Bir Elektrofizyoloji Platformu Kullanarak Retina Dalgalarının Yüksek Yoğunluklu Çok Elektrotlu Dizi Kayıtları

Summary

Yüksek yoğunluklu çoklu elektrot dizileri (HD-MEA'lar), nöral devre gelişiminde çok önemli bir rol oynayan spontan retina dalgalarını incelemek için kullanılır. Bu protokol, fare retina dokusunun hazırlanması ve bir elektrofizyoloji platformunda HD-MEA'lar kullanılarak elektrofizyolojik kayıtların gerçekleştirilmesi için adımları özetlemektedir.

Abstract

Spontan retina dalgaları, gelişim sırasında retina ağı aktivitesinin ayırt edici bir özelliğidir ve aksonların incelmesini, damar sisteminin geçirgenliğini ve nöral devrelerin genel olgunlaşmasını etkileyerek görsel sistemin oluşumunda çok önemli bir rol oynar. Bu dalgalar yaygın olarak, büyük retinal ganglion hücresi (RGC) aktivitesi popülasyonlarının elektrofizyolojik kayıtlarını sağlayan çoklu elektrot dizileri (MEA'lar) kullanılarak ex vivo retinal preparatlarda incelenir. MEA tabanlı elektrofizyoloji, yüksek verimli verileri hızlı bir şekilde toplamak için kullanım kolaylığı nedeniyle güçlü bir araç haline gelmiştir, bu nedenle çeşitli deneysel koşullarda retina aktivitesini incelemek için ideal hale gelmiştir.

Bu protokolde, bir elektrofizyoloji platformunda Yüksek Yoğunluklu MEA (HD-MEA) kullanarak elektrofizyolojik verilerin elde edilmesi için retina dokusunun hazırlanması için kritik adımları özetliyoruz. Süreç, fizyolojik koşullar altında yenidoğan hayvanlardan sağlam retinaların dikkatli bir şekilde izole edilmesiyle başlar. Hazırlandıktan sonra retina, en az 1.000 RGC'den eşzamanlı hücre dışı kayıt yapabilen 26.400 elektrottan oluşan bir ızgaradan oluşan bir HD-MEA çipine dikkatlice monte edilir. Kayıtlar birkaç saate kadar sürebilir. Sonuç olarak, bu metodolojik yaklaşım, retina gelişimi, hastalık ve potansiyel olarak türler arası karşılaştırmalı çalışmaların araştırılmasında değerli uygulamalar sunarak sinirbilim ve görme araştırmalarında daha geniş ilerlemelere katkıda bulunur.

Introduction

Spontan retina dalgaları, görme başlangıcından önce gelişmekte olan retinada gözlenen periyodik ilişkili aktivite patlamalarıdır. Farelerde, retina dalgalarını başlatan ve yayan devreler, gelişim sırasında hızla değişir, embriyonik olarak başlar ve göz açılışında sona erer (doğum sonrası 14^). Retina devreleri geliştikçe, retina dalgalarının uzay-zamansal özellikleri önemli ölçüde değişir ^2,3. Birkaç çalışma, bu spesifik uzay-zamansal özelliklerin görsel sistemin gelişimini yönlendirdiğini desteklemektedir: gözler arasındaki asenkron aktivite, göze özgü ....

Protocol

Bu protokol, Maxwell Biosystems HD-MEA platformunu kullanarak retina dalgalarının MEA kayıtları için yenidoğan farelerden retina dokusunun izole edilmesi ve hazırlanması için adımları özetlemektedir. Prosedür, fizyolojik koşulları korumak, retina dokusunun yapısal olarak sağlam kalmasını, hasarsız kalmasını ve optimal elektrot teması için uygun şekilde hazırlanmasını sağlamak için tasarlanmıştır. Bu deneyler, Vanderbilt Hayvan Bakım ve Kullanım Programı tarafından M2200056-00 protokol numarası altında onaylanmıştır. Fareler (1-2 haftalık, her iki cinsiyet) 12 saatlik gündüz / gece döngüsü vivaryumuna yerleştirildi ve düzenli bir yemek....

Results

HD-MEA'lar ile retina dalgalarının yüksek verimli kayıtları ve analizi
Spontan retinal dalgaların bir saatlik HD-MEA kaydı yapıldı (Şekil 2). Nöronal aktivitenin bir raster grafiği, her noktanın tek bir elektrottan tespit edilen bir aksiyon potansiyelini temsil ettiği retina dalgalarının yapılandırılmış modelini gösterir (Şekil 2A, alt). Elektrotlar arasındaki aktivitenin toplanması, tek bir izle sonuçlanır, bu da 1 saatlik k.......

