Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Elektroporasyon eşiklerinin miktarının belirlenmesi için yüksek verim yeteneğine sahip üç boyutlu doku modeli

839 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68494

⸱

19 Ağustos 2025

 ,  ,  , 
1North Carolina State University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, elektroporasyon protokollerinin yüksek verimli analizi için üç boyutlu bir doku taklidi içinde transfekte edilmiş hücrelerin uzamsal dağılımını kullanarak tersinir ve tersinmez elektroporasyon eşiklerini ölçmek için hesaplamalı modelleme kullanır.

Özet

Elektroporasyon, yeni nesil profilaktikler ve kanser gibi genetik hastalıkların tedavisini içeren uygulamalarla makromolekül iletimi ve yumuşak doku ablasyonu için elektrik darbelerini kullanan umut verici bir teknolojidir. Bu çalışma, belirli bir elektroporasyon protokolü için tersinir ve tersinmez elektroporasyon eşiklerinin nicelleştirilmesi için yüksek verim yeteneğine sahip bir 3D doku kültürü modelini göstermektedir. Düzgün olmayan bir elektrik alanı kullanarak ve transfekte edilmiş hücrelerin uzamsal dağılımını analiz ederek, tek bir numune içinde hem tersinir hem de tersinmez eşikler tanımlanabilir, bu da özellikle in vivo translasyon için elektroporasyon protokollerinin karakterize edilebileceği verimliliği artırır. Bu yeteneği göstermek için, HEK293 hücreleri içeren 3D doku taklitleri, bir GFP kodlayan plazmid vermek için bir halka ve pim elektrot kullanılarak transfekte edildi. Elektroporasyon eşikleri daha sonra, kesilen numunelerin floresan mikroskopi görüntülerine dayalı olarak türetildi. Bu model, elektroporasyon protokollerinin yüksek verimli değerlendirmesi için bir araç olarak kullanım potansiyelini göstermektedir, bu da zaman yoğun olma eğiliminde olan ve in vivo koşulları daha az temsil eden bu eşikleri değerlendirmek için mevcut yöntemlere göre önemli bir avantajdır.

Giriş

Tersinir elektroporasyon (RE), normalde zar geçirimsiz çeşitli bileşikleri ve molekülleri hücrelere 1,2,3 vermek için iyi bilinen bir metodolojidir. Burada, darbeli elektrik alanları (PEF'ler), hücre zarının bölümleri boyunca geçici, lokalize nanogözenekleri indükleyen kritik bir elektrik alanı yoğunluğu elde etmek için kullanılır. RE, boyalar ve nükleik asitlerden kemoterapötiklere ve diğer ilaçlarakadar çeşitli moleküller ve bileşikler sağlamak için kullanılmıştır 4,5,6,7,8,9,10. Bununla birlikte, elektrik alan yoğunluğu yeterince arttırılırsa, daha yüksek bir kritik eşiği karşılayabilir, bu da hücre canlılığında hızlı bir düşüşe neden olur 1,2,11,12. Bu işlem geri dönüşümsüz elektroporasyon (IRE) olarak bilinir ve başka türlü ameliyat edilemeyen tümörler ve kardiyak aritmiler için bir tedavi de dahil olmak üzere yumuşak doku ablasyonu için incelenmiştir 11,12,13,14,15,16. Tedavi sonuçlarını anlamak ve gelecekteki tedavileri bilgilendirmek için, bu RE ve IRE eşiklerinin ölçülmesi, elektroporasyon araştırmalarında yaygın bir uygulamadır 12,17,18,19,20. Bununla birlikte, RE ve IRE eşikleri, hücre tipi, uygulanan voltaj, darbe süresi, darbe sayısı ve darbe iletim hızı 1,17,18,21,22 dahil olmak üzere birçok faktöre bağlı olarak değişir.

