Multimodal Geniş Alanlı Fourier Dönüşümlü Raman Mikroskobu

Özet

Kompakt ve ultra stabil bir çift kırma interferometresine dayanan geniş alanlı Fourier dönüşümlü mikroskobu, 2D dedektörün tüm pikselleri için paralel spektrum elde edilmesini sağlar. Zaman alanı yaklaşımı, fotolüminesans ve Raman sinyallerinin çözülmesini sağlar ve ~1-μm uzaysal ve ^23-cm-1 spektral çözünürlükle hızlı Raman eşlemesi (~5 ms/piksel) sağlar.

Özet

Raman mikroskobi, bir örneğin kimyasal bileşimini belirlemek için güçlü bir tekniktir. Nokta taramalı frekans alanı algılamaya dayanan son teknoloji spontan Raman mikroskoplarının temel zorluğu, genellikle uzun piksel kalma süreleri (0.1-1 s) nedeniyle büyük alanların Raman haritalarının elde edilmesidir. Burada sunulan geniş alanlı Fourier dönüşümü (FT) mikroskobu, ~1-μm mekânsal ve ~^23-cm-1 spektral çözünürlükte genişletilmiş örneklerin hızlı ölçülmesini sağlar. Ticari bir mikroskobun tespit yolu boyunca eklenen, ultra-stabil ve kompakt ortak yol çift kırma interferometresine dayanır; bu da 2D dedektörün tüm pikselleri için paralel spektrum elde edilmesini sağlar ve ölçüm süresini önemli ölçüde azaltır (10-100 kat daha hızlı). Zaman alanı yaklaşımı, frekans alanı tekniğinin başka bir sınırlamasını da etkili bir şekilde ele alır; bu sınırlama, Raman sinyalinin gömülü olabileceği fotolüminesans arka planından Raman sinyalinin ayrılmasıdır. Bu protokol, yükseltilmiş ticari mikroskopla hiperspektral ölçümlerin nasıl yapılacağını açıklar: aydınlatma şemasının hizası, ölçüm parametreleri seçme kriterleri ve spektrumları almak ve incelemek için veri analizi.

Giriş

Spektral görüntüleme, hem spektral hem de mekansal bilgi sağlayan bir tekniktir ve^{mikroskopi 1'den} uzaktan^{algılama 2'ye} kadar çeşitli alanlarda uygulanmıştır. Multispektral ve hiperspektral görüntüleme, bir 2B sensörün her pikseli için birkaç ayrı spektral bant veya sürekli spektrum kaydedilip edilmediğine göre ayrılır. Raman görüntüleme, spektral görüntülemenin özel bir uygulamasıdır.

Raman saçılma mikroskobi, bir sistemin titreşim frekanslarını ν_R ölçmek için güçlü bir tekniktir. Titreşim modları kimyasal bağlarla ilişkilidir ve bu nedenle Raman spektroskopisi³, biyolojik⁴ ve malzeme^{bilimleri 5'te} örneklerin kimyasal bileşiminin araştırılmasını mümkün kılar. Spontan Raman spektroskopisinde, örnek ν₀ frekansında monokromatik radyasyon ile aydınlatılır; buna pompa denir. Pompa ışığının titreşim modlarıyla etkileşime giren bir kısmı, elastik olmayan saçılmaya maruz kalabilir ve bu da ν_S (ν_AS)=ν₀-(+) ν_R frekanslarında fotonlar oluşabilir; burada _{ν R} örnek içindeki moleküler titreşim frekansıdır. Düşük enerjili saçılmış ışık (ν_S) Stokes radyasyonu olarak adlandırılırken, yüksek enerjili olan (ν_AS) anti-Stokes radyasyonudur. Termal dengede, çoğu molekül daha düşük enerji seviyelerini işgal eder, bu nedenle anti-Stokes bileşenleri Stokes bileşenlerinden önemli ölçüde daha zayıftır. Bu nedenle, Raman saçılma mikroskobu genellikle Stokes fotonlarını tespit eder. Moleküller ve katı maddelerin birden fazla titreşim moduna sahip olduğundan, Raman spektrumu benzersiz bir kimyasal imza oluşturan belirgin bantlarla karakterize edilir ve bu da malzemenin tanımlanması ve analizini mümkün kılar. Bu yaklaşımın temel zorluğu, kendiliğinden Raman saçılmasının son derece düşük kesit alanıdır; 10'dan^{fazla 9-10 12} fotondan sadece biri bu süreci geçirmektedir.

