Yöntem makalesi

Manyetik Parçacık Görüntüleme Kullanılarak Pulmoner Fibroz için Nakledilen Distal Akciğer Epitelyal Progenitör Hücrelerinin Görüntü Kılavuzluğunda In Vivo İzlenmesi

762 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68477

⸱

27 Haziran 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 3Department of Pediatrics and Human Development, Michigan State University, 4Lyman Briggs College, Michigan State University, 5College of Social Science, Michigan State University, 6Department of Chemistry, Hunter College, 7Corewell Health Medical Group, 8Institute for Quantitative Health Science and Engineering (IQ), Michigan State University, 9Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Hücre tedavisi, hasarlı dokuyu onarmak ve akciğer fonksiyonunu iyileştirmek için progenitör hücreleri kullanarak pulmoner fibroz için umut verici bir müdahale sunar. Görüntüleme, hücre entegrasyonunun izlenmesinde çok önemli bir rol oynadığından, burada, bir fare modelinde pulmoner fibroz için hücre tedavisinin manyetik parçacık görüntüleme kılavuzluğunda in vivo takibini açıklıyoruz.

Özet

Pulmoner fibrozis (PF), aşırı ekstraselüler matriks birikimine yol açan, doku kalınlaşması, yara izi ve bozulmuş gaz değişimi ile sonuçlanan ve solunum fonksiyon bozukluğuna yol açan tekrarlayan alveoler epitel hasarı ile karakterize ilerleyici ve kronik bir akciğer hastalığıdır. Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda yaklaşık 50.000 yeni vaka bildirilmekte ve hastalar pnömotoraks, pulmoner hipertansiyon, solunum yetmezliği ve akciğer kanseri riskinin artması gibi ciddi komplikasyonlarla karşı karşıyadır. Mevcut terapötik seçeneklerin etkinliği sınırlıdır ve öncelikle hastalığın ilerlemesini yavaşlatmayı amaçlar. Hücre tedavisi, hasarlı akciğer dokusunu yenileme, iltihabı modüle etme ve pulmoner fonksiyonu iyileştirme potansiyeli sunan umut verici bir müdahale olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, bu tedavilerin etkinliği, nakledilen hücrelerin konakçı akciğerler içindeki dağılımını, hayatta kalmasını ve entegrasyonunu izleme yeteneğine önemli ölçüde bağlıdır.

Manyetik Parçacık Görüntüleme (MPI), izleyici olarak süperparamanyetik demir oksit nanopartikülleri (SPION'lar) kullanan yeni, invaziv olmayan, klinik öncesi bir görüntüleme yöntemidir. MPI, yüksek hassasiyet, özgüllük sunar ve arka plan sinyali içermez, bu da etiketli hücrelerin in vivo olarak gerçek zamanlı ve nicel olarak izlenmesine olanak tanır. Bu çalışmada, immün sistemi baskılanmış farelerin akciğerlerine nakledilen insan distal akciğer epitelyal progenitör hücrelerinin izlenmesi için MPI kullanımını araştırdık. Hücreler, sinyali optimize etmek için değişen SPION konsantrasyonları ile etiketlendi, immün boyama ve demir miktar tayini ile doğrulandı. İntratrakeal damlatmadan sonra, nakledilen hücrelerin mekansal dağılımını izlemek için 2D MPI taramaları elde edildi. 2 hafta boyunca uzunlamasına görüntüleme, akciğer dokusu içinde hücre entegrasyonunun ve retansiyonunun görselleştirilmesini sağladı. Başarılı damlatma, hem sol hem de sağ akciğerlerde MPI sinyalleri sergiledi ve bu da zamanla azaldı (~% 65). Fareler daha sonra histolojik doğrulama için sakrifiye edildi. Bu çalışma, pulmoner fibrozda hücre tedavisinin noninvaziv, uzunlamasına izlenmesi için MPI'nin faydasını göstermektedir ve prosedürler sırasında kullanılan karmaşık teknikler etrafında dönmektedir.

