Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare retinasındaki glial etkileşimleri incelemek için bir ex vivo eksplant modeli

1.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68482

⸱

15 Temmuz 2025

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Schepens Eye Research Institute of Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

Bu makalede

Özet

Burada, genişletilmiş ex vivo deneyler için retinayı fare gözünden izole etmek için ayrıntılı bir metodoloji sunuyoruz. Bu protokol, retinal glia'yı canlı dokuda yerinde tutmanın sağladığı araştırma yollarından yararlanmak isteyen araştırmacılar için bu teknik olarak zorlu yaklaşımı erişilebilir kılmayı vurgulamaktadır.

Özet

Glia'nın glokomdaki rolü giderek daha belirgin bir araştırma konusudur, ancak bu destek hücrelerinin popülasyonlarının - yani astrositler ve mikroglia'nın - retinal ganglion hücresi sağkalımını nasıl etkilediği hakkında çok şey bilinmemektedir. İn vivo ve in vitro modeller bir dereceye kadar içgörü sağlarken, her iki yaklaşımın da birincisinde periferik immün yanıtın etkisi ve ikincisinde hücre izolasyonu ve kültürünün neden olduğu fizyolojik fonksiyondaki değişiklikler gibi önemli sınırlamaları vardır. Bu kafa karıştırıcı faktörleri en aza indirmek için, astrositlerin, mikrogliaların ve diğer retinal hücre tiplerinin en az 3 günlük periyotlar boyunca yerinde tutulabildiği ve tipik olarak mümkün olandan daha yüksek bir verimde hedefli araştırmayı mümkün kılan bir ex vivo retinal eksplant sistemi geliştirdik. En önemlisi, bu yaklaşım, canlı bir hayvanda zorlayıcı veya uygulanamaz olabilecek metodolojilere oldukça uygundur, ancak sağlam sinir dokusunun yaygın aşağı akış tahlilleriyle uyumlu kalır. Burada, ex vivo retinada glia ve retinal ganglion hücrelerinin geçirdiği değişiklikleri belgeleyen immünofloresan mikroskobunun temsili sonuçları ile birlikte, sağlam retinal eksplantların izolasyonu ve kültürü için uygun bir protokol sunuyoruz.

Giriş

Gözün arkasında bulunan merkezi sinir sisteminin (CNS) bir uzantısı olan ışığa duyarlı retina, görme için gereklidir ancak hem akut yaralanmaya hem de kronik hastalığa karşı savunmasızdır. Diğer CNS bölgelerinde olduğu gibi, yetişkin retinasındaki nöronlar kaybedildiğinde yerine konmaz ve görsel bilgileri toplayan ve beyne ileten retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) glokomda işlev bozukluğuna ve ölüme karşı özellikle savunmasızdır ve bu da geri dönüşü olmayan görme kaybına neden olur 1,2. Glokom, dünya çapında körlüğün önde gelen bir nedenidir3, ancak etkilenen bireyler üzerindeki yıkıcı etkisine ve topluma olan genel maliyetlerine rağmen, hastalığın erken evrelerinin RGC kaybına nasıl katkıda bulunduğu hakkında çok şey bilinmemektedir4. Glia'nın rolü, glokom patofizyolojisinde önemli bir araştırma alanıdır, çünkü bu nöronal olmayan destek hücreleri RGC sağkalımı5 için gereklidir, ancak hastalıkta yararlı davranışıazaltabilecek fenotipik değişikliklere uğrar 6 ve hatta zararlı fenotiplerinbenimsenmesini sağlayabilir 7. Glia terimi, CNS8 boyunca bir dizi özel hücre tipini kapsamasına rağmen, bunlar genel olarak iki kategoriye ayrılabilir - nöronlarla gelişimsel bir soyu paylaşan ve trofik, enerjik ve yapısal destek sağlayanlar9 ve miyeloid kökenli, özel bağışıklık gözetimi ve yanıt görevlerini yerine getirenler10. Her iki kategorinin temsilcileri - birincisinde astrositler ve Müller hücreleri, ikincisinde mikroglia - retinayıdoldurur 5 ve glokomda, hastalığın ilerlemesi ve RGC sağkalımındaki rolleri hakkında önemli sorular ortaya çıkaran büyük değişiklikler geçirir11.

Bu soruları cevaplama çabaları, kısmen hem in vivo hem de in vitro araştırmalarda zorluklar sunan retinal glia'nın içsel özellikleri tarafından engellenmektedir. Nöronların aksine, elektriksel olarak nispeten sessizdirler, bu da RGC'lerin ve fotoreseptörlerin in vivo olarak glial fonksiyon ve davranıştaki değişiklikleri araştırmak için uygun olmayan fonksiyonel değerlendirmesini sağlayan ERG gibi yaklaşımları yapar. Ve indüklenebilir12 ve spontan13 glokom modelleri mevcut olsa da, hastalığın en erken zaman noktalarında glia'daki değişiklikler hakkında çok şey bilinmemektedir, bu da saptanabilir RGC kaybından önce gelebilir, bu modellerin çoğunda hastalık durumunun değişken penetrasyonu ile birleşen bir problem. Ayrıca, hem klinik hem de deneysel glokomdan elde edilen kanıtlar, hastalığın ilerlemesini etkilemek için farklı 'yönlerde' hareket edebileceklerine dair göstergelere rağmen, mikroglia'nınkinden ayırt edilmesi zor olabilen periferik bağışıklık hücrelerinin katkılarını göstermektedir14,15.

