Bu protokol, 6-8 saat içinde yeterli primer kondrositlerin izolasyonunu sağlayarak kıkırdak biyolojisi ve kıkırdak hastalığı mekanizmalarının daha derinlemesine araştırılmasını kolaylaştırır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kıkırdak Biyolojisi için Fare Primer Kondrositlerinin İn vitro İzolasyonu ve Kültürlenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Eklem kıkırdağı yıkımı, osteoartrit (OA) ve romatoid artrit (RA) dahil olmak üzere çeşitli kıkırdak hastalıklarında önemli bir nedensel faktör olan kondrosit aktivitesinin değişmesine yol açar. Kıkırdakta en bol bulunan hücre tipi olan kondrositlerin biyolojik özelliklerinin derinlemesine incelenmesi, etkili hastalık tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için gereklidir. Primer kondrositlerin izolasyonu ve kültürlenmesi, kıkırdak hastalığının araştırılması için önemli deneysel materyaller sağlar ve kıkırdak yaralanması ve onarım mekanizmalarının çözülmesine katkıda bulunur. Bu protokol, farelerden türetilen birincil kondrositler için in vitro izolasyon ve kültürleme yöntemlerinin ayrıntılı bir tanımını sağlar. Optimize edilmiş kollajenaz II protokolü kullanılarak, yenidoğan fare diz eklemi kıkırdak örnekleri için kondrosit izolasyonu 8 saat içinde tamamlanabilir. Hücre verimi, doku tazeliğine ve başlangıçtaki hücre yoğunluğuna göre değişen, yaklaşık 1-2 × 10³ hücre/mg kıkırdak dokusudur; İzole edilen hücreler %>90 canlılık sergiler. Bu protokol, izolasyondan 1, 2 ve 5 gün sonra kültürlenen hücrelerin morfolojik özelliklerini ve yapışma durumunu gösteren fare birincil kondrositlerini örnek olarak kullanır. Ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ve western blotlama, interlökin-1β (IL-1β) tedavisinin Kollajen Tip II Alfa 1'i (Col2a1) azalttığını ve Matriks Metallopeptidaz 13 (Mmp13) ekspresyonunu arttırdığını gösterdi ve izole kondrositlerin inflamatuar uyaranlara yanıt verdiğini doğruladı. Geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokol, tripsin tedavisinden kaynaklanan potansiyel hücre hasarını önlerken, uzun izolasyon süresinin hücre canlılığı üzerindeki etkisini azaltmak için daha yüksek bir kollajenaz konsantrasyonu kullanır. Elde edilen primer kondrositler saf ve canlıdır, kıkırdak yaralanması ile ilgili mekanizmalar üzerine derinlemesine çalışmalar için uygundur ve bu da in vitro araştırmalar ve kıkırdak hastalığının klinik tedavisi için önemli etkileri vardır.
Giriş
Eklem kıkırdağı yıkımı, OA ve RA 1,2 gibi çeşitli kıkırdak hastalıklarının önemli bir nedenidir. Kıkırdaktaki baskın hücre tipi olan kondrositler, homeostazı korumak ve yaralanmaya yanıt olarak onarımı kolaylaştırmak için gereklidir3. Kondrosit aktivitesindeki değişiklikler sadece kıkırdağın yapısal bütünlüğünü etkilemekle kalmaz, aynı zamanda inflamatuar yanıtları ve ilerleyici doku dejenerasyonunu da indükler4. Bu nedenle, kondrositlerin biyolojik özelliklerinin derinlemesine araştırılması, bu hastalıkların etyopatogenezinin aydınlatılması için çok önemlidir.
Son yıllarda, kondrositlerin inflamatuar yanıtlardaki rolü giderek daha fazla ilgi görmüştür. Çalışmalar, IL-1β ve tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) gibi inflamatuar sitokinlerin, kondrositlerin metabolik süreçlerini önemli ölçüde tehlikeye attığını, bunun da matris parçalayıcı enzimlerin ekspresyonunun artmasına ve matris sentezinin azalmasına neden olduğunu göstermiştir 5,6,7. Bu değişiklikler sonuçta kıkırdağın kademeli olarak dejenerasyonuna ve eklem fonksiyon bozukluğuna yol açar. Bu nedenle, kondrositlerin patolojik koşullar altında biyolojik değişikliklerinin in vitro modellerde araştırılması özellikle zorunlu hale gelmiştir. Geleneksel iki boyutlu (2D) tek katmanlı kültüre dayanarak, üç boyutlu (3D) kondrosit kültürü ve organoid teknolojilerindeki son gelişmeler, kıkırdakla ilgili araştırmalarda giderek daha fazla benimsenmektedir. Bu rafine sistemler, fizyolojik olarak daha alakalı bir mikro ortam sunar ve hastalık bağlamlarında kondrosit davranışı hakkında değerli bilgiler sağlar8.
