Yöntem makalesi

Ookluc: İletim Bloke Edici Bileşikleri Tanımlamak için Bir Plasmodium berghei Hattı

715 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68466

⸱

11 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Parasitology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo

Bu makalede

Özet

Plasmodium cinsel gelişimi sivrisinek orta bağırsağında meydana gelir. Parazitin cinsel aşamalarını hedeflemek, bulaşmayı engellemek için umut verici bir stratejidir. Zigot oluşumundan sonra nanolusiferaz eksprese eden transgenik bir P. berghei olan Ookluc'u geliştirdik ve iletim bloke edici bileşiklerin yüksek verimli taramasını sağladık. Bu makale, Ookluc kullanarak tarama yöntemlerini detaylandırmaktadır.

Özet

Sıtma bir dünya sağlık sorunu olmaya devam ediyor; 2023'te dünya çapında 263 milyon vaka ve 597.000 ölüm bildirildi. Parazitin yaşam döngüsü karmaşıktır ve hastalığı etkili bir şekilde kontrol etmek için kritik gelişim aşamalarında hedefe yönelik müdahalelere ihtiyaç vardır. İletim engelleme (TB) stratejileri, aşılar ve ilaçlar yoluyla sivrisinek vektörünü veya parazitin cinsel aşamalarını hedef alarak Plasmodium iletimini kesmeyi amaçlar. TB müdahaleleri, insan konakçısındaki gametositlere veya sivrisinek orta bağırsağındaki gametler, zigotlar, ookinatlar ve ookistler gibi diğer formlara odaklanabilir.

Yeni TB yaklaşımlarının geliştirilmesi önemli zorluklarla karşı karşıyadır. Parazitin cinsel evrelerini incelemek doğası gereği zordur ve gametositosidal bileşikler için yüksek verimli tarama (HTS) esas olarak P. falciparum kültürlerine dayanır. Bununla birlikte, daha sonraki cinsel aşamalara karşı müdahaleleri değerlendirmek için sağlam in vitro araçlar sınırlı kalmaktadır. TB bileşiklerinin keşfini hızlandırmak için grubumuz, Plasmodium enfeksiyonunun bir murin modeli olan P. berghei'yi kullanarak gametosit aktivasyonu ve döllenmesi için yeni bir HTS testi geliştirdi. Transgenik parazit olan Ookluc, nanolusiferazı yalnızca zigot oluşumundan sonra, ookin gelişimi sırasında en yüksek lüminesans ile eksprese eder. Bu lüminesans tabanlı tahlil, artan lüminesansın ookinat oluşumu ile doğrudan ilişkili olduğu, gametten zigota ve zigottan ookinat farklılaşmasına kantitatif bir okuma sağlar. Bu video makalesinde, Ookluc kullanılarak sıtma TB bileşiklerinin taranması için yöntemler sunulmaktadır.

Giriş

Sıtma, insanlık tarihini derinden şekillendiren eski bir hastalıktır. Yalnızca 2023'te 85 endemik ülkede 263 milyon vaka bildirildi ve 597.000 ölümle sonuçlandı1. Hastalığa, Apicomplexa filumuna ait Plasmodium cinsinin protozoan parazitleri neden olur. İnsanları enfekte eden beş tür arasında - P. falciparum, P. vivax, P. knowlesi, P. ovale ve P. malariae - P. falciparum ve P. vivax vakaların çoğunu oluşturur. P. falciparum şiddetli sıtma ile ilişkilidir ve Afrika'da baskındır, oysa P. vivax en geniş coğrafi dağılıma sahiptir ve Güney Amerika ve Asya'da daha yaygındır2.

