 N hidroklorik asit içinde homojenize edildi20,21. Son olarak, katılar ve çökelti, santrifüjleme yoluyla çözünür bileşenlerden ayrıldı. Standart eğriyi yapmak için, bir cGMP stoğu (300 pmol cGMP/mL), sekiz farklı standart oluşturmak için seri olarak seyreltildi. Standartlar ve numuneler, 0.1 pmol cGMP/mL'ye kadar düşük konsantrasyonları tespit ederek testin hassasiyetini artırmak için asetillendi. Duyarlılıktaki bu artış, asetil grubu cGMP ile bir bağ oluşturduğunda gerçekleştirilir ve her bir antikorun (antiserumda bulunur) asetillenmiş cGMP18'e bağlanma yeteneğini geliştirir. Hem standartların hem de numunelerin asetillenmesi, kuyucuklar arasındaki cGMP bağlanmasında homojenlik sağlar. Mikroplaka kuyucuklarındaki cGMP konsantrasyonunun 1.0 pmol/mL18'i aşması bekleniyorsa, asetilasyon adımı hem standartlar hem de numuneler için atlanabilir.

Numunelerin kuyucuklara eklenmesine hazırlık olarak, numuneler ELISA tamponu ile daha da seyreltildi. Ek seyreltme, numunelerin standart eğri üzerine düşmesine ve NSB, B0 ve standart kuyucukların içeriğine daha yakından benzemesine izin vererek tekdüzelik yarattı. Numuneler ve standartlarla birlikte, kuyularda birkaç başka çözelti karıştırılır. NSB kuyularında, antiserum kesilirken ELISA tamponu (asetilasyon reaktifleri olan ve olmayan) eklenir. Bu, antiserumu içeren spesifik antikorun yokluğunda kuyuya yapışan fare IgG'ye bağlanan AChE izleyici (cGMP'ye bağlı asetilkolinesteraz) miktarını belirlemek içindir. B0 kuyucukları ELISA tamponu (asetilasyon reaktifleri ile), AChE izleyici ve antiserum içeriyordu; bu nedenle, B0 kuyuları, cGMP'nin rekabeti olmadan AChE izleyicinin bağlanma kabiliyetini sergiler. Tüm kuyucuklar uygun şekilde doldurulduktan sonra, mikroplaka inkübe edilir ve daha sonra yıkanır. Ellman'ın reaktifi kuyulara eklendi. Son olarak, Ellman'ın reaktifi eklendikten sonra TA kuyusuna bir AChE izleyici eklendi. Bu kuyu, antikorlar tarafından mikroplakaya ne kadar izleyici bağlandığına bakılmaksızın AChE izleyicinin katalitik aktivitesini temsil eder. Mikroplaka, AChE izleyicinin kolorimetrik bir reaksiyonu katalize etmesine izin verecek şekilde oda sıcaklığında geliştirilmiştir.