Raman saçılma mikroskobunun standart bir konfigürasyonunda, uyarılma ışığı numunenin bir noktasına sıkıca odaklanır. Elastik olarak saçılan pompa fotonları (genellikle spektral filtrelerle) reddedildikten sonra, kalan ışık toplanır ve frekans alanı spektrometresi (örneğin, dispersif ızgara) ile karakterize edilir; Bu cihazların spektral çözünürlüğü ~0.5-1 ^cm-1'e ulaşabilir. Ölçüm, bir örnekin görüş alanındaki (FOV) her nokta (x,y) için nokta veya raster tarama⁶ adlı bir yöntemle tekrarlanır. Bu yaklaşımın iki ana sorunu vardır: (1) kendiliğinden Raman saçılmasının düşük kesiti genellikle spektrometrenin her pikseli için yeterli foton toplamak için uzun entegrasyon süreleri (0.1-1 s) gerektirir, bu nedenle genişletilmiş bir örnekin Raman haritası uzun ölçüm süreleri gerektirebilir; (2) pompa ışığının uyarması ayrıca fotolüminesansı (PL) oluşturur; bu da spontan Raman sinyali ile örtüşür ve çoğu zaman onu bastırabilir.

Alım hızını artırmak için, pompanın FOV çizgisi boyunca (örneğin x koordinatında) odaklandığı ve toplanan sinyalin (PL veya Raman saçılması) 2D sensörlü bir spektrometre tarafından dağıtıldığı hat tarama⁷ yaklaşımı benimsenebilir; böylece verilen koordinat x için bir eksenin spektrumu, diğerinin ise bir uzamsal koordinat y ile karşılık verdiği 2B bir veri seti oluşur. Buna rağmen, bu uygulama hâlâ spektrometrenin giriş yarığının getirdiği önemli kayıplardan muzdariptir; dar genişliği daha iyi spektral çözünürlük sağlar ancak toplanan ışık miktarını da sınırlar.

Geniş alan konfigürasyonu, ölçüm süresini azaltmak için daha uygun olabilir: bu yöntemle, örnekin büyük bir alanı aydınlatılır ve spektrum aynı anda 2D sensörün tüm pikselleri için elde edilir. Bu durumda, spektral bilgiler tek renkli görüntüleme kamerasının önünde bir bant geçişli^{filtre 8} veya ayarlanabilir spektral filtre⁹ kullanılarak toplanabilir. Ayrıca, bu yöntem frekans-alan yaklaşımına dayanır ve yalnızca ayrık sayıda spektral bant elde eder.

Bir spektrumu ölçmek için alternatif bir yöntem Fourier dönüşümü (FT) yaklaşımıdır. Bu, Wiener-Kintchin'in¹⁰. teoremine dayanan bir zaman alanı tekniğidir; bu teorem, bir sinyalin güç spektral yoğunluğunun zaman otokorelasyonunun Fourier dönüşümü olduğunu belirtir. Optikte ise bu, bir interferometre ile dalga formunun iki geciktirilmiş replikası oluşturularak pratikte elde edilir. Girişimleri, göreli gecikmenin bir fonksiyonu olarak dedektör tarafından ölçülür ve bu da sözde interferogram^11'in ortaya çıkmasına yol açar. FT yaklaşımı, kızılötesi spektral bölgede spektrumları ölçmek için yaygın olarak kullanılır ve burada Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FTIR)¹² olarak adlandırılır. FTIR, orta kızılötesi spektral aralığında (~2.5−25 μm dalga boyu) titreşimsel geçişlerin soğurma spektrumunu ölçmek için rutin olarak kullanılır.

