NRF2/HO-1 Yolu Aktivasyonu Yoluyla Spontan İntraserebral Kanamayı Takiben RKIP İnhibisyonu ile Nöronal Ferroptoz Zayıflaması

Spontan intraserebral kanama (İSK), intrakraniyal vasküler hasar, nekroz ve damar rüptürüne bağlı kanama ile karakterize, genellikle bazal gangliyonları etkileyen ve hemorajik inmenin önemli bir alt tipini temsil eden serebrovasküler bir durumdur¹. İSK tanısı alan hastalarda ölüm oranı yaklaşık %50'dir ve hayatta kalanların önemli bir kısmı ciddi bağımsızlık kaybı yaşamaktadır². Spontan İSK için mevcut tedavi seçenekleri sınırlıdır ve mevcut tedavilerin mortaliteyi önemli ölçüde azalttığı veya İSK sonrası nörolojik sonuçları önemli ölçüde iyileştirdiği gösterilmemiştir.

Programlanmış hücre ölümünün demire bağımlı bir formu olan ferroptoz, lipid peroksidasyonu, demir iyonlarının birikmesi ve glutatyonun tükenmesi ile tanımlanır ve onu genetik, morfolojik ve biyolojik açıdan diğer programlanmış hücre ölümü formlarından ayırır³. Artan kanıtlar, nöronal ferroptozun ICH patolojisindeki rolünü vurgulamaktadır. Fosfatidiletanolamin bağlayıcı protein 1 (PEBP1) olarak da bilinen Raf kinaz inhibitör proteini (RKIP), nöral gelişimde rol oynar ve ferroptoz^4'ün önemli bir düzenleyicisi olan 15-lipoksijenaz (15LOX) ile bağlanması yoluyla 15LOX/PEBP1 kompleksini oluşturur. Bununla birlikte, spontan ICH'nin ilerlemesi ile bağlantılı ferroptozda RKIP'nin spesifik rolü ve mekanizmaları keşfedilmemiştir.

Bu çalışma, RKIP inhibisyonunun nöronlar üzerindeki anti-ferroptoz etkilerini incelemiş ve RKIP ekspresyonunun inhibisyonunun, potansiyel olarak nükleer faktör E2 ile ilişkili faktör 2/hem oksijenaz-1 (NRF2/HO-1) yolunun aktivasyonu yoluyla ICH'yi takiben nöronal ferroptozu baskılayabileceğini göstermiştir. Bu bulgular İSK patogenezini hedefleyen yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi açısından önemlidir.

PC12 hücrelerinin kültürü
PC12 hücre hattı, standart kültür koşulları (37 °C, %5 CO₂ nemlendirilmiş atmosfer) altında rutin bakım ile %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin içeren Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) büyüme ortamında çoğaltıldı. Deneysel prosedürler için, yapışık hücreler kültür kapları üzerine kaplandı ve birleşen tek tabakalar (yaklaşık %90 yüzey kaplaması) elde edilene kadar çoğalmasına izin verildi. Hücresel ayrışma, %0.25 tripsin-EDTA çözeltisi kullanılarak enzimatik tedavi yoluyla gerçekleştirildi ve ardından popülasyon stabilitesini sağlamak için birbirini takip eden üç alt kültürleme döngüsü yapıldı. İşlenmiş hücreler daha sonra aşağı akış deneysel uygulamaları ve analitik değerlendirmeler için tahsis edildi.

Hücre canlılığı testleri
Test kitinin üreticisi tarafından sağlanan talimatlar izlenerek PC12 hücreleri üzerindeki hemin ve Locostatin'in sitotoksisitesini değerlendirmek için hücre canlılığı değerlendirildi. PC12 hücreleri, 96 oyuklu plakalara homojen bir şekilde ekildi ve 24 saat boyunca hemin veya Locostatin ile kültürlendi. Fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkandıktan sonra hücreler, 37 °C'de 90 dakika boyunca %10 tetrazolyum tuzu çözeltisi içeren RPMI-1640 ortamında inkübe edildi. Optik Yoğunluk (OD) değerleri daha sonra bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm'de ölçüldü.

