Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Mycobacterium tuberculosis Enfeksiyonunun Hızlı Teşhisi ve Gerçek Zamanlı Floresan PCR'ye Dayalı İlaç Direnci

771 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68445

⸱

15 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Fifth Division Hospital of Xinjiang Production and Construction Corps, 2Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR (qPCR) teknolojisi kullanılarak Mycobacterium tuberculosis ve ilaç direncini tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır.

Özet

Tüberküloz (TB), savunmasız popülasyonları orantısız bir şekilde etkileyen önemli bir sağlık sorunudur. İlaca dirençli tüberkülozun ortaya çıkması ve yayılması küresel halk sağlığı için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. Mycobacterium tuberculosis (MTB) için smear mikroskobu ve kültür gibi geleneksel tanı yöntemlerinin önemli sınırlamaları vardır ve sıklıkla klinik tedavinin gecikmesine neden olur. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, gerçek zamanlı floresan PCR'ye dayalı etkili bir tanı şeması geliştirilmiştir. Yüksek kaliteli MTB nükleik asitleri test numunelerinden ekstrakte edilebilir ve direnç durumu, önemli direnç bölgelerinde tanımlanabilir. Geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yaklaşım tespit süresini sadece birkaç saate indirerek, hastanın ilk ziyaretinden kısa bir süre sonra enfeksiyon ve direnç durumunun belirlenmesini sağlar. Algılama hassasiyeti %85'i aşıyor ve özgüllük %95'e ulaşıyor. Bu non-invaziv teknoloji sadece hasta rahatsızlığını en aza indirmekle kalmaz, aynı zamanda düşük maliyeti ve yüksek verimliliği nedeniyle tabandan gelen sağlık kurumlarında doğru teşhisi de destekler. Genel olarak, yaklaşım TB teşhisinde önemli bir gelişmeyi temsil etmektedir.

Giriş

Mycobacterium tuberculosis'in (MTB) neden olduğu kronik bir bulaşıcı hastalık olan tüberküloz (TB), ilk on küresel ölüm nedeni arasında yer almaktadır1. İlaca dirençli tüberküloz (DR-TB), tüberküloz kontrol çabaları için önemli bir zorluk teşkil etmektedir. Çin Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi (Çin CDC) tarafından yayınlanan Tüberkülozsuz Topluluklar İnşa Etme Eylem Planı (2022-2027), bakteriyolojik olarak doğrulanmış tüm akciğer TB hastalarında erken ilaç direnci taramasına duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır2. DR-TB tespit yeteneklerini geliştirmek, tanı zaman çizelgelerini kısaltmak, DR-TB vakalarının tanımlanmasını en üst düzeye çıkarmak, standartlaştırılmış tedavi ve yönetimi sağlamak ve gerekli enfeksiyon kontrol önlemlerini uygulamak için yeni moleküler tanı teknolojilerinin benimsenmesini savunur3. Ayrıca, DR-TB Önleme ve Kontrolünün Güçlendirilmesine İlişkin Bildirim (No. 4, 2023), ileri tanı tekniklerinin ülke çapında teşvik edilmesini zorunlu kılmaktadır. Evrensel tarama elde etmek, tanısal standardizasyonu iyileştirmek ve sağlık hizmetlerine erişilebilirliği artırmak için bakteriyolojik olarak doğrulanmış tüm TB hastaları için zamanında direnç taraması yapılmasını teşvik etmektedir4.

DR-TB, en az bir anti-TB ilacına dirençli TB vakalarını ifade eder. Mevcut sınıflandırmalar arasında rifampisine dirençli (RR), tek dirençli, polidirençli, çoklu ilaca dirençli (MDR), yaygın ilaca dirençli (XDR öncesi) ve yaygın ilaca dirençli (XDR) TB bulunur. DR-TB epidemiyolojisinin küresel bir meta-analizi, endişe verici direnç oranlarını ortaya koymaktadır: MDR-TB %11.6, izoniazid direnci %15.7, rifampisin direnci %9.4 ve monorezistans %11.8'dir. Bu veriler, DR-TB5'in ciddiyetini ve karmaşıklığını vurgulamaktadır.