Zaman alanı FT yaklaşımı, geleneksel dağıtıcı spektrometrelere kıyasla bazı avantajlar sunar: yarıkların olmaması nedeniyle daha yüksek veri verimliliği sağlar (Jacquinot'nun etendue avantajı¹²); yalnızca tarama aralığına bağlı esnek spektral çözünürlük sağlar. Ayrıca, geniş alan konfigürasyonları için de uygundur: aslında, 2B dedektör kullanıldığında, yöntem her piksel için paralel olarak bir interferogram ölçüyor ve böylece tüm pikseller boyunca sürekli spektrumların eşzamanlı kaydedilmesini sağlıyor. Öte yandan, FT görüntüleme sistemi iki zorlu şartı karşılamalıdır: (1) iki ışık kopyası arasındaki göreceli gecikme, optik döngünün küçük bir kısmına kadar kontrol edilmelidir; (2) Tek bir pikselde girişimde bulunan ışınlar arasındaki faz kayması, iyi bir tutarlılık ve dolayısıyla yüksek kontrast sağlamak için sınırlandırılmalıdır. Bazı çözümler ortak^{yol 13,14} veya neredeyse¹⁵ interferometrelere dayanarak önerilmiştir, ancak bunlar oldukça zahmetlidir veya spektral çözünürlüğü 100 ^cm-1'den büyüktür.

Bu çalışmada, fotolüminesans ve Raman saçılma görüntülerinin elde edilmesini sağlayan yeni bir geniş alan mikroskobu tanımlanmıştır. Bu sistemin yenilikçi bloğu, Translating-Wedge tabanlı Özdeş darbeler eNcoding Sistemi (TWINS)¹⁶ olarak adlandırılan kompakt ve ultra kararlı ortak yol çift kırılma interferometresidir. Yüzlerce optik döngünün gecikme taramalarını optik döngünün küçük bir kısmı kadar faz doğruluğu ve yüksek kararlılıkla sağlar. İki ışık replikası ortogonal polarizasyonlara sahiptir ve aynı ortak yol boyunca kollinerasyonla ilerler, bu nedenle çift ışınlı interferometrede tipik olan yol uzunluğu dalgalanmalarından etkilenmezler. Şekil 1'in iç kısmında gösterilen şema, ortogonal optik eksenlere sahip iki çift kırma kristal bloğundan oluşur: biri (B₂) sabit uzunlukta, diğeri (B₁) ise ortak hipotenüs yönünde hareket ettirilebilen iki kama ayrılmıştır. Gelen ışık, iki kırılma noktası kristalinin optik ekseni boyunca, P₁ tarafından 45° açıdan polarize edilir; böylece enerjinin yarısı sıradan polarizasyon boyunca, yarısı ise olağanüstü polarizasyon boyunca olur. Bifrringent bloklar boyunca ilerlerken, iki ortogonal bileşen göreceli bir gecikme biriktirir ve bu gecikme, kamanın yerleşimi değiştirilerek B₁ bloğunun toplam kalınlığını ince bir şekilde değiştirerek ayarlanır. İkinci polarizör P₂, alan bileşenlerini ortak bir lineer polarizasyona yansıtarak onları etkileşime geçirir. Replikalar arasındaki gecikme τ, ortak hipotenüs boyunca kama yer değiştirme x olarak (Denklem 1) ile bağlıdır, c, kamaların apeks açısı α Δn=n_{e-n o} normal ve olağanüstü kırılma indekslerinde fark (ikili kırılma). Spektral çözünürlük Δv, tarama aralığı T=| ile ters orantılı olduğundan,T_{2-T 1}|, T 1, T₂ interferogramın başlangıç ve son gecikmesi olduğunda, Raman spektroskopisi için yüksek spektral çözünürlük yüksek bifrringans ve uzun kama çevirmeleri gerektirir. En yaygın çift kırma kristallerinden biri olan YVO₄ (itryum ortovanat), yüksek Δn ve görünür-yakın kızılötesinde şeffaflık aralığı nedeniyle özellikle uygundur. Kama 10° apeks açısıyla tasarlanmıştır; böylece 15,3 mm tarama uzunluğuyla, interferometre 600 nm'de 2500 fs gecikme verebilir ve 23 ^cm-1 spektral çözünürlük elde edebilir, tüm spektral aralıkta (silikon kamera hassasiyeti üst sınırı oluşturur). Bu çalışma, istenen spektral çözünürlüğe ulaşmak ve geniş bant arka planını ele almak, Raman sinyalini fotolüminesanstan ayırmak için interferogram örneklemesinin (yani adım ve tarama aralığı) doğru bir ayarının stratejisini sunacaktır.