Kantitatif ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR)
Toplam RNA, RNA ekstraksiyon reaktifi kullanılarak PC12 hücrelerinden ekstrakte edildi. İlk olarak numune, ekstraksiyon reaktifinde homojenize edilerek tam bir lizis sağlandı. Karışıma kloroform ilave edildi, kuvvetlice çalkalandı ve fazları ayırmak için santrifüjlendi (12.000 × g, 15 dakika, 4 °C). RNA'yı içeren sulu faz toplandı ve RNA, izopropanol (sulu faz: iPrOH = 1:1) eklenerek ve oda sıcaklığında inkübe edilerek çökeltildi. RNA'yı peletlemek için santrifüjleme yapıldı (12.000 × g, 10 dakika, 4 °C), safsızlıkları gidermek için 1 mL %70 etanol ilave edildi ve son olarak RNA peleti -80 °C'de saklanmak üzere RNaz içermeyen suda çözüldü. Tamamlayıcı DNA (cDNA) şablonları, RT Master Mix ile ters transkripsiyon yoluyla üretildi. Elde edilen şablonlar daha sonra 1:5 oranında seyreltildi ve gerçek zamanlı bir PCR cihazında kantitatif gerçek zamanlı PCR'ye tabi tutuldu. Her numune üç kopya halinde amplifiye edildi ve PCR ürününün nispi miktarının ortalaması alındı. Kullanılan primerler, temizlik geni olarak hizmet β-aktin ile Tablo 1'de listelenmiştir. Bağıl mRNA konsantrasyonu, E = 2^−ΔΔCt formülü kullanılarak belirlendi ve her reaksiyon için Kritik Eşik Döngüsü (CT) Değeri kaydedildi.

Hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) ve lipid hidroperoksit (LPO) testleri
ROS ve LPO düzeyleri akım sitometrisi kullanılarak ölçüldü. PC12 hücreleri, 24 saat boyunca hemin (80 μM), Locostatin (5 μM) ve ML385 (5 μM) ile muamele edildi ve bulaşıklarda PBS ile 3 kez yıkandı. Hücreler daha sonra 37 °C'de %5 CO ile inkübe edildi 2 2',7'-diklorodihidrofloresein diasetat (DCFH-DA), bir ROS probu ve BODIPY 581/591 C11, bir LPO probu varlığında 40_{dakika boyunca.} Fazla probları çıkarmak için PBS yıkamalarının ardından, floresan yoğunluğu akış sitometrisi ile ölçüldü. Tüm numunelerde tutarlı bir geçit stratejisi uygulandı: ilk olarak, hücreler enkazı dışlamak için FSC-A'ya karşı SSC-A'ya karşı kapılandı, ardından tek hücreler FSC-A'ya karşı FSC-H geçitleme ile seçildi. Boyanmamış hücreler ve tek başına hemin ile muamele edilen hücreler, floresan kompanzasyonunu ve kapılarını oluşturmak için negatif ve pozitif kontroller olarak kullanıldı. Veriler bağlantılı yazılım kullanılarak analiz edildi.

Protein ekstraksiyonu ve western blot
Toplam protein ekstraksiyonu
Tedavi edilen PC12 hücrelerinin süpernatanı atıldı, ardından buz gibi soğuk PBS ile üç yıkama yapıldı. Hücreler tripsin kullanılarak toplandı ve 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjlendi. Süpernatan çıkarıldıktan sonra hücre peleti, %10 proteaz inhibitörü ve %10 fosfataz inhibitörü içeren soğuk Radyo-İmmünopresipitasyon Testi (RIPA) lizis tamponunda homojenize edildi. Buz üzerinde 30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, lizat 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüjlendi. Berrak süpernatan, Yükleme Tamponu (4:1) ile karıştırıldı ve proteinleri denatüre etmek için 95 °C'de 5 dakika ısıtıldı. Protein numuneleri daha sonra kullanılmak üzere -80 °C'de saklandı.