Retinal glia'nın in vitro olarak incelenmesinde de zorluklar vardır. Beyindenastrositler 16,17 ve mikroglia18'in izolasyonu ve kültürü iyi kurulmuş olsa da, son çalışmalar, özellikle astrositlerde19 olmak üzere CNS bölgeleri arasındaki geniş glial heterojenliği vurgulamaktadır ve bir bölgede bulunan fenotipler, retina20,21 gibi başka bir bölgeden glia'da mevcut olmayabilir. Bununla birlikte, çalışma için retinal astrositleri ve mikroglia'yı doğrudan izole etmek özellikle zordur, çünkü her iki hücre tipi de nispeten seyrektir - her biri fare retinasındaki tahmini 6,5 milyon hücrenin %1'inden daha azını oluşturur 22,23,24. Ayrıca, nöronların aksine, glia oldukça plastiktir ve çevrelerindeki dramatik değişikliklere hızla adapte olur 16,18,25; Sonuç olarak, bu hücrelerde in vitro olarak gözlemlenen davranışlar, tipik olarak sağlık veya hastalıkta görülecek fenotipik kalıplardan ziyade yeni ortamlarına spesifik adaptasyonları temsil edebilir. Hem in vivo deneylerin hem de retinal glia'nın primer kültürünün sınırlamaları göz önüne alındığında, glia, RGC'ler ve retinanın diğer elemanlarının ex vivo bağlamda in situ olarak korunduğu bir ara yaklaşım - retinal eksplantlar - aradık. İn vivo modellere göre, bu yaklaşım kısaltılmış bir deneysel zaman kursu26 sunar, retinal glia27'nin doğrudan deneysel manipülasyonunu sağlar ve periferik immün hücre infiltrasyonunun14 potansiyel olarak kafa karıştırıcı etkisini önler. Tersine, birincil hücre kültüründen farklı olarak, hücre dışı ortamda minimum bozulma olur ve glia bozulmadan ve morfolojik olarak tanınabilir kalır, bu da enzimatik ve mekanik bozulmadan sonra bu hücrelerin esasen yeniden büyümesi ve tanımlanması ile ilgili zorlukları ortadan kaldırır16,25.

Daha önce açıklanan retinal eksplant metodolojilerine göre, bu yaklaşım, erişilebilirliği iyileştirme yaklaşımının teknik güvenilirlik, tekrarlanabilirlik ve 'kullanıcı dostu olmasını' en üst düzeye çıkarmaya odaklanmayı vurgular26,28. Diğer araştırmacılarla kişisel iletişimlerde, canlı retinanın ele alınmasıyla ilgili teknik zorlukların, eksplantları kullanmak isteyen birçok kişi için büyük bir engel teşkil ettiğini, oysa eksplantedilen retinanın kültürde bakımının uygun hücre kültürü tesislerine sahip gruplar için nispeten basit olduğunu bulduk. Bu nedenle, bu protokol, retina izolasyonu ile ilişkili öğrenme eğrisini azaltmayı ve araştırmacıların deneysel verileri daha hızlı toplamaya başlamasını sağlamayı amaçlayan bir dizi yenilik içerir. Son olarak, retinal glia'nın davranışını araştırmak ve onu esas olarak immünofloresan mikroskobu ile karakterize etmek için bu eksplant modelinin potansiyeline özel bir vurgu yapmış olsak da, diğer retina hücre tipleri ve yapıları da büyük ölçüde korunur ve ekilen retinalar çok çeşitli ek araştırma tekniklerine uygun kalır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanları içeren tüm prosedürler, Schepens Göz Araştırma Enstitüsü'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (Protokol # 2022N000030, 3/4/2025 onayı). Hayvanlar, Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin (ARVO) Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı Bildirimi'ne uygun olarak ele alındı.

NOT: Şekil 1 , enükleasyonlu fare gözünden canlı retinanın izolasyonundaki temel adımları göstermektedir.

figure-protocol-1
Şekil 1: Enükleasyonlu fare gözünden canlı retinanın izolasyonundaki temel adımların şematik bir gösterimi. Anahtar adımların karşılık gelen adım numaraları daireler halinde verilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Hazırlık