Rifampisin ve izoniazid, TB tedavisi için temel öneme sahip ilaçlardır. Bununla birlikte, Dünya Sağlık Örgütü (WHO), rifampisin direnci için hızlı tanı teknolojileri mevcut olsa da, izoniazid direnci için benzer araçların eksik olduğunu belirtmektedir. Bu boşluk, çoklu ilaca dirençli TB (MDR-TB) tanısının zamanında konulmasını engellemektedir. "Rifampisine dirençli TB" nin geçici tanımı, bu tanısal sınırlamayı yansıtmakta ve diğer ilaçlarakarşı direnci hızlı bir şekilde tespit etmek için yetersiz kapasiteyi vurgulamaktadır 6,7. Dünya Sağlık Örgütü, izoniazid dirençli TB vakalarının rifampisine dirençli vakalardan iki kat daha yaygın olduğunu tahmin etmektedir. Rifampisin direnci taramasına özel güven, izoniazid-monodirençli TB'yi (Hr-TB) gözden kaçırma risklerini gözden kaçırır8. Standart rejimlerle tedavi edilen tespit edilmemiş Hr-TB hastaları, tedavi başarısızlığı, nüks ve MDR-TB9'a ilerleme riskleriyle karşı karşıyadır. Etambutol direnci de endişe vericidir. TB ve MDR-TB tedavisi için kritik bir ilaç olarak, Çin'in 2017 DR-TB temel araştırması, yeni vakalarda %4,9 ve yeniden tedavi vakalarında %17,2 ethambutol direnç oranları bildirmiştir10.

Şu anda, rezidüel tüberkülozun ilaç direncinin tespiti için, yapay kültür bazı laboratuvarlarda hala tercih edilen yöntemdir, ancak gerçek zamanlı floresan PCR teknolojisi, tüberkülozun ilaç direncini tespit etmede geleneksel yöntemlerden üstündür: tespit ve miktar tayini: gerçek zamanlı floresan PCR, floresan sinyallerin gerçek zamanlı izlenmesi yoluyla doğru kantitatif analiz sağlarken, geleneksel yöntemler bu doğruluktan yoksundur. Geleneksel deney yöntemleri zaman alıcı ve emek yoğundur, eğitimli personel gerektirir ve oldukça özneldir. Aksine, gerçek zamanlı PCR, floresan probları ve sinyalleri bilgisayar tarafından yakalayarak insan hatalarını en aza indirir. Geleneksel veri analizi yöntemleri daha özneldir, gerçek zamanlı PCR ise amplifikasyon eğrileri, standart eğriler ve diğer analiz yöntemleri aracılığıyla doğru ve objektif analiz sağlar. Bu ilerlemeler, gerçek zamanlı floresan PCR'yi tüberkülozun ilaç direncini tespit etmek için tercih edilen yöntem haline getirmektedir11.

Özetle, ilaca dirençli tüberküloz (DR-TB) küresel bir kriz olarak ortaya çıkmıştır. Önemli ilaçlara (izoniazid, rifampisin ve etambutol) direnç, tüberküloz kontrol çabalarını daha da karmaşık hale getirmektedir. İlaç direncinin zamanında ve doğru bir şekilde tespit edilmesi, kişiye özel tedavi rejimlerine rehberlik etmek, terapötik başarıyı artırmak ve DR-TB tehdidini azaltmak için çok önemlidir.

Tanısal zorluğu ele almak için, bu çalışmada Mycobacterium tuberculosis'i tanımlayabilen ve balgam örneklerini kullanarak 3,5 saat içinde ilaca dirençli mutasyonları tespit edebilen bir kit kullanılmıştır. Bu, gerçek zamanlı floresan qPCR desteği ile başarıldı. Yöntem basit, uygun maliyetli ve doğrudur, bu da onu DR-TB ile mücadelede değerli bir araç haline getirir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu araştırma, Sincan Üretim ve İnşaat Birlikleri Beşinci Bölüm Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır; Etik numarası LLWYH2025001'dir ve etik bir çatışma yoktur. Reaktifler ve kullanılan ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Örnek toplama

  1. Balgam örneklerini toplamak için Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından önerilen uluslararası standartlaştırılmış vidalı kapaklı balgam şişeleri veya kapalı plastik kutular ve mumlu kağıt kutular kullanın.
  2. Balgam kaplarını hastanın adı, numarası (yeni hastalar için ayakta tedavi sıra numarası veya takip eden hastalar için kayıt numarası), muayene öğeleri ve kap sıra numaraları 1, 2, 3 (1 = aynı gün hemen balgam, 2 = gece balgamı, 3 = ertesi gün sabah balgamı) ile etiketleyin. Balgamı olmayan hastalar için, aerosol kaynaklı balgam toplama yoluyla numune toplayın.
    NOT: Personel, toplanan balgam örneklerinin kalitesini değerlendirmelidir. Numune hacmi genellikle 3-5 mL'de tutulmalıdır. Nitelikli örnekler arasında kuru balgam, kahverengi kan lekeli balgam, az miktarda taze kan içeren balgam veya mukoza balgamı bulunur. Tükürük gibi niteliksiz numuneler, daha fazla rehberlikten sonra test için yeniden gönderilmelidir.

