Yöntem makalesi

Tek çekirdekli süspansiyonlar için fare koku alma epitelinin hızlı diseksiyonu ve ayrışması

DOI:

10.3791/68472

⸱

1 Ağustos 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Genetics and Genomics Graduate Program, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 3Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 4Medical Scientist Training Program, Baylor College of Medicine, 5Cytometry and Cell Sorting Core, Baylor College of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, tek çekirdekli RNA dizilimi amacıyla murin koku alma epitelinin diseksiyonu ve dissosiyasyonu için kolaylaştırılmış bir protokol sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Murin koku alma epiteli, koku alma sisteminin ilk giriş noktasıdır ve koku alma duyu nöronlarını, bunların yenileyici progenitörlerini ve destek hücrelerini içeren çeşitli hücre tiplerini barındırır. Koku alma duyusal nöronları, kimyasal koku maddelerini nöral sinyallere dönüştürür, ancak bu hücrelerin nasıl geliştiği ve döndüğünün, koku soğancısı ile sinapslar oluşturduğunun ve koku reseptörlerini nasıl düzenlediğinin altında yatan mekanizmalar yoğun çalışma alanları olmaya devam etmektedir. Burun boşluğunun dorsal tarafında yer alan koku alma epiteli, konkalar olarak bilinen karmaşık kemikli yapılara yapışır. Bu anatomi, özellikle canlı tek hücreli süspansiyonların hazırlanması bağlamında, ekstraksiyonu ve ayrışması için benzersiz zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Tek hücreli süspansiyon protokolleri genellikle hücre canlılığını vurgulayabilen ve / veya kütüphane hazırlığını geciktirebilen hazırlık adımlarını (örneğin, papain ayrışması, FACS) içerdiğinden, doku ekstraksiyon süresini en aza indirmek çok önemlidir. Bu makale, koku alma epitelinin hızlı diseksiyonu için aerodinamik bir yöntem ve yüksek kaliteli tek çekirdekli süspansiyonlar oluşturmak için bir protokol sunmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Murin koku alma epiteli (OE), koku alma sisteminin önemli bir bileşenidir ve koku verici sinyalleri tespit etmekten ve merkezi sinir sistemine iletmekten sorumludur. En yüzeysel tabakası, bir mukoza tabakası ile kaplı ve destekleyici sustentaküler ve mikrovillar hücreler 1,2 ile çevrili koku alma duyu nöronlarının koku algılayan kirpiklerini içerir. OSN'ler bipolardır, kirpiklerini mukus tabakası içinde bir kafes oluşturmak için apikal olarak uzatır ve aksonlarını temel olarak koku alma ampulü içindeki glomerüllere birleşmek için kemikli kribriform plaka boyunca uzatır. Bu glomerüller, OSN'ler ve aşağı akış nöronları arasındaki sinaps bölgesidir. Altta yatan OSN'ler, küresel bazal hücreler olarak adlandırılan nöronal progenitör hücreler, havadaki toksinler, patojenler ve fiziksel travma gibi çevresel hakaretlere doğrudan maruz kaldıktan sonraöldüklerinde 3 OSN'leri sürekli olarak yeniler. Küresel bazal hücreler, en bazal olarak bulunan ve nazal konkalar adı verilen kemikli çıkıntıların bazal laminasına yapışık olan multipotent yatay bazal hücrelerin 4,5 rezerv havuzundan türetilir. Burun konkaları kıvrımlıdır ve OE'nin ayrılmasını ve homojenize edilmesini zorlaştırır. Ayrıca, OE kafatasının kemikleri ile çevrilidir, bu da bölgeye erişimi zorlaştırır ve geleneksel olarak zaman yoğun bir prosedür gerektirir.

Önceki çalışmalar, koku alma epitelinikemik 6,7,8,9,10'dan serbest bırakmak için genişletilmiş bir papain inkübasyonuna dayanıyordu, bu da tek hücreli süspansiyonun aşağı akış işlemesini daha da geciktirebilir. OSN aksonlarının kesilmesi apoptoz11'i tetiklediğinden, doku ekstraksiyonundan cDNA kütüphanesinin hazırlanmasına kadar geçen süreyi en aza indirmek zorunludur. Ayrıca, OE'nin mimarisi ve koku soğancığına yaptığı projeksiyonlar, başarılı tek hücreli RNA dizilimi için sağlam hücrelerin ekstraksiyonunu zorlaştırır. Neyse ki, tek çekirdekli RNA dizilimi (snRNA-dizilimi), özellikle tek hücre ayrışmasının zor veya pratik olmadığı dokularda, hücre tipi dağılımını korurken hücrelerin profilini çıkarmak için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır12,13.