Giriş

Hücre tedavisi1,2, lösemi ve lenfoma 3,4 (hematopoietik kök hücreler), osteoartrit 5,6 (mezenkimal kök hücreler), tip 1 diyabet7 (adacık hücresi nakli), omurilik yaralanmaları 8,9, nörodejeneratif hastalıklar10,11,12 (nöral kök hücreler) ve akciğer fibrozu 13,14,15,16 (pulmoner progenitör hücreler). Bu tedaviler önemli bir potansiyel sunmakla birlikte, bağışıklık reddi ve uzun vadeli etkinlik gibi zorluklar hala devam etmektedir17,18. Pulmoner fibrozis (PF), akciğer dokusunun aşırı skarlaşması ile karakterize, akciğer fonksiyonunda bozulmaya yol açan kronik ve ilerleyici bir akciğer hastalığıdır19. PF için hücre tedavisi, mezenkimal kök hücreler veya distal akciğer progenitör hücreleri gibi rejeneratif hücreleri etkilenen akciğerlere sokarak hasarlı akciğer dokusunu yenilemeyi ve fibrozu azaltmayı amaçlar20. Bazal hücreler, alveolar tip II hücreler, bronşioalveolar kök hücreler ve diğer multipotent progenitör hücreler gibi popülasyonları içeren distal akciğer progenitör hücreleri, doku onarımını teşvik etme, iltihabı azaltma, potansiyel olarak hasarlı akciğer dokusunu yenileme ve normal akciğer fonksiyonunu geri kazandırırken akciğer hasarının bir kısmını tersine çevirme yeteneğine sahiptir21. Birkaç klinik öncesi ve erken evre klinik çalışma, akciğer progenitör hücrelerinin fibrotik akciğerlere nakledilmesinin alveolar yapıların yenilenmesine, dokunun yeniden şekillenmesini teşvik etmeye ve iltihabı azaltmaya yardımcı olabileceğini göstermiştir 13,22,23. Ek olarak, bu hücreler fibrotik ortamı modüle eden ve onarımı daha da destekleyen çeşitli büyüme faktörleri ve sitokinler salgılayabilir. Akciğer fonksiyonunun iyileştirilmesindeki cesaret verici sonuçlara rağmen, bu hücrelerin hasarlı akciğer dokusuna verimli izolasyonu, genişletilmesi ve entegrasyonu, uzun vadeli güvenliğin sağlanması ve istenmeyen yan etkilerin önlenmesi dahil olmak üzere hücre dağıtımını optimize etmede zorluklar devam etmektedir. Pulmoner fibroz için protokolleri iyileştirmek ve progenitör hücre tedavilerinin uzun vadeli güvenliğini ve etkinliğini değerlendirmek için sürekli araştırmalara ihtiyaç vardır.

Pulmoner fibroz için hücrelerin akciğerlere nakledilmesi, her biri hücre iletimini, sağkalımını ve hasarlı akciğer dokusuna entegrasyonunu iyileştirmek için tasarlanmış çeşitli teknikler içerir. Yaygın yöntemler arasında intravenöz enjeksiyon24,25, endobronşiyal uygulama26,27 ve intratrakeal damlatma 28,29,30,31 bulunur ve her biri belirli avantajlara ve zorluklara sahiptir. Kök hücrelerin intravenöz uygulaması, suboptimal pulmoner homing, hedef dışı organlarda sekestrasyon, sınırlı infüzyon sonrası canlılık ve immünojenik yanıt riski ile engellenir. Endobronşiyal uygulama, daha lokalize olmasına rağmen, heterojen hücre dağılımı, potansiyel hava yolu tıkanıklığı, inflamatuar yanıtlar ve fibrotik akciğer mimarisindeki prosedürel zorluklarla sınırlıdır. Benzer şekilde, intratrakeal damlatma, doğrudan pulmoner birikimi sağlamasına rağmen, tutarsız hücre dağılımına, yetersiz distal akciğer penetrasyonuna, lokalize tahrişe ve akciğer bölmeleri boyunca doz homojenliğinde değişkenliğe yol açabilir. Tüm bu teknikler, akciğer dokusunun yenilenmesinde hücre sağkalımını, entegrasyonunu ve etkinliğini iyileştirmeyi amaçlasa da, optimal tekniğin seçimi, nakledilen hücrelerin türü, fibrozun evresi ve hastanın genel sağlığı gibi faktörlere bağlıdır.

Zorluklarına rağmen, intratrakeal damlatma, özellikle pulmoner fibroz bağlamında, hücreleri doğrudan akciğerlere iletmek için en yaygın kullanılan yöntemlerden biri olmaya devam etmektedir. Bu teknikte hücreler soluk borusuna yerleştirilen bir kateter aracılığıyla akciğereverilir 32. Hücreler daha sonra alveolar boşlukta biriktirilir ve burada hasarlı akciğer dokusunu potansiyel olarak onarabilirler. Bu yöntem minimal invazivdir ve ex vivo akciğer perfüzyonu gibi diğer uygulama yaklaşımlarına kıyasla nispeten daha kolaydır. Hücreler doğrudan akciğerlere yatırıldığından, etkili entegrasyon ve onarım şansını artırabilir. İntravenöz enjeksiyondan farklı olarak, intratrakeal damlatma, sistemik dolaşımı önleyerek hücrelerin karaciğer veya dalak gibi diğer organlarda sıkışma riskini azaltır ve akciğerlerde daha odaklı bir terapötik etkiye yol açar. Bu faydalara rağmen, yöntem, terapötik etkinliği sınırlayabilen, optimal olmayan hücre dağılımı ve tutulması ve akciğerlerde hayatta kalma açısından hala zorluklarla karşı karşıyadır. Devam eden araştırmalar, daha etkili klinik sonuçlar için bu yaklaşımı geliştirmek için çalışmaktadır. Araştırmacılar, çeşitli faktörleri değerlendirerek intratrakeal damlatmanın uygulamaları için uygun olup olmadığını belirleyebilirler. Bunlar, verilen hücrelerin tipini, hayatta kalma ve akciğer dokusuna entegre olma yeteneklerini ve hastalık modelinin ciddiyetini (yani pulmoner fibroz) içerir.