Bir hücre kaynağının seçimi, in vitro bulguların eklemlerin patofizyolojisini doğru bir şekilde özetleyip özetlemediğini kritik olarak belirler. Ölümsüzleştirilmiş kondrosit hatlarının veya kıkırdak eksplantlarının aksine, birincil kondrositler, eklem kıkırdağının doğal genetik arka planını, mekanosensitif kalsiyum sinyal yollarını ve fenotipik stabilitesini korur, böylece yerleşik kıkırdak hücrelerininkini daha yakından yansıtan üstün kondrojenik kapasite ve biyolojik davranışlar sergiler9. Birincil kondrositler ve ATDC5 hücre hattı10 arasında kalsiyum sinyal kaynaklarında ve anahtar iyon kanallarında ve aşağı akış yollarında sistematik farklılıklar belgelenmiştir. Sonuç olarak, eklem fizyolojisi veya patolojisi araştırılırken primer kondrositlere öncelik verilmelidir. Bu nedenle, primer kondrositlerin izolasyonunu ve kültürlenmesini optimize etmek, hastalıkla ilgili biyolojiyi doğru bir şekilde modellemek ve potansiyel terapötik ilaçlarıaraştırmak için gereklidir 11,12,13,14,15. Bununla birlikte, mevcut yöntemler, uzun süreli sindirim nedeniyle hücre canlılığını veya fenotip bütünlüğünü tehlikeye atmaktadır16,17.
Burada, fare kıkırdak dokusundan türetilen ve hızla yeterli hücre veren birincil kondrositlerin in vitro izolasyonu ve kültürlenmesi için bir protokol açıklıyoruz. Geleneksel düşük enzim konsantrasyonlu, uzun süreli sindirim protokolleri ile karşılaştırıldığında, bu çalışma enzim sindirim koşullarını ve doku ön tedavi adımlarını optimize etmiştir. Bu optimizasyon, tripsin tedavisinden15,17 kaynaklanan potansiyel hücre hasarını önlerken sindirim süresini önemli ölçüde 6-8 saate düşürmüştür. Bu yöntem kullanılarak, her bir mg fare kıkırdak dokusundan yaklaşık 1-2 × 103 kondrosit elde edilebilir. Bu protokol, primer kondrositlerin in vitro olarak izole edilmesi ve kültürlenmesi için güvenilir bir kılavuz sunarak kıkırdak hastalığı çalışmaları için sağlam bir model sağlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri, Xi'an Honghui Hastanesi Etik Kurulu (No. 202309009) tarafından onaylandı ve deneysel prosedürler, hayvan deneyleri için 3R'nin değiştirme, azaltma ve iyileştirme ilkelerine sıkı sıkıya bağlı kaldı.
Şekil 1A , reaktiflerin ve ekipmanın hazırlanmasının şematik bir diyagramını göstermektedir. Malzeme Tablosu, bu protokolde kullanılan reaktifler ve ekipman hakkında bilgi içerir.
1. Deney fareleri
NOT: Bu çalışmada dört adet 3 günlük, vahşi tip C57BL/6J fare kullanıldı.
- Kafesleri 25 °C ± 2 °C sabit sıcaklıkta ve P-` nemde, 12 saat/12 saat aydınlık/karanlık döngüsünde tutun. Spesifik patojen içermeyen (SPF) dereceli steril fare diyeti ( 60Co ışınlama ile sterilize edilmiş) ve ad libitum steril su sağlayın.
- Primer kondrositleri izole etmek için ölüm sonrası dört 3 günlük fareden diz eklemi kıkırdağı (~ 10 mg / fare) toplayın.
2. Kıkırdak numunesi toplama ve işleme
- Fare işleme ve doku diseksiyonu
- Yenidoğan fareleri doğumdan sonraki 3 gün içinde ötenazi yapın. Vücut yüzeyini u medikal alkol ile silerek sterilize ediniz.