  1. 1 mL'lik bir pipeti ve bir çift açılı forsepsi dezenfekte edin ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Bunlara protokolün 3. bölümünde ihtiyaç duyulacaktır.
  2. Pipeti kısaltmak ve açıklığı genişletmek için, deliğin en geniş olduğu rezervuarın yaklaşık 2 cm altında, şaft boyunca dik olarak keserek bir transfer pipetini değiştirin. Retinanın takılmayacağı temiz bir kesim olduğundan emin olun.
    NOT: Bu alet, temiz olması ve kullanımlar arasında steril su ile durulanması halinde yeniden kullanım için saklanabilir.
  3. 47.5 mL Nörobazal ortamı 500 μL N-2 takviyesi, 1 mL B-27 takviyesi, 500 μL Glutamax ve 500 μL penisilin-streptomisin karışımı (100 U/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin nihai konsantrasyonu) ile destekleyerek bir biyogüvenlik kabininde 50 ml eksplant ortamı aseptik olarak hazırlayın.
    NOT: Her bir izolasyon serisi için taze eksplant ortamı hazırlayın; fazla ortam 4 °C'de 1 haftaya kadar tutulabilir ve gerekirse ortam değişiklikleri için kullanılabilir. Açıldıktan sonra, kullanılmayan Neurobazal besiyerini 1 ay sonra değiştirin. N-2 ve B-27, donma-çözülme döngülerinden kaçınarak tek kullanımlık alikotlar olarak donmuş halde tutulmalıdır.
  4. Bir biyogüvenlik kabininde, kullanılacak her bir oyuğa bir ek ekleyerek kültür plakalarını aseptik olarak hazırlayın, kültür ortamıyla temas edecek yüzeylere dokunmaktan kaçınmak için ek kenardan çıkan 'çatallar' aracılığıyla tutun.
    1. Eke 1 mL eksplant ortamı ekleyin, ardından kuyucuğun kendisine 3 mL daha ekleyin. Buharlaşmayı kontrol etmek için kullanılmayan kuyucuklara 2-3 mL steril su ekleyin.
    2. Doku izolasyonundan yaklaşık 30 dakika önce dengelemek için plaka(lar)ı %5 CO2 ile 37 ° C'de inkübatöre aktarın.
  5. Doku stabilizasyonu ve transferi için bir substrat oluşturmak üzere filtre kareleri hazırlayın. Malzemenin çevresini bir tıraş bıçağı veya neşter ile keserek filtreyi bir şişe üstü filtreleme kitinden çıkarın. Filtrenin katlanması veya yırtılması nedeniyle yaralanmasını veya zarar görmesini önlemeye dikkat edin.
    NOT: Dişli adaptörün rezervuarla birleştiği yerde daha yumuşak opak plastiği kesmek için sağlam bir tıraş bıçağı kullanarak şeffaf plastik hazneyi çıkarmak, çıkarma işlemini basitleştirir, ancak yaralanmayı önlemek için ek dikkatli olunmalıdır.
    1. Filtre kesilerek ayrıldıktan sonra, çıkarmak için forseps kullanın. Ekstraksiyon sırasında ve sonrasında filtrenin yönüne dikkat edin; Mat taraf (rezervuara bakan), transfer için adım 2.16'da retinayı monte etmek için dik olmalıdır.
    2. Filtreyi yaklaşık 7 mm × 7 mm küçük kareler halinde kesin; Her retinal eksplant bir kare gerektirecektir. Kareleri 100 mm'lik bir Petri kabında steril suda en az 20 dakika önceden bekletin.
      NOT: Filtre kareleri, kullanımdan önce 1 haftaya kadar steril suya batırılmış halde kalabilir. Filtre karelerinin daldırmadan önce yüksek düzeyde statik yük geliştirme eğilimi nedeniyle, yalnızca gerektiği kadar kare hazırlayın. Kalan kuru filtre malzemesi, daha sonra kullanılmak üzere steril 100 mm'lik bir Petri kabında süresiz olarak saklanabilir.