Görüntüleme, hücrelerin izlenmesi, canlılıklarının, dağılımlarının ve etkilerinin değerlendirilmesi, hücre tedavisinin izlenmesinin geliştirilmesi ve tedavi stratejilerinin optimizasyonu için vazgeçilmez bir araçtır33. Araştırmacılar, hücre dağılımını ve tutulmasını izlemek için görüntüleme ve teslimat sonrası analiz yoluyla teslimat verimliliğini değerlendirdiler. Floresan, Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRG), Bilgisayarlı Tomografi (BT), Pozitron Emisyon Tomografisi (PET), Tek Foton Emisyon Bilgisayarlı Tomografi (SPECT) ve ultrason gibi çeşitli teknikler, pulmoner fibroz için etiketli kök hücreleri izlemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, düşük derinlik penetrasyonu (floresan), zayıf hassasiyet (MRI), radyasyona maruz kalma (CT, PET, SPECT) ve düşük çözünürlük (ultrason) gibi sınırlamalarla karşı karşıyadırlar34. Görüntüleme kontrastını, çözünürlüğünü ve biyouyumluluğunu optimize etmek bu zorlukların üstesinden bir dereceye kadar yardımcı olsa da, daha yeni görüntüleme tekniklerinin keşfedilmesi, akciğerlerde doğru kök hücre takibi için de gerekli olabilir. Son yıllarda, Manyetik Parçacık Görüntüleme (MPI), arka plan paraziti olmadan yüksek kontrastlı, yüksek hassasiyetli, gerçek zamanlı, kantitatif görüntüleme sunan, umut verici, radyasyonsuz bir görüntüleme yöntemi olarak ortaya çıkmıştır.

MPI, doğrudan görselleştirme için süperparamanyetik demir oksit nanopartikülleri (SPION'lar) kullanır ve çalışma prensibi, zamanla değişen bir manyetik alana(35,36) maruz kaldığında bu SPION'ların doğrusal olmayan manyetizasyon tepkisine dayanır. Elektromıknatıslar, yalnızca bu bölgedeki parçacıkların doğrusal olmayan manyetizasyon sergilediği ve salınımlı bir manyetik alan tarafından uyarıldığında bir sinyal ürettiği alansız bir bölge (FFR) oluşturmak için kullanılır. Öte yandan, bu FFR'nin dışındaki parçacıkların manyetizasyonu doymuştur ve sinyal üretimine katılmazlar. MPI, FFR'yi görüntüleme hacmi boyunca sistematik olarak hareket ettirerek, nanoparçacık dağılımının ve sonraki görüntülerin uzamsal haritalarını oluşturur. MPI, geleneksel görüntüleme yöntemlerine göre çeşitli avantajlar sunar 37,38. MRI veya CT'den farklı olarak, MPI yalnızca izleyiciden sinyal sağlayarak sıfır arka plan gürültüsü ve olağanüstü kontrast sağlar. Yüksek zamansal çözünürlüğe sahip gerçek zamanlı görüntüleme sunarak hücre göçü veya perfüzyon gibi dinamik süreçleri izlemek için idealdir. Ek olarak, MPI oldukça hassastır ve PET veya CT'den farklı olarak iyonlaştırıcı radyasyon olmadan küçük miktarlarda SPION'ların tespit edilmesine izin verir. Ayrıca, izleyici konsantrasyonunun doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlayan mükemmel doğrusal miktar tayini de gösterir. Genel olarak, MPI hassasiyet, güvenlik ve nicelleştirmenin güçlü yönlerini birleştirerek onu biyomedikal görüntüleme için güçlü bir araç haline getirir. MPI, akciğerlerde kök hücre takibi için umut vericidir ve hücre göçünün, tutulmasının ve terapötik etkilerin hassas bir şekilde izlenmesini sağlar. Doku sinyali paraziti olmadan mükemmel kontrast sağlar, böyleceetiketli kök hücrelerin 39,40,41,42 hassas lokalizasyonunu sağlar. Aşağıdaki bölümler, bu çalışmalar için üstlenilen protokolleri özetlemekte ve etiketli hücreleri fare akciğerlerine iletmek için intratrakeal damlatmanın kullanımını ve MPI yoluyla doğrulamayı göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan denekleri içeren tüm prosedürler Michigan Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve insan denekleri içeren Corewell Health IRB no. 2017-198 tarafından onaylanmıştır. Tüm hastalar çalışmaya katılmadan önce yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler.