Western blot analizi
Proteinler, bir istifleme jeli ve çözme jeli kullanılarak SDS-PAGE ile ayrıldı ve numuneler kuyucuklara yüklendi. İstifleme jeli için 80 V'ta ve çözme jeli için 120 V'ta elektroforez yapıldı. Proteinler, 1-2 saat boyunca 300 mA'lık sabit bir akımda bir transfer sistemi kullanılarak bir poliviniliden florür (PVDF) membranına (metanol içinde 1 dakika önceden aktive edilmiş) aktarıldı. Membran, spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için oda sıcaklığında 2 saat boyunca TBST'de %5 yağsız süt ile bloke edildi. TBST ile üç yıkamadan sonra (her biri 10 dakika), membran gece boyunca 4 °C'de inkübe edildi ve aşağıdaki birincil antikorlar TBST içinde seyreltildi: Tavşan anti-ACSL4 (1:1.000), Tavşan anti-GPX4 (1:1.000), Tavşan anti-HO-1 (1:2.000), Tavşan anti-NRF2 (1:1.000), Tavşan anti-RKIP (1:1.500) ve Fare anti-β-aktin (1:5.000). Membran 3 x 10 dakika TBST ile yıkandı ve oda sıcaklığında 2 saat HRP konjuge ikincil antikorlarla inkübe edildi: HRP etiketli Keçi Anti-Fare IgG (1:1.000), HRP etiketli Keçi Anti-Tavşan IgG (1:1.000). 3 x 5 dakikalık ek TBST yıkamalarından sonra, protein sinyalleri bir ECL Western Blot Kiti kullanılarak görselleştirildi ve ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü.

İmmünofloresan boyama
Hücreler, kültür plakalarına önceden yerleştirilmiş lameller üzerine ekildi ve yapışmasına izin verildi. Deneysel tedavilerden sonra süpernatan atıldı ve hücreler PBS ile 3 kez yıkandı. Hücreler, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitlendi, ardından üç PBS yıkaması yapıldı. Daha sonra hücreler, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %0.1 Triton X-100 ile geçirgenleştirildi ve 3 kez PBS ile yıkandı. Spesifik olmayan bağlanma, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %3 sığır serum albümini (BSA) ile inkübe edilerek bloke edildi. Birincil antikorlar gece boyunca 4 °C'de uygulandı: Tavşan anti-HO-1 (1:500), Tavşan anti-NRF2 (1:500). Ertesi gün üç PBS yıkamasından sonra hücreler, oda sıcaklığında 1 saat boyunca karanlıkta floresan ikincil antikorlarla inkübe edildi: Alexa Fluor 488 etiketli Keçi Anti-Tavşan IgG (1:500). Son yıkamaların ardından numuneler, nükleer karşı boyama için 4',6-diamidino-2'-fenilindol (DAPI) içeren montaj ortamı ile monte edildi. Görüntüler konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak yakalandı.