Candeo ve ^ark.17 tarafından tanımlandığı gibi, bu çift kırıcı spektrometre, hiperspektral ölçümler yapmak için ticari bir optik mikroskopla eşleştirilebilir. Gereksinimler şunlardır: yeniden yapılandırılabilir optik mikroskop gövdesi, TWINS çift kırıcı interferometre, düşük gürültülü monokrom kamera (örneğin CCD veya sCMOS) ve dar bantlı lazer kaynağı. İkincisi için, Raman ve floresans spektroskopisi için tipik uyarılma dalga boyları 355 nm, 488 nm, 514 nm, 532 nm, 633 nm ve 785 nm'dir. Malzemeler Tablosu'nda listelenen yüksek spektral saflıkta lazerler en iyi seçenek olmasına rağmen, daha geniş çizgi genişliğine, örneğin ~0.1 nm'ye sahip bir lazer da kullanılabilir, çünkü cihazın spektral çözünürlüğü sınırlıdır. Mikroskop, TWINS'in tüp lens ile monokrom dedektör arasındaki tespit yoluna yerleştirilmesiyle yükseltiliyor. Bu konfigürasyon, görüş alanında eşit bir yol gecikmesi ve ortalama %55 kontrast sağlar. Uyarılma yolu, numunenin eşit bir şekilde aydınlatılması sağlamak için tasarlanmıştır: pratikte, büyük çekirdekli çok modlu bir fiberin çıkış ucu örnek düzleminde görüntülenir. Mekanik bir karıştırıcı kullanılarak, modlar lifin çekirdeğinde güçlü şekilde bağlanır ve örnek düzleminde düz bir üst profil oluşturur. Ayrıca, titreşimli bir ses bobini, monokromatik radyasyona özgü olan nokta desenini ortalamaya çıkarır. Bu üst şapka aydınlatmasının bir karakterizasyonu Ek Şekil 1'de gösterilmiştir. Işın, sonsuzluk düzeltilmiş bir nesne ile numuneye odaklanır; bu objektif aynı zamanda geri saçılan Raman ve lüminesans ışığını da tespit yoluna doğru toplar. Aydınlatmayı reddetmek için gereken filtreler detaylandırılacaktır.

Bu hiperspektral mikroskopla geniş ve dar bant spektral özelliklerin nasıl ölçüleceğini göstermek için, hem lüminesans hem de Raman saçılması örnek olarak örnek olarak seçilmiş, örnekleme amaçlı ölçülür. Örnek, bilinen Raman spektrumlarına sahip üç toz pigmentin karışımından oluşur: titanyum beyazının iki polimorfu (TiO₂), yani rutil ve anataz, ve kadmiyum sülfüt sarısı (CdS). Ancak aynı prosedür, malzeme biliminden biyolojiye kadar daha geniş bir uygulama yelpazesinde kullanılabilir.

Bu makalenin kapsamı, hiperspektral ölçüm yapmanın adımlarını göstermek, TWINS interferometresinin montajı ve hizalanması ise Candeo ve ^ark.17 tarafından detaylandırılmıştır. Bu nedenle, ilgilenen bir deneyci bu teknolojiye dayalı önceden monte edilmiş bir interferometreden başlamalıdır.

Protokol, örnek hazırlığı ve mikroskobun Raman saçılma ile PL fotonlarını uyaracak şekilde nasıl ayarlanacağı ile başlar. Daha sonra, tarama parametreleri (tarama süresi, örnekleme adımı) ve erişim parametreleri (pozlama süresi, donanım binelemesi) incelenen sinyalin gereksinimlerine göre ayarlanır. Son olarak, elde edilen zamansal veri setinden (zamansal hiperküp, Şekil 2A) her pikselde spektrumun alınması prosedürünü detaylandıran ve gürültü azaltma ile gelişmiş spektral analiz algoritmalarını özetleyen post-işleme boru hattı sunulacaktır. Tüm iş akışı Şekil 3'te gösterilmiştir.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Numune hazırlama

DIKKAT: Bu hazırlık sırasında lateks eldiven takın çünkü CdS pigmenti özellikle solunduğunda toksiktir.

1. Her pigment tozundan 20 mg hassas bir dengeye bir kazıyıcı kullanarak 1:1:1 ağırlık oranı elde edinin.
   NOT: Her örnek için kazıyıcı ucunu dikkatlice temizleyin, çapraz kontaminasyonu önlemek için.
2. Tozları bir harç ile karıştırarak kümeleri çıkar.
3. Ortaya çıkan karışımı mikroskop slaytına döküm; Kazıyıcı ucunu kullanarak nazikçe bastırın ve katmanın neredeyse eşit bir kalınlığını elde edin.
4. Mikroskop örtüsünün kenarlarına oje uygulayın. Karışımın üzerine yerleştirin, oje aşağıya bakacak şekilde ve yeterince baskı uygulayarak sızdırmazlık sağlanır. Cila sertleşmesi için birkaç saniye kurumasına izin verin.

