Elektroporasyon eşiklerinin miktarının belirlenmesi için yüksek verim yeteneğine sahip üç boyutlu doku modeli

Summary

Bu protokol, elektroporasyon protokollerinin yüksek verimli analizi için üç boyutlu bir doku taklidi içinde transfekte edilmiş hücrelerin uzamsal dağılımını kullanarak tersinir ve tersinmez elektroporasyon eşiklerini ölçmek için hesaplamalı modelleme kullanır.

Abstract

Elektroporasyon, yeni nesil profilaktikler ve kanser gibi genetik hastalıkların tedavisini içeren uygulamalarla makromolekül iletimi ve yumuşak doku ablasyonu için elektrik darbelerini kullanan umut verici bir teknolojidir. Bu çalışma, belirli bir elektroporasyon protokolü için tersinir ve tersinmez elektroporasyon eşiklerinin nicelleştirilmesi için yüksek verim yeteneğine sahip bir 3D doku kültürü modelini göstermektedir. Düzgün olmayan bir elektrik alanı kullanarak ve transfekte edilmiş hücrelerin uzamsal dağılımını analiz ederek, tek bir numune içinde hem tersinir hem de tersinmez eşikler tanımlanabilir, bu da özellikle in vivo translasyon için elektroporasyon protokollerinin karakterize edilebileceği verimliliği artırır. Bu yeteneği göstermek için, HEK293 hücreleri içeren 3D doku taklitleri, bir GFP kodlayan plazmid vermek için bir halka ve pim elektrot kullanılarak transfekte edildi. Elektroporasyon eşikleri daha sonra, kesilen numunelerin floresan mikroskopi görüntülerine dayalı olarak türetildi. Bu model, elektroporasyon protokollerinin yüksek verimli değerlendirmesi için bir araç olarak kullanım potansiyelini göstermektedir, bu da zaman yoğun olma eğiliminde olan ve in vivo koşulları daha az temsil eden bu eşikleri değerlendirmek için mevcut yöntemlere göre önemli bir avantajdır.

Introduction

Tersinir elektroporasyon (RE), normalde zar geçirimsiz çeşitli bileşikleri ve molekülleri ^{hücrelere 1,2,3} vermek için iyi bilinen bir metodolojidir. Burada, darbeli elektrik alanları (PEF'ler), hücre zarının bölümleri boyunca geçici, lokalize nanogözenekleri indükleyen kritik bir elektrik alanı yoğunluğu elde etmek için kullanılır. RE, boyalar ve nükleik asitlerden kemoterapötiklere ve diğer ilaçlara^{kadar çeşitli} moleküller ve bileşikler sağlamak için kullanılmıştır 4,5,6,7,8,9,10.

Protocol

Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hücre hazırlığı

1. Bir biyogüvenlik kabininde, plaka 1 × 10⁵ hücre/mL hücre hattı HEK293, doku kültürü başına 10 mL hacimde, T75 şişesi, %10 (h/h) fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş Eagle's Minimum Esansiyel Besiyerinde bulunur.
2. HEK293 hücrelerini nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de %5 CO₂ ortamında inkübe edin.
3. Tohumlamadan 2 gün sonra, kültür ortamını çıkararak ve hücreleri 4 mL% 0.25 tripsin-EDTA ile t....

Results

Halka ve pim elektrot, yeşil bir floresan proteini (GFP) kodlayan bir DNA plazmidini, HEK293 hücreleri ile gömülü 3D kollajen doku taklitlerine başarıyla iletti. Şekil 2'de görüldüğü gibi, transfekte edilen bölgenin dış yarıçapı ölçülerek ve deney düzeneğinin hesaplama modelinden karşılık gelen alan yoğunluğunun türetilmesiyle başarılı RE eşik nicelemesi elde edildi. IRE eşiği, benzer şekilde, transfekte edilen bölgenin iç yarıçapı ölçülerek ölçüldü.

Discussion

Bu yöntemle, tersinir ve tersinmez elektroporasyon eşikleri, ayrı voltajlarda birden fazla numuneyi test etmeye gerek kalmadan tanımlanabilir. Tekdüze olmayan bir elektrik alanının kullanılması, modeldeki transfekte edilmiş hücrelerin uzamsal dağılımına dayalı olarak nicelemeyi mümkün kılar. Bununla birlikte, bu tekdüze olmayan dağılımla ilişkili sınırlamalar vardır. Her şeyden önce, burada açıklanan RE ve IRE eşikleri, sırasıyla başarılı transfeksiyon ve hücre ölümü için eşiklerdir ve b.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
%0,25 tripsin-EDTA	Gibco	25200056
1000 uL pipet ucu	Fisher Bilimsel	13-811-164
15 mL konik tüp	Fisher Bilimsel	14-959-70C
200 uL pipet ucu	Fisher Bilimsel	13-811-139
304 paslanmaz çelik küt uçlu iğneler	McMaster Carr'ın fotoğrafı.	75165A753
316 Paslanmaz çelik boru	McMaster Carr'ın fotoğrafı.	89785K319 Serisi
Akrilik	McMaster Carr'ın fotoğrafı.	8505K754 Serisi
Biyogüvenlik Kabini	Fisher Bilimsel	13-261-312
CAD yazılımı	Dassault Sistemleri	SolidWorks
Merkezkaç	Nuaire	NU-C200R Serisi
Elektroporatör	Hbio	45-0662	Bu çalışmada özel yapım bir cihaz ve bir BTX ECM 830 sistemi kullanılmıştır
EMEM	Fisher Bilimsel	MT10009CV	Bu değişebilir  HEK293 dışında bir hücre hattı kullanılıyorsa
Falcon 12-well Şeffaf Düz Tabanlı TC-işlenmiş Multiwell Hücre Kültürü Plakası, Kapaklı	Corning	353043	Herhangi bir 12 oyuklu plaka kullanılabilir, elektrot tutucuyu imal ederken kuyu boyutlarının dikkate alındığından emin olun.
FBS'nin	Fisher Bilimsel	A5670701
Fiber Optik Sıcaklık Probu	Micronor Inc.	TS5-20MM-02 Serisi
GFP-Plazmit	Aldeveron Hakkında	gWiz-GFP
HEK293 Hücreleri	ATCC	CRL-1573 (İngilizce)	Diğer hücre hatları kullanılabilir, sadece doğru kültür ortamının kullanıldığından emin olun
Sıcak Plaka	Termoelektrik Soğutma Amerika Şirketi	AHP-301CPV
Buz veya Soğutmalı Boncuk Banyosu	Fisher Bilimsel	10-876-001
Görüntü analiz yazılımı	Leica	LAS X
Kuvöz	Fisher Bilimsel	15-015-2633
Ters Floresan Mikroskobu	Leica	DMi8
Lazer Kesici	McMaster Carr'ın fotoğrafı.	7344N11
Penisilin-streptomisin	Fisher Bilimsel	15140122
Pipet Kiti	Fisher Bilimsel	14-388-100
Simülasyon Yazılımı	COMSOL	COMSOL Çoklu Fizik 6.2
T75 Şişesi	Fisher Bilimsel	156499
Tip I Sığır Kollajen Çözeltisi	Gelişmiş Biyomatris	5005	3 mg/mL