Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hipoksi, farelerde otizm spektrum bozukluğunun mendel dışı kalıtımında yer alan miRNA seviyelerini değiştirir

41.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68435

⸱

11 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Gevher Nesibe Genome and Stem Cell Institute, Erciyes University, 2Betül Ziya Eren Genome and Stem Cell (GENKÖK) Center, Erciyes University, 3Department of Medical Biology, Erciyes University, 4Department of Histology and Embryology, Yozgat Bozok University, 5Department of Physiology, Erciyes University, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 7University of Nice Sophia Antipolis, 8Department of Medical Genetics, Erciyes University

Bu makalede

Özet

Burada, yenidoğan farelerde hipoksiyi indüklemek için değişen oksijen konsantrasyonlarına sahip kontrollü ortamlarda vererek bir protokol sunuyoruz. Doğumda oksijen varyasyonlarına maruz kalan fare modelleri, otizm gibi davranışsal fenotipik değişikliklerin indüksiyonunda yer alan miRNA'ların ekspresyonunu kalıcı olarak değiştirmiştir.

Özet

Hipoksi, perinatal dönemde farklı nedenlerle değişen derecelerde ortaya çıkabilir ve gelişimi etkiler. Farelerde hafif ila şiddetli neonatal hipoksinin sonuçlarını, otizm spektrum bozukluğu (ASD) ile ilişkili nörodejeneratif fetal beyin işlev bozuklukları ile potansiyel bağlantısına odaklanarak incelemeyi amaçlıyoruz.

Yenidoğan farelerde, değişen oksijen konsantrasyonlarına sahip kontrollü ortamlarda vererek hipoksiyi indükledik. Sonuçlar, serebral korteks ve hipokampusta yüksek HIF-1α (hipoksi belirteci) seviyelerinin yanı sıra bu bölgelerde artmış nörodejenerasyon gösterdi. Ayrıca, hipoksik gruplarda ASD ile ilişkili miRNA'ların (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p ve miR-499a-5p) ekspresyonunun değiştiğini gözlemledik, ASD'nin insan ve hayvan modellerindeki önceki sonuçlarla tutarlı. Bu moleküler değişikliklere, hipoksik koşullara maruz kalan farelerde azalmış hareket, hız, sosyal etkileşim ve tekrarlayan davranışlar gibi davranış değişikliklerinin yanı sıra köşe arama davranışı sergileme eğiliminin artması eşlik etti. % 12O2 grubunda (hafif hipoksi) davranışsal ve moleküler değişiklikler tespit edilebilir olmasına rağmen, en belirgin değişiklikler daha şiddetli hipoksi gruplarında,% 10 O2 ve% 8O2'de gözlenmiştir.

Genel olarak, sonuçlar neonatal hipoksinin davranışsal sonuçları olan nörodejeneratif hastalıklarla ilişkili kalıcı moleküler değişikliklere neden olabileceğini göstermektedir. Ayrıca, normal doğumda bile, erken gelişim sırasında hipoksiye maruz kalmak hafızayı ve öğrenmeyi bozabilir. Sonuçlar, uzun vadeli nörolojik sorunları önlemek için hipoksiye maruz kalan yenidoğanlarda erken teşhis ve müdahale ihtiyacını vurgulamaktadır. miRNA seviyeleri gelişim sırasında düzenlenir ve dokularda, özellikle germ hücrelerinde meydana gelen modifikasyonlar, bir sonraki nesil için bir risk faktörü oluşturur. Analizler, hipoksi altında fonksiyonel ve davranışsal değişiklikleri etkileyen düzenleyici yolların incelenmesi için bir temel sağlar.

Giriş

Oksijen eksikliği durumu olarak tanımlanan hipoksi, çeşitli patolojilerdeki rolünü anlamak için kritik olan benzersiz hücresel ve moleküler tepkiler ortaya çıkarabilir. Gelişimsel dizileri bozarak moleküler, hücresel ve nöronal değişikliklere ve yaralanmalara yol açabilir. Ayrıca, hipoksiye erken maruz kalma, merkezi sinir sistemi (CNS) gelişimini kesintiye uğratarak aksonal bağlantıyı ve sinaps gelişimini bozar1.

Ek olarak, hipoksinin CNS gelişimi üzerinde olumsuz etkileri olduğu gösterilmiş olsa da, embriyogenez sırasında olduğu gibi belirli koşullar altında kritik bir fizyolojik rol oynayabilir. Normal fizyolojik hipoksi, embriyonik gelişim sırasında oksijen seviyelerinin faydalı bir şekilde doğal olarak düşük olduğu bir durumu ifade eder. Bu süreç, embriyonik hücrelerin anaerobik metabolizmayı teşvik ederek enerji üretmesini sağlar, vaskülarizasyonu hızlandırarak dolaşım sisteminin gelişimini destekler, kalp ve kemiklerin düzgün gelişmesini sağlar ve nöral krest hücrelerinin göçünü uyarır2. Tersine, fizyolojik bağlamının dışında meydana gelen hipoksi, embriyonik gelişim de dahil olmak üzere gelişim ve genel sağlık üzerinde olumsuz etkilere sahip olabilir ve bu da prematüriteye ve hatta embriyonik ölümcüllüğe yol açabilir1. Bu nedenle, birçok yenidoğan normal doğum sırasında hipoksik durumlar yaşadığından, genellikle bakıcılar veya tıbbi personel tarafından hemen tanınmadan, önemli bir halk sağlığı sorunudur3. Ek olarak, hipoksi ile ilişkili nöronal bağlantıdaki değişiklikler, otizm spektrum bozuklukları (ASD) ve zihinsel engelliler dahil olmak üzere nörogelişimsel bozukluklarla bağlantılıdır1.

Moleküler bir perspektiften bakıldığında, hipoksi, sinaptik fonksiyonları düzenleyen genlerin ekspresyonunu değiştirerek, böylece nöronal bağlantıyı bozarak ve nörogelişimsel bozuklukların gelişimine katkıda bulunarak nörogelişimi etkileyebilir4.

Klinik olarak, neonatal hipoksi, hormonal ve metabolik yollar yoluyla CNS gelişimini etkiler1. Akut hipoksiye yanıt olarak, hipotalamus hızla kortikotropin salgılatıcı hormon ve arginin vazopressini serbest bırakır, bu daha sonra ön hipofizden adrenokortikotropik hormon salınımını tetikler, ardından fetal adrenal kortekste glukokortikoid üretimi izler ve bu yanıtın derecesi hipoksinin yoğunluğu ve süresi ile ilişkilidir. Hipotalamik-hipofiz-adrenal (HPA) eksenin akut strese bu hızlı tepkisi, glukokortikoidlerin stresin fizyolojik etkilerini sınırlamada ve ilişkili gen ekspresyonunu, protein sentezini ve hücresel metabolizmayı etkileyerek fetal homeostazı sürdürmedeki kritik rolünü vurgulamaktadır 5,6.