2. İzolasyon ve montaj

  1. İkincil bir yaklaşımla onaylamadan önce fareyi onaylanmış bir yöntemle ötenazi yapın; bu çalışmada CO2 asfiksiasyonu ve ardından servikal çıkık kullanılmıştır. Her iki gözü de kavisli, künt uçlu forsepslerle enüklee edin ve steril PBS'ye yerleştirin.
  2. 100 mm'lik bir Petri kabını steril PBS ile doldurarak ve binoküler diseksiyon skopu aşamasına yerleştirerek çalışma alanını hazırlayın.
    1. 1 cm genişliğinde bir laboratuvar mendili şeridi kesin ve dengeleyici bir alt tabaka görevi görmesi için tabağa daldırın.
    2. Bir gözünüzü diseksiyon kabına aktarın, diğerini PBS'de bırakın ve buzun üzerine veya 4 °C'deki bir buzdolabına koyun.
      NOT: Retinanın uzun süreli ölüm sonrası aralığa duyarlılığı nedeniyle, her seferinde bir fareye ötenazi yapılması önerilir.
  3. Gözü konumlandırın ve hareketsiz hale getirin. Gözü batık laboratuvar mendili üzerinde manevra yapmak için forseps kullanın, bu da stabilizasyona yardımcı olacaktır.
    1. Uygun bir tutma noktası belirleyin, açılı forsepslerle kavrayın ve gözü yandan veya ideal olarak aşağıdan tutulacak şekilde hafifçe yuvarlayın. Ön-arka eksenin (yani korneadan optik sinire kadar) yatay olduğundan emin olun. Bu oryantasyon görünürlüğü artırır ve diseksiyon sırasında göz üzerindeki baskıyı en aza indirir.
      NOT: Mümkünse, gözün delinmesini veya sıkılmasını önlemek için ekstraorbital dokuyu kavrayın, kas veya konjonktivayı optik sinir veya yağ yerine tercih edin.
  4. Açılı forsepslerle tutuşu sürdürürken, gözün tamamen suya daldırıldığından ve güvenli bir şekilde hareketsiz hale getirildiğinden emin olun. #11 neşterin ucu paralel ve korneanın skleraya geçtiği limbusun yaklaşık 0,5 mm arkasında, bir kesi yapın.
    NOT: Bu kesi, yaylı makasın bir bıçağının ucuna sığacak kadar büyük olmalıdır. Neşter ucunun keskinliği, küreyi temiz bir şekilde delmek için çok önemli olduğundan, bıçağı her iki retinadan sonra değiştirin.
    1. Yaylı makasın bir bıçağını kürenin içine sokun ve göz çevresini dairesel olarak kesmeye başlayın, forseps kullanarak gözü gerektiği gibi nazikçe yeniden konumlandırın.
      NOT: Bu kesim mümkün olduğunca düz ve limbusa paralel olmalıdır; Gözü yeniden konumlandırmak, makası bırakmayı ve her elinizle bir çift forseps kullanmayı gerektirebilir. Maruz kaldıktan sonra, retinayı diseksiyon boyunca su altında tutun.
  5. Kesi gözü çevreledikten sonra, ön segmenti ve lensi dikkatlice çıkarın, ardından görsel incelemeyi ve vitreusun çıkarılmasını kolaylaştırmak için vizör lastiğini yukarı bakacak şekilde çevirin. Uzatılmış bir optik sinir parçası bağlı kalırsa, bunu kolaylaştırmak için daha kısa (1-2 mm) bir uzunluğa kesin.
  6. Retinada gözle görülür hasar ve vitreal odada, ön segmentin çıkarılması sırasında girmiş olabilecek RPE veya koroidden pigmentli hücreler gibi kalıntılar olup olmadığını kontrol edin. Vizör lastiğini bu konumda hareketsiz hale getirmek için açılı forseps kullanın.
    NOT: En iyi sonuçlar için, vitreus odasındaki kalıntılar uzaklaştırılmalı ve retina çevresindeki siliyer cismin kalıntı ve yapışık kalıntıları en aza indirilmelidir. Bu zorlu bir süreç olabilir ve Temsili Sonuçların 'Mekanik yaralanmayı tanıma ve sorun giderme' ve 'Metabolik yaralanma' bölümlerinde ek notlar bulunabilir.
    1. Küçük partikül kalıntılarını gidermek için vitreus odasını PBS ile yıkamak için modifiye edilmiş transfer pipetini kullanın, pipet ucunu sıvı yüzeyinin altında tutarak ve rezervuar ampulünde yeterli miktarda PBS bulundurarak hava kabarcıklarını önleyin.
    2. Retina yüzeyiyle teması en aza indirerek ince bir suluboya fırçasıyla daha büyük kalıntıları temizleyin. Gerekirse, ince uçlu forsepslerle daha kalıcı kalıntıları temizleyin; Bununla birlikte, hasarı önlemek için metal alet uçlarının retina ile doğrudan temasından kaçının.
  7. Görünür kalıntıları temizledikten sonra, vitreus odasını yukarıda açıklandığı gibi transfer pipetinden PBS ile tekrar tekrar (3-5 kez) yıkayın. Bu, enkaz çıkarıldıktan sonra kalabilecek gevşek bir şekilde yapışan vitreusu kaldıracaktır. Odayı nazikçe araştırmak için ince fırçayı kullanın, özellikle siliyer cismin elemanları kalırsa, çevreye yakın bir yerde. Vitreus optik olarak şeffaf iken, fırça lifleri üzerinde bir sürükleme görevi görür ve bu şekilde algılanabilir.
    NOT: Retina üzerindeki ince bir kalıntı vitreus tabakası, retinanın ex vivo olarak izolasyonunu veya tutulmasını olumsuz yönde etkilemiyor gibi görünmemektedir, ancak retina çevresinde, genellikle siliyer cisimden kalan yapılarla ilişkili önemli miktarların varlığı, çıkarılmazsa retina katlanmasına ve numune kaybına neden olabilir.
    1. Önemli vitreus cepleri kalırsa, fırçanın lifleri retinaya temas ederse, bunu sığ bir açıdan yaptıklarından ve vitreusu odadan itmek yerine çekerek fırçayı takip ettiklerinden emin olarak, çevreye doğru hafifçe dışarı doğru süpürerek çıkarmak için fırçayı kullanın.
      NOT: Vitreusun çıkarılması, makroskopik olarak görülemeyebilecek retina hasarını önlemek için özellikle dikkatli kullanım gerektirir; Bu hasarın tanınması ve önlenmesine ilişkin tavsiyeler, Temsili Sonuçların 'Mekanik yaralanmayı tanıma ve sorun giderme' ve 'Metabolik yaralanma' bölümlerinde bulunur.