- Fare diz eklemlerini steril cerrahi aletlerle izole edin. Bunları steril 1x PBS'ye yerleştirin.
- Diz eklemini çevreleyen kasları, kemikleri, sinovyumu ve diğer proliferatif bağ dokularını steril cerrahi aletlerle dikkatlice çıkarın. Sadece diz ekleminin kıkırdak dokusunu tutun.
- Doku örneklerini steril 1x PBS ile 3 kez durulayın. Sıvıyı atın.
NOT: Şekil 1B , kıkırdak dokusu edinimi ve ön işlemenin basitleştirilmiş bir şematik diyagramını göstermektedir.
Şekil 1: Malzeme hazırlama ve kıkırdak numunesi işlemenin basitleştirilmiş iş akışı. (A) Reaktifler, sarf malzemeleri ve ana aletler dahil olmak üzere reaktif ve ekipman kurulumunun şematik diyagramı. (B) Fare diz eklemlerinden kıkırdak dokularını işlemek için adım adım protokol. Kısaltmalar: PBS = fosfat tamponlu salin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. Primer kondrositlerin izolasyonu ve kültürü
- İzole edilmiş kıkırdak dokusunu yeni bir 6 oyuklu hücre kültürü plakasına aktarın. Steril bir No. 11 cerrahi bıçak kullanarak dokuyu yaklaşık 0,25mm3 boyutunda küçük parçalara ayırın. Önceden soğutulmuş steril 1x PBS ile bir kez durulayın. Sıvıyı atın.
- Doku bloğunu kaplamak için yüksek konsantrasyonlu kollajenaz II (25 mg/mL, steril Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı/Besin Karışımı F-12 [DMEM/F12] bazal ortamında çözülmüş) içeren 2 mL önceden ısıtılmış (37 °C) sindirim solüsyonu ekleyin.
- Enzimatik sindirim için hücre kültürü plakasını nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatöründe 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra sıvıyı atın.
- 3.2 ve 3.3 adımlarını tekrarlayın.
NOT: Yüksek konsantrasyonlu enzim sindirimi bir ön adımdır. Dokuyu önceden sindirmeyi, daha sonra daha iyi sindirim için yapısını kısmen parçalamayı ve doku çevresinden kesilme nedeniyle var olabilecek matris yapışıklıklarını gidermeyi amaçlar. - Doku bloğunu kaplamak için düşük konsantrasyonlu kollajenaz II (5 mg/mL, steril DMEM/F12 bazal ortamda çözülmüş) içeren 2 mL önceden ısıtılmış (37 °C) sindirim solüsyonu ekleyin.
- Hücre kültürü plakasını nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatöründe 37 °C'de sindirim için 6-8 saat inkübe edin ve hücre ayrılmasının ilerlemesini gözlemleyin. Lizis verimliliğini artırmak için ara sıra yavaş yatay çalkalama (80-120 rpm) veya hafif pipetleme gerçekleştirin.
NOT: Yenidoğan fare dokusu için, hücre salınımı 3 saat civarında görülebilir ve tam izolasyon 6 ila 8 saat arasında elde edilebilir. 6-8 saatlik kollajenaz II tedavisi sırasında, her saat başı lizizi gözlemleyin ve çıplak gözle belirgin doku parçaları görülmediğinde ve hücrelerin% 90'ı mikroskop altında serbest ve süspansiyon halinde olduğunda sindirimi sonlandırın. Sindirim sürecinde, optik mikroskop altında kıkırdak doku kütlesinden yavaş yavaş ayrılan vakuol benzeri kondrositler gözlemlenebilir. Bu adım, uzun süreli sindirimin neden olduğu kondrositlere verilen zararı en aza indirmek için birkaç kez tekrarlanabilir ve hücre verimini artırmak için sindirim solüsyonu taze, düşük konsantrasyonlu kollajenaz II sindirim solüsyonu ile değiştirilebilir. - Tüm sindirim ürünlerini 100 μm'lik bir hücre süzgecinden steril 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün.
NOT: Kondrosit agregatlarının kaybını önlemek ve verimi artırmak için 100 μm'lik bir hücre süzgeci kullanın. Besiyeri değişimi sırasında artık doku parçaları çıkarılır. - Hücre kültürü plakasını steril 1x PBS ile durulayın. Hücre süzgecinden tekrar süzün.