Akciğer nakli yapılan İdiyopatik Pulmoner Fibrozis (İPF) hastalarından insan akciğer eksplant örnekleri Corewell Health'ten toplandı. Transplantasyon prosedüründen önce, tüm hastalar hipoksemi, dispne ve azalmış akciğer hacmi43 ile karakterize idiyopatik pulmoner fibroz (İPF) tanı kriterlerini karşıladı. Akciğer lobunun distal ucundan alınan dokunun patolojik analizi fibrozisin varlığını doğruladı.

Erkek NOD / SCID fareleri 8 haftalıkken satın alındı ve 1 hafta boyunca alışmalarına izin verildi ve daha sonra işlemden 12 hafta öncesine kadar yaşlandırıldı.

1. İnsan hava yolu epitel hücrelerinin izolasyonu ve genişletilmesi

  1. Diseksiyon sırasında hücre bütünlüğünü korumak için ekilen akciğer örneğini buz üzerine yerleştirin. Numunede bulunan bronşları/büyük hava yollarını tanımlayın; Küçük hava yolları, akciğer örneğinin distal kısımlarında, büyük hava yollarından en uzakta bulunur. Sterilize edilmiş aletler kullanarak, akciğer örneğinin distal kısmını eksize edin ve dokunun sindirimine yardımcı olmak için daha küçük porsiyonlara bölün. Fazla kan ve sıvıyı çıkarmak için numuneyi Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) durulayın, ardından küçük hava yollarını içeren ekilen akciğer dokusunu Streptomyces griseus'tan proteaz, 1x penisilin / streptomisin, DNaz I ve 50 mL'lik bir tüpte 1x Gentamisin'den oluşan bir tamponda sindirin. Dokuyu 37 ° C'lik bir su banyosuna yaklaşık 4 saat boyunca veya doku yeterince sindirilene kadar sallanacak şekilde yerleştirin.
  2. 50 mL'lik tüpün içeriğini 100 μm'lik steril bir hücre süzgecinden geçirin. Dokuyu 3 kez DPBS ile durulayın ve yıkamaları süzgeçten geçirin. Hücreleri 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleme ile peletleyin, süpernatanı çıkarın ve hücre süspansiyonunu 500 μL'ye ayarlanmış bir pipetle 50x pipetleyerek hücreleri 1 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin.
  3. Hücre süspansiyonunu, hava yolu epitelyal büyüme ortamını içeren 75cm2'lik bir kültür şişesine ekleyin. Hücreleri yaklaşık 2 hafta boyunca 37 ° C,% 5 CO2'de kültürleyin.

2. Hava yolu epitel hücrelerinin nanopartiküllerle etiketlenmesi (demir oksit izleyici)

  1. Epitel kültürleri %80 birleştiğinde, hücreleri 250 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyonda demir oksit izleyici ile etiketleyin. Epitel hücrelerinin şişesi başına 10 mL kültür ortamına uygun hacimde demir oksit izleyici ekleyin ve 48 saat inkübe edin.
    NOT: Farklı konsantrasyonlarda demir oksit izleyici (50, 100, 200 ve 250 μg/mL) hücre etiketlemesi için değerlendirildi ve ardından 2D MPI taramaları yapıldı (Şekil 1A). Transplantasyon için 50.000 hücre ile birlikte 250 μg/mL konsantrasyonu bu çalışma için sonlandırıldı.
  2. 48 saat sonra, fazla nanopartikülleri çıkarmak için hücreleri 3x DPBS ile yıkayın.
  3. Hücre ayırıcı reaktif kullanarak hücreleri ayırın ve hücreleri 37 ° C'de 15 dakika veya hücreler şişenin yüzeyinden kalkmaya başlayana kadar inkübe edin.
  4. Hücreleri 1 mL Fetal Sığır Serumu içeren 50 mL'lik bir tüpe toplayın. Şişeyi 3x 5 mL DPBS ile durulayın ve yıkamaları hücreleri içeren 50 mL'lik tüpe ekleyin.
  5. Hücreleri 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre süspansiyonunu 50 μL'ye ayarlanmış bir pipetle 50x pipetleyerek hücreleri 1 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin.
  6. Hücre konsantrasyonunu belirlemek ve in vivo transplantasyon için gerekli hücre süspansiyonu hacmini belirlemek için bir hemositometre kullanın.
  7. Hücre süspansiyonunun 100 μL'sini alın ve% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.