Elektroporasyon protokolleri, çeşitli RE ve IRE eşikleri 1,17,18,21,22 ile sonuçlanan bir dizi parametreye sahiptir. Optimal tedavi voltajları ve dalga formları uzun süredir araştırılmaktadır. Ticari olarak mevcut elektroporasyon teknolojilerinin çoğu, 100 μs-10 ms23 mertebesinde monopolar PEF'lerle protokoller kullanır. Bu protokoller klinik olarak anlamlı sonuçlar elde ederken, in vivo olarak yoğun kas kasılmalarına neden olurlar 24,25,26. Bu nedenle, bu stimülasyonu hafifleten daha kısa, bipolar mikrosaniye darbeleri, son zamanlarda ilgi çeken bir konu haline gelmiştir 1,11,24. Bununla birlikte, bu darbeler, darbe simetrisi, patlama süresi ve sıcaklığa bağımlılık 1,17,22,27 dahil olmak üzere RE ve IRE eşiklerini etkileyen yeni faktörler ortaya çıkarmaktadır. Ek olarak, hücre tipi ve doku özelliklerinin de hem RE hem de IRE sonuçlarını önemli ölçüde etkilediği gösterilmiştir 19,28,29. Alan gelişmeye devam ettikçe, bu faktörlerin ve bunların birbirleriyle ve diğer olası çevresel faktörlerle olan etkileşimlerinin RE ve IRE eşiklerini nasıl etkilediğini daha fazla karakterize etmeye ihtiyaç duyulmaktadır ve bu da daha yüksek verimli deneyler yapabilmek için deneysel verimliliği artırmayı giderek daha gerekli hale getirmektedir.

Tipik in vitro elektroporasyon deneyleri, hücreleri paralel iletken plakalara sahip bir küvette işleyerek protokolleri test eder, bu da tedavi sırasında küvet içinde düzgün bir elektrik alanı dağılımı ile sonuçlanır 19,30,31,32,33,34. Daha önce de belirtildiği gibi, belirli bir tedavi için en uygun uygulanan voltajı belirlemek için bir protokolün RE ve/veya IRE eşiklerini tanımlamak gerekir. Küvet çalışmalarında bunun başarılabilmesi için, her biri ayrı uygulanan voltajlara sahip birden fazla küvetin işlenmesi gerekir. Bu, ayrı ayrı hazırlanması, işlenmesi ve analiz edilmesi gereken önemli sayıda numune gerektirir ve bu da deneysel verimi sınırlar. Bu süreci iyileştirmek için, tekdüze olmayan alan dağılımları oluşturan elektrotlar kullanılarak tek bir numunede alan kuvvetlerinin sürekliliğini değerlendirmek için hem 2D 35,36 hem de 3D 13,20,27,37 kültür modelleri geliştirilmiştir 13,20,27,37,38,39. RE ve IRE eşikleri daha sonra 13,20,27,37,38 elektrik alan dağılımının hesaplama modellerinden türetilir. Bu, gereken numune sayısını büyük ölçüde azaltır ve eşik miktar tayini için daha yüksek verimli bir yaklaşım sağlar.

Bu makale, çeşitli ortamlarda (örneğin, hücre tipleri, tedavi parametreleri, verilecek moleküller) elektroporasyon protokollerinin verimli bir şekilde değerlendirilmesi için bir araç olarak potansiyelini göstermek için bir 3D in vitro modelde RE ve IRE alan ölçümü için bu yaklaşımı göstermeyi amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hücre hazırlığı

  1. Bir biyogüvenlik kabininde, plaka 1 × 105 hücre/mL hücre hattı HEK293, doku kültürü başına 10 mL hacimde, T75 şişesi, %10 (h/h) fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş Eagle's Minimum Esansiyel Besiyerinde bulunur.
  2. HEK293 hücrelerini nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de %5 CO2 ortamında inkübe edin.
  3. Tohumlamadan 2 gün sonra, kültür ortamını çıkararak ve hücreleri 4 mL% 0.25 tripsin-EDTA ile tedavi ederek deneyler için hücreleri hasat edin.
  4. Hücreleri ve tripsini% 5 CO2 ortamı ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 3-5 dakika inkübe edin veya hücreler kültür yüzeyinden ayrılana kadar inkübe edin.
  5. 4 mL kültür ortamı ekleyerek tripsinin enzimatik aktivitesini inaktive edin.
  6. Pelet hücreleri, 180 × g'da 5 dakika santrifüj ederek ve kültür ortamında 8 × 106 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse eder.

2. 3D doku modeli oluşturma

NOT: Karışıma hava kabarcıklarının girmesini önlemek için bu adımlar için ters pipetleme kullanın.

