Yöntem makalesi

Drosophila melanogaster'de Lokomotor Disfonksiyonun Nörotoksisite için Bir Okuma Olarak Davranışsal Analizi

DOI:

10.3791/68517

⸱

18 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  , 
1Center of Biotechnology of Azores (CBA), University of the Azores, 2Mesosystem Investigação & Investimentos by Spinpark

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, geleneksel memeli modellerine bir alternatif olarak lokomotor disfonksiyonun nicelleştirilmesi yoluyla meyve sineğindeki nörotoksisiteyi değerlendirmek için yüksek verimli, uygun maliyetli bir yöntem sunar. Farmasötik bileşiklerin, çevresel ajanların veya genetik modifikasyonların nörotoksik etkilerini hassas, tekrarlanabilir ve etik açıdan uygun bir model kullanarak değerlendirmeyi amaçlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, lokomotor disfonksiyonu ölçerek meyve sineğinde (Drosophila melanogaster) nörotoksisiteyi değerlendirmek için yüksek verimli, uygun maliyetli bir yöntem sunar. Geleneksel memeli modelleri, etkili olmakla birlikte, kaynak yoğun ve etik olarak kısıtlıdır, bu da alternatif in vivo modellere olan ihtiyacı vurgulamaktadır. Mevcut yaklaşım, bireysel sineklerdeki motor bozuklukları yakalamak için klasik tırmanma testini gerçek zamanlı izleme platformuyla bütünleştirir. Bu birleşik sistem, nörotoksikolojik tarama için ölçeklenebilir bir strateji sağlayarak hassasiyeti, otomasyonu ve tekrarlanabilirliği artırır. Kritik prosedür adımları, standartlaştırılmış yetiştirme koşullarını, sinek ölümlerini veya davranış değişikliklerini en aza indirmek için dikkatli anestezi ve kullanımı ve sistemin uygun kalibrasyonunu içerir. Mikrokapiler bazlı besleme, lokomotor analizi tamamlayarak ve gerektiğinde bileşik alımının değerlendirilmesine izin vererek, yutma miktar tayininin isteğe bağlı entegrasyonunu sağlar. Yöntem, gerçek zamanlı ve uzun vadeli davranışsal izlemeyi destekler, gözlemci yanlılığını azaltır ve deneyi kesintiye uğratmadan günlük ilerleme değerlendirmesini sağlar. Işık tercihi testi, doğrudan ölçümler kullanılarak dahil edilebilir. Platform, davranışsal çözünürlük, verim ve veri tutarlılığında önemli avantajlar sağlar. Bazı alternatif sistemlerde bulunan gerçek zamanlı floresan yeteneklerinden yoksun olmasına rağmen, büyük ölçekli davranışsal tarama için oldukça etkili olmaya devam etmektedir. Bu protokol, farmasötik bileşiklerin, çevresel ajanların veya genetik modifikasyonların nörotoksik etkilerini hassas, tekrarlanabilir ve etik açıdan uygun bir in vivo model kullanarak değerlendirmeyi amaçlayan laboratuvarlar için özellikle değerlidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nörotoksisitenin değerlendirilmesi, çevresel ve farmasötik bileşiklerin gelişmekte olan sinir sistemi üzerindeki potansiyel olumsuz etkilerini değerlendirmek için kritik öneme sahiptir1. Geleneksel nörotoksisite testi, pahalı, zaman alıcı ve etik olarak kısıtlı olan kemirgenler gibi memeli modellerine dayanır2. Sonuç olarak, nörotoksik maddelerin hızlı, yüksek verimli taramasını sağlayan alternatif modeller gereklidir3. Araştırmalar, meyve sineğinin iyi karakterize edilmiş genetiği, korunmuş nörogelişimsel yolları ve kısa bir yaşam döngüsünedeniyle nörotoksisiteyi incelemek için güçlü bir model organizma olarak ortaya çıktığını vurgulamaktadır 4,5. Davranışsal uç noktalar arasında, motor disfonksiyon, nörogelişimsel bozukluğun hassas ve ölçülebilir bir biyobelirteç olarak hizmet eder ve insan nörolojik bozuklukları ile ilişkili olabilecek nörotoksik etkilerin erken tespitine olanak tanır6.