Azalan normal oksijen seviyeleri, çoğu transkripsiyon faktörleri, Hipoksi ile İndüklenebilir Faktörler (HIF'ler) ve prolil hidroksilazlar (PHD'ler) gibi hücresel oksijen sensörleri tarafından düzenlenen hipoksiye karşı çeşitli yanıtları aktive eder1. İn vitro çalışmalarda7'de gösterildiği gibiO2 homeostazının bir düzenleyicisi olan HIF-1, HIF-1α ve HIF-1β8'den oluşan bir heterodimerdir. Hipoksik koşullar altında, hidrojen atomunun kompleks içindeki bir hidroksil grubu ile değiştirilmesi azalır, bu da HIF-1α birikimine yol açar ve bu daha sonra HIF-1β ile dimerleşir. Sonuç olarak, HIF-1 dimer, yüzlerce genin transkripsiyonunu aktive ettiği çekirdeğeyer değiştirir 1.

Nöronların oksijene bağımlı doğası, onları hipoksik strese karşı özellikle duyarlı hale getirir. Bu nedenle, hipoksi, aksonal yol bulma ve sinaps gelişimini bozarak nöronal fonksiyon üzerinde uzun vadeli etkileri olan beyin fizyolojisi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir9. Nöronal bağlantılardaki bu değişiklikler, ASD'ler ve zihinsel engellilik gibi çeşitli nörogelişimsel bozukluklara yatkın olabilir 9,10.

Perinatal asfiksi, doğum sırasında oksijen yoksunluğu olarak tanımlanır ve maternal-fetal kanama, göbek kordonu basısı, plasental komplikasyonlar, uterus rüptürü, omuz distosisi veya yenidoğanın ilk nefesini alamaması gibi perinatal olayların bir sonucu olarak ortaya çıkabilir. Bu ciddi olay her yıl dünya çapında yaklaşık dört milyon yenidoğanı etkilemekte ve bir milyon yenidoğan ölümüyle sonuçlanmaktadır 11,12,13. Çoğu bebek hipoksi ataklarından kurtulsa da, bazı hastalarda nöbet bozuklukları, serebral palsi, bilişsel gecikmeler ve motor eksiklikler gibi kalıcı nörolojik sorunlara yol açabilen hipoksik-iskemik ensefalopati gelişir. Ek olarak, asfiksi ve iskemi, CNS (% 28), kardiyovasküler sistem (% 25), böbrekler (% 50) ve akciğerler (% 23) gibi çeşitli organ ve sistemlerin işlev bozukluğuna neden olabilir11.

Ek olarak, serebral vasküler sistemin olgunlaşmamış olması ve zayıf otoregülasyon, yenidoğanları iskemik risklere yatkın hale getiren faktörlerdir. Bu tür süreçlerde, inflamasyon ve oksidatif stres, neonatal hipoksik-iskemik hasarın ve ilişkili hücre ölüm mekanizmalarının ana aracılarıdır. Anormal apoptoz, gelişmekte olan beyni motor ve bilişsel bozukluk risklerine maruz bırakabilir14.

ASD'nin karmaşıklığı göz önüne alındığında, poligenik bir yapıya sahip gibi görünen altta yatan genetiğin yanı sıra gelişimini belirleyen çevresel faktörleri anlamak önemlidir. Özellikle, ASD'nin poligenik temeli, genetik yatkınlıkların hipoksi de dahil olmak üzere dış faktörlerle etkileşime girdiği çok faktörlü bir etiyolojiyi ifade eder. Monozigotik ikizlerde gözlenen %60-92'lik uyum, genetik etkilerin önemini vurgularken, uyumsuzluk çevresel faktörlerin de rol oynadığını göstermektedir. Otizm prevalansının 13/10.000 olduğu tahmin edilmektedir ve bu oranın son yıllarda arttığı düşünülmektedir15. Çalışmalar, hamilelik sırasında çevresel faktörlere maruz kalmanın otizm riskini artırabileceği hipotezini desteklemektedir, ancak bu çalışmaların sonuçları, tanı kriterleri, karşılaştırma grupları, örneklem büyüklüğü ve maruziyet değerlendirme yöntemlerindeki farklılıklar nedeniyle genellikle tutarsızdır 15,16.

Ayırt edici nöropatolojik bulgular tam olarak bilinmemekle birlikte, çalışmalar mikroskobik ve fonksiyonel beyin anormalliklerini ortaya koymaktadır. Bu anormallikler, etiyolojik olarak anlamlı dönemin in utero olabileceğini ve patogenezin prenatal dönemde başlayabileceğini düşündürmektedir15. Hamilelik sırasındaki maruziyetler, otizm için potansiyel risk faktörleri üzerine epidemiyolojik araştırmaların ana odak noktasıdır. Özellikle, obstetrik komplikasyonların ASD riskini artırabileceği hipotezi birçok çalışma tarafından desteklenmektedir, ancak bu etkilerin büyüklüğü ve sonuçları çalışmalar arasında değişmektedir17.

Genetik faktörlere ek olarak, epigenetik mekanizmalar hipoksik koşullar altında gen ekspresyonunun düzenlenmesinde anahtar bir rol oynamaktadır. Özellikle, miRNA'lar, hipoksiye hücresel yanıtta, HIF üzerindeki etkileri gibi önemli bir düzenleyici mekanizma sunar. Hipoksinin erken aşamalarında, miRNA seviyelerindeki spesifik değişiklikler HIF-1 birikimine ve stabil HIF-2 ve HIF-3 seviyelerinin korunmasına katkıda bulunabilir18. Birçok miRNA'nın ekspresyon profili hipoksik ve iskemi koşulları altında değişse de, sınırlı sayıda hipoksi ile ilişkili miRNA'nın fonksiyonel bir rol oynadığı ve HIF ekspresyonunu etkilediği gösterilmiştir. Bu, dokuya özgü miRNA ekspresyonu18 nedeniyle farklı insan dokularının neden hipoksik tepkilerde farklılık gösterdiğini açıklar.

Ortaya çıkan veriler ayrıca spesifik miRNA'ların ASD patolojisinde rol oynadığını göstermektedir. Önceki çalışmamızda, kanserde hücre sağkalımını, farklılaşmasını ve stres yanıtlarını düzenlediği bilinen miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p ve miR-499a-5p'nin OSB hastalarında anormal ekspresyon sergilediğini ve potansiyel olarak nörogelişimsel sonuçları etkilediğini gösterdik. Daha sonra bu bulguları ASD'nin fare modellerinden alınan kan, hipotalamus ve sperm örneklerinde doğruladık ve gen düzenleyici değişikliklerin hastalık19 ile tutarlı bir ilişkisini gösterdik. Bu sonuçlar, bu miRNA'ların büyüme ve gelişmenin önemli aşamalarında aşağı regülasyonunun ASD gibi hastalıkların gelişimi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabileceğini göstermektedir. Bu ayrıca neonatal hipoksinin moleküler ve davranışsal özellikler üzerindeki derin etkisini göstermektedir.