Bir dizi çalışma 6,7,8,10,14,15 fare OE'sinin tek hücreli dizilimini gerçekleştirmiş olsa da, hiçbiri OE'nin kırılganlığı ve kafatasının çeşitli kemikleri tarafından kaplanması göz önüne alındığında gerekli olan tutarlı ve uygun doku toplama için optimize edilmiş ayrıntılı bir diseksiyon prosedürü sunmamaktadır. Ek olarak, mevcut diseksiyon kılavuzları16 hızdan ziyade anatomik yapıyı korumaya odaklanmıştır ve bu da potansiyel olarak uzun diseksiyon sürelerine yol açmaktadır. RNA bozulmasını en aza indirmek ve hazırlanan çekirdeklerin17,18 kalitesini en üst düzeye çıkarmak için uygun doku hazırlığı gerekli olduğundan, murin OE'nin çeşitli aşağı akış uygulamalarında kullanılmak üzere tek çekirdekli bir süspansiyona hızlı diseksiyonu ve homojenizasyonu için optimize edilmiş bir protokol garanti edilir.

Bu protokol (Şekil 1), bu zorlukların üstesinden gelmek için tasarlanmış, murin OE'nin hızlı bir şekilde diseksiyonunu ve çekirdeği izole etmek amacıyla dokunun verimli bir şekilde ayrışmasını sağlayan aerodinamik bir yöntem sunar. Bu yaklaşım, koku alma biyolojisinin moleküler temellerini araştırmak için güvenilir bir teknik sağlayan yüksek kaliteli tek çekirdekli dizilemeyi19 kolaylaştırır.

figure-introduction-1
Şekil 1: C57BL/6 fare kafatasının ilgili dikişlerinin ve kemiklerinin anatomisi ve koku alma epitelinin temsili kesiti. (A) Kafatasının dikişleri renk kodludur. Dikişler kafatasının bir tarafında renk kodludur, diğer tarafı ise referans için işaretlenmeden bırakılır (solda). Dikişlerin isimleri buna göre renk kodludur (sağda). (B) Kafatasının kemikleri renk kodlu. Kemikler kafatasının bir tarafında renk kodludur, diğer tarafı ise referans için işaretlenmeden bırakılmıştır (solda). Kemiklerin isimleri buna göre renk kodludur (sağda). (C) OE'nin orta kısmının enine kesiti (bu makalede açıklanan yöntem kullanılarak diseseke edilmiştir), bir tarafta renk kodlu konkalar ve referans için sol üst kısım işaretlenmemiş (solda). Görselleştirilmiş konkaların adları (sağda). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmadaki tüm hayvan deneyleri, Baylor Tıp Fakültesi IACUC tarafından onaylanmış ve uygun olarak yürütülmüştür. Dişi C57BL/6J (JAX:000664) fareler kullanıldı. Reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Koku alma epitel diseksiyonu