  1. Bir biyogüvenlik kabininde, hazırlanan 8 × 106 hücre/mL hücre süspansiyonunu Tip I Sığır Kollajen Solüsyonu (3 mg/mL) ile 1:1 oranında iyice karıştırın. Karışımla çalışırken erken polimerizasyonu önlemek için buzun üzerine veya soğuk boncuk banyosuna yerleştirin.
  2. 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunun tabanını kaplamak için kombine çözeltiden 500 μL pipetleyin. Çözeltiyi kuyunun ortasına dağıtmaya başlayarak ve ardından yavaşça dışa doğru spiral çizerek jelin tabanı eşit şekilde kapladığından emin olun.
  3. Jelin kenarlarının kuyu duvarlarına temas ettiğinden emin olmak için plakayı hafifçe döndürün.
  4. Jelleri 37 ° C'de% 5 CO2 ortamı ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 6 saat boyunca veya jeller sertleşene ve plakayı eğerken hareket etmeyene kadar inkübe edin.
  5. Kuyucuk plakasını eğin ve tedaviden en az 1 saat önce plakanın duvarından aşağı kaymasına izin vererek her bir oyuğa 500 μL kültür ortamı ekleyin. Jeller, oluşturulduktan sonraki 48 saat içinde tedavi edilmelidir.

3. Elektrot imalatı

  1. İki adet 1.64 mm 304 paslanmaz çelik künt uçlu şırınga iğnesi üzerindeki plastik Luer bağlantısını çıkarın. Pim elektrodu olarak hizmet etmesi için bir iğneyi bir kenara koyun. Diğer iğne için bir ucun son 5 mm'sini düzleştirin.
  2. Kuyu plakasının dibine aynı hizada oturacak kadar uzun olan 19 mm dış çaplı 316 paslanmaz çelik borunun bir bölümünü keserek halka elektrodu oluşturun.
  3. CAD yazılımı ile Şekil 1'de görüldüğü gibi bir elektrot tutucu tasarlayın. Tutucunun pim elektrodu için merkezi bir deliğe, halka elektrot için bir oluğa ve halka elektrodu yerinde tutan bir pres uyumu oluşturmak için düzleştirilmiş iğnenin yerleştirilebilmesi için oluğu kesen bir deliğe sahip olduğundan emin olun.
    1. Ayrıca, tutucunun 12 oyuklu bir plakaya sıkıca oturacak ve halka ve pim elektrotlarını, elektrotlar ve kuyunun tümü koaksiyel38 olacak şekilde kuyu içinde ortalayacak şekilde tasarlanmış bir dudağa sahip olduğundan emin olun.
  4. Yerleşik lazer kesim tekniklerini kullanarak elektrot tutucuyu akrilikten imal edin40.
  5. Halka ve pim elektrotlarını elektrot tutucusuna takarak elektrodu monte edin.
  6. Düzleştirilmiş bir ucu olan iğneyi tutucuya bastırarak halka elektrodu sabitleyin.

4. 3 boyutlu doku modelinin elektroporasyon ile tedavisi

  1. Bir biyogüvenlik kabininde, plakayı eğin ve her bir oyuktan 400 μL kültür ortamı aspire edin. Jel ile temas etmemeye dikkat edin. Jel hidrasyonunu korumak için aspire edilen her kuyuda 100 μL ortam bırakılmalıdır. Aspire edilecek 400 μL'den az sıvı varsa (pipet sıvı bırakmaz/hava çeker), 100 μL kültür ortamı ekleyin.
  2. Bu aspire edilmiş kuyucuklara (kuyu başına toplam 120 μL hacim için) 20 μL 5 μg/μL GFP plazmit çözeltisi ekleyin, plakayı eğerek ve reaktifi her bir kuyucuğun duvarına karşı biriken sıvıya ekleyerek. Jel yüzeyine eşit şekilde yayılmasını sağlamak için hafifçe döndürün.
  3. Jelleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2 ortamında 10 dakika inkübe edin.
  4. Fiber optik sıcaklık probunu pin elektroduna yerleştirin ve sıcaklığı okumaya başlayın.
  5. Elektroporatörün pozitif ucunu pim elektroduna ve negatif ucunu halka elektrodu sabitleyen iğneye bağlayın.
  6. Sıcak plakayı açın ve jelleri 37 ° C'lik bir sıcaklıkta kalacak şekilde ısıtın.
  7. Pimdeki fiber optik sıcaklık problu halka ve pim elektrodunu kuyuya yerleştirin. Pimin plakaya dik olduğundan ve her iki elektrotun da jele tam olarak temas ettiğinden emin olun.
  8. Jelin 37 °C'de olduğundan emin olun.
  9. Elektroporasyon tedavisi uygulayın.
  10. Kuru görünen jellere 100 μL ortam ekleyin.
  11. 4.7-4.10 arasındaki adımları tekrarlayın.
  12. Tüm tedaviler tamamlandıktan sonra, jelleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2 ortamında 10 dakika inkübe edin.
  13. Kuyucuk plakasını eğin ve plakanın duvarından aşağı kaymasına izin vererek her bir oyuğa nazikçe 500 μL kültür ortamı ekleyin.
  14. Jelleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2 ortamı ile 24 saat inkübe edin.