- Önceki adımdaki tüm süzüntüyü 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın. Fren kapalıyken oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın.
- 2 mL steril 1x PBS ekleyin ve bir pipetle hafifçe üfleyerek ve aspire ederek çökeltiyi nazikçe yeniden süspanse edin. Steril 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Fren kapalıyken oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın.
- Adım 4.10'daki çökeltiyi,% 15 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 P / S içeren 2 mL taze hazırlanmış steril DMEM / F12 tam ortamı ile yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak hasat edilen hücre süspansiyonunu numaralandırın, ardından hücreleri 2-2.5 × 105 hücre /cm2'de steril 10 cm'lik bir kültür kabına koyun. Tam ortam ile 10 mL'lik bir son hacme tamamlayın.
NOT: Kondrosit tohumlama yoğunluğu 2-2.5 × 105 hücre /cm2 olmalıdır, çünkü düşük veya orta yoğunluklu tohumlama eklem kondrositlerinin fibroblastlara doğru fenotipik bir kaymasına yol açabilir. İzole edilen birincil hücrelerin proliferasyon aktivitesi ve canlılığı, isteğe bağlı MTT testleri veya tripan mavisi dışlama boyaması (İsteğe Bağlı Adım) kullanılarak değerlendirilebilir. - Nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.
- Hücrelerin optik mikroskop altında duvara tamamen yapıştığı gözlemlendikten sonra taze DMEM/F12 tam ortamıyla ( FBS, %1 P/S içeren) değiştirin.
- Ortamı 2 günde bir değiştirin. Birleşme p'e ulaşana kadar kültürlemeye devam edin, bu noktada sonraki deneyler yapılabilir.
NOT: Kültür ortamındaki serum konsantrasyonu, hücre durumuna bağlı olarak% 15'e yükseltilebilir. Şekil 2 , kıkırdak dokusu sindirimi, izolasyonu ve birincil hücrelerin kültürünün basitleştirilmiş bir şematik diyagramını göstermektedir.
Şekil 2: Kıkırdak dokusu sindirimi, birincil hücre izolasyonu ve kültürü için basitleştirilmiş prosedür. Kıkırdak kıyıldı ve 15 dakika boyunca yüksek konsantrasyonlu kollajenaz II sindirim solüsyonu ile sürekli olarak sindirildi, bir kez tekrarlandı, ardından hücreleri izole etmek için 6-8 saat boyunca düşük konsantrasyonlu kollajenaz II sindirim solüsyonu ile sindirildi. Sindirilen doku daha sonra süzüldü ve süzüntü toplandı ve santrifüjlendi. Hücre peleti 1x PBS ile yıkandı ve birleşme p'e ulaşana kadar DMEM/F12 ortamında kültürlendi, bu noktada hücreler sonraki deneyler için hazırdı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Birincil kondrositlerin fonksiyonel doğrulaması
- Enflamatuar koşullar altında kondrositlerin metabolizması ve değişiklikleri.
- Enflamatuar durumları simüle etmek için hücreleri 24 saat boyunca 10 ng/mL IL-1β ile tedavi edin.
- RT-qPCR ve western blotlama için, COL2A1, MMP13 gibi kondrosit hücre dışı matrisinin metabolik göstergelerini saptamak için toplam RNA'yı veya toplam proteini çıkarın.
NOT: Şekil 3, primer kondrositlerin fonksiyonel validasyonunun ve sonraki deneysel prosedürlerin şematik bir diyagramını göstermektedir. Antikor bilgisi Malzeme Tablosunda verilmiştir. Western blotlama ve RT-qPCR için ayrıntılı prosedürler Tablo 1, Tablo 2, Tablo 3, Tablo 4 ve Tablo 5'te verilmiştir. Tüm yöntemler standart protokolleri 11,18 izledi.