  1. Tercih edilen herhangi bir yöntemi kullanarak fareyi derinlemesine uyuşturarak başlayın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Cerrahi anestezi düzlemini sıkı bir ayak parmağı çimdikleme ile onaylayın ve en az 10 mL buz gibi soğuk 1x PBS'nin transkardiyak perfüzyonu ile devam edin. Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi çıkarın (Şekil 2A).
    NOT: Başın vücuttan çıkarılması isteğe bağlıdır. Biri kafayı çıkarmaya karar verirse, dekapitasyondan önce kafatasının etrafındaki deri ve diğer yumuşak dokuların çıkarılması önerilir.
  2. Bir çift ince, keskin uçlu makas kullanarak, bir makas ucunu arka yörüngeye ve diğerini işitme kanalına bitişik olarak yerleştirerek elmacık kemerlerini skuamöz kemikten iki taraflı olarak kırmak için iki kesi yapın ( Şekil 2B'deki yeşil çizgiler).
  3. Frontal kemiğin en ön yönü boyunca yörüngeden yörüngeye sığ bir kesi yapın. Frontal kemiğin sadece sırt yüzeyini (~1-2 mm derinliğinde) kesin, yörüngeyi oluşturan alttaki yapıları veya kemikleri kesmemeye dikkat edin ( Şekil 2B'deki mavi çizgi).
    NOT: Yörüngeler arasında sığ bir kesi elde etmek için makası kafatasına dik tutun ve kesmek için yalnızca keskin uçları kullanın.
  4. Foramen magnumdan kafatasının orta hattı boyunca, sagital ve interfrontal sütürler boyunca, adım 1.3'te frontal kemikte yapılan interorbital insizyona ulaşılana kadar kesin ( Şekil 2B'deki kırmızı çizgi).
  5. Kafatasının orta hattı boyunca yapılan kesiye bir çift forseps yerleştirin ve kraniyal tonozun bir yarım küresini yanal olarak sıkıca çekin. Bu eylem aynı zamanda yörüngenin kemiklerini (frontal, maksiller ve lakrimal) çıkaracak ve koku alma konkalarının yanal yönlerini ortaya çıkaracaktır (Şekil 2D).
    NOT: Bu noktadan itibaren OE'ye yanlışlıkla zarar vermemeye dikkat edin.
  6. Burun kemiğini ve kesici dişleri tutarak, forseps kullanarak kontralateral kraniyal tonozu kırın. Beynin (koku alma ampulleri dahil) yırtılırken kemiğin yarım küresi ile birlikte çıkarılmasına izin verin (Şekil 1E). Bu adımdan sonra kalması gereken tek görünür kemiksi yapılar kafatasının tabanı ve OE'yi çevreleyen kemiklerdir (Şekil 2F).
  7. Bir çift kemik kıskacı veya rongeur kullanarak, kesici dişlerin tabanına kadar kalan tüm ön kemiği ve premaksiller (kesici) kemiği çıkarın (Şekil 2G).
  8. Burun kemiğini kribriform plakadan ayırmak için frontonazal sütür boyunca kesmek için kemik penseleri kullanın, altta yatan açıkta kalan OE'ye zarar vermemek veya kribriform plakayı kırmamak için son derece dikkatli olun.
  9. OE'yi ortaya çıkarmak için forseps kullanarak burun kemiğini kribriform plakadan kaldırın (Şekil 2H). Artık premaksiller kemik dorsal OE'yi engelliyorsa, devam etmeden önce çıkarın ( Şekil 1I'deki siyah daireler).
  10. İnce uçlu forsepsler kullanarak, nazal septumun dorsal yönünü kribriform plak ile birleştiği yerde nazikçe sabitleyin ve arkaya doğru çekin (Şekil 2J,K). Minimum dirençle, ana koku alma epiteli tamamen sağlam bir yapı olarak serbest kalacaktır (Şekil 2L).
  11. Hemen OE ayrışması ile devam edin veya daha sonraki işlemler için dokuyu dondurun.

figure-protocol-1
Şekil 2: Koku alma epitelinin hızlı diseksiyonu için teknik. (A) Çevredeki yumuşak dokunun çıkarılmasını takiben fare kafası. (B) Kraniyal tonoz insizyonları için renk kodlu kılavuzlar. (C) Kraniyal tonoz insizyonlarını takiben görünüm. (D) Koku alma epiteline bitişik yörünge kısmı ile birlikte kraniyal tonozun ilk yarım küresinin çıkarılması. (E) Beyin ile birlikte kraniyal tonozun kontralateral kısmının çıkarılması. (F) Beynin ve kafatası tonozunun çıkarılmasını takiben baş. (G) Frontomaksiller sütürde insizyon sonrasında en ön-frontal kemiğin ve posterior premaksillanın çıkarılması. (H) Burun kemiklerinin çıkarılması. (I) Siyah daireler, isteğe bağlı olarak çıkarılabilen rezidüel premaksiller kemik alanlarını vurgular. (J) Sağlam koku alma epitelinin çıkarılması için forsepslerin yerleştirilmesi. (K) Koku alma epitelini serbest bırakmak için arkaya doğru çekin. (L) Koku alma epitelinin tamamen serbest bırakılması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Koku alma epitel ayrışması ve tek çekirdek izolasyonu