5. Yıkama ve görüntüleme

  1. Plakayı eğin ve kültür ortamını her bir oyuktan aspire edin. Jel ile temas etmemeye dikkat edin.
  2. Plakayı eğin ve plakanın duvarından aşağı kaymasına izin vererek her bir oyuğa yavaşça 500 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
  3. Jelleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2 ortamında 5 dakika inkübe edin.
  4. Plakayı eğin ve PBS'yi her bir kuyudan aspire edin. Jel ile temas etmemeye dikkat edin.
  5. Plakayı eğin ve plakanın duvarından aşağı kaymasına izin vererek her bir oyuğa yavaşça 500 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
  6. Plakayı yavaşça döndürün, eğin ve PBS'yi her bir kuyucuktan aspire edin. Jel ile temas etmemeye dikkat edin.
  7. Görüntüleme için jelleri nemli tutmak için 100 μL taze PBS ekleyin.
  8. Standart floresan mikroskopi teknikleri kullanılarak görüntü plakası. Bu, tersinir ve tersinmez elektrik alan eşiklerinin sırasıyla bölgenin dış ve iç kenarlarını bağladığı belirgin bir yeşil, torus şeklinde bölgeye sahip jellerin görüntülerini vermelidir.
  9. Kuyucuk plakasını eğin ve plakanın duvarından aşağı kaymasına izin vererek her bir oyuğa nazikçe 500 μL kültür ortamı ekleyin.
  10. Jelleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2 ortamı ile 24 saat inkübe edin.
  11. Her zaman noktası için 5.1-5.10 adımlarını tekrarlayın.

6. Hesaplamalı model oluşturma

  1. Bir fizik simülasyon yazılımı açın ve Elektrik Akımları, Katılarda Isı Transferleri ve Elektromanyetik Isıtma fiziğini kullanan yeni bir 2B eksenel simetrik model oluşturun.
  2. Voltaj, ortam sıcaklığı, sıcak plaka sıcaklığı, sıcaklık ayar noktası, darbe iletim hızı, entegre elektrik dozu ve halka ve pim elektrotlarının, jelin ve deney düzeneğinin kuyu plakasının boyutları için parametreler oluşturun.
  3. Şekil 2A'da görüldüğü gibi, halka ve pim elektrotlarının, jelin ve deney düzeneğinin kuyu plakasının radyal bir kesitini temsil eden alan geometrileri oluşturun.
  4. İn vitro deney sırasında kullanılan fiber optik sıcaklık probunu temsil etmek için jel yüksekliğinin yarısına merkezi elektrotun içine bir prob noktası yerleştirin.
  5. Giriş bağımsız değişkeni olarak sıcaklığı kullanan parçalı bir işlev oluşturun.
  6. Fonksiyonu, sıcaklık adım 6.2'de tanımlanan sıcaklık ayar noktası parametresinden düşük olduğunda değeri 1 ve aksi takdirde 0 olacak şekilde tanımlayın.
  7. Pim elektrodunu temsil eden alan geometrisinin en üst yüzeyine bir Voltaj sınır koşulu uygulayın ve voltaj değerini, adım 6.2'de tanımlanan voltaj parametresine, adım 6.4'te oluşturulan prob noktasının sıcaklığında değerlendirilen adım 6.6'daki parçalı fonksiyonla çarparak ayarlayın.
  8. Halka elektrodunu temsil eden etki alanı geometrisinin en üst yüzeyine bir Toprak sınırı koşulu uygulayın.
  9. Kalan tüm etki alanı sınırlarına bir Elektrik Yalıtımı sınır koşulu uygulayın.
  10. Sıcaklığı kullanan sürekli bir fonksiyon oluşturun.
  11. Kollajen jelinin sıcaklığa bağlı iletkenliğinin yerleşik bir modelini27 kullanarak işlevi 0.8277 + 0.0323*T olarak tanımlayın.
  12. Özel bir malzeme tanımlayın ve elektrik iletkenliğini adım 6.11'de tanımlanan sürekli işleve ayarlayın. Bu malzemeyi jel alanına uygulayın.
  13. Pim ve halka elektrot alanlarına sırasıyla 304 ve 316 paslanmaz çelik malzeme ve kuyu plakası alanlarına polistiren atamak için malzemeleri tanımlayın veya varsa yazılım varsayılanlarını kullanın.
  14. Modelin tabanına bir Sıcaklık sınır koşulu uygulayın ve sıcaklık değerini 37 °C'ye ayarlayın.
  15. Başka bir alanla arayüz oluşturmayan diğer tüm etki alanı kenarlarına bir Yüzey Ortam Radyasyonu sınır koşulu uygulayın ve etki alanının plakanın, jelin veya elektrotun bir parçası olmasına bağlı olarak emisyonu sırasıyla 0,97, 0,9 ve 0,075 olarak ayarlayın27.
  16. Modele Ücretsiz Üçgen Ağ ekleyin. Öğe boyutunu Daha İnce olarak ayarlayın.
  17. Çeşitli parametre düzeylerini değerlendiriyorsanız, bir parametrenin değerlendirileceği tüm değerleri listeleyen bir parametrik tarama oluşturun.
  18. Hesaplama düğmesine tıklayarak simülasyonu çalıştırın.
  19. Tamamlandıktan sonra, Sonuçlar bölümünde elektrik alanının 2D-Cutline Grafiğini oluşturun.
  20. Jel alanının ortasından pim elektrotundan halka elektroda geçmek için kesme çizgisini tanımlayın. Bu, pin elektrodunun kenarından halka elektrotun kenarına kadar üstel bir bozulmaya neden olmalıdır.
  21. Bir arama tablosu oluşturmak için çizim verilerini .csv veya .xlsx dosyası olarak dışa aktarın.