Şekil 3: Birincil kondrosit fonksiyonel doğrulama programının şematik diyagramı. IL-1β tedavisinin neden olduğu inflamatuar durumlar; RT-qPCR ve Western blotlama ile değerlendirilen kıkırdakla ilişkili fenotipler üzerindeki etkiler. Kısaltmalar: IL-1β = interlökin-1β; RT-qPCR = Ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Western Blotlama iş akışı koşulları | |
| Adım | Durum / Reaktif |
| SDS-PAGE jel hazırlama | %8 (a/h) Tris-HCl ayırıcı jel |
| İstifleme elektroforezi | 80 V, 30–40 dk |
| Elektroforezin çözülmesi | 120 V, 1–1,5 saat |
| Aktarmak | Yarı kuru, 15 V, 30–60 dk |
| Engelleme | Hızlı engelleme tamponu, oda sıcaklığında 2 saat |
Tablo 1: Western blotlama iş akışı koşulları. SDS-PAGE bileşimi, elektroforez parametreleri, transfer ayarları ve blokaj prosedürü dahil olmak üzere western blotlama koşullarının özeti.
| Ters transkripsiyon reaksiyon karışımı | |
| Parça | Hacim (μL) |
| 5× Transkriptör Ters Transkriptaz Reaksiyon Tamponu | 4 |
| Deoksinükleotid Karışımı (her biri 10 mM) | 2 |
| Koruyucu RNaz İnhibitörü (40 U/μL) | 0.5 |
| Transkriptör Ters Transkriptaz (20 U/μL) | 0.5 |
| Nükleaz içermeyen su | 20'ye kadar |
| Toplam hacim | 20 |
Tablo 2: Ters transkripsiyon reaksiyon karışımı. cDNA sentezi için ters transkripsiyon reaksiyonu bileşimi.
| Fare primer kondrositinin RT-qPCR'si için primer bilgisi | ||||
| Gen adı | Sıra(5'3 ') | Tavlama sıcaklığı (°C) | ||
| mGapdh | İletmek | TGGCCTTCCGTGTTCCTAC | 60 | |
| Ters | GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA | |||
| mCol2a1 | İletmek | TGACCTCAACTACATGGTCTACA | 60 | |
| Ters | CTTCCCATTCTCGGCCTTG | |||
| mMmp13 | İletmek | CTTCTTCTTGTTGAGCTGGACTC | 60 | |
| Ters | CTGTGGAGGTCACTGTAGACT | |||
Tablo 3: Fare primer kondrositinin RT-qPCR'si için primer bilgisi. Fare primer kondrositlerinde Gapdh, Col2a1 ve Mmp13 transkriptlerini ölçmek için kullanılan primerlerin dizileri ve tavlama sıcaklığı (60 °C).
| RT-qPCR reaksiyon karışımı | |
| Parça | Hacim (μL) |
| 2 × SYBR Yeşil qPCR Ana Karışımı | 10 |
| Seyreltilmiş cDNA şablonu | 8 |
| İleri primer (10 μM) | 1 |
| Ters astar (10 μM) | 1 |
| Toplam hacim | 20 |
Tablo 4: RT-qPCR reaksiyon karışımı. SYBR Green ana karışımı, şablonu ve primerleri ile RT-qPCR reaksiyon karışımı (20 μL).
| RT-qPCR döngü protokolü | ||
| Adım | Sıcaklık (°C) | Saat |
| İlk denatürasyon (×1) | 95 | 10 dakika |
| Denatürasyon (×40) | 95 | 5 sn. |
| Tavlama/uzatma (×40) | 60 | 15 sn. |
| Dahili (×40) | 72 | 30 sn. |
| Erime eğrisi (×1) | 95 55 95 | 60 sn 30 sn 30 sn |
Tablo 5: RT-qPCR döngü protokolü. 95 °C'de 5 saniye denatürasyon, 60 °C'de 15 saniye tavlama/uzatma ve 40 döngü boyunca son bir erime eğrisi analizi yapıldı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1, Şekil 2 ve Şekil 3'te açıklandığı gibi, protokolü gerçekleştirdik ve fare diz eklemlerinden primer kondrositleri başarıyla izole ettik. Yaklaşık 10 mg yenidoğan fare kıkırdağından, %>90 canlılığa sahip yaklaşık 1 × 104 hücre elde ettik. İn vitro kültürün ilk gününde, birincil fare kondrositleri, çoğu hücrenin süspansiyon halinde olduğu ve henüz kültür kabının dibine tam olarak yapışma...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Primer kondrositlerin izolasyonu ve kültürü, kıkırdak hastalıklarının patofizyolojisini aydınlatmak için gereklidir22. Primer kondrosit kültüründe, kollajenaz konsantrasyonunu ve sindirim süresini optimize etmek çok önemlidir, çünkü potansiyel hücresel hasarı azaltırken hücre dışı matrisin bozulmasını dengeler17. Burada, primer kondrositleri fare kıkırdak dokularından izole etmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem kullanılarak her 1 mg fare ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82370909) tarafından desteklenmiştir. Şekil 1, Şekil 2 ve Şekil 3 Figdraw ile oluşturulmuştur.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1&kez; PBS Toz (2 L) | Hizmet biyografisi | G0002-2L | |