Protokoldeki birkaç adım, testin sonuçlarını değiştirebilir; En iyi sonuçlar için takip eden adımları gerçekleştirirken ekstra özen gösterilmelidir. Homojenizasyon adımı için ve asetilasyondan sonra her doku tipi için uygun seyreltmelerin belirlenmesi, numunelerin standart eğriye düşmesini garanti etmek için gereklidir. Standartlar hazırlanırken, bir alikotun çıkarılmasından önce veya bir alikotun eklenmesini takiben çözeltiler iyice girdaplanmalı veya karıştırılmalıdır. Bu adım, her standardın beklenen cGMP konsantrasyonlarına ulaşmak için önemlidir. Asetilasyon adımları sırasında, tutarlı absorbans okumaları elde etmek için her standart ve numune aynı süre boyunca girdaplanmalıdır. Standartlar ve numuneler de uygun kuyuya bir alikot eklenmeden hemen önce girdaplanmalıdır. Bu uygulama daha doğru cGMP konsantrasyonları ile sonuçlanır. Mikroplakanın tamamen yıkanması, tüm bağlanmamış AChE izleyicilerini kuyudan çıkardığı için absorbans değerlerinin doğruluğunu da artırır. Ellman reaktifinin eklenmesinden sonra, mikroplakanın gelişmesi için yeterli zamana izin verilmeli, renge ve en önemlisi B0 kuyucuklarının absorbanslarına dikkat edilmelidir. Kopyalar veya üçlüler arasındaki cGMP konsantrasyonunun, daha yüksek konsantrasyonlara sahip olanlara kıyasla daha düşük cGMP seviyelerine sahip numunelerde daha fazla değişebileceğini bilmek önemlidir. Daha konsantre bir numunenin ölçülmesi bu sorunun çözülmesine yardımcı olabilir. Ek olarak, mikroplakalar arasındaki herhangi bir değişkenliği hesaba katmak için, aynı doku tipindeki numuneler mümkün olduğunda aynı plaka üzerinde ölçülmelidir. Bu yönergelerin izlenmesinin, tahlilden elde edilen verilerin kalitesini iyileştirmesi beklenmektedir.

Yukarıdaki protokol diğer yumuşak, katı dokulara tahmin edilebilir. Yukarıdaki protokolün doku hazırlama alt bölümünün daha da geliştirilmesi, vaskülaritesi nedeniyle ilgi çekebilecek kemik de dahil olmak üzere sert dokuların işlenmesi için uygun bir yöntemle sonuçlanabilir. Bu tekniğin sürekli geliştirilmesi, çok çeşitli katı dokularda cGMP konsantrasyonlarını ölçmek için uygun bir yöntemle sonuçlanabilir ve bu da hemen hemen her dokuda NO'nun bolluğu hakkında ek bilgi toplamak için yararlı bir yöntemle sonuçlanabilir. Yukarıda belirtilen rekabetçi ELISA protokolü, cGMP'yi ölçmek ve NO'nun bolluğunu tahmin etmek için yararlı bir teknik olsa da, iki önemli sınırlaması vardır: (1) Bu test, çözünür guanilil siklaz tarafından sentezlenen cGMP ile partikül guanilil siklaz (pGC) tarafından sentezlenen cGMP arasında ayrım yapmaz. Natriüretik peptitler pGC aktivitesini22 uyarır ve bu nedenle, bu yol yoluyla cGMP'deki değişiklikler NO'nun bolluğundaki değişiklikleri göstermez; (2) Ek olarak, fosfodiesteraz (PDE) enzimleri ELISA testinin sonuçlarını etkiler. Birkaç PDE, cGMP'yi hidrolize eder ve sGC'nin NO23 tarafından uyarılmasını takiben konsantrasyonunu azaltır. Bu nedenle, PDE'lerin katalitik aktivitesi, cGMP konsantrasyonları ile NO'nun bolluğu arasındaki bağlantıyı gizleyebilir. cGMP kaybını önlemek için sildenafil gibi bir PDE5 inhibitörünün eklenmesi, cGMP konsantrasyonlarındaki eğilimleri gözlemlemek için ölçümler elde etmenin aksine, öncelikle kesin cGMP konsantrasyonları elde etmeye odaklanan deneyler için tavsiye edilir. PDE5 inhibitörleri, numune alımından yaklaşık 1 saat önce hayvanlara sildenafil olarak uygulanabilir (etkiler 4 saat24 saate kadar sürer) veya bu tür bir uygulama mümkün değilse, toplanan numunelere sildenafil eklenebilir. Doku toplandıktan sonra PDE'leri inhibe ederken, dokuların sildenafil varlığında homojenize edilmesi için 0.1 N hidroklorik aside sildenafil ekleyin. Hayvan tedavisi ile sildenafil arasında çapraz konuşma olmadığından emin olmak için sildenafil içeren ve içermeyen ölçümlerin yapılması gerekir.