2. Mikroskop kurulumu

DIKKAT: Lazer açıkken güvenlik gözlüğü takın, çünkü örnek düzleminde elde edilebilecek maksimum güç 300 mW'dır.

NOT: Pompa lazer performansı, veri sayfasında belirtilen sıcaklık aralığında (örneğin, Malzemeler Tablosu'nda belirtilen lazer için 10-40 °C) işletildiği sürece sıcaklık değişimlerinden etkilenmez.

1. TWINS interferometresini mikroskobin algılama yolu boyunca hizala.
   NOT: Candeo ve ^ark.17 tarafından detaylandırıldığı gibi, tüp lens ile dedektör arasına interferometre modülü eklenmelidir; böylece aralarında uygun mesafe sağlanır. Bu çalışmada kullanılan mikroskop için, bu sadece okulluk modülü çıkarıldığında garanti edilir.
2. Koehler aydınlatma şemasını lazer uyarıma uyarlamak için, mikroskobun yerleşik uyarılma lambasını çıkarın ve büyük çekirdekli çok modlu bir fiberin çıkışında ışığı toplamak için mikroskop objektif kullanın.
   NOT: Objektif büyütme, lifin ucu örnek düzlemiyle konjuge edildiğinde aydınlatma deseninin boyutunu belirler. Olası bir seçenek 10x/0.25-0.30 hedeftir.
3. Uyarılma dalga boyuncasını seçin ve uyarılma lazerini büyük çekirdekli çok modlu fiberin girişine odaklayın. Kamerayı aç ve görselleştirme yazılımı çalıştır.
   1. Lifin orta bölümünü ses bobininin titreşimli membranına bağlayın, böylece benek gider. Mekanik olarak fiberi sıkıca bükerek tüm mekansal modlarını birleştirmek için karıştırın. Lazeri aç.
   2. Hizalama için bir test örneği hazırlayın; örneğin, mikroskop kapak üzerindeki floresan kırmızı işaret çizgileri.
   3. Fiber ucu aydınlatma optik sistemine göre konumunu hassas bir çeviri aşamasıyla hareket ettirerek numune düzleminde eşit yoğunlukta ve iyi tanımlanmış kenarlara sahip bir nokta elde edin.
      NOT: Tüm bildirilen ölçümler için 532-nm lazer kullanılır. 400 μm çekirdek boyutunda bir fiberde, noktanın çapı kamera FOV genişliğinin %82'sini kaplar.
4. Uyarılma ve algılama yolları için bir filtre seti kullanın ve aşağıdaki kriterleri benimseyin (Ek Şekil 2):
   1. Lazer hattını temizlemek ve fiberde yayılma nedeniyle doğrusal olmayan genişlemeden kaynaklanan pompa yan bantlarını reddetmek için 532 nm (2.0 nm bant genişliği) içinde dar bir bant geçirici filtre kullanın.
   2. Lazer ışığını numuneye yansıtmak ve objektif tarafından toplanan kırmızıya kaymış geri saçılan radyasyonu iletmek için dikroik bir ayna ( Şekil 1'deki DM) kullanın.
   3. Kalıntı aydınlatma ışığını reddetmek için 532 nm'de uzun geçirici bir filtre ( Şekil 1'de LPF) kullanın.
   4. Raman saçılma ölçümü sırasında, arka plan floresansını bastırmak için 600 nm'de kısa geçişli bir filtre ( Şekil 1'de SPF) kullanın.
5. Örnek düzlemindeki gücü bir güç ölçer ile ölç. Pompa ışınını zayıflatarak numunede hasara yol açmayan bir yoğunluk elde edin (Tablo 1'de bildirildiği gibi 2 W/^cm2 mertebası). Diğer ölçüm parametrelerini ayarlarken lazer için bir perde kullanın.
   NOT: Kendiliğinden Raman saçılmasının düşük kesit oranı nedeniyle, sinyal toplamayı artırmak için yüksek güç yoğunluğu gereklidir. Ancak, örnek hasar eşiği dikkate alınmalıdır. Nokta tarama sistemlerinin aksine, geniş alan sistemi geniş bir alanı aydınlatır, bu da güç tüketimini azaltır ve örnek hasarını önlemek için dikkatli güç yönetimi gerektirir.
6. Örneği mikroskop aşamasına koy ve odaklığı ayarla.
   NOT: Odaklığı kolayca bulmak için, önce örneği iletim veya yansıtma sırasında beyaz bir lambayla aydınlatın. İkinci durumda, mikroskobun yanına yerleştirilen bir ampul kullanılabilir. Örnek odak, pompa lazer ışığı ile optimize edilecektir.