3. İn vitro immün boyama ve mikroskopi

  1. 100 μL'lik hücre süspansiyonu alikotunu bir slayt ve filtre içeren bir sitospin kartuşuna yükleyin ve 1.000 rpm'de 5 dakika döndürün.
  2. Hidrofobik bir kalem kullanarak slayttaki hücrelerin ana hatlarını çizin.
  3. Slaytları DPBS ile 2 x 15 dakika yıkayın.
  4. DPBS'de% 0.1 Triton X-100 ile oda sıcaklığında 5 dakika inkübe ederek slayt üzerindeki hücreleri geçirgen hale getirin.
  5. Hücreleri DPBS ile 2 x 2 dakika yıkayın.
  6. Slaytları DPBS'de% 5 sığır serum albümini (BSA) /% 1 keçi serumu ile 2 saat bloke edin.
  7. Primer antikordaki (anti-dekstran) slaytları DPBS'de% 2.5 BSA /% 0.5 keçi serumunda gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  8. Birincil antikoru çıkarın ve slaytları 3 x 5 dakika 1x Tween 20 (TBST) ile Tris-Buffered Salin içinde yıkayın.
  9. Slaytları karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca DPBS'de% 2.5 BSA /% 0.5 keçi serumunda 1: 1.000 ikincil antikor ile inkübe edin.
  10. Slaytları 1x TBST ile 3 x 5 dakika yıkayın.
  11. DPBS'de 1: 1.000 konsantrasyonda slayta bir nükleer boyama maddesi olan 4 ", 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilmesine izin verin.
  12. Slaytları 2x TBST ile 5 x 1 dakika yıkayın. Slayttan fazla 1x TBST'yi çıkarın.
  13. DAPI ile montaj ortamı ekleyin ve herhangi bir hava kabarcığı olmamasına dikkat ederek sürgünün üzerine bir cam lamel yerleştirin.
  14. Slayt ayarlandıktan sonra, şeffaf bir oje kullanarak lamel kenarlarını kapatın.
  15. Slaytları konfokal bir mikroskopta görüntüleyin.

4. İntratrakeal damlatma kullanılarak hücre nakli

  1. Hazırlık
    1. Her fare için gereken bleomisin (BLM) dozunu hesaplamak için fareyi tartın.
    2. 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, istenen BLM çözeltisini (sterilize edilmiş tuzlu su içinde seyreltilmiş) 50 μL'yi aşmayacak bir hacimde hazırlayın.
      NOT: İlaç konsantrasyonu deneysel hedeflere bağlı olarak değişecektir. Bu prosedür için 0.6 U/kg'da BLM kullanıldı.
    3. BLM solüsyonunu bir pipete yükleyin. Ek olarak, tüm sıvı hacminin trakeaya atıldığından emin olmak için 200 μL hava ile bir şırıngayı önceden yükleyin.
      NOT: 72 saatlik BLM işleminden sonra, etiketli hücre süspansiyonu benzer şekilde uygulanacaktır.
    4. Uygulanacak 50.000 hücre içeren hücre süspansiyonunun hacmini hesaplamak için adım 2.6'dan elde edilen hücre sayısını kullanın.
    5. Fareyi, sakinleşene kadar izofluran (% 2.5-3) sağlayan anestezi ünitesine bağlı bir indüksiyon kutusuna yerleştirerek uyuşturun.
      NOT: Fareler tüm prosedür boyunca iki kez uyuşturulur: (1) BLM uygulamasının yapıldığı gün ve (2) BLM dozundan 72 saat sonra hücrelerin intratrakeal damlatıldığı gün.
    6. Fiber ışık entübasyon kitini, fiber optik prob laringoskop ve kateterden geçecek şekilde Şekil 2A'da gösterildiği gibi kurun.
      NOT: Fiberin ışıklı ucu kateter tüpünün hemen dışına (1-2 mm) yerleştirilmelidir.
  2. intratrakeal damlatma
    1. Ayak parmağınızı arka ayaklardan herhangi birine sıkıştırarak pedal refleksini kontrol ederek anesteziyi onaylayın. Yeterli anestezi onaylandıktan sonra, fareyi açılı bir kemirgen entübasyon standı üzerinde sırtüstü pozisyonda kesici dişlerinden asın.
    2. Künt uçlu forseps kullanarak, dili dikkatlice kavrayın ve yukarı ve sola doğru hareketlerle, gırtlağın yeterli görselleştirmesini elde etmek için dili konumlandırın.
    3. Fiber optik probu açın ve trakeaya yaklaşmak için ağza girin. Gırtlağın daha iyi görselleştirilmesi için laringoskopun büyütecini kullanın ve trakeal açıklıktaki ses tellerini bulun.
    4. Kateteri trakeal açıklığa yerleştirin ve laringoskopu çok dikkatli bir şekilde çıkarın ve dışarı çekin. Kateterin üst ucuna küçük bir damla salin (20 μL) yerleştirin.
      NOT: Sıvı seviyesi, farenin nefes alma hızıyla uyumlu olarak yukarı ve aşağı hareket edecektir. Bu, kateterin trakeaya yerleştirilmesini ve yanlışlıkla yemek borusuna yerleştirilmesini onaylayacaktır.
    5. Önceden yüklenmiş 200 μL hava ile bir şırınga takın ve damlacığı içeri itin. Hücre süspansiyonunu (≤50 μL) katetere yerleştirin ve daha önce olduğu gibi hava yüklü şırınga kullanarak aşılayın.
    6. Damatılan sıvının trakeadan kaçmasını önlemek için kateteri 5-7 saniye yerinde bırakın. Ardından, kateteri yavaşça dışarı çekin.
    7. Fareyi entübasyon standı üzerinde en az 30 saniye aynı konumda tutun.
    8. Fareyi çıkarın ve bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirilmiş bir kurtarma kafesine koyun. Anesteziden tamamen iyileşene kadar izleyin.