Bu çalışmada, hafif ila orta derecede neonatal hipoksinin yetişkinlikte otizm gelişme riski üzerindeki etkisini test ettik. Bunu yapmak için, yenidoğan fareler farklı hipoksi seviyelerine maruz bırakıldı. Gerçekten de, doğumda hipoksi yaşayan fareler, yetişkinlikte davranış değişiklikleri ve daha da önemlisi moleküler düzeyde ASD ile ilişkili değişiklikler sergiler. Bu nedenle, sonuçlarımız hipoksinin uzun vadeli etkileri hakkında değerli bilgiler sağladı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deney protokolleri Erciyes Üniversitesi (HAYDEK) Yerel Hayvan Deneyleri Etik Kurulu tarafından onaylanmış ve 21/216 lisans numarası ile gerçekleştirilmiştir.

1. Hayvan denekler

NOT: Bu çalışma, Erciyes Üniversitesi Betül-Ziya EREN Genom ve Kök Hücre Merkezi'nin (GENKÖK) Transgenik Ünitesi'nden Balb/c farelerini içermektedir.

  1. Ortalama 18-25 g ağırlığında 2 aylık Balb/c fareleri kullanın. Fareleri 20 saatlik ± karanlık döngüsünde (2-3 saat) %52 ± %3 nem ile 6 ila 18°C sıcaklıkta tutun.
  2. Fareleri standart fare peletleri ile besleyin, haftalık yatak takımları değiştirin ve yiyecek ve suya sınırsız erişim sağlayın.
    NOT: Moleküler çalışmalar GENKÖK Genomik ve Hipoksi Laboratuvarları ile Bozok Üniversitesi Histoloji ve Embriyoloji Laboratuvarı'nda gerçekleştirilmiştir. Bir 'DURDURMA noktası', çalışmanızı belirtilen sıcaklıkta nerede duraklatabileceğinizi ve koruyabileceğinizi gösterir.

2. Hipoksi modelinin kurulması

  1. Deneyi 3 hipoksik ve 1 sahte kontrol grubu olmak üzere 4 grubu içerecek şekilde tasarlayın.
  2. Sağlıklı hamile dişi fareler oluşturmak için sağlıklı dişi fareleri sağlıklı erkek farelerle eşleştirin, bu fareler sonunda aşağıdaki gruplara ayrılacaktır: şiddetli hipoksi (% 8 O2) (n = 4), orta hipoksi (% 10 O2) (n = 4), hafif hipoksi (% 12 O2) (n = 4) ve sahte kontrol grubu (n = 4) olarak normoksi (% 21 O2).
  3. Hipoksiyi indüklemek için, hamile fareleri hipoksi laboratuvarına aktarın ve E21.5 gününden 72 saat önce izlemeye başlayın.
  4. Hipoksik gruplardaki hamile farelerin doğum noktasını tespit edin ve hemen hipoksi odalarına yerleştirin. Her oda için oksijen seviyelerini her grup için açıklandığı gibi ayarlayın (adım 2.2'de gösterilmiştir).
  5. Yenidoğanları sadece 5 dakika hipoksik koşullarda tutun, ardından hemen normal barınma koşullarına aktarın.
    NOT: Denekleri daha uzun süre hipoksik koşullarda tutmak ölümcüllüğe neden olabilir.
  6. Hipoksinin neden olduğu hasarı doğrulamak ve cinsiyeti belirlemek için her gruptan 2 yenidoğan (rastgele seçilmiş) kullanın. Yetişkinlik aşaması için ek moleküler ve davranışsal testler için kalan yavruları emzirme döneminin sonuna kadar normal barınma koşullarında annelerinin yanında tutun ( Ek Şekil 1'deki deneysel tasarıma bakınız).

3. Yenidoğan aşamasında cinsiyetler arasındaki hipoksik etkilerdeki potansiyel farklılıkları değerlendirmek için cinsiyet belirleme

  1. Gerekli anestezik dozunu hesaplamak için her fareyi (rastgele seçilen (x2/grup)) ayrı ayrı tartın. İntraperitoneal olarak 100 mg / kg'da ketamin ve 10 mg / kg'da ksilazin uygulayın.
  2. Fare tamamen uyuşturulduktan sonra, servikal çıkık yoluyla ötenaziye devam edin ve hemen steril etiketli 1.5 mL tüplerde (bir STOP noktası, -80 ° C) kuyruk dokularını toplayın
  3. Daha fazla analiz için tüm beyin dokularını hemen toplayın ve %10 formaldehit içeren santrifüj tüplerine aktarın (bir STOP noktası, 25 °C).
  4. DNA ekstraksiyonu için dokuları hazırlayın.
    1. Kuyruk numunelerini hazırlayın ve 25 °C'de çözdürün (gerekirse). Numunelere 1 M Tris, 0.5 M EDTA,% 4 SDS, dH2O ve proteinaz K içeren 300 μL lizis tamponu ekleyin.
  5. Numuneleri homojenize edin.
    1. Numuneleri girdaplayarak iyice karıştırın ve gece boyunca 55 °C'de inkübe edin.
    2. Ertesi gün 100 μL amonyum asetat ekleyin ve girdaplama ile kısa bir süre karıştırın. 12.000 g'da 25 °C'de 20 dakika santrifüjleyin
  6. Faz ayrımı gerçekleştirin.
    1. Berrak sulu fazı dikkatlice 1,5 mL etiketli yeni steril tüplere aktarın.
    2. 500 μL izopropanol ekleyin ve 25 °C'de (bir DURMA noktası, -20 °C) 5 dakika inkübe edin. 12.000 g'da 25 °C'de 10 dakika santrifüjleyin
  7. DNA peletini yıkayın.
    1. Tüpün altındaki peleti inceledikten sonra, süpernatanı dikkatlice atın.
    2. 1000 μL %70 etanol ekleyin ve peleti yüzdürmek için tüpe hafifçe vurun. 7500 g'da 25 °C'de 10 dakika santrifüjleyin
  8. DNA'yı saflaştırın.
    1. Tüpün altındaki peleti inceledikten sonra, süpernatanı dikkatlice atın.
    2. Artık etanolü çıkarmak için 10 μL'lik bir mikropipet kullanın ve tamamen kurumasını bekleyin.
    3. Ekle 100 μL Nükleaz İçermeyen Su (NFW) peleti yeniden süspanse etmek için. +4 °C'de 10-15 dakika inkübe edin.
  9. DNA'yı ölçün ve saklayın.
    1. Bir spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün. DNA örneklerini daha fazla kullanana kadar +4 °C'de saklayın. (bir DURMA noktası).
  10. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirin.
    1. SRY-F, SRY-R ve dolaylı PAX6-F, PAX6-R primerleri tasarlayın (Ek Tablo 1'e bakın).
    2. Aşağıdaki gibi bir PCR karışımı hazırlayın (numune başına): 5 μL PCR tamponu (10x), 4 μL MgCl2, 4 μL dNTP, dört primerin her birinden 0.5 μL, 31 μL dH2O ve 0.5 μL Taq polimeraz.
      NOT: Optimum amplifikasyonu sağlamak için Taq polimeraz kullanımdan hemen önce ve en son eklenmelidir.
    3. Etiketli PCR tüplerini hazırlayın ve +4 °C'lik bir soğutma rafına yerleştirin. Karışımın 45 μL'sini tüplere dağıtın.
    4. PCR karışım damlacıklarının tüpün dibinde olduğundan emin olmak için bloğa hafifçe vurun.
    5. 5 μL DNA örneği ekleyin ve kısa bir süre pipetleyin. Kısa bir süre vorteks yapın ve ardından tüpleri santrifüjleyin.
    6. Tüpleri PCR makinesine yerleştirin ve programı aşağıdaki koşullara ayarlayın: Başlangıçta, 5 dakika boyunca 95 ° C'de inkübasyon, 1 dakika boyunca 94 ° C'de 40 döngü denatürasyon, 57 ° C'de 45 saniye tavlama ve 72 ° C'de 1 dakika uzatma. Döngülerden sonra, 10 dakika boyunca 72 ° C'de son bir uzatma, ardından 40 ° C'de süresiz olarak bir tutma.
  11. Sonuç örneklerini %2 agaroz jel elektroforezi kullanarak görselleştirin.
    NOT: İki bant gösteren örnekler erkektir ve sadece bir banda sahip olanlar dişidir.