İstatistiksel analiz
Ölçüm verileri ortalama ± standart sapma (S.D.) olarak ifade edildi. Analiz için üç bağımsız kopya tahlilinden elde edilen sonuçları temsil eden nicel veriler alındı. İki grup arasındaki karşılaştırmalarda t-testi, çoklu gruplar arasındaki karşılaştırmalarda tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve çoklu karşılaştırmalar için Tukey's post hoc testi uygulanmıştır. P değerinin 0,05 < olması istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Hemin, plazma zarı hasarına neden olabilir, bu nedenle ICH'nin in vitro hücre modellerinin yapımında sıklıkla kullanılır. Bu çalışma, değişen konsantrasyonlarda ve sürelerde hemin tedavisinin PC12 hücre canlılığı üzerindeki etkilerini araştırırken, aynı zamanda western blot analizi yoluyla karşılık gelen deneysel koşullar altında RKIP protein ekspresyon dinamiklerini analiz etti (Şekil 1A). Hücre canlılığı, 60 μM veya daha yüksek hemin konsantrasyonlarında önemli ölçüde azaldı (Şekil 1B) ve bu azalma, artan konsantrasyonlarla doza bağlı bir şekilde meydana geldi. Ayrıca, hemin sitotoksisitesi zamana bağlıydı ve yavaş yavaş azalmadan önce maruziyetin ilk 24 saati içinde zirve yaptı (Şekil 1C). Western blot analizi, RKIP protein ekspresyonunun 80 μM heminde önemli ölçüde yükseldiğini (Şekil 1D,E) ve stimülasyondan 24 saat sonra zirveye ulaştığını gösterdi (Şekil 1F,G). Bu bulgulara dayanarak, altta yatan mekanizmaları ve ilgili sinyal yollarını aydınlatmak için sonraki deneyler için 80 μM hemin ve 24 saatlik bir tedavi süresi seçtik.

RKIP'nin ICH'yi takiben nöronal ferroptozdaki rolünü araştırmak için, RKIP ekspresyonunu inhibe etmek için Locostatin kullandık (Şekil 2A). Locostatin, RKIP'ye bağlanır, RKIP ile hem Raf-1 kinaz hem de GRK2 arasındaki etkileşimleri bozar, böylece inhibitör amaca ulaşmak için RKIP'nin fonksiyonel etkilerini azaltır. Bu çalışmada, ilişkili moleküler mekanizmalarıaraştırmak için bir RKIP inhibitörü olarak Locostatin kullandık 5,6. Locostatin'in sitotoksisitesi ilk olarak canlılık testi kullanılarak 0-40 μM konsantrasyon aralığında değerlendirildi. Sonuçlar, ≤5 μM'de önemli bir sitotoksisite göstermedi ve sonraki deneyler için güvenli bir konsantrasyon aralığı oluşturdu (Şekil 2B). Ayrıca 5 μM Locostatin'in RKIP ekspresyonu üzerindeki inhibitör etkisini western blotlama ve RT-qPCR analizlerini kullanarak doğruladık. Western blot, RKIP protein seviyelerinde anlamlı bir azalma olduğunu gösterirken (Şekil 2C,D), RT-qPCR, RKIP mRNA seviyelerinde azalma gösterdi (Şekil 2E). Bu bulgular, 5 μM Locostatin'in RKIP ekspresyonunu inhibe etmedeki etkinliğini göstermektedir.

Bu çalışmada, RKIP'nin ferroptozdaki düzenleyici işlevini tanımlamak için hemin kaynaklı bir PC12 intraserebral kanama (ICH) hücre modeli geliştirilmiştir. Sonuçlarımız, hemin stimülasyonunun hücre canlılığını azaltırken RKIP ekspresyonunu önemli ölçüde artırdığını gösterdi. Mevcut çalışmalara dayanarak, hemin kaynaklı hücre ölümünün, hücresel bölmelerde patolojik demir birikimi ve yüksek seviyelerde reaktif oksijen türleri (ROS) ile işaretlenmiş demir katalizli bir lipid peroksidasyon süreci olan ferroptoz ile yakından ilişkili olabileceğini tahmin ettik.

