Burada, genişletilmiş ex vivo deneyler için retinayı fare gözünden izole etmek için ayrıntılı bir metodoloji sunuyoruz. Bu protokol, retinal glia'yı canlı dokuda yerinde tutmanın sağladığı araştırma yollarından yararlanmak isteyen araştırmacılar için bu teknik olarak zorlu yaklaşımı erişilebilir kılmayı vurgulamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare retinasındaki glial etkileşimleri incelemek için bir ex vivo eksplant modeli
Bu makalede
Özet
Özet
Glia'nın glokomdaki rolü giderek daha belirgin bir araştırma konusudur, ancak bu destek hücrelerinin popülasyonlarının - yani astrositler ve mikroglia'nın - retinal ganglion hücresi sağkalımını nasıl etkilediği hakkında çok şey bilinmemektedir. İn vivo ve in vitro modeller bir dereceye kadar içgörü sağlarken, her iki yaklaşımın da birincisinde periferik immün yanıtın etkisi ve ikincisinde hücre izolasyonu ve kültürünün neden olduğu fizyolojik fonksiyondaki değişiklikler gibi önemli sınırlamaları vardır. Bu kafa karıştırıcı faktörleri en aza indirmek için, astrositlerin, mikrogliaların ve diğer retinal hücre tiplerinin en az 3 günlük periyotlar boyunca yerinde tutulabildiği ve tipik olarak mümkün olandan daha yüksek bir verimde hedefli araştırmayı mümkün kılan bir ex vivo retinal eksplant sistemi geliştirdik. En önemlisi, bu yaklaşım, canlı bir hayvanda zorlayıcı veya uygulanamaz olabilecek metodolojilere oldukça uygundur, ancak sağlam sinir dokusunun yaygın aşağı akış tahlilleriyle uyumlu kalır. Burada, ex vivo retinada glia ve retinal ganglion hücrelerinin geçirdiği değişiklikleri belgeleyen immünofloresan mikroskobunun temsili sonuçları ile birlikte, sağlam retinal eksplantların izolasyonu ve kültürü için uygun bir protokol sunuyoruz.
Giriş
Gözün arkasında bulunan merkezi sinir sisteminin (CNS) bir uzantısı olan ışığa duyarlı retina, görme için gereklidir ancak hem akut yaralanmaya hem de kronik hastalığa karşı savunmasızdır. Diğer CNS bölgelerinde olduğu gibi, yetişkin retinasındaki nöronlar kaybedildiğinde yerine konmaz ve görsel bilgileri toplayan ve beyne ileten retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) glokomda işlev bozukluğuna ve ölüme karşı özellikle savunmasızdır ve bu da geri dönüşü olmayan görme kaybına neden olur 1,2. Glokom, dünya çapında körlüğün önde gelen bir nedenidir3, ancak e....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvanları içeren tüm prosedürler, Schepens Göz Araştırma Enstitüsü'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (Protokol # 2022N000030, 3/4/2025 onayı). Hayvanlar, Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin (ARVO) Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı Bildirimi'ne uygun olarak ele alındı.
NOT: Şekil 1 , enükleasyonlu fare gözünden canlı retinanın izolasyonundaki temel adımları göstermektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Makroskopik ölçekte, ekilen retinalar hem 1 hem de 3 günlük zaman noktalarında esasen değişmeden kalır, ancak son zamanlarda nispeten kırılgan hale gelirler, bu da fiksasyon veya diğer deneysel son noktalardan önce dikkatli bir şekilde ele alınmasını gerektirir. Retinalar, katlanma olmaksızın (oksijen ve besin maddelerinin difüzyonunda lokalize bozulmaya neden olabilir) nispeten düz olmalı ve hava-sıvı arayüzü ile hücre kültürü eki arasındaki ortamda asılı kalmalıdır. 3. günde, askıdaki dokunun altındaki ekin altında haf.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Retinal eksplantlar gibi organotipik kültür32 yaklaşımları, in vivo çalışmaların yerinde bağlamının çoğunu korurken, hücre kültürünün deneysel esnekliğinden ve hızlı geri dönüş süresinden yararlanır ve bu da onları hücre tipleri arasındaki karmaşık etkileşimleri araştırmak için güçlü bir yol haline getirir. Bu protokolü, gözle ilgili önemli deneyime sahip olabilecek ve sabit bir retinayı manipüle etmekte rahat olabilecek, ancak yeni bir retinayı .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