İki konak boyunca birden fazla gelişim aşamasını içeren Plasmodium yaşam döngüsünün karmaşıklığı, endemik bölgelerde iletimini ve kalıcılığını kolaylaştırır3. Bu döngüdeki kritik bir adım, insanlardan sivrisinek vektörüne geçiştir ve bu da onu müdahale için kilit bir hedef haline getirir. Bulaşma, merozoitler erkek ve dişi gametositlere farklılaştıkça Plasmodium cinsel evrelerinin geliştiği insan konakçıda başlar. Bir sivrisinek tarafından yutulduktan sonra, çevresel ipuçları gametosit aktivasyonunu ve gamet oluşumunu tetikleyerek orta bağırsak lümeninde döllenmeye yol açar. Elde edilen zigot, orta bağırsak epitelini aktif olarak istila eden ve bazal lamina içinde bir ookiste dönüşen hareketli bir ookinte farklılaşır. Ookistin içinde binlerce sporozoit üretilir ve daha sonra hemolenf içine salınır ve tükürük bezlerine göç etmelerine izin verir. Orada, sporozoitler asiner hücreleri istila eder ve sivrisinek bir sonraki kan yemeğini alana kadar kaldıkları bez lümenine hareket eder ve paraziti insan derisine iletir4.

Mevcut ilaçların sınırlamaları ve antimalaryallere karşı artan direnç göz önüne alındığında, yeni iletim engelleme (TB) stratejilerinin araştırılması kritik öneme sahiptir5. Sivrisinek enfeksiyonları, manuel mikroskobik analiz veya radyoaktif hipoksantin dahil etme gibi geleneksel tarama yöntemleri emek yoğundur, standartlaştırılması zordur ve yüksek verimli uygulamalar için uygun değildir 6,7. Floresan tabanlı tespiti (örneğin, DNA boyama veya GFP raportörleri) kullanan daha yeni yaklaşımlar verimliliği artırmıştır, ancak parazitin cinsel evrelerini hedef alan bileşiklerin değerlendirilmesinde önemli zorluklar devam etmektedir 6,7,8.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, Ookluc olarak adlandırılan nanolusiferaz (nLuc) eksprese eden bir transgenik P. berghei hattı geliştirilmiştir8. Bu sistemde, nLuc geni, zigotlarda aktive olan ookinit spesifik P. berghei Circumsporozoite ve TRAP ile ilişkili protein (CTRP) promotörünün kontrolü altına yerleştirilir ve bu da nLuc üretiminin gamet aktivasyonundan yaklaşık 6 saat sonra başlamasına ve dönüşüm testinden 24 saat sonra zirveye ulaşmasına yol açar8. Bu tasarım, döllenmeden kısa bir süre sonra parazit canlılığının otomatik, lüminesans tabanlı nicelleştirilmesini sağlar - doğrudan vektör manipülasyonu ihtiyacını ortadan kaldırır - ve binlerce bileşiğin yüksek verimli taramasını kolaylaştırır8.

nLuc ekspresyonu, ookin canlılığından bağımsız olarak meydana gelse de, ookin morfogenezi gibi daha sonraki aşamaları spesifik olarak etkileyen bileşiklerin tespitini sınırlasa da, Ookluc, reaktif oksijen türleri üretimini indükleyen ajanlar da dahil olmak üzere sivrisinek içinde gametogenezi, cinsel rekombinasyonu veya parazit sağkalımını hedefleyen TB bileşiklerini tanımlamak için oldukça etkili olmaya devam etmektedir. Önceki çalışmalar, Plasmodium cinsel evreleri 9,10,11,12,13,14,15'i inhibe ettiği bilinen bileşikleri başarıyla tanımlayarak bu sistemi doğrulamıştır. Bu nedenle, Ookluc, Plasmodium cinsel evrelerinin yüksek verimli taraması için sağlam ve yenilikçi bir platformu temsil etmekte, yeni TB bileşiklerinin keşfini kolaylaştırmakta ve önümüzdeki yıllarda sıtmanın ortadan kaldırılmasına yönelik çabaları ilerletmektedir8. Bu protokol, ilaç taraması ve inhibitör konsantrasyon %50 (IC50) tayini için Ookluc sisteminin uygulamasını özetlemektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, etik kurallara sıkı sıkıya bağlı olarak yürütülmüş ve São Paulo Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Enstitüsü Hayvan Kullanımı Etik Komitesi (CEUA-ICB/USP) tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar, bu komite tarafından belirlenen standartlara uygun olarak barındırıldı ve bakımı yapıldı. Genetiği değiştirilmiş Plasmodium parazitlerini ve bunların -80 °C'de dondurularak saklanmasını içeren deneyler, São Paulo Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Enstitüsü Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (CIBio-ICB/USP) tarafından belirlenen düzenlemelere uygun olarak yürütülmüştür. Bu çalışmada ikisi enfekte ve biri enfekte olmayan 3-5 haftalık toplam üç dişi BALB/c faresi kullanıldı.