7. Eşik türetme

  1. Mikroskobun yazılımını kullanarak, dikey ve yatay eksenler boyunca torus şeklindeki bölgenin dış ve iç kenarlarının çapını ölçün. Yazılım bu yeteneğe sahip değilse, bunu yapmak için ImageJ'yi kullanın.
  2. Sırasıyla dış ve iç çapların ortalamasını alın ve torus şeklindeki bölgenin dış ve iç yarıçaplarını hesaplamak için ikiye bölün. Dış yarıçap RE eşiğini gösterir. İç yarıçap, IRE eşiğini gösterir.
  3. Adım 6.21'de oluşturulan arama tablosunu kullanarak, ölçülen yarıçaplardaki elektrik alan yoğunluğunu türetin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Halka ve pim elektrot, yeşil bir floresan proteini (GFP) kodlayan bir DNA plazmidini, HEK293 hücreleri ile gömülü 3D kollajen doku taklitlerine başarıyla iletti. Şekil 2'de görüldüğü gibi, transfekte edilen bölgenin dış yarıçapı ölçülerek ve deney düzeneğinin hesaplama modelinden karşılık gelen alan yoğunluğunun türetilmesiyle başarılı RE eşik nicelemesi elde edildi. IRE eşiği, benzer şekilde, transfekte edilen bölgenin iç yarıçapı ölçülerek ölçüldü.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yöntemle, tersinir ve tersinmez elektroporasyon eşikleri, ayrı voltajlarda birden fazla numuneyi test etmeye gerek kalmadan tanımlanabilir. Tekdüze olmayan bir elektrik alanının kullanılması, modeldeki transfekte edilmiş hücrelerin uzamsal dağılımına dayalı olarak nicelemeyi mümkün kılar. Bununla birlikte, bu tekdüze olmayan dağılımla ilişkili sınırlamalar vardır. Her şeyden önce, burada açıklanan RE ve IRE eşikleri, sırasıyla başarılı transfeksiyon ve hücre ölümü için eşiklerdir ve b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Kuzey Carolina Eyalet Üniversitesi'nde gerçekleştirildi ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01CA272550) tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0,25 tripsin-EDTAGibco25200056
1000 uL pipet ucuFisher Bilimsel13-811-164
15 mL konik tüpFisher Bilimsel14-959-70C
200 uL pipet ucuFisher Bilimsel13-811-139
304 paslanmaz çelik küt uçlu iğnelerMcMaster Carr'ın fotoğrafı.75165A753
316 Paslanmaz çelik boruMcMaster Carr'ın fotoğrafı.89785K319 Serisi
AkrilikMcMaster Carr'ın fotoğrafı.8505K754 Serisi
Biyogüvenlik KabiniFisher Bilimsel13-261-312
CAD yazılımıDassault SistemleriSolidWorks
MerkezkaçNuaireNU-C200R Serisi
ElektroporatörHbio45-0662Bu çalışmada özel yapım bir cihaz ve bir BTX ECM 830 sistemi kullanılmıştır
EMEMFisher BilimselMT10009CVBu değişebilir  HEK293 dışında bir hücre hattı kullanılıyorsa
Falcon 12-well Şeffaf Düz Tabanlı TC-işlenmiş Multiwell Hücre Kültürü Plakası, KapaklıCorning353043Herhangi bir 12 oyuklu plaka kullanılabilir, elektrot tutucuyu imal ederken kuyu boyutlarının dikkate alındığından emin olun.
FBS'ninFisher BilimselA5670701
Fiber Optik Sıcaklık ProbuMicronor Inc.TS5-20MM-02 Serisi
GFP-PlazmitAldeveron HakkındagWiz-GFP
HEK293 HücreleriATCCCRL-1573 (İngilizce)Diğer hücre hatları kullanılabilir, sadece doğru kültür ortamının kullanıldığından emin olun
Sıcak PlakaTermoelektrik Soğutma Amerika ŞirketiAHP-301CPV
Buz veya Soğutmalı Boncuk BanyosuFisher Bilimsel10-876-001
Görüntü analiz yazılımıLeicaLAS X
KuvözFisher Bilimsel15-015-2633
Ters Floresan MikroskobuLeicaDMi8
Lazer KesiciMcMaster Carr'ın fotoğrafı.7344N11
Penisilin-streptomisinFisher Bilimsel15140122
Pipet KitiFisher Bilimsel14-388-100
Simülasyon YazılımıCOMSOLCOMSOL Çoklu Fizik 6.2
T75 ŞişesiFisher Bilimsel156499
Tip I Sığır Kollajen ÇözeltisiGelişmiş Biyomatris50053 mg/mL