2. Balgam ön işleme

  1. Toplanan balgamın hacmine bağlı olarak balgam kabına %4'lük NaOH çözeltisinin hacminin 1-2 katı ekleyin. İçeriği 2 dakika çalkalayın ve karıştırın.
  2. Kabı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin ve balgamın tamamen sıvılaşmasını sağlamak için bu süre zarfında birkaç kez sallayın.
    NOT: Aşındırıcı doğası nedeniyle NaOH'yi dikkatli kullanın. Balgam tam olarak sıvılaştırılmamışsa çalkalama süresini artırın. Bu adım, deney boyunca özellikle önemlidir.

3. Reaktif hazırlama (PCR öncesi alan)

  1. Reaktiflerin hazırlanması: Reaktifleri belirlenen PCR öncesi alanda hazırlayın. Dondurulmuş reaktifleri oda sıcaklığına kadar çözün. 5-10 saniye boyunca girdap. Oda sıcaklığında 5-10 saniye boyunca 3000 × g'da santrifüjleyin.
    NOT: Bu reaktif bir çift sistemdir (A/B) ve ayrı olarak hazırlanmalıdır.
  2. PCR ana karışım hazırlama
    1. Karışım A: 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, (n + 3) × 19.6 μL RIF PCR Mix A ve (n + 3) × 0.4 μL TB enzimini birleştirin. 5-10 saniye boyunca girdap. Oda sıcaklığında 5-10 saniye boyunca 3000 × g'da santrifüjleyin (PCR Mix A: 60 μL).
    2. Karışım B: Başka bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde, (n + 3) × 19.6 μL RIF PCR Karışımı B ve (n + 3) × 0.4 μL TB enzimini birleştirin. Yukarıdaki gibi vorteks ve santrifüj (PCR Karışımı B: 60 μL).
  3. Depolama ve kullanım: Hazırlanan ana karışımları ≤-18 °C'de saklayın. Hemen kullanılmayacaksa, 4 saat içinde kullanın.
    NOT: Aynı protokol EMB ve INH reaktifleri için de geçerlidir.
  4. PCR ana karışımının alıntılanması: 20 μL PCR Mix A ve Mix B'yi ayrı PCR ince duvarlı reaksiyon tüplerine dağıtın. Aliquoted tüpleri kapalı torbalarda ekstraksiyon alanına aktarın.

4. Nükleik asit ekstraksiyonu ve numune yükleme (ekstraksiyon alanı)

  1. 1.2 mL tamamen sıvılaştırılmış balgamı 15.058 × g'da oda sıcaklığında 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti saklayın. İsteğe bağlı: Ekipman izin veriyorsa, sindirilmiş numunenin tamamını santrifüjleyin.
  2. Peletleri 1.2 mL tuzlu su, girdap ve santrifüjde 15.058 × g'da oda sıcaklığında 5 dakika boyunca yeniden süspanse edin. Bu yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
  3. Pelete 250 μL TB ekstraksiyon tamponu ekleyin. Girdap yapın ve 99 ° C'de 10 dakika boyunca termal lizis gerçekleştirin. Oda sıcaklığına soğutun. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 15.058 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın (ekstrakte edilen numune).
    NOT: Viskoz numuneler için sıvılaştırma tamponunun hacmini artırın veya girdaplama süresini uzatın. Numuneler yalnızca DNA ekstraksiyonu içinse, tam sindirimi sağlamak için sıvılaştırma süresini uzatın.
  4. Bir mikropipet kullanarak, her bir PCR ince duvarlı reaksiyon tüpüne 5 μL ekstrakte edilmiş numune veya negatif/pozitif kontroller ekleyin. Tüpleri hemen kapatın ve uygun şekilde etiketleyin.
  5. 5-10 saniye boyunca vorteks yüklü PCR tüpleri ve kısaca santrifüjleyin (5-10 sn). Tüpleri PCR amplifikasyon alanına aktarın.