1. Malzemeler ve reaktifler

  1. RPMI 1640'ı 0.025 M HEPES, penisilin-streptomisin-neomisin (PSN), 50 mg / L hipoksantin ve 100 μM ksanthurenik asit ile takviye ederek ookinat ortamını hazırlayın. PH'ı 8.3 8,16'ya ayarlayın.
  2. Lusiferaz tahlil sisteminde sağlanan 1 hacim substratı 50 hacim lizis tamponu ile karıştırarak lüminesans tahlili için çalışma solüsyonunu hazırlayın.
  3. Bir inkübatörü 21 °C'ye ayarlayın.

2. Enfeksiyon ve parazitli kan toplanması

  1. İki dişi BALB / c faresini (4-6 haftalık) intraperitoneal (IP) enjeksiyonu yoluyla 150 μL kriyoprezervasyonlu Ookluc suşu ile enfekte edin (Gün 0).
    NOT: Bu protokolde, hayvan tesislerinde kullanıma hazır olmaları ve yaygın olarak kullanılmaları nedeniyle BALB/c farelerin kullanılmasını önermekteyiz. Bununla birlikte, P. berghei enfeksiyonuna duyarlı olan ve gametositogenezi destekleyen herhangi bir vahşi tip fare türü kullanım için uygun olmalıdır.
  2. 3. Günden başlayarak, Giemsa ile boyanmış kan yaymalarının mikroskobik incelemesi ile parazitemi ve gametositemiyi değerlendirin.
  3. Parazitemi ve gametositemi sırasıyla yaklaşık% 5 ve% 0.5'e ulaştığında (genellikle 4. günde), heparinize şırıngalar kullanarak kardiyak ponksiyon yoluyla kan toplayın ve her iki enfekte fareden kanı toplayın.
    NOT: Bu , P. berghei'nin transgenik bir çizgisi olmasına rağmen, büyümesi ve gametositemi profili, ANKA suşunda gözlenenlere benzer. Bu bağlamda, gametositlerin toplam parazitemiye göre oranı yaklaşık 10 kat daha düşüktür.
    NOT: İdeal olarak, bileşik plaka (aşağıya bakınız) parazitlenmiş kanın toplanmasından önce hazırlanır, bu nedenle kan, toplandıktan hemen sonra plakaya pipetlenir. Fare kanının farklı bir odada toplanması gerekiyorsa veya başka bir nedenle hemen bileşik plakaya pipetlenemiyorsa, alınan kan 37 °C'de 30 dakikadan fazla tutulmamalıdır.

3. Dönüşüm testi - 96 oyuklu plakalarda tarama

NOT: Tutarlı sonuçlar elde etmek için, bulguları doğrulamak için tüm deney farklı günlerde üç kez tekrarlanmalıdır.

  1. Seyreltici olarak ookinat ortamı kullanarak bileşik numuneleri hazırlayın (10 μM'lik bir nihai konsantrasyon). Bileşik stoğu 1 mM'ye seyreltin ve 1 mM stoğu Ookinete Ortamında 1:100 v:v seyrelterek çalışma numuneleri hazırlayın. Yinelenen bir tahlil için, 200 μL çalışma numunesinden oluşan son bir hacim hazırlayın.
  2. Bileşik, su dışında bir çözücü içinde seyreltilirse, gözlenen herhangi bir inhibisyonun çözücüye değil bileşiğe atfedilebildiğinden emin olmak için, ookinat ortamında test numunesindekiyle aynı oranda seyreltilmiş çözücüyü içeren bir kontrol numunesi ekleyin.
    NOT: Örnek olarak, 90 bileşiği tarayacağız.
  3. İki adet 96 oyuklu plaka kullanarak, aşağıdaki gibi ve Şekil 1'de gösterildiği gibi her bir oyuklu kutucuğa 80 μL numuneyi iki nüsha halinde (iki plaka) yerleştirin: Pozitif kontrol: 80 μL ookinat ortamı; Negatif kontrol: 80 μL ookinat ortamı; Solvent kontrolü:% 1 DMSO ile 80 μL ookinat ortamı; Numuneler: Okinat ortamında her bir bileşiğin 80 μL'si 10 μM.