| 100 mm hücre kültürü kapları | Hizmet biyografisi | CCD-100 Serisi | |
| 100 μ m hücreli elek | Sangon Biyoteknoloji | F613463-0001 | |
| 15mL Konik Santrifüj Tüpü (Steril, Enzimsiz) | Hizmet biyografisi | EP-1501-J | |
| 50mL Konik Santrifüj Tüpü (Steril, Enzimsiz) | Hizmet biyografisi | EP-5001-J | |
| 6 oyuklu hücre kültürü plakası | Hizmet biyografisi | CCP-6H | |
| Anti-COL2A1 tavşan poliklonal antikoru | İmmünoyol | YT1022 Serisi | Birincil Antikorlar; Dünya Bankası: 1/500 |
| Anti-GAPDH fare monoklonal antikoru | Protein teknolojisi | 60004-1-IG | Birincil Antikorlar; Dünya Bankası: 1/2000 |
| Anti-MMP13 tavşan poliklonal antikor | İmmünoyol | YT2796 Serisi | Birincil Antikorlar; Dünya Bankası: 1/1000 |
| Aseptik ultra temiz tezgah | Termo Balıkçı | 51029704 | |
| Hücre kültürü inkübatörü | Termo Balıkçı | 51033782 | |
| Kollajenaz II | Güneş Enerjisi | C8150 Serisi | |
| Özel primerler (Gapdh, Col2a1, Mmp13) | Sangon Biyoteknoloji | Primer BLAST kullanılarak tasarlanmıştır | |
| DMEM/F12 orta | Hidrolik klon | SH30023.01 | |
| Fetal sığır serumu | Eski Hücre | FCS500 Serisi | |
| HRP-Keçi Anti-Fare poliklonal antikoru | İmmünoyol | RS0001 Serisi | İkincil Antikorlar; WB: 1/10000 |
| HRP-Keçi Anti-Tavşan poliklonal antikor | İmmünoyol | RS0002 Serisi | İkincil Antikorlar; Dünya Bankası: 1/10000 |
| Ters faz kontrast mikroskobu | OLYMPUS | CKX53 Serisi | |
| Mikropipet | Termo Balıkçı | ||
| Minyatür tezgah üstü santrifüj | SUNNE | SN-TDL-6 | |
| 11 numaralı cerrahi bıçak | Hizmet biyografisi | QXJZ-11 | |
| Penisilin-Streptomisin Çözeltisi(100X) | Beyotime | C0222 (İngilizce) | |
| Küçük Hayvan Diseksiyon Aletleri Seti | Hizmet biyografisi | QXTZ01 |
Kaynaklar
- Makris, E. A., Gomoll, A. H., Malizos, K. N., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Repair and tissue engineering techniques for articular cartilage. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 21-34 (2015).
- Bierma-Zeinstra, S., Van Middelkoop, M., Runhaar, J., Schiphof, D. Nonpharmacological and nonsurgical approaches in OA. Best Pract Res Clin Rheumatol. 34 (2), 101564(2020).
- Urlic, I., Ivkovic, A. Cell sources for cartilage repair-biological and clinical perspective. Cells. 10 (9), 2496(2021).
- Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Nat Med. 26 (10), 1583-1592 (2020).
- Zhao, K., Ruan, J., Nie, L., Ye, X., Li, J. Effects of synovial macrophages in osteoarthritis. Front Immunol. 14, 1164137(2023).
- Wang, B. W., et al. Aucubin protects chondrocytes against IL-1β-induced apoptosis in vitro and inhibits osteoarthritis in a mouse model. Drug Des Devel Ther. 13, 3529-3538 (2019).
- Kuswanto, W., Baker, M. C. Repurposing drugs for the treatment of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 32 (8), 886-895 (2024).
- Heywood, H. K., Thorpe, S. D., Jeropoulos, R. M., Caton, P. W., Lee, D. A. Modulation of sirtuins during monolayer chondrocyte culture influences cartilage regeneration upon transfer to a 3d culture environment. Front Bioeng Biotechnol. 10, 971932(2022).