5. PCR amplifikasyonu (amplifikasyon alanı)

NOT: Rifampisin, etambutol ve izoniazid direnç tespiti için programlar bir Hongshi termal döngüleyici üzerinde ayarlanmıştır (Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3). Bisiklet koşulları dahildir.

  1. Yüklü PCR ince duvarlı reaksiyon tüplerini amplifikasyon için termal döngüleyiciye yerleştirin.
  2. Döngüleyici arayüzüne erişin. Deney Sihirbazı'na tıklayın ve deney türünü Standart Eriyik Eğrisi olarak seçin ( Şekil 1'de gösterildiği gibi).
  3. Plaka Düzenleyici'ye tıklayın, iki bitişik boş kuyucuğu yatay olarak seçin ve bir örneği tanımlamak için sağ panelden ilgili ilaç şablonunu atayın (Şekil 2'de gösterildiği gibi).
  4. Negatif/pozitif kontrolleri ve numune bilgilerini yapılandırın. Programı başlatmak için Başlat'a tıklayın. Çalışma süresi 2 saat 22 dakikadır.
  5. Tamamlandıktan sonra, PCR ince duvarlı reaksiyon tüplerini (mühürlü) kapalı bir torbaya aktarın. Kapağı sabitleyin ve biyolojik olarak tehlikeli atık olarak kullanın.
  6. Verileri işlemek için Thermal Cycler'da Analiz Et'e tıklayın.
    NOT: Bu yöntemin tespit limitleri aşağıdaki gibidir: Kompozit grup: 10 bakteri/mL; Rifampisin: 20.000 bakteri/mL; İzoniazid: 10.000 bakteri/mL; Etambutol: 10.000 bakteri/mL. (Tespit limiti (LoD) verileri, reaktif talimat kılavuzunda sağlanan 765 klinik vakanın istatistiksel analizinden elde edilmiştir.)

6. Sonuçların yorumlanması

  1. Test numuneleri ve pozitif kontroller arasındaki erime sıcaklığı (Tm) farklarını karşılaştırarak mutasyonları belirleyin.
    NOT: Yabani tip (İlaca duyarlı): Numunenin Tm değerleri, dört kanalın tümündeki pozitif kontrolle eşleşir (sapma ≤1 °C). Mutant (İlaca dirençli): Herhangi bir kanaldaki Tm değeri, pozitif kontrolden (ΔTm ≥2 °C) ≥2 °C daha düşüktür).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, 17 tüberküloz hastasından alınan balgam örneklerini test etmek için gerçek zamanlı floresan PCR ve erime eğrisi analizi kullanılmıştır. Ek olarak, 30 hastaya rifampisin direnç testi yapıldı ve 20 hastaya izoniazid ve etambutol direnci test edildi. Gerçek zamanlı floresan PCR yöntemi, Mycobacterium tuberculosis

&

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İlaca dirençli Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) suşlarının küresel ölçekte ortaya çıkması, tüberküloz (TB) hastalarının tedavisini önemli ölçüde zorlaştırmıştır. Özellikle, çoklu ilaca dirençli (MDR) ve yaygın ilaca dirençli (XDR) tüberküloz, TB kontrolü için zorlu zorluklar oluşturmaktadır12. İlaç direncinin hızlı bir şekilde saptanması, uygun tedavi rejimlerinin tasarlanması, terapötik başarısızlığın önlenmesi ve dirençli suşların daha fazla ya...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Kolordu Tüberküloz Projesi'nden özel bir hibe ile finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Yüksek hızlı santrifüj
Lizis TamponuXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Mycobacterium tuberculosis Etambutol Direnci Mutasyon Tespit KitiXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Mycobacterium tuberculosis Isoniazid Direnç Mutasyon Tespit KitiXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Mycobacterium tuberculosis Rifampisin Direnci Mutasyon Tespiti KiXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
SLAN-96P Gerçek Zamanlı PCR SistemiShanghai Hongshi Medical Technology Co., Ltd.SLAN-96P
Balgam İşleme ÇözümüXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
TopPette Pipetleyici
2411070124030801240111012403100124110701