4. Yenidoğan farelerde hipoksi hasarının doğrulanması

  1. Hipoksik hasarı doğrulamak için fedas edilen farelerden toplanan beyin dokularını mikroskobik olarak değerlendirin ve HIF-1α'yı test etmek için İmmünohistokimyasal olarak inceleyin.
    1. Düzeltme ve parafin dokuyu gömmek.
      1. Dokuları formaldehit içinde 12 saat koruyun, ardından 6 saat suda yıkayın.
      2. Her konsantrasyon için 1 gün boyunca etil alkol serisinde dehidrasyon yaparak dokuları sabitleyin:% 70,% 80,% 90, daha sonra% 100 etil alkolde 3 saat. Temizlemek için dokuları 15 dakika ksilen içine yerleştirin.
      3. Dokuları her biri 1 saat boyunca parafin serisi I, II ve III'e aktarın. Üçüncü saatten sonra, beyin örneklerini düzgün bir şekilde yönlendirin ve bunları temiz parafine gömün.
      4. Döner bir mikrotom kullanarak parafin bloklarından 5 μm kalınlığında bölümler kesin.
    2. Slaytları hazırlayın.
      1. Hematoksilen ve eozin (HE) boyama için, bölümleri düz cam slaytlara yerleştirin.
      2. İmmünohistokimya için, bölümleri pozitif yüklü cam slaytlara yerleştirin.
        NOT: (bir DURMA noktası), slaytlar daha fazla değerlendirme ve çalışma için bu aşamada arşivlenebilir.
    3. HE boyama yapın.
      1. Numuneleri 10 dakika boyunca Ksilen I çözeltisine daldırın.
      2. Numuneleri 10 dakika daha Ksilen II çözeltisine daldırın.
      3. Numuneleri, her biri 1 dakika boyunca bir dizi azalan alkol konsantrasyonuna aktarın: %100, %96 ve %80.
      4. Numuneleri 2 dakika boyunca damıtılmış suyla yıkayın.
      5. Örnekleri 8 dakika hematoksilen içine daldırın, ardından 2 dakika boyunca damıtılmış suda yıkayın.
      6. Yıkadıktan sonra, numuneleri 1 saniye boyunca asidik alkolle muamele edin, ardından 1 dakikalık bir yıkama yapın.
      7. Numuneleri 10 saniye boyunca amonyaklı suya koyun, ardından 1 dakikalık yıkamayı tekrarlayın.
      8. Numuneleri 30 saniye boyunca% 70 alkole koyun.
      9. Örnekleri 10 dakika boyunca eozin içine daldırın.
      10. Alkol konsantrasyonlarını her biri 1 dakika artırarak numuneleri kademeli olarak aktarın: %96, %96 ve %100.
      11. Numuneleri her biri 1 dakika boyunca Ksilen I, Ksilen II ve Ksilen III çözeltilerine daldırın.
      12. Bir lamel ile örtün.
    4. Mikroskop kullanarak inceleyin.
      1. HE boyamadan sonra, her grubun tüm beyin dokularını ışık mikroskobu altında inceleyin.
      2. Nöronal dejenerasyon ve periselüler / perivasküler ödem için hipokampal ve kortikal alanları değerlendirin.
  2. HIF-1α boyama yapın.
    1. Yeterli fiksasyonu sağlamak için numuneleri pozitif yüklü slaytlar üzerinde gece boyunca 67 °C'de bir inkübatörde inkübe edin.
    2. Deparafinizasyonu tamamlamak için bölümleri ksilen I ve ksilen II çözeltilerinden geçirin.
    3. Bölümleri sırayla %100, %96, %80 ve %70 etanol çözeltilerine 5 dakika yerleştirerek ve ardından 5 dakika damıtılmış suda durulayarak yeniden sulandırın.
    4. İki 5 dakikalık döngü için 665 W'ta 0,01 M sitrik asit (pH 6,0) içinde bölümleri mikrodalgada pişirerek epitopları maskeleyin.
    5. Bölümleri oda sıcaklığında (RT) 20 dakika soğutun.
    6. Bölümlerin çevresini hidrofobik bir kalemle tanımlayın, ardından bölümleri PBS'de her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
    7. Endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için bölümleri metanol içinde% 3 hidrojen peroksit içinde 10 dakika inkübe edin.
    8. Bölümleri PBS'de her seferinde 5 dakika boyunca 3 kez tekrar yıkayın.
    9. Spesifik olmayan immünoglobulin bağlanmasını önlemek için, bölümleri 7 dakika boyunca UV bloke edici bir reaktif ile inkübe edin.
    10. Kesitleri gece boyunca 4 ° C'de anti-HIF-1α primer antikoru (1:200 seyreltme) ile inkübe edin.
    11. Bölümleri PBS'de her seferinde 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
    12. Bölümlere biyotinile edilmiş ikincil antikor uygulayın ve RT'de 40 dakika inkübe edin.
    13. Bölümleri PBS'de her seferinde 5 dakika boyunca 3 kez tekrar yıkayın.
    14. Bölümlere streptavidin solüsyonu uygulayın ve RT'de 30 dakika inkübe edin.
    15. Bölümleri PBS'de her seferinde 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
    16. 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) uygulayarak ve ışık mikroskobu altında gözlemleyerek boyama reaksiyonunu geliştirin.
    17. Çekirdekleri boyamak için bölümleri modifiye edilmiş Gill II hematoksilen çözeltisi ile boyayın.
    18. Bölümleri artan etanol konsantrasyonlarından (%70, %80, %96 ve %100 etanol) geçirerek kurutun.
    19. Bölümleri, her biri 10 dakika boyunca Ksilen I ve Ksilen II çözeltilerinde inkübe ederek temizleyin.
    20. Bölümleri bir montaj ortamı ve bir lamel ile monte edin.
    21. Monte edilmiş bölümleri ışık mikroskobu altında inceleyin ve hipokampus ve prefrontal korteks alanlarını değerlendirin.
    22. Açık kaynaklı görüntü işleme yazılımı kullanarak immünoreaktivite seviyelerini ölçün.