5. Manyetik parçacık görüntüleme

  1. Fareyi, sakinleşene kadar izofluran (% 2-2.5) sağlayan anestezi ünitesine bağlı bir indüksiyon kutusuna yerleştirerek uyuşturun.
  2. Fare yatağını, anestezi hattı uygun bağlantılardan yatağın altından geçecek şekilde bir MPI tarayıcıya kurun.
  3. Fare sakinleştirilirken, MPI tarayıcıyı görüntüleme için hazırlayın. Bağlantılı yazılımı başlatın ve Project'te bir klasör adı tanımlayın ve tanımlama için Sınav adı etki alanında tarama yapın ve tarama parametrelerini gereksinimlere göre ayarlayın. Bu prosedürü takip etmek için şu tarama parametrelerini kullanın: Tarama Tipi: 2D tarama; Tarama modu: Standart; İletim Kanalları: Çok Kanallı (İzotropik); Projeksiyon başına ortalamalar: 2.
  4. Adım 4.2.1'de açıklandığı gibi anesteziyi kontrol edin. Fareyi Şekil 2E'de gösterildiği gibi MPI yatağına güvenli bir şekilde yerleştirin.
    NOT: Tarama sırasında anestezinin uygun şekilde sürdürülmesi için burnun yatağın yerleşik burun konisi ile düzgün şekilde hizalandığından emin olun.
    DİKKAT: Tarama sırasında yetersiz anestezi, tarama devam ederken farenin uyanmasına neden olabilir.
  5. Fare tarayıcıya yerleştirildikten sonra, yatağı deliğin içine itin ve Taramayı Başlat'a tıklayın.
  6. Tarama tamamlandıktan sonra, fareyi MPI yatağından çıkarın ve bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirilmiş bir kurtarma kafesine koyun. Anesteziden tamamen iyileşene kadar izleyin.
  7. Görüntü analiz yazılımı kullanarak görüntüleri analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Pilot çalışma altı fare ile gerçekleştirildi. Bunlardan sadece bir fare, çalışmanın tamamlanmasından önce, 10. günde öldü. Farklı etiketleme konsantrasyonları için 2D MPI sinyal yoğunlukları, hücre sayısının bir fonksiyonu olarak değerlendirildi (Şekil 1A). Sinyal yoğunluğunun demir oksit izleyicinin konsantrasyonu ile doğru orantılı olduğu gözlendi. Bu nedenle, 250 μg/mL'lik konsantrasyon optimal etiketleme konsantrasyonu olarak kabul edildi ve sonraki çalı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Farelerde intratrakeal damlatma, maddeleri doğrudan akciğerlere vermek için kesin bir tekniktir. Bu prosedür boyunca birden fazla kritik adım sırasında dikkatli dikkat gereklidir. Rahatsızlığı ve hareketi önlemek için uygun anestezi derinliğinin sağlanmasından başlayarak ve trakeal açıklığa net erişim için hava yolunu hizalamak üzere fareyi boynu uzatılmış olarak sırtüstü konumlandırın. Dil bastırıcının kullanılması hava yolunun açık kalmasına yardımcı olabilir. Kateterin dikkatli bir şe...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışmanın finansmanı kısmen R01HL153165-01A1'den XPL'ye ve R21AI159928-01'den PW'ye verilen hibe ile sağlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.7 mL microcentrifuge tubeDOT ScientificRN1700-GMTHücre toplama ve BLM seyreltmelerinin hazırlanması için
Anti-Dekstran antikoduSTEMCELL Technologies60026Birincil Antikor
BD Luer-Lok ŞırıngaBecton, Dickinson309628İntratracheal instillasyon sırasında hava enjeksiyonları için
Cytospin 3Thermo Shandon74010121GB
DNase IMillipore-Sigma10104159001
Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS -/-) Gibco14190250
Fetal Bovin Serum ThermoFisher ScientificA5670701
Gentamisin Gibco15750060
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed İkincil Antikor, Alexa Fluor® 568ThermoFisher ScientificA-11004İkincil Antikor
Keçi SerumuMillipore-SigmaG9023
IsofluranCovetrus11695067772Gaz anestezisi
Isofluran buharlaştırıcıSOMNI ScientificVS6002Anestezi aparatı
MomentumMagnetic Insight IncPreklinik Manyetik Parçacık Görüntüleme (MPI) tarayıcı
Mouse entübasyon kitiOHANOhan-201Gerekli tüm aksesuarları ile komple entübasyon kiti
NOD/SCID FareleriJackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:001303İmmün yetmezlikli fare modeli
Penisilin/Streptomisin Gibco15140122
PneumaCult-Ex Plus Medium STEMCELL Technologies5040
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI InvitrogenP36962Immünoboyamalı slaytlar için montaj ortamı
Protease from Streptomyces griseus Millipore-SigmaP5147
Cerrahi kitiFarenin dilini tutmak için kullanılan keskin uçlu forseps
Tris-Buffered Saline with Tween20 (TBST)ThermoFisher Scientific28360
TrypLE Express Enzim ThermoFisher Scientific12604021
VivoTrax PlusMagnetic InsightMIVTP01In vitro hücre etiketleme ve sonrasında MPI için demir oksit izleyici