  8. Vitreus odası kalıntılardan arındırıldıktan ve sadece minimal vitreus kaldıktan sonra, numuneyi açılı forseps ile stabilize etmeye devam ederken dış retinayı göz kabından nazikçe ayırın. Optik sinir kafasına zarar vermekten kaçının ve retinayı sabitlemek için bu yapıyı sağlam bırakın.
    1. Bir çift forseps alın, uçları birbirine değecek şekilde kapalı pozisyonda tutun ve mümkünse önceden var olan bir boşluğu kullanarak retina ve koroid arasına nazikçe yerleştirin. Bu yapılar tamamen ayrılana kadar retina ve koroid arasındaki cebi büyütmek için forsepsin uçları yerine düz kollarını kullanın.
      NOT: Retina ve koroid arasındaki boşluğu genişletmek için uçları itmek yerine yanal hareketleri vurgulayın. Bu hareketler sırasında forsepsleri nazikçe bükmek, forseps ve doku arasındaki sürtünmeden kaynaklanan katıksız stresi azaltırken ayrılmayı iyileştirebilir.
  9. Dış retinayı koroidden ayırdıktan sonra, vizör lastiğini - sklera, koroid vb. - aşağı doğru çekmek için ikinci bir forseps çifti kullanırken numuneyi stabilize etmeye devam edin. Retina başarılı bir şekilde ayrılmışsa, göz kabı tek bir forseps çifti tarafından tutulabilirken, optik sinir başında bağlı olarak yerinde kalmalıdır. Retina vizör lastiği ile aşağı doğru bastırırsa, optik sinir başı dışındaki bağlantı noktalarını nazikçe yoklamaya ve ayırmaya devam edin.
  10. Retina optik sinir kafasına sabitlenmişken, dokuyu hareketsiz hale getirmeye devam edin ve optik sinir başının altındaki göz kabını toplamak için ikinci forseps çiftini kullanın.
    1. Retina ile herhangi bir kalıntı siliyer cisim arasındaki açıda fazla vitreus nedeniyle retina çevresinin hiçbirinin katlanmış pozisyonda kalmadığından emin olmak için kontrol edin. Gerekirse, ek kalıntıları temizlemek için transfer pipetini kullanarak hazneyi PBS ile yıkayın ve dokuyu aşırı çekmemeye dikkat ederek dokuyu açmak ve fazla vitreusu ortadan kaldırmak için fırçayı nazikçe kullanın.
  11. Retina her iki taraftan açıktayken, merkezden yaklaşık 90 mm uzakta durarak, çevreden optik sinir başına doğru düz bir çizgi halinde uzanan, yaklaşık 1° aralıklı bir dizi rahatlatıcı kesim yapmak için yaylı makası kullanın. Bu, retinadaki retinal ganglion hücre aksonlarının transeksiyonunu en aza indirir ve kültürlenmiş eksplantların kalitesini iyileştirir.
  12. Batık dokuyu yerinde tutarken, tabaktan çıkarmadan önce dokudan yanal olarak çekmek için forseps kullanarak laboratuvar mendilini nazikçe çıkarın. Mendile yapışmayı ve olası numune kaybını önlemek için retina ile temastan kaçının.
  13. Ardından, dokuyu tutmaya devam edin ve optik siniri doğrudan retinanın altından kesmek için yaylı makası kullanın, ardından vizör lastiğinin geri kalanını tabaktan çıkarın.
  14. Retina gözün geri kalanından izole edildikten sonra, 35 mm'lik bir Petri kabını PBS ile doldurun ve daha pürüzlü mat tarafı yukarı bakacak şekilde alta bir filtre karesi yerleştirmek için forseps kullanın. Filtrenin retinayı hareket ettirmek için bir substrat olarak kullanılmasını engelleyebileceğinden, filtrenin buruşmasını önlemeye dikkat edin.
  15. Retinayı transfer pipeti ile nazikçe aspire edin ve dikkatlice 35 mm'lik tabağa aktarın. Retinanın iç yüzeyinin dik olduğundan ve dokunun doğrudan filtre karesinin üzerinde durduğundan emin olmak için retinayı fırça ile hareket ettirin.
  16. Retinayı filtrenin üzerine indirmek için PBS'yi transfer pipeti ile tabaktan yavaşça aspire edin. Gerekirse, retina filtreye yerleşene kadar devam etmeden önce dokuyu yeniden ayarlamak için duraklatın.
    NOT: Hızlı aspirasyon, retinanın ani yanal hareketine neden olarak hasara veya doku kaybına neden olabilir. Hasarı önlemek için retinanın tamamı kareye dayanmalıdır; bununla birlikte, retina sorunlu bir konuma yerleşirse, retina yeniden askıya alınana kadar PBS tekrar tabağa eklenebilir ve montaj yeniden denenebilir.
  17. Retina filtreye yerleştikten sonra, katlanmış olabilecek herhangi bir periferik retinayı açmak için fırçayı kullanın. PBS seviyesini, retinanın filtreden kolayca hareket etmemesi için dikkatli bir şekilde dengeleyin, aynı zamanda numunenin kurumaması ve fırçanın iç retinaya zarar vermeden düzgün bir şekilde hareket edebilmesi için yeterli kalıntı kaldığından emin olun.
  18. Retinada kalıntı olup olmadığını bir kez daha kontrol edin. Hasarı önlemek için, PBS'yi dokunun yaklaşık 1 cm yukarısından retinaya damlatmak için transfer pipetini kullanarak retinayı doğrudan tutmadan temizleyin. Bu, kalan kalıntıları temizlemelidir, ancak tabağa çok fazla PBS eklenirse, retina geri yüzebilir. Bu meydana gelirse, dokuyu yeniden monte etmek için tekrar aspirasyon yapın.
    NOT: 'Sahte' numuneler, başka bir yerde açıklandığı gibi fiksasyon, blokaj/geçirgenlik ve antikor boyama için retinaların 24 oyuklu bir plakaya aktarılmasıyla oluşturulabilir21. Bu sahte kontroller, izolasyon sırasında meydana gelebilecek retinadaki mekanik yaralanmaların giderilmesi için kullanışlıdır.