  1. Numune başına bir C-tüpü ve iki adet 15 mL konik tüpü buz üzerine yerleştirin.
  2. Önceden yapılmış çekirdek ekstraksiyon tamponuna RNAse inhibitörü (0.2 U/μL'lik nihai konsantrasyona) ekleyerek lizis tamponunu hazırlayın.
  3. Her 15 mL konik tüpe 4 mL %1 BSA ekleyin, kısaca girdap yapın ve fazlalığı atın. Bu, tüplere çekirdek yapışmasını en aza indirmek için 15 mL'lik konik tüplerin her birini BSA ile kaplar.
  4. Bir bütün OE için, her bir C-tüpüne 2 mL buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin.
  5. C-tüplerine OE örnekleri ekleyin. #2 forseps kullanarak, her bir numuneyi ilgili C-tüpünün üzerinde tutun ve bir çift ince uçlu makas kullanarak küçük parçalar halinde kesin.
  6. Her bir numuneyi içeren C-tüplerini otomatik doku ayrıştırıcı bloklarının üzerine baş aşağı yerleştirin. Ayrıştırıcı ekranında, her bloğa karşılık gelen kare Serbest'ten Seçili'ye değişecektir.
  7. Miltenyi klasörüne geçiş yapmak için klasör simgesine basın. Okları kullanarak 4C_nuclei_1 programına (ayrıştırıcı içinde önceden yüklenmiş bir program) ilerleyin. Programı her bloğa uygulamak için Tamam'a basın ve ardından döngüyü başlatmak için Başlat'a basın. Döngü tamamlandıktan hemen sonra C-tüplerini ayrıştırıcıdan çıkarın.
    NOT: Mümkünse, ayrışma döngüsü sırasında C-tüplerini buz gibi soğuk tutun. Döngü tamamlandıktan hemen sonra numuneleri ayrıştırıcıdan çıkarmak ve çekirdeğin aşırı parçalanmasını önlemek için protokolün sonraki adımlarına devam etmek önemlidir.
  8. Bir pipet ile homojenize süspansiyonu C-tüpünden aspire edin ve 70 μm'lik bir süzgeçten geçirerek ilk BSA kaplı konik tüpe süzün. C-tüpünün dibinde biriken kemik parçalarını aspire etmekten kaçının.
  9. Tam filtrasyonu sağlamak için süzgeci 1 mL buz gibi soğuk 1x PBS ile durulayın.
  10. Filtrelenmiş süspansiyonu 500 × g'da 5 ° C'de 4 dakika boyunca sallanan kovalı bir santrifüjde santrifüjleyin.
  11. Süpernatanı nazikçe aspire edin ve atın, peleti rahatsız etmemeye dikkat edin. Nazik pipetleme ile çekirdek peletini 1 mL buz gibi soğuk 1x PBS'de tamamen yeniden süspanse edin.
  12. Yeniden süspanse edilmiş çekirdekleri 30 μm'lik bir süzgeçten ikinci BSA kaplı konik tüpe geçirin. Çekirdek konsantrasyonu, bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanılarak ölçülebilir.
  13. Numune bütünlüğünü korumak ve bozulmayı önlemek için seçilen aşağı akış protokolüne (FACS ile veya FACS olmadan) hemen devam edin (Şekil 3).
    NOT: Sorunsuz ve zamanında tamamlanmasını sağlamak için kullanıcıların bu protokolün tamamında alıştırma çalıştırmaları yapmaları önemle tavsiye edilir.