figure-protocol-1
Şekil 1: Bileşik tarama için tasarlanmış 96 oyuklu bir plaka düzeninin şematik gösterimi. Plaka düzeni, pozitif kontrol (C+), negatif kontrol (C-), kontrol artı seyreltme çözücüsü (C+S) ve 90 test bileşiği (S1-S90) içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Negatif kontrol (C-) hariç, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 1:20 v:v oranında 4 μL parazitlenmiş fare kanı ekleyin. Pipetleme ile nazikçe homojen hale getirin.
    NOT: Kayıpları göz önünde bulundurarak, her plaka için ~ 400 μL parazitlenmiş kan ihtiyacını hesaplıyoruz.
  2. Negatif kontrol için, enfekte olmamış fare kanını 1:20 oranında ekleyin (v:v, kan:örnek). Yavaşça homojenize edin.
  3. 21 °C'de 6 saat veya 24 saat inkübe edin.
    NOT: nLuc aktivitesi 6 saatlik inkübasyon ile tespit edilebilir ve testin24 saatinde zirve yapar 8. Test, ookin morfogenezini inhibe eden bileşikler gibi, zigot oluşumundan sonra aktiviteye sahip bileşikleri tanımlayamaz, çünkü oluşan zigotlar, morfogenezin tamamlanmasından bağımsız olarak nLuc biriktirecektir. Bu nedenle, gametogenezi, cinsel rekombinasyonu inhibe ederek nLuc aktivitesini bloke edecek veya erken sitotoksisiteye sahip tüm bileşikleri tespit etmek için 6 saatlik inkübasyon yeterlidir. Bununla birlikte, normalde daha güçlü sinyallere ve daha iyi sinyal-gürültü oranına sahip olmak için 24 saatlik inkübasyonları tercih ederiz.

4. Lüminesans deneyi

  1. İnkübasyon süresinden sonra, kan-ortam karışımının tam olarak sağlanmasını sağlamak için numuneleri yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin.
  2. Lizis tamponu/lusiferaz substrat karışımını kullanmadan hemen önce 1:50 oranında (v:v, substrat:lizis tamponu) hazırlayın.
  3. Substrat karışımını numunelerle 1:1 (v:v) oranında karıştırın ve kabarcıkları önlemek için nazikçe karıştırın. 37 °C'de 3-5 dakika inkübe edin.
    NOT: Bu örnekte, her kuyucuğa 84 μL substrat:lizis tamponu ekledik.
  4. Numuneleri 96 oyuklu beyaz, düz tabanlı bir plakaya aktarın. Bir plaka okuyucu kullanarak lüminesansı ölçün. Aşağıdaki parametre yapılandırmasını kullanın: emisyon filtresi: lens; ölçüm aralığı süresi: kuyucuk başına 1 sn.

5. Veri analizi - tarama

  1. Lüminesans testinden sonra, ortaya çıkan ham verileri not edin (Şekil 2).
    NOT: Elde edilen Bağıl Işık Birimleri (RLU), kullanılan luminometreye bağlıdır. Bizim olgumuzda, pozitif kontrol için RLU değerleri 24 saatlik bir inkübasyon testinde 10.000 ila 500.000 arasında değişmektedir. Daha kısa inkübasyon süreleri (6 saat) daha düşük RLU değerlerine neden olacaktır.

figure-protocol-2
Şekil 2: Bileşik tarama için bir dönüşüm testinin simüle edilmiş bir okumasından elde edilen sonuçlar. Görüntü, 90 bileşikten oluşan bir panelin varlığında ookinlerin dönüştürülmesinden sonra gerçekleştirilen bir testten simüle edilmiş lüminesans okumalarını görüntüler. Düşük Bağıl Işık Birimi değerleri, ookin oluşumunun azaldığını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Bir elektronik tablo kullanarak, aşağıdaki formülü kullanarak her ölçümün ortalamasını hesaplayın. XX'yi ilk ölçüm hücresinin adresiyle ve YY'yi ikinci ölçüm hücresinin adresiyle değiştirin. Tüm numuneler için formülü tekrarlayın.
    =(ORTALAMA(XX:YY)
  2. Sonuçların daha iyi bir analizi için verileri % inhibisyona dönüştürün. E-tabloda aşağıdaki formülü kullanın. A'yı örnek RLU değeriyle ve B'yi kontrol RLU değeriyle değiştirin. Test edilen tüm bileşikler için formülü tekrarlayın:
    = 1 - (A/B) x 100
    NOT: Veriler Şekil 3'te gösterildiği gibi görünecektir.