Sınırlamalarına rağmen, tahlil, NO sinyalinin aşağı akış iletimi hakkında bilgilendirici bir içgörü olarak kullanılır. Sonuç olarak, katı dokulardaki cGMP konsantrasyonlarının ölçümünün diğer NO ölçüm yöntemleriyle birleştirilmesi, NO'nun organlardaki etkilerinin daha iyi anlaşılmasını sağlar.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, intramural NIDDK/NIH tarafından Alan N. Schechter'e verilen 1ZIADK025104-18 hibesi ile desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL BD Şeffaf Oral ŞırıngaBecton Dickinson50382903052177
14 mL Yuvarlak Tabanlı Test TüpüDoğan352059
2,0 ml Mikrotüpler, ÇeşitliOlympus Plastikleri24-283A
30-300 &mikro; L çok kanallı pipet Eppendorf Belediyesi3125000052
Asetik Anhidrit (cGMP kitinde)Cayman Kimya Şirketi400031%98 saf
Tehlike: Yanıcı, Aşındırıcı: cildi ciddi şekilde yakar, göz hasarı, Akut toksisite
Güvenli Kullanım: Tutuşturucu kaynaklardan uzak tutun, havalandırılmış bir alanda çalışın, eldiven giyin
cGMP Asetilkolinesteraz İzleyici (cGMP kitinde)Cayman Kimya Şirketi481020potasyum fosfat dibazik, sodyum klorür,  potasyum fosfat monobazik, sığır albümini, sodyum azid, EDTA, cGMP AChE izleyici
Tehlike: Sağlık tehlikesi: tekrarlanan maruziyetten kaynaklanan organ toksisitesi,
Aşındırıcı: göz hasarı,
Cilt ve solunum yolu tahriş edici
Güvenli Kullanım: Havalandırılmış bir alanda çalışın, eldiven giymek
cGMP ELISA Antiserum (cGMP kitinde)Cayman Kimya Şirketi481022potasyum fosfat dibazik, sodyum klorür,  potasyum fosfat monobazik, sığır albümini,  sodyum azid, EDTA, tavşan anti-cGMP poliklonal Antiserum
Tehlike: Sağlık tehlikesi: tekrarlanan maruziyetten kaynaklanan organ toksisitesi,
Aşındırıcı: göz hasarı,
Cilt ve solunum yolu tahriş edici, Akut toksisite
Güvenli Kullanım: Havalandırılmış bir alanda çalışın, eldiven giyin
cGMP ELISA Standardı (cGMP kitinde)Cayman Kimya Şirketi481024potasyum fosfat dibazik, sodyum klorür,  potasyum fosfat monobazik, sığır albümini,  sodyum azid, EDTA, cGMP standardı
Tehlike: Sağlık tehlikesi: tekrarlanan maruziyetten kaynaklanan organ toksisitesi,
Aşındırıcı: göz hasarı,
Cilt ve solunum yolu tahriş edici
Güvenli Kullanım: Havalandırılmış bir alanda çalışın, eldiven giyin
Döngüsel GMP ELISA KitiCayman Kimya Şirketi581021
ELISA Tampon Konsantresi 10X (cGMP kitinde)Cayman Kimya Şirketi4000601 M fosfat, %1 BSA, 4 M sodyum klorür, 10 mM EDTA, %0.1 sodyum azid
Tehlike: Sağlık tehlikesi: tekrarlanan maruziyetten kaynaklanan organ toksisitesi,
Aşındırıcı: göz hasarı,
Cilt ve solunum yolu tahriş edici
Güvenli Kullanım: Havalandırılmış bir alanda çalışın, kapatılabilir kapaklı bir kapta saklayın, eldiven giyin
ELISA Reaktif HaznesiPierce (Şimdi Thermo Fisher Scientific)15075