figure-protocol-2
Şekil 3: Koku alma epitel ayrışması ve tek çekirdekli izolasyon iş akışı. Diseksiyonu takiben, koku alma epiteli mekanik ve kimyasal olarak ayrışır. Lizat daha sonra 70 μm'lik bir süzgeçten süzülür, 1x PBS ile durulanır ve 500 × g'da 5 dakika santrifüjlenir. Pelet, 30 μm'lik bir süzgeçten süzülmeden önce 1x PBS'de yeniden süspanse edilir. Elde edilen çekirdek süspansiyonu, çeşitli aşağı akış dizileme uygulamaları için kullanılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diseksiyon ve analiz için anatomik bağlam sağlamak amacıyla, C57BL/6 fare kafatasının dikişleri ve kemikleri ile koku alma epitelinin (OE) merkezi kısmı görselleştirildi ve renk kodlandı (Şekil 1). Her görüntünün bir tarafı, ilgili dikişleri, kemikleri ve konkaları vurgulamak için açıklama eklenirken, diğer taraf referans için işaretlenmeden bırakıldı. OE kesiti, belirlenen protokoller20'ye göre hazırlandı ve konka tanımlaması, önceki anatomik karakterizasyonlara

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan prosedür, intrakardiyak 1x PBS perfüzyonunu takiben sağlam bir OE'nin tutarlı bir şekilde çıkarılmasını sağlar. Bu, önceki yöntemlere16 kıyasla hızda kayda değer bir gelişmeyi temsil eder ve OSN'lerin beynin çıkarılması sırasında meydana gelen akdotomi2'yi takiben dejenere olmaya başladığı göz önüne alındığında özellikle önemlidir.

Frontal, premaksiller ve nazal kemiklerin dikkatli bir şekilde çı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan etmektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Baylor Tıp Fakültesi'nin Tek Hücreli Genomik Çekirdeğini kabul etmek istiyor. Bu proje, NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 ve SS10 RR024574) finansmanı ve Joel M. Sederstrom'un uzman yardımı ile Baylor Tıp Fakültesi'ndeki Sitometri ve Hücre Sıralama Çekirdeği tarafından desteklenmiştir. Bu proje kısmen NIH/NICHD [P50HD103555], NIH/NINDS [5R01NS078294] ve NIH/NIA [5F30AG076265] tarafından finanse edilmiştir. Şekil 3 BioRender'da oluşturulmuştur. https://BioRender.com/5418352.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 mL Santrifüj TüpüHücre tedavisi229411
Kemik Nipper Güzel Bilim Araçları16102-11
Bonn Miniature Iris Makası Miltex 18-1392
Sığır Serumu Albümin SolüsyonuSigma-AldrichA1595 Serisi
Dumont #3 Forseps Güzel Bilim Araçları11231-30
Dişi C57BL/6J farelerJackson LaboratuvarıJAX:000664
gentleMACS C tüpler Miltenyi Biotec130-093-237
gentleMACS Octo Dissosiyatör Miltenyi Biotec130-096-427
MACS SmartSüzgeçler 30 um Miltenyi Biotec130-098-458
MACS SmartSüzgeçler 70 um Miltenyi Biotec130-098-462
Mikro Friedman-Pearson RongeursGüzel Bilim Araçları16220-14
Çekirdek Ekstraksiyon Tamponu Miltenyi Biotec130-128-024
Fosfat Tamponlu Salin (PBS), 1x kalsiyum ve magnezyum içermez, PH 7.4 ± 0.1Corning21-040-CV
Koruyucu RNAse İnhibitörü Millipore Sigma3335402001
Sorvall Legend XTR Soğutmalı SantrifüjTermo Bilimsel50119927-5