figure-protocol-3
Şekil 3: Her bir bileşik için inhibisyonun %'si olarak temsil edilen bileşik taraması için bir dönüşüm testinin simüle edilmiş bir okumasından elde edilen sonuçlar. Yukarıda tarif edildiği gibi hesaplanan, test edilen her bir bileşik için dönüşümün inhibisyon yüzdesi. Vurgulanan kareler, dönüşümün% 95'ten fazla inhibisyonunu destekleyen bileşikleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. % 95'ten fazla inhibisyon gösteren bileşikleri tanımlayın.
    NOT: Bu bileşikler 10 μM konsantrasyonda cinsel aşamalara karşı yüksek aktivite gösterir. Örneğimizde, cinsel aşamalara karşı yüksek aktiviteye sahip beş bileşik bulduk.
  2. Tanımlanan bileşikler için, aşağıda açıklandığı gibi bir IC50 belirlemesi gerçekleştirin.

6. Dönüşüm deneyi - IC 50'nin belirlenmesi

  1. Fareleri Ookluc ile enfekte edin ve bölüm 2'de açıklandığı gibi parazitlenmiş kan toplayın.
  2. Seyreltici olarak ookinat ortamı kullanarak numuneleri hazırlayın. Bileşik tarafından% 100 dönüşüm inhibisyonunun gözlendiği bir başlangıç konsantrasyonu kullanın.
    NOT: Aktif bileşikler 10 μM konsantrasyonlu bir ekranda tanımlandığından, ilk doz-yanıt eğrisi için başlangıç konsantrasyonu olarak 20 μM kullanıyoruz. Doğru bir doz-yanıt eğrisi için, testinizin% 100 dönüşüm inhibisyonu ile% 0 inhibisyonuna yol açan nihai konsantrasyonlar% 100 ile sonuçlanan başlangıç konsantrasyonlarını içermesi önemlidir. Bu yaklaşım, hassas bir IC50 hesaplaması sağlar. İlk doz-yanıt eğrisi, ~% 100 inhibisyon ile bileşiğin en düşük konsantrasyonlarını bildirecektir. Bu protokolde örnek olarak yakın zamanda Ookluc13 kullanılarak tanımlanan PyAz90'ı kullanacağız.
  3. 96 oyuklu bir plakada, üç kopya ekleyin (bkz. Şekil 4): Pozitif kontrol (C +): 80 μL ookinit ortamı; Negatif kontrol (C-): 80 μL ookinat ortamı; Numune ilk seyreltme (Cpd D1): Ookinat ortamındaki başlangıç konsantrasyonunda 160 μL bileşik, bu da dönüşümün 0 inhibisyonu ile sonuçlanır; D2 ila D12 kuyuları: 80 μL ookinit ortamı.
  4. 80 μL kuyu D1'i D2'ye pipetleyerek iki kat seri seyreltme yapın, homojenize edin ve 80 μL kuyu D2'yi D3'e pipetleyin ve bu şekilde devam edin. Tüm kuyucukların toplam hacminin 80 μL olduğundan emin olun, bu nedenle D12 kuyusundan çıkarılan son 80 μL'yi atın.
    NOT: Deneyi, Şekil 4'te gösterildiği gibi tüm numuneler için en az üç kopya ile gerçekleştirin. Sonuçlarınızın güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için, tüm deney her seferinde yeni enfekte olmuş hayvanlar kullanılarak üç ayrı günde tekrarlanmalıdır.
    NOT: İlk ekranda, sonuçlar dönüştürmede çözücünün herhangi bir etkisini göstermiyorsa, bu kontrollerin seri seyreltmelere dahil edilmesi gerekli değildir. Aksi takdirde, çözücünün seri seyreltmeleri de dahil edilmelidir.