3. Ölçüm parametreleri

1. Kama çevirmesini gerçekleştiren motorun sürücüsünü açın. Donanım bileşenlerini (kamera ve motor) aynı anda kontrol ederek hiperspektral ölçümler yapılabilir (kullanıcı arayüzüne Ek Şekil 3'te gösterilmiştir).
2. Kamera alım parametrelerini, pozlama süresini ve donanım binelemesini sinyal yoğunluğunu optimize etmek için aşağıdaki talimatları uygulayarak ayarlayın:
   1. Zamansal sinyaldeki yüksek sinyal-gürültü oranı (SNR), alınan spektrumda yüksek bir SNR'ye yol açtığından, sensör dinamik aralığını daha iyi dolduran uzun bir pozlama süresi ayrıcalık sağlar.
      NOT: Düşük sinyaller için, Raman saçılmasında olduğu gibi, sinyal seviyesi ile toplam ölçüm süresi arasında bir uzlaşma bulunmalıdır: en uzun pozlama süresi mümkün olmayabilir.
   2. Okumadan önce daha fazla pikselden şarj toplamak için donanım binning'i seçin.
      NOT: Yükü toplap tek bir okuma yapmak, birkaç pikseli okuyup sinyallerini sonradan işlemde toplamaktan daha iyi gürültü performansı sağlar. Binning seçimi aynı zamanda mekansal çözünürlükte kabul edilebilir azalma ile de yönlendirilir.
3. Tarama parametrelerini, toplam tarama süresini ve örnekleme adımını aşağıdaki kriterlere göre seçin:
   1. Raman tepeleri için yüksek spektral çözünürlük elde etmek için, asimetrik uzun kama çevirisi (-2526 fs→ -36 fs) ayarlayın. Öte yandan, sıfır gecikme pozisyonu (-65 fs → 65 fs) etrafında simetrik tarama yaparak PL sinyalinin daha fazla geniş bant spektral özelliklerini elde edin.
   2. Gecikme τ için Denklem 1'i wedge translek x'in fonksiyonu olarak kullanarak, ilgi duyulan spektral bant genişliği için Nyquist sınırını karşılamak için örnekleme adımını seçin.
      NOT: Spektrumun minimum dalga boyu λ_min, (Denklem 2) verilmiştir.
      
      burada ikili kırılma Δn dalga boyuna bağlıdır (bkz. Sellemeier denklemleri).
4. Deliyi açmak için lazerin numuneye parlamasını yapın. Sinyal yoğunluğunda bir azalma gözlemlenirse, örnek sabit bir duruma (genellikle birkaç saniye) ulaşana kadar beklen.
   NOT: Sinyal yoğunluğundaki azalmayı telafi etmek için, iyi bir SNR sağlamak için binning ve pozlama süresini ayarlayın.
5. Her kama pozisyonu için monokrom bir görüntü alınmaya başlayın, yani 2D sensörün her noktasından replikalar arasında zaman gecikmesi var.
   NOT: Edinim yazılımı iki değişkeni kaydetmelidir: zamansal hiperküp (2D görüntü seti) ve tarama sırasında kodlayıcı tarafından kaydedilen motor konumlarının vektörü.
6. Ölçüm bittikten sonra lazeri kapatın ve veri analizine devam edin.