Ellman Reaktifi (cGMP kitinde)Cayman Kimya Şirketi400050potasyum fosfat dibazik, sodyum klorür, potasyum fosfat monobazik, asetiltiyokolin (iyodür), 5,5'-ditiyobis-(2-nitrobenzoik asit)
Tehlike: Akut toksisite, Sağlık Tehlikesi: organ toksisitesi, Aşındırıcı: Göz hasarı, Cilt tahriş edici, solunum yolu tahriş edici
Güvenli Kullanım: Havalandırılmış bir alanda çalışın, eldiven giyin
Hidroklorik asitSigma-Aldrich320331Tehlike: Aşındırıcı: metali aşındırır, cildi ciddi şekilde yakar, Göz hasarı, Solunum yolu tahriş edici
Güvenli Kullanım: Havalandırılmış bir alanda çalışın, eldiven giyin
Sıvı AzotRobert'ın OksijeniAzot
Tehlike: Sıkıştırılmış Gaz: Kriyojenik yanık, frosbite, boğulma riski
Güvenli Kullanım: Havalandırılmış bir alanda çalışın, eldiven giyin
Fare Anti-Tavşan IgG Kaplamalı Plaka (cGMP kitinde)Cayman Kimya Şirketi400006
Tehlike: Yok
Yeni Klasik MF DengesiMettler Toledo
Orbital Çalkalayıcı Stovall Yaşam Bilimleri A.Ş. (Şimdi IBI Bilimsel)15-453-211 (Değişir)
ParafilmBemis Şirketi A.Ş.3023-4526 (Değişir)
Polisorbat 20 (cGMP kitinde)Cayman Kimya Şirketi400035
Tehlike: Yok
Potasyum Hidroksit (cGMP kitinde)Cayman Kimya Şirketi400029%85 saf
Tehlike: Aşındırıcı: metalleri ve cildi aşındırır,
Göz hasarı, Akut toksisite
Güvenli Kullanım: Havalandırılmış bir alanda çalışın, eldiven giyin
Precellys Evolution HomojenizatörBertin TeknolojileriPE000062-PEVO0-A
Precellys Lysing Kit Sert Doku HomojenizasyonuBertin TeknolojileriP000911-LYSK0-A
Sense Mikroplaka OkuyucuHIDEX425-301
Sorvall Legend Micro 17R SantrifüjThermo Fisher Bilimsel75002441
Doku PülverizatörüHücre KırıcıHücre kırıcı kiti
Girdap Cini 2Bilimsel Endüstriler SI-0246 Serisi
Yıkama ŞişesiSigma-AldrichZ423092
Yıkama Tamponu Konsantresi 400X (cGMP kitinde)Cayman Kimya Şirketi400062potasyum fosfat dibazik, potasyum fosfat monobazik, su
Tehlike: Aşındırıcı: Göz hasarı, Akut toksisite, Cilt tahriş edici, Organ toksisitesi
Güvenli Kullanım: Havalandırılmış bir alanda çalışın, eldiven giyin

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dierks, E. A., Burstyn, J. N. Nitric oxide (NO), the only nitrogen monoxide redox form capable of activating soluble guanylyl cyclase. Biochem Pharmacol. 51 (12), 1593-1600 (1996).
  2. Koglin, M., Behrends, S. A functional domain of the alpha1 subunit of soluble guanylyl cyclase is necessary for activation of the enzyme by nitric oxide and YC-1 but is not involved in heme binding. J Biol Chem. 278 (14), 12590-12597 (2003).
  3. Olson, L. J., Knych, E. T., Herzig, T. C., Drewett, J. G. Selective guanylyl cyclase inhibitor reverses nitric oxide-induced vasorelaxation. Hypertension. 29 (1), 254-261 (1997).
  4. Bailey, S. J., et al. Dietary nitrate supplementation reduces the O2 cost of low-intensity exercise and enhances tolerance to high-intensity exercise in humans. J Appl Physiol (1985). 107 (4), 1144-1155 (2009).