figure-protocol-4
Şekil 4: Bileşik IC50 tayini için tasarlanmış 96 kuyulu plaka düzeni. Plaka düzeni, pozitif kontrol (C+), negatif kontrol (C-) ve bileşik (Cpd) seyreltmelerini (D1 ila D12) içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. 96 oyuklu plakaya 1:20 v:v'de parazitlenmiş fare kanı ekleyin. Pipetleme ile nazikçe homojen hale getirin.
    NOT: Negatif kontrol (C-) dışında her oyuğa toplam 4 μL parazitlenmiş kan eklenecektir. Kayıpları göz önünde bulundurarak, test edilecek her bileşik için ~ 200 μL parazitlenmiş kan ihtiyacını hesaplıyoruz.
  2. Negatif kontrol kuyucuklarında, enfekte olmamış fare kanını 1:20 oranında ekleyin (v:v, kan:örnek). Yavaşça homojenize edin.
  3. 21 °C'de 6 saat veya 24 saat inkübe edin.
  4. Lüminesans testini bölüm 4'te açıklandığı gibi gerçekleştirin.

7. Veri analizi - IC 50 tayini

NOT: IC50 , biyolojik aktivitenin/inhibisyonun P'sini inhibe etmek için gereken bir bileşiğin konsantrasyonu olarak tanımlanır. Bu tahlilde inhibisyon, ookinat dönüşümündeki azalmayı ifade eder. Veriler, X ekseninin bileşik konsantrasyonu (log-dönüştürülmüş) ve Y ekseninin % inhibisyonu temsil ettiği sigmoidal bir doz-yanıt eğrisi olarak temsil edilir.

  1. Bölüm 5, adım 5.3'te açıklandığı gibi % inhibisyonu hesaplayın.
  2. Yazılımı açın ve bir XY tablosu oluşturun.
  3. Y ekseni seçeneklerini şu şekilde ayarlayın: Yan yana alt sütunlarda 3 çoğaltma değeri girin.
  4. X'in bileşik konsantrasyonu ve Y'nin % inhibisyonu temsil ettiği verileri yapıştırın (Şekil 5A).
  5. Menü çubuğunda, Analiz Et'e tıklayın ve Doğrusal olmayan regresyon (eğri uyumu) seçeneğini belirleyin ve ardından Doz-yanıt eğrileri - İnhibisyon ve [inhibitör] ile normalleştirilmiş yanıt - değişken eğim; Tamam'a tıklayın.
  6. Sol panelde, verilerin doz-yanıt eğrisini gözlemleyin. Renk değişiklikleri ve nokta biçimleri gibi istediğiniz kişiselleştirmeyi uygulayın.
  7. Hesaplanan IC50

figure-protocol-5

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ookluc parazitlerinin oluşumu, yeni TB ilaç adaylarının, özellikle bileşiklerin gamet aktivasyonu, döllenme ve zigot oluşumu üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesinde, mevcut tahliller tarafından sunulmayan bir bakış açısıyla değerlendirilmesini sağlar8. Şekil 2 ve Şekil 3, yöntemin, parazitin cinsel aşamalarına karşı bir bileşik panelini yüksek verimli bir şeki...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yeni TB bileşikleri geliştirmek için kullanılan çoğu HTS yöntemi, gametositogenez inhibisyonu veya gametosisidal aktiviteye odaklanır. Bugüne kadar, gametosit fonksiyonu, gametogenez, zigot oluşumu ve ookinit morfogenezinindeğerlendirilmesine izin veren sadece iki P. berghei modeli geliştirilmiştir 5.

Bu modellerden biri, ctrp promotörü17'ye bağlı bir floresan raportörü kullandığı için Ooklu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu proje, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2021/06769-0) ve Instituto Serrapilheira (hibe G-1709-16618) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dimetil Sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD8418 Serisi
Windows için GraphPad Prism sürüm 10.0.0GraphPad Yazılımı, Boston, Massachusetts, ABD
Domuz bağırsak mukozasından elde edilen heparin sodyum tuzuSigma-AldrichH3393 Serisi
HEPES (1 M)Termo Bilimsel15630106
HipoksantinSigma-AldrichH9636 Serisi
Fare------3 ila 5 haftalık dişi BALB/c fareleri
Nano-Glo Lusiferaz Test SistemiPromegaN1110 Serisi
Penisilin &eksi; Streptomisin &eksi; Neomisin Çözeltisi Stabilize EdildiSigma-AldrichP4083
POLARStar Omega Mikroplaka Okuyucu BMG Laboratuvar Teknolojisi----
RPMI 1640 Orta, GlutaMAX TakviyesiTermo Bilimsel61870036
Ksantürenik asitSigma-AldrichD120804