Kaynaklar

  1. Salari, N., et al. Global prevalence of drug-resistant tuberculosis: A systematic review and meta-analysis. Infect Dis Poverty. 12 (1), 57(2023).
  2. Cai, X., Xu, X., He, G., Jiang, X., Wu, L. Drug resistance in drug-resistant tuberculosis patients with and without diabetes mellitus: A comparative analysis. BMC Infect Dis. 24 (1), 807(2024).
  3. Egan, K. A., et al. Compensatory evolution in NusG improves fitness of drug-resistant M. tuberculosis. Nature. 628 (8006), 186-194 (2024).
  4. Sulis, G., Pai, M. Isoniazid-resistant tuberculosis: A problem we can no longer ignore. PLoS Med. 17 (1), e1003023(2020).
  5. Perumal, R., et al. Regimens for drug-resistant tuberculosis. N Engl J Med. 388 (2), 189(2023).
  6. Menzies, D., et al. Effect of duration and intermittency of rifampin on tuberculosis treatment outcomes: A systematic review and meta-analysis. PLoS Med. 6 (9), e1000146(2009).
  7. Turkova, A., et al. Shorter treatment for nonsevere tuberculosis in African and Indian children. N Engl J Med. 386 (10), 911-922 (2022).
  8. Diagnosis of tuberculosis and detection of drug-resistance: rapid communication. , World Health Organization. https://www.who.int/publications/i/item/B09111 (2024).
  9. Xiang, X., et al. Mycobacterial ethambutol responsive genes and implications in antibiotics resistance. J Drug Target. 29 (3), 284-293 (2021).
  10. Deshpande, A., Likhar, R., Khan, T., Omri, A. Decoding drug resistance in Mycobacterium tuberculosis complex: Genetic insights and future challenges. Expert Rev Anti Infect Ther. 22 (7), 511-527 (2024).
  11. Sun, Q., et al. Mutations within embCAB are associated with variable level of ethambutol resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from China. Antimicrob Agents Chemother. 62 (1), e01279-e01317 (2017).
  12. Noordhoek, G. T., et al. Sensitivity and specificity of PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis: A blind comparison study among seven laboratories. J Clin Microbiol. 32, 277-284 (1994).
  13. Lee, H., et al. Assessment of the quantitative ability of AdvanSure TB/NTM real-time PCR in respiratory specimens by comparison with phenotypic methods. Ann Lab Med. 34, 51-55 (2014).
  14. Murphy, S. G., et al. Direct detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using targeted next generation sequencing. Front Public Health. 11, 1206056(2023).
  15. Araya, B. T., et al. Performance of the Abbott RealTime MTB and RIF/INH resistance assays for the detection of Mycobacterium tuberculosis and resistance markers in sputum specimens. PLoS One. 16, e0251602(2021).
  16. Motta, I., et al. Recent advances in the treatment of tuberculosis. Clin Microbiol Infect. 30 (9), 1107-1114 (2024).
  17. Zhang, X., et al. A new method for the detection of Mycobacterium tuberculosis based on the CRISPR/Cas system. BMC Infect Dis. 23 (1), 680(2023).
  18. Sam, I. K., et al. TB-QUICK: CRISPR-Cas12b-assisted rapid and sensitive detection of Mycobacterium tuberculosis. J Infect. 83 (1), 54-60 (2021).
  19. Park, Y. K., et al. Correlation of the phenotypic ethambutol susceptibility of Mycobacterium tuberculosis with embB gene mutations in Korea. J Med Microbiol. 61 (4), 529-534 (2012).
  20. Global tuberculosis report. , World Health Organization. https://www.who.int/teams/global-programme-on-tuberculosis-and-lung-health/tb-reports/global-tuberculosis-report-2023 (2023).
  21. Parsa, S., et al. Detection of isoniazid and rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from sputum samples by high-resolution melting analysis. Curr Microbiol. 79 (9), 257(2022).
  22. Plinke, C., et al. embCAB sequence variation among ethambutol-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates without embB306 mutation. J Antimicrob Chemother. 65 (7), 1359-1367 (2010).
  23. Xie, L., et al. Accurate and affordable detection of rifampicin and isoniazid resistance in tuberculosis sputum specimens by multiplex PCR-multiple probes melting analysis. Infection. 52 (6), 2371-2398 (2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Tüberküloz Tanısıİlaç Dirençli TBGerçek Zamanlı PCRNükleik Asit EkstraksiyonuDirenç TespitiYayma MikroskopisiKültür YöntemiTanısal Duyarlılık

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.