3. Kültür ortamına aktarım ve bakım

  1. Biyogüvenlik kabinine taşımak için 35 mm'lik kabın kapağını kapatın ve retinanın filtreden çıkmasını önlemek için kabı düz tutun. Böyle bir durumda, yukarıdaki gibi yeniden monte edin.
  2. Dezenfekte etmeden veya eldiven değiştirmeden önce kabin içindeki herhangi bir ekipmana veya yüzeye dokunmamaya dikkat ederek, retinayı içeren 35 mm'lik kapalı kabı biyogüvenlik kabinine yerleştirin.
  3. Eldivenleri etanol ile dekontamine edin ve/veya değiştirin, ardından eksplant besiyeri ile önceden yüklenmiş 6 oyuklu plakayı inkübatörden biyogüvenlik kabinine taşıyın. Adım 1.1'de bulunan aletleri kullanarak biyogüvenlik kabini içinde adım 3.4 ve 3.5'i gerçekleştirin.
  4. Retinayı içeren 35 mm'lik çanağın kapağını çıkarın ve retinaya doğrudan dokunmadan filtre karesini dikkatlice kaldırmak için açılı forseps kullanın. 6 oyuklu plakanın kapağını çıkarın ve filtreyi uygun bir kuyu ekinin ortasına yerleştirin, ardından yavaşça ortama indirin. Retina bu adım sırasında filtreden ayrılacak ve hava-sıvı arayüzünün hemen altında yüzecektir.
  5. Retina ve filtre ayrıldıktan sonra, filtreyi yavaşça retinadan uzaklaştırın ve ortamdan çıkarın. 1 mL'lik pipeti kullanarak, retinayı ekin tabanı ile hava-sıvı arayüzü arasına sıkıştırarak düz durmasını sağlamak için ek parçadan 500 μL ortam çıkarın.
  6. Plakanın kapağını yerine takın ve retinayı kuyu merkezine yakın tutmaya dikkat ederek %5 CO2 ile 37 °C'de inkübatöre geri koyun. Tek bir plakada en fazla 6 retina tutulabilir.
    NOT: Eksplantlar 24 saat veya daha az tutulursa, deneyin sonuna kadar inkübatörde bırakılabilirler. Daha uzun süre saklanırsa, in vitro olarak 1 gün sonra ve daha sonraki alternatif günlerde P ortam değişikliği önerilir.

4. İmmün boyama için fiksasyon (isteğe bağlı)