Kaynaklar

  1. Sano, M. B., Fan, R. E., Xing, L. Asymmetric waveforms decrease lethal thresholds in high frequency irreversible electroporation therapies. Sci Rep. 7 (1), 40747(2017).
  2. Batista Napotnik, T., Polajžer, T., Miklavčič, D. Cell death due to electroporation - A review. Bioelectrochem. 141, 107871(2021).
  3. Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavčič, D. Membrane electroporation and electropermeabilization: mechanisms and models. Annu Rev Biophys. 48 (1), 63-91 (2019).
  4. Schipilliti, F. M., et al. Electrochemotherapy for solid tumors: literature review and presentation of a novel endoscopic approach. Radiol Oncol. 56 (3), 285-291 (2022).
  5. Hoejholt, K. L., et al. Calcium electroporation and electrochemotherapy for cancer treatment: importance of cell membrane composition investigated by lipidomics, calorimetry and in vitro efficacy. Sci Rep. 9 (1), 4758(2019).
  6. Gary, E. N., Weiner, D. B. DNA vaccines: Prime time is now. Curr Opin Immunol. 65, 21-27 (2020).
  7. Sachdev, S., Potočnik, T., Rems, L., Miklavčič, D. Revisiting the role of pulsed electric fields in overcoming the barriers to in vivo gene electrotransfer. Bioelectrochem. 144, 107994(2022).
  8. Lambricht, L., et al. Clinical potential of electroporation for gene therapy and DNA vaccine delivery. Expert Opin Drug Deliv. 13 (2), 295-310 (2016).
  9. Gothelf, A., Gehl, J. What you always needed to know about electroporation-based DNA vaccines. Hum Vaccin Immunother. 8 (11), 1694-1702 (2012).
  10. Lin, F., et al. Optimization of electroporation-enhanced intradermal delivery of DNA vaccine using a minimally invasive surface device. Hum Gene Ther Methods. 23 (3), 157-168 (2012).
  11. Sano, M. B., DeWitt, M. R., Teeter, S. D., Xing, L. Optimization of a single insertion electrode array for the creation of clinically relevant ablations using high-frequency irreversible electroporation. Comput Biol Med. 95, 107-117 (2018).
  12. Davalos, R. V., Mir, L. M., Rubinsky, B. Tissue ablation with irreversible electroporation. Ann Biomed Eng. 33 (2), 223-231 (2005).
  13. Ivey, J. W., et al. Targeted cellular ablation based on the morphology of malignant cells. Sci Rep. 5, 17157(2015).
  14. Meijerink, M. R., et al. Irreversible electroporation to treat unresectable colorectal liver metastases (COLDFIRE-2): A phase II, two-center, single-arm clinical trial. Radiology. 299 (2), 470-480 (2021).
  15. Sugrue, A., et al. Irreversible electroporation for catheter-based cardiac ablation: A systematic review of the preclinical experience. J Interv Card Electrophysiol. 55 (3), 251-265 (2019).
  16. Wittkampf, F. H. M., van Es, R., Neven, K. Electroporation and its relevance for cardiac catheter ablation. JACC Clin Electrophysiol. 4 (8), 977-986 (2018).
  17. Fesmire, C. C., Petrella, R. A., Kaufman, J. D., Topasna, N., Sano, M. B. Irreversible electroporation is a thermally mediated ablation modality for pulses on the order of one microsecond. Bioelectrochem. 135, 107544(2020).
  18. Fesmire, C. C., et al. Integrated Time Nanosecond Pulse Irreversible Electroporation (INSPIRE): Assessment of dose, temperature, and voltage on experimental and clinical treatment outcomes. IEEE Trans Biomed Eng. 71 (5), 1511-1520 (2023).