4. Edinilen veri küpünün işlenmesi

1. Edinilen veri setinden spektral hiperküpü şu talimatlara uygun şekilde üretin:
   1. Belirli step motor için motor pozisyon düzeltme dosyasını yükleyin (tartışmaya bakınız).
   2. Belirli interferometrenin frekans kalibrasyon dosyasını, ölçülen uzamsal frekansları (psödo frekansları) gerçek optik frekanslarla ilişkilendirmek için yükleyin (bkz. Tartışma bölümü).
   3. Tüm piksellerin interferogramlarını Fourier dönüştürerek hesaplanacak spektrumlar için frekans aralığını seçin.
   4. Ölçülen interferogramı pencerelendirmek için mevcut apodizasyon^{fonksiyonları 12} arasında, alınan spektrumlarda spektral genişleme ile artefakt indirgemesi arasında iyi bir denge sağlayan olanı seçin; örneğin Happ-Genzel (Hamming) penceresi.
   5. Tüm pikseller için apodize interferogramları Fourier dönüştürerek spektral hiperküp üretin. Karmaşık değerlerde kaydet.
      NOT: FT'den gelen karmaşık spektrum, veri setini gürültüden arındırmak ve seçilmiş piksel kümesinin ortalama spektrumunu çıkarmak için faydalı olacak ek bilgi taşır.
2. Spektral hiperküp hesaplandıktan sonra çeşitli araştırmalar yapın; örneğin, seçilen alanlarda ortalama spektrum elde edin; sahte renkli RGB görüntü üretir; spektral zirveleri haritalama; Arka planı çıkar.
3. Özellikle Raman spektrumlarında önemli zirveleri bastırabilecek spektral gürültüyü azaltmak için, Tekil Değer Ayrıştırmasını (SVD⁾¹⁸ uygulayarak şu adımları takip edin:
   1. Zamansal hiperküpü sıraları boyunca interferogramlarla bir matris A olarak yeniden şekillendirin.
   2. Matrisin SVD'sini gerçekleştirerek U, S ve V matrisleri elde edilir ve A = USV^T olur.
      NOT: U sütunları, V'nin özvektörlerinin (sütunlar) mekansal dağılımlarıdır; S, tekil değerlere (SV) sahip çapraz bir matristir.
   3. U'nun her sütununu piksel matrisine dönüştürün ve uzaysal frekanslarını elde etmek için 2D FT hareketini yapın.
   4. Yüksek frekanslar haritada çok ani değişikliklerle ilişkili olduğundan, bunları gürültü olarak kabul edin; hesaplanan Fourier uzayında merkezli ve düşük (çoğunlukla sinyal) ve yüksek (çoğunlukla gürültü) frekansları ayıran kare bir bölge tanımlar.
      NOT: Bu alan için olası bir seçim, Fourier uzay boyutuna göre 1/4 kenar olmaktır.
   5. Her SV için uzamsal sinyal oranını (SSR) sınır içindeki piksel yoğunluklarının (kompleks modül) toplamını, sınır dışındaki yoğunlukların toplamına bölerek hesaplayın. SSR'yi SV sayısının bir fonksiyonu olarak çizin.
   6. SSR için bir eşik tanımlayın; yani veri setindeki gürültü katkısını azaltmak ve artefaktlardan kaçınmak için tutulması gereken önemli SV sayısı.
      NOT: SSR genellikle tekil değerlerin sayısı arttıkça bir platoya dönüşen azalma eğilimi gösterir. Genel kural, plato başladığı noktaya kadar tekil değerleri korumaktır.
   7. Tüm alt SV'leri diyagonal matriks S'de sıfıra ayarlayın, S_{gürültüden arındırılmış} elde edin ve bir ses dengesi almış zamansal hiperküpü US_{denoizasyonlu} V^T olarak hesaplayın.
      NOT: SVD, yeniden şekillendirilmiş spektral hiperküpe (sıralar interferogram yerine spektrum içerir) de uygulanabilen bir matris çarpanlaştırmadır.
4. Spektrumları almak için sessizleştirilmiş zamansal hiperküp ile 4.1-4.2. adımları tekrarlayın.
5. Programı Referans^19'daki bağlantıdan indirerek veri setinin daha derin analizini Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Square (MCR-ALS) algoritması ile gerçekleştirin.
   NOT: Yazılım geliştiricileri algoritmanın ayrıntılı bir^{açıklamasını sunar 20}. Karışım analizi problemini çözmek için yinelemeli bir yöntemdir: her spektrum, saf spektral profillerin doğrusal kombinasyonu olarak ifade edilir. Matris temsili ile: B = C R^T+E, burada B veri seti, C her spektrum için konsantrasyonları içerir, R sütunları bileşenlerin referans spektrumlarıdır ve E hatayı ifade eder.
   1. Spektral hiperküpü N_piksel x N_frekans matrisine dönüştürün; toplam piksel sayısı N piksel ve N_frekans vektörü uzunluğu ile N_piksel sayısı vardır.
   2. Örnekte beklenen tür sayısını seçin ve referans spektrumlarını yükleyin.
      NOT: Referans spektrumları her pigment için ayrı ayrı ölçülebilir. Aksi takdirde, program veri setinin SVD'sini oluşturur ve ilk tahminler için seçilen bileşenler kadar çok ana bileşen kullanır.
   3. Kısıtlamaları seç: alınan spektral profiller negatif olmayan ve referans spektrumlara mümkün olduğunca benzer olmalıdır.
   4. Her tür için konsantrasyon haritasını (C'nin yeniden şekillendirilmiş sütunları) ve spektrumları (R sütunları) çizin.
   5. Bu haritaları dışa aktarın ve yanlış renkli bir görüntü oluşturmak için kullanın (Şekil 4A), böylece analiz sona erer.
      NOT: Burada sunulan sonuçların elde edilmesinde kullanılan programlar kamuya açık değildir, ancak yazarlardan talep üzerine alınabilir.