RKIP ve ferroptoz arasındaki ilişkiyi daha fazla araştırmak için hemin ile uyarılan PC12 hücrelerini Locostatin ile tedavi ettik. Western blot analizi, ferroptozun önemli bir itici gücü olan asil-CoA sentetaz uzun zincir ailesi 4'ün (ACSL4) ekspresyonunun, hemin ile tedavi edilen grupta önemli ölçüde arttığını ortaya koymuştur (Şekil 3A,B). ACSL4, ferroptozda kritik bir ölüm yanlısı gendir, çoklu doymamış yağ asitlerinin (PUFA'lar) esterifikasyonunu teşvik eder ve böylece ferroptoza karşı hücresel duyarlılığı arttırır. Ek olarak, bir ferroptoz inhibitörü olan glutatyon peroksidaz 4'ün (GPX4) ekspresyonu, hemin ile tedavi edilen grupta önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 3A,C). GPX4, lipid peroksitleri temizleyerek lipid peroksidasyonunu inhibe eden ve böylece hücreleri oksidatif hasardan koruyan önemli bir ferroptoz düzenleyicisidir. Bu sonuçlar, hemin stimülasyonunun PC12 hücrelerinde ferroptozu artırdığını göstermektedir. Bununla birlikte, hemin grubuyla karşılaştırıldığında, RKIP'nin Locostatin ile farmakolojik inhibisyonu bu değişiklikleri tersine çevirdi, bu da RKIP ekspresyonunun baskılanmasının PC12 hücrelerinde ferroptozu inhibe ettiğini gösterdi. mRNA düzeyinde de tutarlı sonuçlar gözlendi (Şekil 3 F,G).

Ayrıca ferroptozla ilişkili yol moleküllerinin ekspresyonunu da araştırdık. NRF2/HO-1 yolunun ferroptozda önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Buna dayanarak, RKIP inhibisyonunun NRF2/HO-1 yolunu aktive ederek nöronal ferroptozu baskılayabileceğini varsaydık. Bu hipotezi test etmek için, önce PC12 hücrelerini hemin ile uyardık ve NRF2 proteininin ekspresyonunun önemli ölçüde arttığını bulduk (Şekil 3A,D), aşağı akış ürünü HO-1'de önemli bir artışla birlikte (Şekil 3A,E). Bu bulgular, hemin kaynaklı ferroptozun, hücreler üzerinde koruyucu bir etki gösteren NRF2/HO-1 yolunu aktive ettiğini göstermektedir. Hücresel antioksidan tepkilerin önemli bir düzenleyicisi olan NRF2, HO-1 gibi aşağı akış hedef genlerinin ekspresyonunu düzenleyerek hücresel antioksidan kapasiteyi arttırır, böylece ferroptozu inhibe eder. Daha sonra, Locostatin tedavisi, hemin ile tedavi edilen gruba kıyasla HO-1 ve NRF2 ekspresyonunu daha da arttırdı (Şekil 3A, D). mRNA seviyesinde de tutarlı sonuçlar gözlendi (Şekil 3I,J), ayrıca RKIP inhibisyonunun NRF2'yi ve aşağı akış molekülü HO-1'i modüle ederek hemin ile uyarılan PC12 hücrelerinde ferroptozu baskıladığını doğruladı.

Özellikle, başka bir ferroptoz inhibitörü olan ferritin ağır zincir 1 (FTH1), hemin stimülasyonu üzerine artan ekspresyon gösterdi ve RKIP inhibe edildiğinde ekspresyonu daha da yükseldi (Şekil 3H). FTH1 , demir depolama ve oksidasyondan sorumlu olan ferritinin önemli bir bileşenidir. Demir iyonlarını daha kararlı bir forma dönüştürerek serbest demirin neden olduğu oksidatif stresi azaltır. Hemin stimülasyonu üzerine FTH1'in yukarı regülasyonu, hücreler oksidatif hasarı önlemek için fazla demiri depolamaya çalıştıklarından, aşırı demir yüküne telafi edici bir yanıtı temsil edebilir. Locostatin tedavisi üzerine FTH1 ekspresyonundaki daha fazla artış, serbest demir seviyelerinin azaldığını ve antioksidan kapasitenin arttığını düşündürür ve RKIP inhibisyonunun PC12 hücrelerinde hemin kaynaklı ferroptozu baskıladığı sonucunu güçlendirir.