  19. Potočnik, T., Sachdev, S., Polajžer, T., Maček Lebar, A., Miklavčič, D. Efficient gene transfection by electroporation-In vitro and in silico study of pulse parameters. Appl Sci. 12 (16), 8237(2022).
  20. Jacobs IV, E. J., Campelo, S. N., Charlton, A., Altreuter, S., Davalos, R. V. Characterizing reversible, irreversible, and calcium electroporation to generate a burst-dependent dynamic conductivity curve. Bioelectrochem. 155, 108580(2024).
  21. Weaver, J. C., Smith, K. C., Esser, A. T., Son, R. S., Gowrishankar, T. R. A brief overview of electroporation pulse strength-duration space: a region where additional intracellular effects are expected. Bioelectrochem. 87, 236-243 (2012).
  22. Sano, M. B., Arena, C. B., DeWitt, M. R., Saur, D., Davalos, R. V. In-vitro bipolar nano- and microsecond electro-pulse bursts for irreversible electroporation therapies. Bioelectrochem. 100, 69-79 (2014).
  23. Sokołowska, E., Błachnio-Zabielska, A. U. A critical review of electroporation as a plasmid delivery system in mouse skeletal muscle. Int J Mol Sci. 20 (11), 2776(2019).
  24. Mercadal, B., Arena, C. B., Davalos, R. V., Ivorra, A. Avoiding nerve stimulation in irreversible electroporation: a numerical modeling study. Phys Med Biol. 62 (20), 8060-8079 (2017).
  25. Fusco, R., Di Bernardo, E., D'Alessio, V., Salati, S., Cadossi, M. Reduction of muscle contraction and pain in electroporation-based treatments: an overview. World J Clin Oncol. 12 (5), 367-381 (2021).
  26. Cvetkoska, A., Maček-Lebar, A., Trdina, P., Miklavčič, D., Reberšek, M. Muscle contractions and pain sensation accompanying high-frequency electroporation pulses. Sci Rep. 12 (1), 8019(2022).
  27. Fesmire, C. C., et al. Temperature dependence of high frequency irreversible electroporation evaluated in a 3D tumor model. Ann Biomed Eng. 48 (8), 2233-2246 (2020).
  28. Ĉemazˆr, M., et al. Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro. Electro Magnetobiol. 17 (2), 263-272 (1998).
  29. Young, J. L., Dean, D. A. Electroporation-mediated gene delivery. Adv Genet. 89 (1), 49-88 (2015).
  30. Bosnjak, M., Lorente, B. C., Pogacar, Z., Makovsek, V., Cemazar, M. Different incubation times of cells after gene electrotransfer in fetal bovine serum affect cell viability, but not transfection efficiency. J Membr Biol. 247 (5), 421-428 (2014).
  31. Hyder, I., Eghbalsaied, S., Kues, W. A. Systematic optimization of square-wave electroporation conditions for bovine primary fibroblasts. BMC Mol Cell Biol. 21 (1), 9(2020).
  32. Sherba, J. J., et al. The effects of electroporation buffer composition on cell viability and electro-transfection efficiency. Sci Rep. 10 (1), 3053(2020).
  33. Potter, H., Heller, R. Transfection by electroporation. Curr Protoc Mol Biol. 62 (9), Unit 9.3 (2003).
  34. Silve, A., Vezinet, R., Mir, L. M. Nanosecond-duration electric pulse delivery in vitro and in vivo: Experimental considerations. IEEE Trans Instrum Meas. 61 (7), 1945-1954 (2012).
  35. Avazzadeh, S., et al. Establishing electroporation thresholds for targeted cell-specific cardiac ablation in a 2D culture model. J Cardiovasc Electrophysiol. 33 (9), 2050-2061 (2022).