  5. Vanhatalo, A., et al. Acute and chronic effects of dietary nitrate supplementation on blood pressure and the physiological responses to moderate-intensity and incremental exercise. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (4), R1121-R1131 (2010).
  6. Qin, X., et al. Balancing role of nitric oxide in complement-mediated activation of platelets from mcd59a and mcd59b double-knockout mice. Am J Hematol. 84 (4), 221-227 (2009).
  7. Radomski, M. W., Palmer, R. M., Moncada, S. An l-arginine/nitric oxide pathway present in human platelets regulates aggregation. PNAS. 87 (13), 5193-5197 (1990).
  8. Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: Implications for the perivascular dynamics of NO and O2. PNAS. 98 (1), 355-360 (2001).
  9. Park, J. W., et al. Preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements. J Vis Exp. (173), e62427(2021).
  10. Park, J. W., et al. Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye. Sci Rep. 10 (1), 13166(2020).
  11. Srihirun, S., et al. Nitrate uptake and metabolism in human skeletal muscle cell cultures. Nitric Oxide. 94, 1-8 (2020).
  12. Montoliu, C., et al. Correlation of nitric oxide and atrial natriuretic peptide changes with altered cGMP homeostasis in liver cirrhosis. Liver Int. 25, 787-795 (2005).
  13. Origlia, C., et al. Platelet cGMP inversely correlates with age in healthy subjects. J Endocrinol Invest. 27 (2), RC1-RC4 (2004).
  14. Calamera, G., et al. Fret-based cyclic GMP biosensors measure low cGMP concentrations in cardiomyocytes and neurons. Commun Biol. 2, 394(2019).
  15. Rutkowski, N., et al. Real-time imaging of cGMP signaling shows pronounced differences between glomerular endothelial cells and podocytes. Sci Rep. 14, 26099(2024).
  16. Straub, A. C., Beuve, A. A primer for measuring cGMP signaling and cGMP-mediated vascular relaxation. Nitric Oxide. 117, 40-45 (2021).
  17. Huang, K. T., Lin, T. J., Hsu, M. H. Determination of cyclic GMP concentration using a gold nanoparticle-modified optical fiber. Biosens Bioelectron. 26 (1), 11-15 (2010).
  18. Cyclic gmp elisa kit. , https://cdn.caymanchem.com/cdn/seawolf/insert/581021.pdf (2024).
  19. Park, J. W., et al. Dietary nitrate metabolism in porcine ocular tissues determined using 15N-labeled sodium nitrate supplementation. Nutrients. 16 (8), 1154(2024).
  20. Cgmp enzyme immunoassay kit, direct technical bulletin. , https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/289/571/cg200bul.pdf?srsltid=AfmBOoqWnOVurQ549ESXk_E7DJoqNs7v268ktTabHHYc6I_6NZkc-j_V (2025).
  21. Cyclic gmp competitive elisa lysate and homogenate samples. , https://assets.thermofisher.com/TFS Assets/LSG/certificate/Certificates%20of%20Analysis/RA229061_EMSCGMPL.pdf (2025).
  22. Hamad, A. M., Range, S., Holland, E., Knox, A. J. Regulation of cGMP by soluble and particulate guanylyl cyclases in cultured human airway smooth muscle. Am J Physiol. 273 (4), L807-L813 (1997).
  23. Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. J Biol Chem. 279 (25), 26149-26158 (2004).
  24. Corbin, J. D., et al. [3h]sildenafil binding to phosphodiesterase-5 is specific, kinetically heterogeneous, and stimulated by cGMP. Mol Pharmacol. 63 (6), 1364-1372 (2003).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Siklik GMP l mNitrik Oksit YolaKompetitif ELISAKat Doku AnaliziGuanilil Siklaz AktivitesiDoku HomojenizasyonuBoncuklu De irmen Homojenizat rPorcine Doku AnaliziAsetilkolinesteraz zleyiciOptik Yo unluk l m

İlgili makaleler