PC12 hücrelerindeki ROS ve lipid hidroperoksit (LPO) seviyeleri akış sitometrisi ile değerlendirildi. Hemin tedavisi, Locostatin uygulamasını takiben tersine çevrilen ROS ve LPO seviyelerinde önemli bir artışa yol açtı. Bu bulgu, RKIP'nin inhibe edilmesinin nöronlarda ferroptozu baskılamaya yardımcı olabileceğini göstermektedir (Şekil 4A-D).

Özetle, PC12 hücre canlılığında hemin kaynaklı doz ve zamana bağlı azalmalar, RKIP protein seviyelerinde belirgin bir artışla birlikte görülür. Bu süreç, yüksek ACSL4 seviyeleri ve bastırılmış GPX4 ekspresyonu ile ilişkilendirildi. Eş zamanlı olarak, her ikisi de oksidatif strese ve lipid membran bozulmasına aracılık ederek ferroptozun temel itici güçleri olarak hizmet eden önemli bir oksidatif hasar belirteçleri (ROS ve LPO) birikimi gözlendi. Ayrıca, demir depolama proteini FTH1'in yukarı regülasyonu, aşırı demir yüküne telafi edici bir hücresel yanıt önerdi. Kritik olarak, RKIP'nin Locostatin tarafından farmakolojik inhibisyonu bu değişiklikleri tersine çevirdi ve hemin kaynaklı ferroptozu ortadan kaldırdı (Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4).

Tahlillerden elde edilen sonuçlar, RKIP'nin inhibe edilmesinin nöronal ferroptozu etkili bir şekilde baskıladığını ve NRF2/HO-1 ekspresyonunu düzenlediğini gösterdi. NRF2/HO-1 yolunun ferroptozda önemli bir rol oynadığı göz önüne alındığında, RKIP inhibisyonu ile gözlenen nöronal ferroptozun baskılanmasına bu yolun uyarılması yoluyla aracılık edilebileceği varsayılmıştır. Bu hipotezi test etmek için daha fazla deney yapıldı (Şekil 5A).

Seçici bir NRF2 inhibitörü olan ML385 kullanıldı ve sonuçlar, NRF2 ekspresyonunun hem protein (Şekil 5B,C) hem de mRNA seviyelerinde (Şekil 5E) etkili bir şekilde azaldığını doğruladı. Ek olarak, NRF2'nin bir aşağı akış molekülü olan HO-1'in ekspresyonu değerlendirildi. Bulgular, RKIP inhibisyonunun başlangıçta HO-1 ekspresyonunu arttırırken, NRF2 inhibisyonunu takiben bu etkinin tersine döndüğünü göstermiştir (Şekil 5B,D,F). Bu sonuçlar, RKIP inhibisyonunun NRF2/HO-1 yolunu aktive ederek nöronal ferroptozu zayıflatabileceğini düşündürmektedir. RKIP inhibisyonunu takiben NRF2'nin nükleer translokasyonu gözlendiğinden, immünofloresan boyama bu bulguları daha da destekledi (Şekil 5G-J).

Daha sonra, akış sitometrisi kullanarak PC12 hücrelerindeki ROS ve LPO seviyelerini daha da değerlendirdik. NRF2'nin ML385 ile inhibisyonunun, ROS ve LPO seviyelerinde Locostatin'in neden olduğu azalmayı tersine çevirdiğini bulduk. Bu bulgular, RKIP supresyonunun NRF2/HO-1 yolunu aktive ederek nöronal ferroptozu inhibe edebileceğini düşündürmektedir (Şekil 6A-D).

VERİ KULLANILABİLİRLİĞİ:
Mevcut çalışma sırasında oluşturulan veri kümeleri Ek Dosya 1'e dahil edilmiştir.