Kaynaklar

  1. World malaria report 2024: addressing inequity in the global malaria response. , World Health Organization. https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024 (2025).
  2. Miller, L. H., Ackerman, H. C., Su, X., Wellems, T. E. Malaria biology and disease pathogenesis: insights for new treatments. Nature Med. 19 (2), 156-167 (2013).
  3. Tsoumani, M. E., Voyiatzaki, C., Efstathiou, A. Malaria Vaccines: From the Past towards the mRNA Vaccine Era. Vaccines. 11 (9), 1452(2023).
  4. Ménard, R., et al. Looking under the skin: the first steps in malarial infection and immunity. Nature Rev. Microbiol. 11 (10), 701-712 (2013).
  5. Appetecchia, F., et al. Transmission-blocking strategies for malaria eradication: Recent advances in small-molecule drug development. Pharmaceuticals. 17 (7), 962(2024).
  6. Baniecki, M. L., Wirth, D. F., Clardy, J. High-throughput Plasmodium falciparum growth assay for malaria drug discovery. Antimicrob Agents Chemother. 51 (2), 716-723 (2007).
  7. Delves, M., et al. The activities of current antimalarial drugs on the life cycle stages of Plasmodium: A comparative study with human and rodent parasites. PLoS Med. 9 (2), e1001169(2012).
  8. Calit, J., et al. Screening the pathogen box for molecules active against Plasmodium sexual stages using a new nanoluciferase-based transgenic line of P. berghei identifies transmission-blocking compounds. Antimicrob Agents Chemother. 62 (11), e01053-e01118 (2018).
  9. Calit, J., et al. Novel transmission-blocking antimalarials identified by high-throughput screening of Plasmodium berghei Ookluc. Antimicrob Agents Chemother. 67 (4), e0146522(2023).
  10. Lima, M. N. N., et al. Integrative multi-kinase approach for the identification of potent antiplasmodial hits. Front Chem. 7, 773(2019).
  11. Ferreira, L. T., et al. Computational chemogenomics drug repositioning strategy enables the discovery of epirubicin as a new repurposed hit for Plasmodium falciparum and P. vivax. Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), aac.02041-aac.02119 (2020).
  12. Krishnan, K., et al. Torin 2 derivative, NCATS-SM3710, has potent multistage antimalarial activity through inhibition of P. falciparum phosphatidylinositol 4-kinase (Pf ACS Pharmacol). Transl Sci. 3 (5), 948-964 (2020).
  13. Calit, J., et al. Pyrimidine azepine targets the Plasmodium bc1 complex and displays multistage antimalarial activity. JACS Au. 4 (10), 3942-3952 (2024).
  14. Lima, M. N., et al. Chalcones as a basis for computer-aided drug design: Innovative approaches to tackle malaria. Future Med Chem. 11 (20), 2635-2646 (2019).
  15. Ferreira, L. T., et al. A novel 4-aminoquinoline chemotype with multistage antimalarial activity and lack of cross-resistance with PfCRT and PfMDR1 mutants. PLoS Pathog. 20 (10), e1012627(2024).
  16. Blagborough, A. M., et al. Assessing transmission blockade in Plasmodium spp. Methods Mol Biol. 923, 577-600 (2013).
  17. Azevedo, R., et al. Bioluminescence method for in vitro screening of Plasmodium transmission-blocking compounds. Antimicrob Agents Chemother. 61 (6), aac.02699-aac.02616 (2017).
  18. Gaitán, X. A., et al. Characterisation of the merozoite thrombospondin related anonymous protein (MTRAP) of Plasmodium berghei as a transmission-blocking antigen. Mem Inst Oswaldo Cruz. , 119(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Y ksek Kapasiteli TaramaSeks el EvrelerGametosit AktivasyonuL minesans AnaliziOokinete Geli imiIC50 BelirlemeDoz Yan t E risiPlaka Okuyucu

İlgili makaleler