Kaynaklar

  1. Biehl, J. K., Russell, B. Introduction to Stem Cell Therapy. J Cardiovasc Nurs. 24 (2), 98-103 (2009).
  2. Herberts, C. A., Kwa, M. S. G., Hermsen, H. P. H. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9 (1), 29(2011).
  3. Bair, S. M., Brandstadter, J. D., Ayers, E. C., Stadtmauer, E. A. Hematopoietic stem cell transplantation for blood cancers in the era of precision medicine and immunotherapy. Cancer. 126 (9), 1837-1855 (2020).
  4. Xuan, L., Liu, Q. Maintenance therapy in acute myeloid leukemia after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J Hematol Oncol. 14 (1), 4(2021).
  5. Zhu, C., Wu, W., Qu, X. Mesenchymal stem cells in osteoarthritis therapy: a review. Am J Transl Res. 13 (2), 448-461 (2021).
  6. Giorgino, R., et al. Knee osteoarthritis: Epidemiology, pathogenesis, and mesenchymal stem cells: What else is new? An update. Int J Mol Sci. 24 (7), 6405(2023).
  7. Jeyagaran, A., et al. Type 1 diabetes and engineering enhanced islet transplantation. Adv Drug Deliv Rev. 189, 114481(2022).
  8. Shinozaki, M., Nagoshi, N., Nakamura, M., Okano, H. Mechanisms of stem cell therapy in spinal cord injuries. Cells. 10 (10), 2676(2021).
  9. Zipser, C. M., et al. Cell-based and stem-cell-based treatments for spinal cord injury: evidence from clinical trials. Lancet Neurol. 21 (7), 659-670 (2022).
  10. Kim, S. W., et al. Neural stem cells derived from human midbrain organoids as a stable source for treating Parkinson's disease: Midbrain organoid-NSCs (Og-NSC) as a stable source for PD treatment. Prog Neurobiol. 204, 102086(2021).
  11. Nie, L., et al. Directional induction of neural stem cells, a new therapy for neurodegenerative diseases and ischemic stroke. Cell Death Discov. 9 (1), 215(2023).
  12. Yue, C., Feng, S., Chen, Y., Jing, N. The therapeutic prospects and challenges of human neural stem cells for the treatment of Alzheimer's Disease. Cell Regen. 11 (1), 28(2022).
  13. Kim, J. -H., et al. Human pluripotent stem cell-derived alveolar organoids for modeling pulmonary fibrosis and drug testing. Cell Death Discov. 7 (1), 48(2021).
  14. Cheng, W., Zeng, Y., Wang, D. Stem cell-based therapy for pulmonary fibrosis. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 492(2022).
  15. Milman Krentsis, I., et al. Lung cell transplantation for pulmonary fibrosis. Sci Adv. 10 (34), eadk2524(2024).
  16. Suezawa, T., et al. Disease modeling of pulmonary fibrosis using human pluripotent stem cell-derived alveolar organoids. Stem Cell Rep. 16 (12), 2973-2987 (2021).
  17. Madrid, M., Sumen, C., Aivio, S., Saklayen, N. Autologous induced pluripotent stem cell-based cell therapies: Promise, progress, and challenges. Curr Protoc. 1 (3), e88(2021).
  18. Balistreri, C. R., et al. Stem cell therapy: old challenges and new solutions. Mol Biol Rep. 47 (4), 3117-3131 (2020).
  19. Richeldi, L., Collard, H. R., Jones, M. G. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 389 (10082), 1941-1952 (2017).
  20. Tzouvelekis, A., Antoniadis, A., Bouros, D. Stem cell therapy in pulmonary fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 17 (5), 368-373 (2011).
  21. Rawlins, E. L. Lung epithelial progenitor cells. Proc Am Thorac Soc. 5 (6), 675-681 (2008).
  22. Han, M. -M., et al. Nanoengineered mesenchymal stem cell therapy for pulmonary fibrosis in young and aged mice. Sci Adv. 9 (29), eadg5358(2023).
  23. Averyanov, A., et al. First-in-human high-cumulative-dose stem cell therapy in idiopathic pulmonary fibrosis with rapid lung function decline. Stem Cells Transl Med. 9 (1), 6-16 (2019).
  24. Glassberg, M. K., et al. Allogeneic human mesenchymal stem cells in patients with idiopathic pulmonary fibrosis via intravenous delivery (AETHER): A phase I safety clinical trial. Chest. 151 (5), 971-981 (2017).