5. Davranışsal deneyler

  1. Hipoksinin doğrulanmasından sonra, kalan farelerin anneleriyle birlikte emzirme dönemini tamamlamalarına izin verin.
  2. Doğum sonrası 21. günde anogenital mesafeye göre cinsiyet belirleme yapın, ardından hayvanları cinsiyetlerine göre farklı kafeslerde barındırın. Hipoksik ve sahte kontrol gruplarındaki fareler 2 aylık olduklarında, onları davranışsal deneylere tabi tutun.
  3. Davranışsal testler yapmadan önce, denekleri testten önce 15-30 dakika boyunca test ortamına alıştırın.
  4. Denekler ve denemeler arasındaki tüm cihazları/aparatları %70 etanol kullanarak dezenfekte ettiğinizden emin olun.
  5. Yeni nesne tanıma (NOR) testi gerçekleştirin.
    1. Fotoğraf makinesini, nesnelerin net bir şekilde görülebileceği ve izlenebileceği bir konuma ayarlayın.
    2. Uygun video izleme yazılımını yükleyin.
    3. Test alanını (60 cm × 60 × cm × 40 cm'lik bir kutu) fareden daha büyük olmayan iki nesneyle hazırlayın. İki nesnenin benzer boyut ve şekilde olduğundan ve kolayca erişilebilir olduğundan emin olun (duvarlardan 10 cm × 10 cm uzakta ve paralel).
    4. 1. Gün: Alıştırma aşaması:
      1. Fareyi iki özdeş nesneyle arenaya yerleştirin. Farenin belirli bir süre boyunca (örn. 10 dakika) nesneleri serbestçe keşfetmesine izin verin.
      2. Bu oturum sırasında, farenin her bir nesneyle geçirdiği süreyi gözlemleyin ve kaydedin. Ayrıca, farenin her bir nesneye kaç kez döndüğünü veya her bir nesneyle kaç kez etkileşime girdiğini kaydedin
    5. 2. Gün: Yeni nesne tanıtımı:
      1. 1. gündeki tanıdık nesnelerden birini yeni bir nesneyle (görünüm, doku veya şekil olarak farklı) değiştirin.
      2. Fareyi arenaya geri koyun ve ilk oturumda olduğu gibi aynı süre boyunca tekrar özgürce keşfetmesine izin verin.
    6. Farenin tanıdık nesneyle (1. günden itibaren) ve yeni nesneyle geçirdiği toplam süreyi kaydedin. Farenin her bir nesneye kaç kez döndüğünü veya her bir nesneyle kaç kez etkileşime girdiğini kaydedin.
    7. Aşağıdaki formülü kullanarak farenin hafızasını ve öğrenimini değerlendirmek için Ayrımcılık İndeksini (DI) hesaplayın:
      Ayrımcılık İndeksi (DI) = {(Yeni nesneyle geçirilen süre − Tanıdık nesneyle geçirilen süre)/(Her iki nesneyle geçirilen toplam süre)} × 100.
      NOT: Daha yüksek bir DI, yeni nesneye daha fazla ilgi olduğunu gösterir, bu da daha iyi hafıza ve öğrenme yetenekleri önerir. 0'a yakın bir DI, tercih olmadığını gösterir, bu da tanıdık nesne için eşit ilgi veya zayıf bir bellek olduğunu gösterir.
    8. Farenin doğal merakına ve tanıdık ve yeni nesneleri tanıma ve ayırt etme yeteneğine dayalı olarak öğrenme ve hafıza yeteneklerini objektif olarak değerlendirmek için DI'yi kullanın.
  6. Kuyruk süspansiyon testi (TST) gerçekleştirin
    1. Kamerayı, farelerin net bir şekilde görülebileceği ve izlenebileceği bir konuma kurun. Uygun video izleme yazılımını yükleyin.
    2. Deney düzeneğini aynı anda 3 fareyi barındıracak şekilde boşlukla hazırlayın.
    3. Fareleri test sırasında birbirlerini görememeleri için izole etmek için 20 cm aralıklarla 25 cm yüksekliğinde karton paneller kullanın.
    4. 12 cm uzunluğunda bant şeritleri kesin ve bunları her farenin kuyruğuna dikkatlice yapıştırın, kuyruğun zarar vermeden güvenli bir şekilde takıldığından emin olun. Bandı kuyruğun ucuna (2 cm) yerleştirin, böylece fare kendine zarar vermeden askıya alınabilir.
    5. Fareleri asılıyken 6 dakika boyunca kaydedin.
    6. Sürenin sonunda kaydı durdurun, fareyi çıkarın ve muhafaza kafesine geri koyun. Aktif hareket süresini ve hareketsizlik süresini belirlemek için videoları analiz edin.
      NOT: Hareketsizlik genellikle öğrenilmiş bir çaresizlik veya stres durumunu gösterdiğinden, bu stres tepkisi hakkında fikir verecektir. Hareketsizlik derecesi, farelerde davranışsal umutsuzluk veya stres tepkisini ölçmek için yaygın olarak kullanılır, bu da stres veya depresif durumların etkileriyle ilişkili olabilir.
    7. Gözlemlenen hareket ve hareketsizlik modellerine dayanarak, zorla askıya alınmaya yanıt olarak farelerin duygusal durumunu ve stresle başa çıkma mekanizmalarını değerlendirin.
  7. Mermer gömme testi yapın
    1. Boş bir kafesi (20 cm × 35 cm × 15 cm) 5 cm yüksekliğinde mısır koçanı ile doldurun. Her biri 4 bilye olacak şekilde 5 sıra halinde 20 bilye düzenleyin. Mermerlerin yüzeye eşit olarak dağıldığından emin olun.
    2. Nesneyi kafesin bir köşesine yerleştirin ve tüm kafese serbest erişim sağlayın.
    3. Fareye kafesi keşfetmesi için 20 dakika verin. Bu süre zarfında fare, mermerleri mısır koçanı ile örtmeye çalışarak bazı gömme davranışları sergileyebilir. 20 dakika sonra fareyi kafesten çıkarın.
    4. 20 dakikalık süre boyunca farenin mısır koçanının altına gömdüğü toplam bilye sayısını sayın. Gömülü toplam mermer sayısını kaydedin, çünkü bu davranışın temel ölçüsüdür.
      NOT: Gömülü mermer sayısı genellikle kemirgenlerde anksiyete, kompulsif davranış veya neofobinin bir göstergesi olarak kullanılır. Daha fazla sayıda gömülü mermer genellikle daha yüksek düzeyde kaygı veya kompulsif eğilimlerle ilişkilidir.
    5. Gömülü mermerlerin toplam sayısına dayanarak, farelerde anksiyete ile ilgili davranışları ve kompulsif eğilimleri değerlendirin, bu da tedavilerin veya deneysel koşulların etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.
  8. Sosyal etkileşim testi yapın.
    1. Kamerayı, farelerin net bir şekilde görülebileceği ve izlenebileceği bir konuma kurun.
    2. Kamerayı bilgisayara bağlayın ve uygun video izleme yazılımını kurun. Üç odayı ayırmak için iki duvarlı (60 cm) × 40 cm × 25 cm) iki duvarlı (40 cm × 25 cm) dikdörtgen bir kutu yerleştirin.
    3. Deney konusunun aşina olduğu bir fareyi (15 cm × 10 cm) içeren bir kafes ve deney konusuyla daha önce etkileşimi olmayan bir fareyi içeren başka bir kafesi (15 cm × 10 cm) yerleştirin.
    4. Kayda başlayın ve konuyu orta bölmeye yerleştirin.
      NOT: Bu deneyde deney hayvanları dışında kullanılan farelerin aynı cinsiyetten ve sağlıklı olması gerekmektedir.
    5. Konuyu 5 dakika boyunca izleyin ve video kamera ile kaydedin. Sürenin sonunda kaydı durdurun, fareyi çıkarın ve muhafaza kafesine geri koyun.
    6. SIT yazılımını kullanarak, farelerin sosyal etkileşim sürelerini ve sosyal yenilik eğilimlerini analiz edin ve bunları sahte kontrol grubuyla karşılaştırın.
      NOT: Sosyal davranışlara daha fazla zaman harcanması (örneğin, tımar etmek veya koklamak) ve saldırganlıktan kaçınmak veya saldırganlık sergilemek için daha az zaman harcanması, yüksek sosyallik gösterme olarak yorumlanabilir. Etkileşimden kaçınmak, tecritte daha fazla zaman geçirmek veya artan saldırganlık sergilemek, kaygı, sosyal geri çekilme veya sosyal olarak etkileşim kurma yeteneğinin azaldığını gösterebilir.
  9. Açık alan testi gerçekleştirin.
    1. Kamerayı, farelerin net bir şekilde görülebileceği ve izlenebileceği bir yere yerleştirin. Kamerayı bilgisayara bağlayın ve uygun video izleme yazılımını kurun.
    2. Test alanını kurun (60 cm × 60 cm × 40 cm'lik bir kutu) ve 16 kare oluşturmak için kutuyu hayali çizgilerle bölün.
    3. Kayda başlayın ve fareyi dikkatlice arenanın ortasına yerleştirin. Farenin davranışını 5 dakika boyunca gözlemleyin ve kaydedin.
    4. Sürenin sonunda kaydı durdurun, fareyi çıkarın ve muhafaza kafesine geri koyun.
    5. İzleme yazılımını kullanarak, deneklerin kaygı, lokomotor, keşif ve duygusal aktivite düzeylerini değerlendirmek için yürüme, tırmanma, kaçış, tımar, hareketsizlik, toplam geçiş, dışkılama ve idrara çıkma gibi dış ve iç davranışları ölçün.
  10. Morris su labirenti (MWM) testini gerçekleştirin.
    1. 120 cm çapında ve 60 cm derinliğindeki su labirentini 23 ± 1 °C'de bir davranış laboratuvarında sabit bir pozisyonda hazırlayın.
    2. Labirenti dört hayali çeyreğe bölün ve labirent duvarlarının her çeyreğinin merkezine, tabandan yaklaşık 20 cm uzakta farklı görsel ipuçları (şekil ve renk olarak) asın. 17 cm uzunluğunda ve 10 cm çapında bir platformu duvardan 20 cm uzağa yerleştirin.
      NOT: Labirent, ipuçları ve platform, farelerin hafızalarını doğru bir şekilde eğitebilmeleri için konumunu veya konumunu değiştirmemelidir.
    3. Labirenti platformun 1 cm altına kadar 21-26 °C su ile doldurun ve siyah çok yüzeyli akrilik boya ile boyayın.
      NOT: Diğer fare türlerinin kullanılması durumunda, fareleri izleyebilmek için su, farelerin kontrast rengiyle renklendirilmelidir.
    4. Kamerayı tam görüntüyü yakalayan bir konuma yerleştirin ve bilgisayardaki MWM yazılımına bağlayın.
      NOT: Beşinci günlük deneme için programda platform yeri atanmalıdır.
    5. Test, her biri dört deneme ile 5 gün sürer. İlk dört gün boyunca, kayda başlayın ve deneği her gün farklı bir kadrana yüzü tank duvarına bakacak şekilde dikkatlice yerleştirerek denemeye başlayın.
    6. 5. gün test programında platform konumunu atayın.
      NOT: Bu, deneklerin çağrışımsal bir bellek oluşturmasını engeller. Deneklerin suya dikkatli bir şekilde yerleştirilmesi ve doğru sıcaklığın korunması, dış stres eklemekten kaçınmak için çok önemlidir. Denemeler 5 dakika sürer ve (i) platforma ulaşıldığında (ii) 5 dakikalık süre sınırı sona erdiğinde otomatik olarak sona erer. Günler boyunca, denekler platformun yerini öğrenmeli ve daha kısa sürede bulmalıdır.
    7. Beşinci günde, platformu çıkarın ve fareleri daha önce açıklandığı gibi labirentin bir karesine dikkatlice yerleştirin.
      NOT: Deneme sürümü, (i) fare platformu bulup üzerine adım attığında, (ii) 5 dakikalık süre sınırı sona erdiğinde otomatik olarak sona erer. Sağlıklı denekler önceki platformun yerini bulmalıdır. Yazılım, farenin her denemede platformu bulması için geçen süreyi otomatik olarak hesaplayacak ve deneklerin kısa ve uzun süreli hafızasını ve öğrenme yeteneklerini değerlendirmeye yardımcı olacaktır.