Sonuçlar

Şekil 4A, toz karışımının seçilmiş bir bölgesi için Raman haritasını gösterir. Bu, MCR-ALS ile elde edilen bolluk haritalarının sahte renk temsilidir ve adım 4.5'te açıklanmıştır. Örnek bileşimi hakkında bilgi sağlar, çünkü üç tür FOV içinde net bir şekilde ayırt edilebilir. Şekil 4B, haritanın seçilen bölgelerindeki ortalama spektrumları gösterir; seçilen tarama uzunluğuyla tanımlanan 23 ^cm-1 spektral çözünürlük vard...

Tartışma

Kendiliğinden Raman saçılma ve lüminesans görüntülerinin elde edilmesi için geniş alanlı FT multimodal mikroskobu tanıtılmıştır ve malzeme bilimine uygulanabilir. Biyolojik örneklere uygulanabilirliği, Candeo ve ^ark.17 tarafından gösterilmiştir; bu kişiler, boyalı insan hücrelerinin hiperspektral floresans görüntüsü sunmaktadır. Bu alandaki Raman saçılma ölçümlerinin temel zorluğu, geniş aydınlatılan bir alandan verimsiz ısı dağılımı sonucu oluşan fotohasarı önlem...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anatase	Kronos	1200	Beyaz TiO2 pigment polimorfu
Kadmiyum sülfür tozu	Kremer Pigmente GmbH & Co.	21060	Kadmiyum sarısı, renk indeksi koyu/PY35
Kamera	Andor	Luca R	1004x1002 piksel 8µ ile elektron çarpan CCD kamera; M x 8&Micro; m
Temizlik filtresi	Semrock	LL01-532-12.5	Ø 1/2" 2.0 nm- 532 nm'de FWHM lazer çizgisi filtresi
Kapak Slipleri	BRAND GmbH & Şirket	4700 55	Borosilikat cam 22x22x0.15 mm mikroskop kapak kapakları
Dikroik ayna	Semrock	Di02-R532-25x36	532 nm'de 25,2x35,6 mm tek kenarlı lazer dikroik ışınayıcı
Fiber	Thorlabs	M74L05	400µ m-core boyutu, NA 0.39 çok modlu fiber
Lazer	Hubner Fotonik	Cobolt Samba 1000	532 nm'de CW diyotlu pompalı lazer, maksimum güç 1000 mW
Uzun geçişli filtre	Semrock	LP03-532RU-25	532 nm'de ultra dik uzun geçişli kenar filtresi
Mikroskop	Leica	DMRBE	Trinoküler araştırma mikroskobu
Amaç	Leica	PL-FLUOTAR, 10x/0.30	10x büyütme ile uyarılma ve toplama hedefi, 0.3 NA
Amaç	Newport	M-10X	Objektif lens aydınlatma yolunda, 10x büyütme, 0.25 NA ile
Rutile	Kronos	2900	Beyaz TiO2 pigment polimorfu
Kısa geçişli filtre	Thorlabs	FESH600	Ø 25,0 mm kısa geçişli filtre, kesme dalga boyu 600
Slaytlar	Marienfeld	1000612	76x26x1 mm mikroskop slaytları