  25. Zhao, X., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cell therapy for reverse bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Sci Rep. 13 (1), 13183(2023).
  26. Tzouvelekis, A., et al. A prospective, non-randomized, no placebo-controlled, phase Ib clinical trial to study the safety of the adipose derived stromal cells-stromal vascular fraction in idiopathic pulmonary fibrosis. J Transl Med. 11 (1), 171(2013).
  27. Tzouvelekis, A., et al. Stem cell therapy for idiopathic pulmonary fibrosis: a protocol proposal. J Transl Med. 9 (1), 182(2011).
  28. Choi, S. M., et al. Classical monocyte-derived macrophages as therapeutic targets of umbilical cord mesenchymal stem cells: comparison of intratracheal and intravenous administration in a mouse model of pulmonary fibrosis. Respir Res. 24 (1), 68(2023).
  29. Llontop, P., et al. Airway transplantation of adipose stem cells protects against bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J Investig Med. 66 (4), 739-746 (2018).
  30. Gad, E. S., et al. The anti-fibrotic and anti-inflammatory potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells and nintedanib in bleomycin-induced lung fibrosis in rats. Inflammation. 43 (1), 123-134 (2020).
  31. Aal Porzionato,, et al. Intratracheal administration of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles reduces lung injuries in a chronic rat model of bronchopulmonary dysplasia. Am Jl Physiol Lung Cell Mol Physiol. 320 (5), L688-L704 (2021).
  32. Ortiz-Muñoz, G., Looney, M. R. Non-invasive Intratracheal Instillation in Mice. Bio Protoc. 5 (12), e1504(2015).
  33. Srinivas, M., et al. Imaging of cellular therapies. Adv Drug Deliv Rev. 62 (11), 1080-1093 (2010).
  34. Li, Z., Tong, L., Zhao, H., He, Z. Medical Imaging in Clinical Practice. Erondu, F. O. , IntechOpen. (2013).
  35. Knopp, T., Gdaniec, N., Möddel, M. Magnetic particle imaging: from proof of principle to preclinical applications. Phys Med Biol. 62 (14), R124-R178 (2017).
  36. Borgert, J., et al. Fundamentals and applications of magnetic particle imaging. J Cardiovasc Computed Tomogr. 6 (3), 149-153 (2012).
  37. Mohapatra, J., et al. Principles and applications of magnetic nanomaterials in magnetically guided bioimaging. Mater Today Phys. 32, 101003(2023).
  38. Pablico-Lansigan, M. H., Situ, S. F., Samia, A. C. S. Magnetic particle imaging: advancements and perspectives for real-time in vivo monitoring and image-guided therapy. Nanoscale. 5 (10), 4040-4055 (2013).
  39. Bulte, J. W. M., et al. Quantitative "hot-spot" imaging of transplanted stem cells using superparamagnetic tracers and magnetic particle imaging. Tomography. 1 (2), 91-97 (2015).
  40. Lemaster, J. E., Chen, F., Kim, T., Hariri, A., Jokerst, J. V. Development of a trimodal contrast agent for acoustic and magnetic particle imaging of stem cells. ACS Appl Nano Mater. 1 (3), 1321-1331 (2018).
  41. Shalaby, N., et al. Complementary early-phase magnetic particle imaging and late-phase positron emission tomography reporter imaging of mesenchymal stem cells in vivo. Nanoscale. 15 (7), 3408-3418 (2023).
  42. Wang, Q., et al. Artificially engineered cubic iron oxide nanoparticle as a high-performance magnetic particle imaging tracer for stem cell tracking. ACS Nano. 14 (2), 2053-2062 (2020).
  43. Li, X., et al. Extravascular sources of lung angiotensin peptide synthesis in idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (5), L887-L895 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre TedavisiSPION EtiketlemeH cre TransplantasyonuBoylamsal G r nt lememm nboyamaHistolojik Do rulama

İlgili makaleler