6. Yetişkin fareler için hipoksi hasarının doğrulanması

  1. Davranış testi tamamlandıktan sonra, denekleri servikal çıkık ile feda edin.
  2. Moleküler analiz için sahte kontrol grubu da dahil olmak üzere her gruptan 6 fareden hipokampal doku ve kan örnekleri toplayın (bölüm 7).
  3. Yenidoğan döneminde hipoksi maruziyetinin yetişkin beyin morfolojisi üzerindeki etkilerini incelemek için kalan 4 farenin beyinlerini %10 formaldehit solüsyonuna yerleştirin.
  4. Yetişkin fare beyinlerinin histolojik analizini yapmak için daha önce bölüm 4'te açıklananla aynı tekniği kullanın.

7. Yetişkin faz örneklerinden toplam RNA izolasyonu

  1. Her doku örneğine 500 μL trizol ve 500 μL kan ekleyin.
  2. Beyin dokusu için, numuneleri bir şırınga kullanarak homojenize edin.
  3. Karışımı RT'de 5 dakika inkübe edin.
  4. Her tüpe 200 μL kloroform ekleyin ve RT'de 5 dakika daha inkübe edin.
  5. 12.000 g'da +4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin.
  6. Sulu fazı (RNA) dikkatlice yeni bir steril tüpe aktarın.
  7. İzopropanol ekleyin (sulu faza 1:1 oranında) ve karışımı gece boyunca inkübe edin. (bir DURMA noktası/ -20 °C).
  8. Ertesi gün, +4 °C'de 10 dakika boyunca 12.000 g'da santrifüjleyin.
  9. Süpernatanı dikkatlice atın ve pelete 1000 μL% 75 etanol ekleyin.
  10. 7.500 × g'da +4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  11. Etanol yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
    NOT: Pelet çok küçükse bir yıkama yeterlidir.
  12. Süpernatanı atın ve peletin RT'de kurumasını bekleyin.
  13. Tamamen kuruduktan sonra, peleti 50 μL NFW ile tekrar süspanse edin ve +4 °C'de 10-15 dakika buz üzerinde inkübe edin.
  14. RNA konsantrasyonunu spektrofotometrik olarak ölçün.
  15. RNA örneklerini daha fazla analize kadar -80 °C'de saklayın.

8. Tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi

  1. +4 °C'lik bir soğutma rafında çalışarak, kan ve beyin dokularından izole edilen RNA örneklerini hazırlayın.
  2. Etiketli PCR tüplerini hazırlayın.
  3. cDNA sentez kiti reaktiflerini üreticinin talimatlarına göre karıştırın.
  4. Her numune için toplam 14 μL reaksiyon karışımı hazırlayın ve tüplere dağıtın.
  5. Karışıma 6 μL RNA örneği ekleyin.
  6. Üretici tarafından belirtilen sıcaklık ve zaman koşullarına göre PCR cihazında cDNA sentezi gerçekleştirin.
    NOT: Bu aşamada sentezlenen cDNA, daha fazla kullanıma kadar -80 °C'de saklanabilir.
  7. Sentezlenen cDNA'yı 1:5 oranında seyreltin.
  8. Gelecekteki qPCR analizi için seyreltilmiş cDNA'yı -80 °C'de saklayın.

9. miRNA için kantitatif gerçek zamanlı PCR (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p, miR-499a-5p ve normalizasyon kontrolü olarak U6 küçük nükleer RNA) ekspresyonu

  1. Her miRNA için primerleri tasarlayın (diziler için Ek Tablo 2'ye bakın).
  2. PCR reaksiyon karışımını üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
  3. 14 μL reaksiyon karışımını 96 oyuklu bir PCR plakasının her bir oyuğuna dağıtın.
  4. Toplam 20 μL'lik bir reaksiyon hacmi için her bir oyuğa 6 μL 1: 5 seyreltilmiş cDNA ekleyin.
  5. Bu programı izleyerek varyasyonu en aza indirmek için her numune için iki kez PCR gerçekleştirin: 120 saniye boyunca 95 ° C'de ilk denatürasyon, 10 saniye boyunca 95 ° C'de 45 döngü denatürasyon, 60 saniye boyunca 56 ° C'de tavlama ve amplifikasyon ve 15 saniye boyunca 60 ° C'de, ardından 95 ° C'de erime eğrisi analizi.
  6. Ct (Döngü eşiği) değerlerini kullanarak sonuçları analiz edin ve 2-ΔΔCt yöntemini kullanarak verileri normalleştirin.

10. İstatistiksel analiz

  1. . miRNA ekspresyon verilerini analiz etmek için histogramları, Q-Q grafiklerini ve Shapiro-Wilk testini kullanarak verilerin normalliğini değerlendirin.
    1. Veriler normal olarak dağıtılmışsa, Tek Yönlü ANOVA kullanın.
    2. Veriler normal dağılım göstermiyorsa, Kruskal-Walli testini, öğrenci t-testini veya Mann-Whitney U testini uygulayın.
  2. Her gruptaki cinsiyet farklılıklarını değerlendirirken, verilerin dağılımına bağlı olarak öğrencinin t-testini veya Mann-Whitney U testini kullanın. İstatistiksel anlamlılık <0.05'lik bir p değeri ile belirlenir.
    NOT: Tüm analizler uygun istatistiksel yazılımlar kullanılarak yapılmalıdır. Burada GraphPad Prism 8 kullanılmıştır.
  3. Davranışsal deneylerin sonuçlarını analiz etmek için histogramları, Q-Q grafiklerini ve Shapiro-Wilk testini kullanarak verilerin normalliğini değerlendirin.
    1. Veriler normal olarak dağıtılmışsa, İki Yönlü ANOVA kullanın.
    2. Normal dağılım göstermeyen veriler için Kruskal-Walli testini, Student t-testini veya Mann-Whitney U testini gerçekleştirin.
    3. Verilerin dağılımına bağlı olarak öğrencinin t-testini veya Mann-Whitney U testini kullanarak her gruptaki cinsiyet farklılıklarını değerlendirin. Yine, p değeri 0.05'< ise sonuçları istatistiksel olarak anlamlı olarak düşünün.
  4. İmmünohistokimyasal analizler için, kadın ve erkek gruplarını karşılaştırmak için İki Yönlü Varyans Analizi ve ardından Tukey'in post-hoc testi kullanın.
  5. Her hipoksi durumundaki kadın ve erkek gruplarını karşılaştırmak için Sidak'ın post-hoc testini kullanın. İstatistiksel anlamlılık, p değerinin 0.05 < ise belirlenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, gebe Balb/c fareleri doğum sırasında %8O2 (şiddetli), %10O2 (orta) ve %12O2 (hafif) hipoksik koşullara maruz bırakıldı ve yenidoğan fareler hafif, orta ve şiddetli neonatal hipoksi modelleri oluşturmak için bu hipoksik koşullar altında 5 dakika tutuldu. Sahte kontrol grubu olarak belirlenen grup normoksik (%21 O2) doğum koşullarına tabi tutuldu ve daha sonra standart bakım koşulları altında yaşamalarına izin verildi. Bu, ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Önemli bir yenidoğan sağlık sorunu olan perinatal hipoksi, kritik gelişimsel süreçleri bozarak moleküler, hücresel ve nöronal değişikliklere neden olabilir ve otizm spektrum bozukluğu (ASD) dahil olmak üzere çeşitli nörogelişimsel bozukluklarla ilişkilendirilmiştir1. Şiddetli hipoksi, ani etkileri nedeniyle geniş çapta incelenmiş olsa da, perinatal dönemde hafif ila orta derecede hipoksinin uzun vadeli sonuçları daha az anlaşılmıştır. Çalışmamız, neonatal hipoksis...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK) tarafından finanse edilmiştir ve yazarlar Celalettin Göktaş'a (Transgenik hayvan tesisi) ve biyolog Selda Taşdemir'e (Davranış laboratuvarı) teşekkür etmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(-20 ve derece; C) DondurucuSiemens KD86NAWE0N
(+4 ve derece; C) BlokAntagen Biosciencehttps://antagen.net/product/384-well-pcr-plate-rack-cat-rkp384/
(+4 ve derece; C) BuzdolabıSiemens KD86NAWE0N
(-20 ve derece; C) BlokCleaver Sientifichttps://www.cleaverscientific.com/electrophoresis-products/coolcube-storage-rack/
Mutlak EtanolMerck1070172511
Amonyum AsetatSigma238074-500G
Analitik Denge  Adam EkipmanlarıLAB214i
KloroformMerck1024451000
Sitrik Asit Merck100241
BilgisayarHPhttps://www.hp.com/us-en/shop/pdp/hp-all-in-one-24-cr1000t-238-9p2v3av-1
EDTASigmaE9884-1KG
Entellan Merck107961
EosinMerck109844
Ependorf (1,5 mL)?solab078.03.021
Ethovision SistemiNoldushttps://noldus.com/ethovision-xt
EtuvNUVEEN 400/500 N/A
Falcon Tüpleri (15 mL)Isolab078.02.001
FormaldehitMerck104002
Isı KamerasıSamsungSC2000
HematoksilinMerck105175
HIF-1α AntikorBiyografibs-20398R 
Hypoxia Chambers BiospherixA-Chamber
İzoproponalMerck1096342511
Light Cycler 480 IIRoche5015278001
Mermer Gömme Testi KafesiVishnu https://guide.labanimal.com/product/standard-housing-stainless-steel
Mikrosantrifüj Tüpleri (1.5 mL)Greiner616201
Mikropipet Uçları (100 & mikro; L)Greiner774353
Mikropipet Uçları (1000 & mikro; L)Greiner778353
Mikropipetler (10 & mikro; L)GilsonFD10001
Mikropipetler (100 & mikro; L)GilsonFD10004
Mikropipetler (1000 & mikro; L)GilsonFD10003
Mikropipet Uçları (10 & mikro; L)Greiner772353
Mikropipetler(2 & mikro; L)GilsonGFAM00064
MikroskopiOlympusBx53
miRCURY LNA RT Kiti (cDNA Sentez Kiti)Qiagen339340
miRCURY LNA SYBR Yeşil PCR KitiQiagen339346
Çok kuyu plakalarıRoche4729692001
Nano SpektrofotometreShimadzuC101-E112
Roman Nesne Tanıma Testi ArenasıKüresel Biyoteknoloji137
Open Field Test ArenasıKüresel Biyoteknoloji117
Oxycycler BiospherixA42OC
Parafin Leica 39602012
PBS TabletSigmaP4417-50TAB
PCR CihazıSensoquestT3-0140
Plaka DönmesiPeqlab91-PSPIN-P
PrizmaGraphPadhttps://www.graphpad.com/
Proteinaz KSigmaP6556-10MG
QIAzol Lizis Reaktif İzolasyon ReaktifiQiagen79306
SDSSigma8170342500
İkinci Antikor AbcamA0545-1ML
Sosyal Etkileşim Testi'nin Üç OdasıKüresel Biyoteknoloji118
DönmeGilsonPMC880
Şırınga (2 mL)Baybihttps://beybi.com.tr/urunler/medikal-urunler/medikal-sarf-malzemeleri/parcali-enjektorler
Kuyruk Süspansiyon Testi KurulumuSelf Made, benzerini Harvard Apparatus'ta bulabilirsinizKendi Yapımı (https://www.harvardapparatus.com/tail-suspension-test.html) adresinde benzer bir sayfa bulabilirsiniz.
TermomikserEppendorf#5355
Trizma üssüSigma1503-1KG
VortexHeidolph541-10000-00-1
Xylenes Isolab 9,90,01,92,501