Discussion

Burada açıklanan protokol, retina dokusunun hazırlanması ve HD-MEA kayıtlarının gerçekleştirilmesi için tekrarlanabilir ve yüksek verimli bir yöntem sağlayarak retina ağ aktivitesini incelemek için sağlam bir yöntem sunar. HD-MEA teknolojisi, özellikle yüksek verimli verilerin yakalanmasında geleneksel elektrofizyolojik ve görüntüleme tekniklerine göre önemli avantajlar sunar. HD-MEA, spontan retina dalga dinamiklerinin gerçek zamanlı, milisaniye ölçeğinde doğruluk kayıtları sunarak hass.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL tek kullanımlık transfer pipeti (ucu kesilmiş)	Fisherbarnd	13-711-9CM	Retinanın petri kapları arasında hareket etmesine yardımcı olur.
Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF)			Retina dokusu için fizyolojik koşulları korur; NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, CaCl2, MgCl2, glikoz ve karbojen ile köpürtülmüş
CaCl2	Fisher Chemicals	C79-500	Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) hazırlamak için)
Karbojen kaynağı (%95 O2, %5 CO2)			aCSF'yi oksijenlendirmek ve doku canlılığını korumak için kullanılır.
Kavisli bıçaklı neşter (#10)	Integra	4-110	Dokuyu hassas bir şekilde kesmek için kullanılır.
Diseksiyon mikroskobu (stereoskop)	Zeiss	Stemi 508	Retina dokusunu görselleştirmek ve işlemek için gereklidir.
glikoz	Fisher Chemicals	BP350-1	Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) hazırlamak içinSıralı
ısıtıcı	Çok Kanallı Sistem	TC02	aCSF'yi 32-34 ° C'ye ısıtır; Optimum koşullar için C.
Ismatec Perfüzyon Sistemi	Ismatec	ISM4208	Oksijenli aCSF'nin sürekli akışını sağlar.
KCl	Fisher Chemicals	P271-500	Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) hazırlamak
içinKH2PO4	Sigma Aldrich	P5504-100g	Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) hazırlamak içinMaxOne
Kayıt Ünitesi	Maxwell Biosystems	MX1-BRD	MaxOne Çip ve Sistem MaxOne Sistemi
	arasındaki arayüz Maxwell Biosystems	MEA tabanlı elektrofizyolojik geri kazanımlar için	MX1-SYS
3 eksenli mikromanipülatöre ve değiştirilebilir uçlara sahip MaxOne Doku Tutucu	Maxwell Biosystems	MX1-HLD	Retinanın MEA çipi üzerine hassas bir şekilde yerleştirilmesini sağlar.
MEA çipi (MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems)	Maxwell Biosystems	MX1-S-CHP	Nöronal aktiviteyi kaydetmek için yüksek yoğunluklu mikroelektrot dizisi.
MgCl2	Fisher Chemicals	M33-500	Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) hazırlamak içinNaCl
	Fisher Chemicals	S271-1	Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) hazırlamak
içinNaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500	Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) hazırlamak içinİğne
(30 G x ½)	BD Biosciences	305106	Korneada kesiler yapılmasına yardımcı olur.
Yenidoğan hayvanlar (P1-P14; fare)Retinal			çalışmalar için kullanılan fareler, sıçanlar veya diğerleri gibi model organizmalar.
MaxLab Live Scope yazılımına sahip	PC HP	Z4	Veri toplama ve kayıtların analizi için kullanılır.
Petri kabı (35 mm veya 60 mm)	Pyrex	3483E12	Diseksiyon için çalışma alanı olarak kullanılır.
Roboz mikro Adson forseps (RS-5232, 4,75" uzunluğunda, 1 x 2 diş, 0,5 mm uç)	Roboz	RS-5232	İnce diseksiyon için özel forseps.
Roboz yaylı makas (RS-5671, 10 mm kesme kenarı, 0,15 mm uç genişliği, 3¾ » toplam uzunluk)	Roboz	RS-5671	Hassas dokuları kesmek için hassas makas.
Tek saç fırçası			Hassas dokuyu işlemek için tek bir saça modifiye edilmiş küçük boya fırçası.
İki ince uçlu forseps	Roboz	RS-5060	Hassas doku işleme için kullanılır.
Whatman filtre kağıtları (# 1), küçük parçalar halinde kesilmiş	GE Healthcare	1001-042	Retina dokusunu işlemek ve kurutmak için kullanılır.