  36. Fiorentzis, M., et al. Conjunctival melanoma and electrochemotherapy: preliminary results using 2D and 3D cell culture models in vitro. Acta Ophthalmol. 97 (4), e632-e640 (2019).
  37. Arena, C. B., Szot, C. S., Garcia, P. A., Rylander, M. N., Davalos, R. V. A three-dimensional in vitro tumor platform for modeling therapeutic irreversible electroporation. Biophys J. 103 (9), 2033-2042 (2012).
  38. Sano, M. B., Fesmire, C. C., DeWitt, M. R., Xing, L. Burst and continuous high frequency irreversible electroporation protocols evaluated in a 3D tumor model. Phys Med Biol. 63 (13), 135022(2018).
  39. Marrero, B., Heller, R. The use of an in vitro 3D melanoma model to predict in vivo plasmid transfection using electroporation. Biomaterials. 33 (10), 3036-3046 (2012).
  40. Berrie, P. G., Birkett, F. N. The drilling and cutting of polymethyl methacrylate (Perspex) by CO2 laser. Opt Lasers Eng. 1 (2), 107-129 (1980).
  41. Gothelf, A., Mir, L. M., Gehl, J. Electrochemotherapy: results of cancer treatment using enhanced delivery of bleomycin by electroporation. Cancer Treat Rev. 29 (5), 371-387 (2003).
  42. Tasu, J. P., Tougeron, D., Rols, M. P. Irreversible electroporation and electrochemotherapy in oncology: state of the art. Diagn Interv Imaging. 103 (11), 499-509 (2022).
  43. Babiuk, S., et al. Electroporation improves the efficacy of DNA vaccines in large animals. Vaccine. 20 (27), 3399-3408 (2002).
  44. Bernelin-Cottet, C., et al. Electroporation of a nanoparticle-associated DNA vaccine induces higher inflammation and immunity compared to its delivery with microneedle patches in pigs. J Control Release. 308, 14-28 (2019).
  45. Jorritsma, S. H. T., Gowans, E. J., Grubor-Bauk, B., Wijesundara, D. K. Delivery methods to increase cellular uptake and immunogenicity of DNA vaccines. Vaccine. 34 (46), 5488-5494 (2016).
  46. Edd, J. F., Horowitz, L., Davalos, R. V., Mir, L. M., Rubinsky, B. In vivo results of a new focal tissue ablation technique: irreversible electroporation. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (7), 1409-1415 (2006).
  47. Williamson, R. H., DeWitt, M. R., Elhanafi, D., Zaharoff, D. A., Sano, M. B. Optimization of bipolar microsecond electric pulses for DNA vaccine delivery. IEEE Trans Biomed Eng. 72 (1), 1-12 (2025).
  48. Vera Tizatl, C. E., Vega López, M. A., Vera Hernández, A., Leija Salas, L. A., Vera Tizatl, A. L. Proceedings of the 2024 Global Medical Engineering Physics Exchanges / Pan American Health Care Exchanges (GMEPE/PAHCE). 1, 1-5 (2024).
  49. Vera-Tizatl, A. L., et al. Liver-tumor mimics as a potential translational framework for planning and testing irreversible electroporation with multiple electrodes. Bioeng Transl Med. 9 (1), e10607(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Yüksek Verimli ModelDoku ElektroporasyonuGeri Dönüşümlü ElektroporasyonGeri Dönüşümsüz ElektroporasyonElektrik Alan DağılımıHEK293 HücreleriFloresan MikroskobiPlazmid Transfeksiyonu
Elektroporasyon eşiklerinin miktarının belirlenmesi için yüksek verim yeteneğine sahip üç boyutlu doku modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.