Kaynaklar

  1. Bonkowsky, J. L., Son, J. -H. Hypoxia and connectivity in the developing vertebrate nervous system. Dis Model Mech. 11 (12), dmm037127(2018).
  2. Dunwoodie, S. L. The role of hypoxia in development of the mammalian embryo. Dev Cell. 17 (6), 755-773 (2009).
  3. Beck, S., et al. The worldwide incidence of preterm birth: a systematic review of maternal mortality and morbidity. Bull World Health Organ. 88 (1), 31-38 (2010).
  4. Milash, B., et al. Temporal dysynchrony in brain connectivity gene expression following hypoxia. BMC Genomics. 17 (1), 334(2016).
  5. Adachi, K., Umezaki, H., Kaushal, K. M., Ducsay, C. A. Long-term hypoxia alters ovine fetal endocrine and physiological responses to hypotension. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 287 (1), R209-R217 (2004).
  6. Imamura, T., Umezaki, H., Kaushal, K. M., Ducsay, C. A. Long-term hypoxia alters endocrine and physiologic responses to umbilical cord occlusion in the ovine fetus. J Soc Gynecol Investig. 11 (3), 131-140 (2004).
  7. Fajersztajn, L., Veras, M. M. Hypoxia: from placental development to fetal programming. Birth Defects Res. 109 (17), 1377-1385 (2017).
  8. Ruas, J. L., Poellinger, L. Hypoxia-dependent activation of HIF into a transcriptional regulator. Semin Cell Dev Biol. 16 (4-5), 514-522 (2005).
  9. Mukandala, G., Tynan, R., Lanigan, S., O'Connor, J. J. The effects of hypoxia and inflammation on synaptic signaling in the CNS. Brain Sci. 6 (1), 6(2016).
  10. Lee, S., et al. Gene networks associated with non-syndromic intellectual disability. J Neurogenet. 32 (1), 6-14 (2018).
  11. Fattuoni, C., Palmas, F., Noto, A., Fanos, V., Barberini, L. Perinatal asphyxia: a review from a metabolomics perspective. Molecules. 20 (4), 7000-7016 (2015).
  12. Locci, E., et al. Exploring perinatal asphyxia by metabolomics. Metabolites. 10 (4), 141(2020).
  13. De Haan, M., et al. Brain and cognitive-behavioural development after asphyxia at term birth. Dev Sci. 9 (4), 350-358 (2006).
  14. Armstrong-Wells, J., Bernard, T. J., Boada, R., Manco-Johnson, M. Neurocognitive outcomes following neonatal encephalopathy. NeuroRehabilitation. 26 (1), 27-33 (2010).
  15. Gardener, H., Spiegelman, D., Buka, S. L. Prenatal risk factors for autism: comprehensive meta-analysis. Br J Psychiatry. 195 (1), 7-14 (2009).
  16. Hicks, S. D., Middleton, F. A. A comparative review of microRNA expression patterns in autism spectrum disorder. Front Psychiatry. 7, 176(2016).
  17. Cassidy, F. C., Charalambous, M. Genomic imprinting, growth and maternal-fetal interactions. J Exp Biol. 221 (Suppl_1), jeb164517(2018).
  18. Serocki, M., et al. miRNAs regulate the HIF switch during hypoxia: a novel therapeutic target. Angiogenesis. 21 (2), 183-202 (2018).
  19. Ozkul, Y., et al. A heritable profile of six miRNAs in autistic patients and mouse models. Sci Rep. 10 (1), 9011(2020).
  20. Siniscalco, D., et al. Autism spectrum disorders: is mesenchymal stem cell personalized therapy the future. J Biomed Biotechnol. 2012, 480289(2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Neonatal HipoksiMikroRNA DisregülasyonuDavranışsal TestlerMorris Su LabirentiYeni Nesne TanımaBilye Gömme TestiSosyal Etkileşim TestiNörodejenerasyon BelirteçleriErken Müdahale
Hipoksi, farelerde otizm spektrum bozukluğunun mendel dışı kalıtımında yer alan miRNA seviyelerini değiştirir
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.