  1. İmmün boyama yapıyorsanız, fiksasyon için aşağıdaki adımlara bakın; İmmün boyama, düz monte edilmiş retinalar21 için daha önce ayrıntılı olarak açıklanan parametreler kullanılarak gerçekleştirilebilirken, ekilen retinanın fiksasyonu özel hususlar gerektirir.
  2. Eksplantlar ve ortam içeren hücre kültürü eklerini 6 oyuklu kültür plakasından çıkarın ve bunları, fiksasyondan sonra düzgün bir şekilde atılabilen gözeneksiz bir yüzeye (kültür plakasının plastik kapağı gibi) yerleştirin, çünkü ekler hafif gözeneklidir ve az miktarda fiksatif bu alttaki yüzeye geçecektir.
  3. Kültür ortamını eklerden nazikçe çıkarın, ardından her birine 1 mL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. Retinaların bir davlumbazda 15 dakika sabitlenmesine izin verin, ardından PFA'yı çıkarın ve kurumsal politikaya göre atın.
    DİKKAT: Paraformaldehit tehlikelidir ve bilinen bir kanserojen olan formaldehitin öncüsüdür. Dikkatli olun ve uygun önlemlerle çeker ocakta sabitleme yapın.
  4. PFA'yı çıkarmak için retinaları PBS ile 3 kez (her biri 5 dakika) yıkayın, ardından PBS'deki retinaları başka bir yerde açıklandığı gibi blokaj, geçirgenlik ve immün boyama için 24 oyuklu bir plakadaki ayrı kuyucuklara aktarmak için modifiye edilmiş bir transfer pipeti kullanın21. PFA ile kontamine olmuş plastikleri (pipet uçları, ekler ve sabitleme sırasında kullanılan gözeneksiz yüzey) kurumsal politikaya göre atın.
    NOT: Transfer pipeti, sabit ve lekeli retinaları montaj ve görüntüleme için bir slayta aktarmak için saklanabilir. PFA ile doğrudan temas etmemiş olması gerekmesine rağmen, canlı ve sabit dokuyu işlemek için farklı transfer pipetlerinin kullanılması önerilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Makroskopik ölçekte, ekilen retinalar hem 1 hem de 3 günlük zaman noktalarında esasen değişmeden kalır, ancak son zamanlarda nispeten kırılgan hale gelirler, bu da fiksasyon veya diğer deneysel son noktalardan önce dikkatli bir şekilde ele alınmasını gerektirir. Retinalar, katlanma olmaksızın (oksijen ve besin maddelerinin difüzyonunda lokalize bozulmaya neden olabilir) nispeten düz olmalı ve hava-sıvı arayüzü ile hücre kültürü eki arasındaki ortamda asılı kalmalıdır. 3. günde, askıdaki dokunun altındaki ekin altında haf...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Retinal eksplantlar gibi organotipik kültür32 yaklaşımları, in vivo çalışmaların yerinde bağlamının çoğunu korurken, hücre kültürünün deneysel esnekliğinden ve hızlı geri dönüş süresinden yararlanır ve bu da onları hücre tipleri arasındaki karmaşık etkileşimleri araştırmak için güçlü bir yol haline getirir. Bu protokolü, gözle ilgili önemli deneyime sahip olabilecek ve sabit bir retinayı manipüle etmekte rahat olabilecek, ancak yeni bir retinayı ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

M.A.M., NIH / NEI R01EY035312, Glokom Araştırma Vakfı Tedavi Katalizörü Ödülü, Melza M. ve Frank Theodore Barr Vakfı, Robert M. Sinskey, MD, Vakıf, Ruettgers Ailesi Yardım Vakfı ve BL Manger Vakfı tarafından desteklenmiştir. P.F.C., NIH/NEI 2T32EY007145 tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda bir NIH Vizyon Araştırması için Çekirdek Hibe P30 EY003176 ile de sağlandı.  Şekil 1 Biorender ile oluşturulmuştur. Yazarlar, el yazması hakkındaki geri bildirimleri için Dr. Nasir Uddin'e ve yardım ve destek için Dr. Qiurong Zhu'ya teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
#11 Neşter bıçaklarıBard-Parker3,71,311
1 mL pipet ('Pipetman P1000')GilsonF144059M
100 mm Petri kabıFalcon351029
%16 ParaformaldehitTed Pella Inc18,505Fiksasyon için %4'e seyreltilmiş
24 KuyuluPlaka Şahin353047Sabitleme, engelleme ve antikor inkübasyonu
35 mm Petri kabıFalcon351008
6 oyuklu plaka ve yerleştirme kitiGreiner bio-one657641
Alexa Fluor 488-Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-545-1521:800 seyreltme
Alexa Fluor 594 Eşek anti-sıçan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe EdilmişInvitrojenA-212091:800 seyreltme
Alexa Fluor 594-F (ab ') 2 Eşek Anti-Fare IgG (H + L)  Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları, Inc.  715-586-1501:800 seyreltme
Alexa Fluor 647-Eşek Anti-Kobay IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 706-605-1481:800 seyreltme
Alexa Fluor 647-F(ab')2 Eşek Anti-Tavuk IgY (IgG) (H + L) Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları, Inc.  703-606-1551:800 seyreltme
Açılı forseps ('5/45')FST / Dumont11251-35
Anti-Brn3a antikoru (fare)ChemiconMAB15851:200 seyreltme
Anti-CD206 antikoru (sıçan)BioradMCA22351:200 seyreltme
Anti-GFAP antikoru (tavuk)Abcamab46741:1000 seyreltme
Anti-Iba1 antikor (tavşan)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation019-197411:500 seyreltme
Anti-Tmem119 antikoru (kobay)Sinaptik Sistemler400 0041:500 seyreltme
B-27, 50xGibco (Thermofisher)17504044
Künt kavisli forseps ('Ekstra İnce Graefe)FST11152-10
Sığır Serumu AlbüminiSigma-AldrichA9647Bloke etme ve antikor inkübasyonu için %1 w/v kullanın
Filtre kiti (0.2 & mikro; m aPES membran, 150 mL Şişe Üstü Filtre) FisherScientificFB12566508
İnce Fırça, Boyut 3/0Princeton Art & Brush Co.06435-1030
GlutaMaxGibco (Thermofisher)35050061
Lab mendilleri (Kim mendilleri) KIMTECH34155
N-2, 100xGibco (Thermofisher)17502048
Neurobazal-A Medium, eksi fenol kırmızısıGibco (Thermofisher)12349015
Normal Eşek SerumuJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 017-000-121Bloke etme ve antikor inkübasyonu için% 10'da kullanın
Penisilin-StreptomisinGibco (Thermofisher),15140122
Pipet Uçları, 1000 ve mikro; LTipOne1126-7810
Yaylı Makas ('Cohan-Vannas')FST15000-11
Steril su ('Dnase, Rnase içermez')Invitrogen10977-015
Steril filtreli PBSGibco10010-023
Düz forseps ('mini')FST / Dumont11200-14
Transfer Pipeti, 5.8 mLfisherscientific13-711-9AMMD
Triton X-100Termo Bilimsel KimyasallarA16046. Blokeetme ve antikor inkübasyonu için% 0.5'te AP kullanımı