- Piñeiro-Ramil, M., et al. Generation of human immortalized chondrocytes from osteoarthritic and healthy cartilage : A new tool for cartilage pathophysiology studies. Bone Joint Res. 12 (1), 46-57 (2023).
- Li, W., Zhou, Y., Han, L., Wang, L., Lucas Lu, X. Calcium signaling of primary chondrocytes and atdc5 chondrogenic cells under osmotic stress and mechanical stimulation. J Biomech. 145, 111388(2022).
- Zhao, Y., et al. Protein folding dependence on selenoprotein m contributes to steady cartilage extracellular matrix repressing ferroptosis via PERK/ATF4/CHAC1 axis. Osteoarthritis Cartilage. 33 (2), 261-275 (2025).
- Zhang, H., et al. Mechanical overloading promotes chondrocyte senescence and osteoarthritis development through downregulating FBXW7. Ann Rheum Dis. 81 (5), 676-686 (2022).
- Tang, H., et al. The IRF1/GBP5 axis promotes osteoarthritis progression by activating chondrocyte pyroptosis. J Orthop Translat. 44, 47-59 (2024).
- Bittner, N., et al. Primary osteoarthritis chondrocyte map of chromatin conformation reveals novel candidate effector genes. Ann Rheum Dis. 83 (8), 1048-1059 (2024).
- Ramser, A., Greene, E., Rath, N., Dridi, S. Primary growth plate chondrocyte isolation, culture, and characterization from the modern broiler. Poult Sci. 102 (1), 102254(2023).
- Mao, J., et al. Insufficiency of collagenases in establishment of primary chondrocyte culture from cartilage of elderly patients receiving total joint replacement. Cell Tissue Bank. 24 (4), 759-768 (2023).
- Lau, T. T., Peck, Y., Huang, W., Wang, D. A. Optimization of chondrocyte isolation and phenotype characterization for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 21 (2), 105-111 (2015).
- Pagani, S., et al. Rna extraction from cartilage: Issues, methods, tips. Int J Mol Sci. 24 (3), 2120(2023).
- Goldring, M. B., Otero, M., Tsuchimochi, K., Ijiri, K., Li, Y. Defining the roles of inflammatory and anabolic cytokines in cartilage metabolism. Ann Rheum Dis. 67 (Suppl 3), 75-82 (2008).
- Wang, G., et al. TGFbeta attenuates cartilage extracellular matrix degradation via enhancing FBXO6-mediated MMP14 ubiquitination. Ann Rheum Dis. 79 (8), 1111-1120 (2020).
- Pang, Y., Zhao, L., Ji, X., Guo, K., Yin, X. Analyses of transcriptomics upon IL-1β-stimulated mouse chondrocytes and the protective effect of catalpol through the NOD2/NB-κb/MAPK signaling pathway. Molecules. 28 (4), 1606(2023).
- Naranda, J., Gradisnik, L., Gorenjak, M., Vogrin, M., Maver, U. Isolation and characterization of human articular chondrocytes from surgical waste after total knee arthroplasty (TKA). PeerJ. 5, e3079(2017).
- Koyama, N., et al. Pluripotency of mesenchymal cells derived from synovial fluid in patients with temporomandibular joint disorder. Life Sci. 89 (19-20), 741-747 (2011).
- Lawrence, J. E. G., et al. Single-cell transcriptomics identifies chondrocyte differentiation dynamics in vivo and in vitro. Dev Cell. , (2025).
- Huang, C., et al. Single-cell transcriptomic analysis of chondrocytes in cartilage and pathogenesis of osteoarthritis. Genes Dis. 12 (2), 101241(2025).
- Wu, C. L., et al. Single cell transcriptomic analysis of human pluripotent stem cell chondrogenesis. Nat Commun. 12 (1), 362(2021).
- Zhang, H., Huang, J., Alahdal, M. Exosomes loaded with chondrogenic stimuli agents combined with 3d bioprinting hydrogel in the treatment of osteoarthritis and cartilage degeneration. Biomed Pharmacother. 168, 115715(2023).
- Mahapatra, C., Jin, G. Z., Kim, H. W. Alginate-hyaluronic acid-collagen composite hydrogel favorable for the culture of chondrocytes and their phenotype maintenance. Tissue Eng Regen Med. 13 (5), 538-546 (2016).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.