Şekil 1: Hemin ile uyarılan PC12 hücreleri tarafından bir in vitro hastalık modelinin oluşturulması.(A) Hemin ile uyarılan PC12 hücre modelinin yapısının şematik gösterimi. (B) Hücresel canlılığı değerlendirmek için hücre canlılığı testi kullanılarak in vitro intraserebral kanama modeli kurulumu için optimal hemin konsantrasyonunun belirlenmesi. (C) Çeşitli zaman noktaları için hemin (80 μM) ile muamele edilmiş PC12 hücreleri ile hücre canlılığı testi. (D,E) Farklı hemin konsantrasyonları (24 saat) ile tedavi edilen PC12 hücrelerinde temsili western blot analizi ve RKIP ekspresyon seviyelerinin kantitatif değerlendirmesi. (F,G) Temsili western blot analizi ve değişen süreler boyunca hemine (80 μM) maruz kalan PC12 hücrelerinde RKIP ekspresyon seviyelerinin kantitatif değerlendirmesi. Tüm veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur (n = 3). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Kısaltmalar: CCK8 = Hücre Sayma Kiti-8; WB = batı lekesi; RKIP = Raf kinaz inhibitörü proteini. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Hemin ile uyarılan PC12 hücrelerinde Locostatin'in RKIP ekspresyonu üzerindeki etkisi.(A) PC12 hücrelerinde Locostatin tedavisi için deneysel prosedürün şematik gösterimi. (B) Farklı Locostatin konsantrasyonları ile muamele edilen PC12 hücrelerinin hücre canlılığı, hücre canlılığı testi kullanılarak değerlendirildi. (C,D) Hemin (80 μM,24 saat) ve/veya lokostatin (5 μM,24 saat) ile tedavi edilen PC12 hücrelerinde RKIP ekspresyonu, temsili lekeler ve istatistiksel analizler gösterilerek western blot ile analiz edildi. (E) Hemin (80 μM,24 saat) ve/veya Locostatin (5 μM,24 saat) ile tedavi edilen PC12 hücrelerinde RKIP mRNA ekspresyonu RT-qPCR kullanılarak ölçüldü. Tüm veriler ortalama ± SD (n=3) olarak sunuldu. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Kısaltmalar: CCK8 = Hücre Sayma Kiti-8; WB = batı lekesi; RT-qPCR = Kantitatif Ters Transkripsiyon-Polimeraz Zincir Reaksiyonu; ROS = Reaktif oksijen türleri; LPO = lipid peroksidasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Hemin stimülasyonunu takiben PC12 hücrelerinde RKIP inhibisyonunun ferroptoz üzerindeki etkisi. (AE) Hemin (80 μM,24 saat) ve/veya Locostatin (5 μM,24 saat) ile tedavi edilen PC12 hücrelerinde ACSL4, GPX4, NRF2 ve HO-1'deki protein ekspresyon değişikliklerinin Western blot analizi. (F-J) Hemin (80 μM,24 saat) ve/veya Locostatin (5 μM,24 saat) ile tedavi edilen PC12 hücrelerinde ACSL4, GPX4, NRF2, HO-1 ve FTH1'in mRNA ekspresyon seviyelerinin RT-qPCR analizi. Tüm veriler ortalama ± SD (n=3) olarak sunuldu. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Kısaltmalar: WB = batı lekesi; RT-qPCR = Kantitatif Ters Transkripsiyon-Polimeraz Zincir Reaksiyonu; RKIP = Raf kinaz inhibitörü proteini; ACSL4 = Asil-CoA sentetaz uzun zincir ailesi 4; GPX4 = Glutatyon peroksidaz 4; NRF2 = Nükleer faktör E2 ile ilgili faktör 2; HO-1 = Hem oksijenaz-1; FTH1 = Ferritin ağır zincir 1. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Hemin stimülasyonunu takiben PC12 hücrelerinde RKIP inhibisyonunun oksidatif stres üzerindeki etkisi. (A,C) Hemin (80 μM,24 saat) ve/veya Locostatin (5 μM,24 saat) ile tedavi edilen PC12 hücrelerinde reaktif oksijen türlerinin üretiminin akış sitometrisi analizi. (B,D) Hemin (80 μM,24 saat) ve/veya Locostatin (5 μM,24 saat) ile tedavi edilen PC12 hücrelerinde lipid peroksidasyonunun akış sitometrisi analizi. Tüm veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur (n = 3). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Kısaltmalar: ROS = Reaktif oksijen türleri; LPO = lipid peroksidasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: RKIP inhibisyonunun aracılık ettiği anti-ferroptotik etkilerde NRF2'nin rolü. (A) PC12 hücrelerinin farklı koşullar altında işlenmesi için deneysel prosedürün şematik gösterimi. (B-D) PC12 hücrelerinde hemin (80 μM, 24 saat) ve/veya Locostatin (5 μM,24 saat) ve/veya ML385 (5 μM, 24 saat) ile farklı tedavi koşulları altında NRF2 ve HO-1'deki protein ekspresyon değişikliklerinin Western blot analizi. (E,F) Hemin (80 μM, 24 saat) ve/veya Locostatin (5 μM, 24 saat) ve/veya ML385 (5 μM, 24 saat) ile tedavi edilen PC12 hücrelerinde NRF2 ve HO-1'in mRNA ekspresyon seviyelerinin RT-qPCR analizi. (G-J) Hemin (80 μM, 24 saat) ve/veya Locostatin (5 μM, 24 saat) ve/veya ML385 (5 μM, 24 saat) ile tedavi edilen PC12 hücrelerinde NRF2 ve HO-1 ekspresyonunun immünofloresan analizi ve ortalama floresan yoğunluğunun ölçülmesi. Ölçek çubukları= 50 μm. Tüm veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur (n = 3). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Kısaltmalar: WB = batı lekesi; RT-qPCR = Kantitatif Ters Transkripsiyon-Polimeraz Zincir Reaksiyonu; IF boyama = İmmünofloresan boyama; NRF2 = Nükleer faktör E2 ile ilgili faktör 2; HO-1 = Hem oksijenaz-1. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: RKIP inhibisyonunun aracılık ettiği oksidatif stresin baskılanmasında NRF2'nin rolü.(A,C) PC12 hücrelerinde hemin (80 μM, 24 saat) ve/veya Locostatin (5 μM, 24 saat) ve/veya ML385 (5 μM, 24 saat) ile reaktif oksijen türlerinin üretiminin akış sitometrisi analizi. (B,D) Hemin (80 μM,24 saat) ve/veya Locostatin (5 μM, 24 saat) ve/veya ML385 (5 μM, 24 saat) ile tedavi edilen PC12 hücrelerinde lipid peroksidasyonunun akış sitometrisi analizi. Tüm veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur (n = 3). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Kısaltmalar: ROS = Reaktif oksijen türleri; LPO = lipid peroksidasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: NRF2/HO-1 yolunu aktive ederek spontan ICH'yi takiben nöronal ferroptozu zayıflatan RKIP inhibisyonunun şematik gösterimi.Bulgularımız, RKIP inhibisyonunun NRF2 nükleer translokasyonunu etkili bir şekilde desteklediğini, lipid ROS birikimini baskıladığını ve sonuç olarak hemin kaynaklı ferroptoz ve oksidatif strese karşı koruduğunu göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Kantitatif ters transkripsiyon-PCR için primerler.

Ek Dosya 1: CCK-8 testleri, Western blot, RT-qPCR ve akış sitometrisi analizleri dahil olmak üzere ilk altı rakamı destekleyen ham ve işlenmiş nicel veriler. Veriler, şekil alt panellerine göre düzenlenir ve istatistiksel analizler için kullanılan tüm yinelenen değerleri içerir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar, bu makalede bildirilen çalışmayı etkilemiş gibi görünebilecek bilinen hiçbir rakip mali çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan ederler.