M.A.M., NIH / NEI R01EY035312, Glokom Araştırma Vakfı Tedavi Katalizörü Ödülü, Melza M. ve Frank Theodore Barr Vakfı, Robert M. Sinskey, MD, Vakıf, Ruettgers Ailesi Yardım Vakfı ve BL Manger Vakfı tarafından desteklenmiştir. P.F.C., NIH/NEI 2T32EY007145 tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda bir NIH Vizyon Araştırması için Çekirdek Hibe P30 EY003176 ile de sağlandı. Şekil 1 Biorender ile oluşturulmuştur. Yazarlar, el yazması hakkındaki geri bildirimleri için Dr. Nasir Uddin'e ve yardım ve destek için Dr. Qiurong Zhu'ya teşekkür eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| #11 Neşter bıçakları | Bard-Parker | 3,71,311 | |
| 1 mL pipet ('Pipetman P1000') | Gilson | F144059M | |
| 100 mm Petri kabı | Falcon | 351029 | |
| %16 Paraformaldehit | Ted Pella Inc | 18,505 | Fiksasyon için %4'e seyreltilmiş |
| 24 Kuyulu | Plaka Şahin | 353047 | Sabitleme, engelleme ve antikor inkübasyonu |
| 35 mm Petri kabı | Falcon | 351008 | |
| 6 oyuklu plaka ve yerleştirme kiti | Greiner bio-one | 657641 | |
| Alexa Fluor 488-Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-545-152 | 1:800 seyreltme |
| Alexa Fluor 594 Eşek anti-sıçan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş | Invitrojen | A-21209 | 1:800 seyreltme |
| Alexa Fluor 594-F (ab ') 2 Eşek Anti-Fare IgG (H + L) | Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları, Inc. | 715-586-150 | 1:800 seyreltme |
| Alexa Fluor 647-Eşek Anti-Kobay IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 706-605-148 | 1:800 seyreltme |
| Alexa Fluor 647-F(ab')2 Eşek Anti-Tavuk IgY (IgG) (H + L) | Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları, Inc. | 703-606-155 | 1:800 seyreltme |
| Açılı forseps ('5/45') | FST / Dumont | 11251-35 | |
| Anti-Brn3a antikoru (fare) | Chemicon | MAB1585 | 1:200 seyreltme |
| Anti-CD206 antikoru (sıçan) | Biorad | MCA2235 | 1:200 seyreltme |
| Anti-GFAP antikoru (tavuk) | Abcam | ab4674 | 1:1000 seyreltme |
| Anti-Iba1 antikor (tavşan) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 019-19741 | 1:500 seyreltme |
| Anti-Tmem119 antikoru (kobay) | Sinaptik Sistemler | 400 004 | 1:500 seyreltme |
| B-27, 50x | Gibco (Thermofisher) | 17504044 | |
| Künt kavisli forseps ('Ekstra İnce Graefe) | FST | 11152-10 | |
| Sığır Serumu Albümini | Sigma-Aldrich | A9647 | Bloke etme ve antikor inkübasyonu için %1 w/v kullanın |
| Filtre kiti (0.2 & mikro; m aPES membran, 150 mL Şişe Üstü Filtre) | FisherScientific | FB12566508 | |
| İnce Fırça, Boyut 3/0 | Princeton Art & Brush Co. | 06435-1030 | |
| GlutaMax | Gibco (Thermofisher) | 35050061 | |
| Lab mendilleri (Kim mendilleri) | KIMTECH | 34155 | |
| N-2, 100x | Gibco (Thermofisher) | 17502048 | |
| Neurobazal-A Medium, eksi fenol kırmızısı | Gibco (Thermofisher) | 12349015 | |
| Normal Eşek Serumu | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 017-000-121 | Bloke etme ve antikor inkübasyonu için% 10'da kullanın |
| Penisilin-Streptomisin | Gibco (Thermofisher), | 15140122 | |
| Pipet Uçları, 1000 ve mikro; L | TipOne | 1126-7810 | |
| Yaylı Makas ('Cohan-Vannas') | FST | 15000-11 | |
| Steril su ('Dnase, Rnase içermez') | Invitrogen | 10977-015 | |
| Steril filtreli PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Düz forseps ('mini') | FST / Dumont | 11200-14 | |
| Transfer Pipeti, 5.8 mL | fisherscientific | 13-711-9AMMD | |
| Triton X-100 | Termo Bilimsel Kimyasallar | A16046. Bloke | etme ve antikor inkübasyonu için% 0.5'te AP kullanımı |
Kaynaklar
- Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annu Rev Vis Sci. 2, 235-254 (2016).
- Alqawlaq, S., Flanagan, J. G., Sivak, J. M.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