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Graziadei, P. P. C., Graziadei, G. A. M. Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. I. Morphological aspects of differentiation and structural organization of the olfactory sensory neurons. J Neurocytol. 8 (1), 1-18 (1979).
  2. Monti Graziadei, G. A., Graziadei, P. P. C. Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. II. Degeneration and reconstitution of the olfactory sensory neurons after axotomy. J Neurocytol. 8 (2), 197-213 (1979).
  3. Caggiano, M., Kauer, J. S., Hunter, D. D. Globose basal cells are neuronal progenitors in the olfactory epithelium: a lineage analysis using a replication-incompetent retrovirus. Neuron. 13 (2), 339-352 (1994).
  4. Iwai, N., Zhou, Z., Roop, D. R., Behringer, R. R. Horizontal basal cells are multipotent progenitors in normal and injured adult olfactory epithelium. Stem Cells. 26 (5), 1298-1306 (2008).
  5. Schwob, J. E., et al. Stem and progenitor cells of the mammalian olfactory epithelium: Taking poietic license. J Comp Neurol. 525 (4), 1034-1054 (2017).
  6. Fletcher, R. B., et al. Deconstructing olfactory stem cell trajectories at single-cell resolution. Cell Stem Cell. 20 (6), 817-830.e8 (2017).
  7. Gadye, L., et al. Injury activates transient olfactory stem cell states with diverse lineage capacities. Cell Stem Cell. 21 (6), 775-790.e9 (2017).
  8. Saraiva, L. R., et al. Hierarchical deconstruction of mouse olfactory sensory neurons: from whole mucosa to single-cell RNA-seq. Sci Rep. 5 (1), 18178(2015).
  9. Fletcher, R. B., et al. p63 regulates olfactory stem cell self-renewal and differentiation. Neuron. 72 (5), 748-759 (2011).
  10. Brann, D. H., et al. Non-neuronal expression of SARS-CoV-2 entry genes in the olfactory system suggests mechanisms underlying COVID-19-associated anosmia. Sci Adv. 6 (31), eabc5801(2020).
  11. Carter, L. A., MacDonald, J. L., Roskams, A. J. Olfactory horizontal basal cells demonstrate a conserved multipotent progenitor phenotype. J Neurosci. 24 (25), 5670-5683 (2004).
  12. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Sci Rep. 7 (1), 6031(2017).
  13. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).
  14. Ruiz Tejada Segura, M. L., et al. A 3D transcriptomics atlas of the mouse nose sheds light on the anatomical logic of smell. Cell Rep. 38 (12), 110547(2022).
  15. Li, W., et al. A single-cell transcriptomic census of mammalian olfactory epithelium aging. Dev Cell. 59 (22), 3043-3058.e8 (2024).
  16. Dunston, D., Ashby, S., Krosnowski, K., Ogura, T., Lin, W. An effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization. J Vis Exp. (78), e50538(2013).
  17. Gurumurthy, R. K., Kumar, N., Chumduri, C. Optimized protocol for isolation of high-quality single cells from the female mouse reproductive tract tissues for single-cell RNA sequencing. STAR Protoc. 2 (4), 100970(2021).
  18. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).
  19. Belfort, B. D. W., et al. Comparative analysis of AAV serotypes for transduction of olfactory sensory neurons. Front Neurosci. 19, 1531122(2025).
  20. Huang, J. S., et al. Immature olfactory sensory neurons provide behaviourally relevant sensory input to the olfactory bulb. Nat Commun. 13 (1), 6194(2022).
  21. Barrios, A. W., Nunez, G., Sanchez Quinteiro, P., Salazar, I. Anatomy, histochemistry, and immunohistochemistry of the olfactory subsystems in mice. Front Neuroanat. 8, 63(2014).
  22. Antunes, M. B., et al. Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures. Biotechniques. 43 (2), 195-204 (2007).
  23. Wu, J., Cai, Y., Wu, X., Ying, Y., Tai, Y., He, M. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).
  24. Bakulski, K. M., et al. Single-cell analysis of the gene expression effects of developmental lead (Pb) exposure on the mouse hippocampus. Toxicol Sci. 176 (2), 396-409 (2020).
  25. Chang, C. -S., et al. Single-cell RNA sequencing uncovers the individual alteration of intestinal mucosal immunocytes in Dusp6 knockout mice. iScience. 25 (2), 103738(2022).
  26. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  27. Koenitzer, J. R., Wu, H., Atkinson, J. J., Brody, S. L., Humphreys, B. D. Single-nucleus RNA-sequencing profiling of mouse lung. Reduced dissociation bias and improved rare cell-type detection compared with single-cell RNA sequencing. Am J Respir Cell Mol Biol. 63 (6), 739-747 (2020).
  28. Xiong, A., Zhang, J., Chen, Y., Zhang, Y., Yang, F. Integrated single-cell transcriptomic analyses reveal that GPNMB-high macrophages promote PN-MES transition and impede T cell activation in GBM. eBioMedicine. 83, 104239(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fare DiseksiyonuTek ekirdek S spansiyonuTek H cre DizilemeOlfakt r Sens r N ronlarDoku DisosyasyonuAk SitometrisiMark r GenlerBurun Bo lu uProjenit r H creler

İlgili makaleler