Kaynaklar

  1. Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annu Rev Vis Sci. 2, 235-254 (2016).
  2. Alqawlaq, S., Flanagan, J. G., Sivak, J. M. All roads lead to glaucoma: induced retinal injury cascades contribute to a common neurodegenerative outcome. Exp Eye Res. 183, 88-97 (2019).
  3. Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
  4. Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644 (2022).
  5. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  6. Livne-Bar, I., et al. Astrocyte-derived lipoxins A4 and B4 promote neuroprotection from acute and chronic injury. J Clin Invest. 127 (12), 4403-4414 (2017).
  7. Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
  8. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  9. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiol Rev. 98 (1), 239-389 (2018).
  10. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
  11. Tezel, G. Molecular regulation of neuroinflammation in glaucoma: current knowledge and the ongoing search for new treatment targets. Prog Retin Eye Res. 87, 100998(2022).
  12. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
  13. Schlamp, C. L., Li, Y., Dietz, J. A., Janssen, K. T., Nickells, R. W. Progressive ganglion cell loss and optic nerve degeneration in DBA/2J mice is variable and asymmetric. BMC Neurosci. 7, 66(2006).
  14. Paschalis, E. I., et al. Permanent neuroglial remodeling of the retina following infiltration of CSF1R inhibition-resistant peripheral monocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (48), E11359-E11368 (2018).
  15. Rutigliani, C., et al. Widespread retina and optic nerve neuroinflammation in enucleated eyes from glaucoma patients. Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 118(2022).
  16. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  17. Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. J Biol Chem. 292 (21), 8874-8891 (2017).
  18. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Front Cell Neurosci. 12, 242(2018).
  19. Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nat Commun. 11 (1), 1220(2020).
  20. Cullen, P. F., Sun, D. Astrocytes of the eye and optic nerve: heterogeneous populations with unique functions mediate axonal resilience and vulnerability to glaucoma. Front Ophthalmol (Lausanne). 3, 1217137(2023).
  21. Cullen, P. F., Gammerdinger, W. J., Ho Sui, S. J., Mazumder, A. G., Sun, D. Transcriptional profiling of retinal astrocytes identifies a specific marker and points to functional specialization. Glia. 72 (9), 1604-1628 (2024).
  22. Cullen, P. F., Mazumder, A. G., Sun, D., Flanagan, J. G. Rapid isolation of intact retinal astrocytes: a novel approach. Acta Neuropathol Commun. 11 (1), 154(2023).
  23. Li, F., Jiang, D., Samuel, M. A. Microglia in the developing retina. Neural Dev. 14 (1), 12(2019).
  24. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  25. Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (1), 149-170 (2017).
  26. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  27. Tao, C., Zhang, X. Retinal proteoglycans act as cellular receptors for basement membrane assembly to control astrocyte migration and angiogenesis. Cell Rep. 17 (7), 1832-1842 (2016).
  28. Schaeffer, J., Delpech, C., Albert, F., Belin, S., Nawabi, H. Adult mouse retina explants: from ex vivo to in vivo model of central nervous system injuries. Front Mol Neurosci. 13, 599948(2020).
  29. Vagaja, N. N., et al. Changes in murine hyalocytes are valuable early indicators of ocular disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1445-1451 (2012).
  30. Alarautalahti, V., et al. Viability of mouse retinal explant cultures assessed by preservation of functionality and morphology. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (6), 1914-1927 (2019).
  31. Rodrigues, E. B., et al. The use of vital dyes in ocular surgery. Surv Ophthalmol. 54 (5), 576-617 (2009).
  32. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  33. Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
  34. Kinuthia, U. M., Wolf, A., Langmann, T. Microglia and inflammatory responses in diabetic retinopathy. Front Immunol. 11, 564077(2020).
  35. Reboussin, E., et al. Evaluation of neuroprotective and immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells in an ex vivo retinal explant model. J Neuroinflammation. 19 (1), 63(2022).
  36. Do, M. T. H. Melanopsin and the intrinsically photosensitive retinal ganglion cells: biophysics to behavior. Neuron. 104 (2), 205-226 (2019).
  37. Yu, A., et al. Microglia target synaptic sites early during excitatory circuit disassembly in neurodegeneration. iScience. 28 (4), 112201(2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Retinal Eksplant ModeliN roinflamasyon GlokomuRetinal Ganglion H creleriAstrosit Mikrogliamm nofloresan MikroskopiRetinal H cre zolasyonuEx Vivo RetinaGFAP Ekspresyonu
Fare retinasındaki glial etkileşimleri incelemek için bir ex vivo eksplant modeli
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.