Sineklerde yapılan lokomotor deneyler, ölçülebilir bir nörotoksisite ölçüsü sağlar ve doz-yanıt değerlendirmelerini mümkün kılar, bu da onları insan nörotoksisite riskinin azaltılması için uygun hale getirir7. Negatif jeotaksi testi (tırmanma), sineklerin bir şişenin dibine vurulduktan sonra içgüdüsel olarak tırmandığı, motor gelişim, koordinasyon ve denge seviyelerini yansıtan yaygın olarak kullanılan bir yaklaşımdır 8,9. Bu yöntem basit, uygun maliyetli ve ciddi lokomotor anormallikleri ve açık rahatsızlıkları değerlendirmek için yararlı olsa da, hareketin yalnızca tek boyutlu bir değerlendirmesini sağlar ve ince motor bozuklukları, rafine değişiklikleri ve nörotoksik maddelerin neden olduğu semptomların uzun vadeli davranışsal izlenmesini tespit etmede hassasiyet eksikliği olabilir8. Bu sınırlamaları ele almak için, Ethoscope sistemi gibi daha gelişmiş hareket izleme teknolojileri geliştirilmiştir10. Bu otomatik kayıt sistemi, sineklerin davranışlarını yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik ile analiz etmek için özel olarak tasarlanmış yüksek verimli bir video izleme cihazıdır11. Konvansiyonel lokomotor tahlillerin aksine, bu sistem hareketin sürekli, gerçek zamanlı izlenmesini sağlar ve geleneksel tırmanma tahlillerinin gözden kaçırabileceği ince davranışsal anormallikleri yakalar 11,12,13. Teknoloji, sinek hareketlerini sürekli olarak yüksek çözünürlükte kaydeden, gözlemci yanlılığını ortadan kaldıran ve deneysel tekrarlanabilirliği geliştiren kızılötesi aydınlatmalı bir kamera sistemi kullanarak otomatik video izleme özelliğine sahiptir13. Ek olarak, yürümeyi, dinlenmeyi ve tımarlama, besleme veya seğirme gibi ince hareketleri ayırt eden mikro hareketleri algılayarak motor davranışın daha ayrıntılı bir analizini sağlar13. Uzun süreli davranışsal izleme mümkündür, bu da uzun süreler boyunca sürekli izlemeye izin verir, bu da onu ilerleyici nörotoksik etkileri değerlendirmek için ideal hale getirir10. Video kayıt sisteminin ölçeklenebilirliği ve yüksek verim kapasitesi, birden fazla sineğin paralel olarak izlenmesini sağlayarak birden fazla nörotoksik bileşiğin ve genetik durumun aynı anda taranmasını kolaylaştırır10. Ayrıca sistem, açık kaynaklı yazılımı entegre ederek araştırmacıların uyku-uyanıklık döngüleri, sirkadiyen ritimler ve ayrıntılı lokomotor ölçümler10,14 dahil olmak üzere deneysel ihtiyaçlara göre analiz boru hatlarını özelleştirmelerine olanak tanır. Python tabanlı bir çerçeve olan Etoskopi'nin entegrasyonu gibi son gelişmeler, veri analizini geliştirmiş, davranışsal çalışmalarda erişilebilirliği ve tekrarlanabilirliği iyileştirmiştir14. Bu çerçeve, araştırmacıların uzman olmayan kullanıcılar için engelleri azaltırken daha karmaşık hareket analizleri yapmalarına olanak tanır. Jupyter tabanlı bir ortam olan ethoscope-lab, sorunsuz veri işlemeyi daha da kolaylaştırır, işbirlikçi araştırmayı teşvik eder ve deneysel tekrarlanabilirliği sağlar14.

Geleneksel tırmanma testlerinin yanı sıra yüksek verimli video izleme platformundan yararlanan bu çalışma, gelişimsel nörotoksik madde maruziyetini takiben motor işlev bozukluğunun kapsamlı ve hassas bir değerlendirmesini sağlar. İnce ölçekli lokomotor kusurları analiz etme yeteneği, onu nöral gelişimi ve motor koordinasyonu bozan bileşikleri taramak için güçlü bir araç haline getirir. Nörotoksisite taraması için meyve sineklerinin kullanılması, maliyet kısıtlamaları nedeniyle büyük ölçekli taramaların genellikle sınırlı olduğu omurgalı modellerine kıyasla, maliyet etkinliği ve yüksek verim kapasitesi dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sunar15. Sinek modeli, hastalık durumlarını taklit etmek ve nörotoksinlerden etkilenen moleküler yolları tanımlamak için hızlı genetik manipülasyonlara izin verir16. Memeli sinir sistemlerinden daha basit olmasına rağmen, sinekler nöral gelişim ve motor kontrolde yer alan temel korunmuş yolları korurlar17. Gerçek zamanlı video kayıt sistemi gibi yüksek çözünürlüklü izleme yöntemleri, toksik madde maruziyetinin neden olduğu motor açıklarının erken aşamada tespit edilmesine olanak tanıyarak veri doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini artırır11.

İzleme teknolojisinin ve geleneksel tırmanma testlerinin entegrasyonu, nörotoksik madde maruziyetinin neden olduğu ince lokomotor bozuklukları tespit etmek için sağlam ve ölçeklenebilir bir yöntem sağlayarak sürekli, yüksek çözünürlüklü davranışsal izlemeye izin verdi. Genetik araçlar, kısa bir yaşam döngüsü ve gelişmiş davranışsal analizin kombinasyonu, meyve sineğini nörotoksisite taraması için omurgalı modellerine güçlü bir alternatif olarak konumlandırır ve sonuçta daha güvenli ilaç geliştirmeye ve gelişmiş çevresel risk değerlendirmelerine katkıda bulunur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Örnek olarak, bu protokol Physalis physalis zehir fraksiyonunun nörotoksik potansiyelini değerlendirmek için kullanıldı. Kontrol grubu, test bileşiği olmadan sadece fizyolojik tampon ve sükroz çözeltisi aldı. Tüm deneyler W118 suşu üzerinde gerçekleştirildi. Drosophila ile yapılan deneyler için etik izin gerekli değildir, çünkü bunlar hayvan bakımı yönetmelikleri kapsamında değildir.

1. Reaktifler ve numune hazırlama

  1. Spesifik testin gereksinimlerine bağlı olarak PBS (10 mM, pH 7.0) veya HEPES (10 mM, pH 7.0) gibi bir biyolojik tampon ve 10 M'lik bir sakaroz stok çözeltisi hazırlayın. Kopya sayısına ve denemenin süresine göre örnek hacmini hesaplayın.
  2. Numuneyi, 1 M'lik bir nihai konsantrasyona kadar sükroz çözeltisi ile desteklenmiş bir biyolojik tampon kullanarak istenen konsantrasyona seyreltin. Numune şeffafsa, beslenme davranışını görsel olarak değerlendirmek için uygun gıda boyası (örn. 0,1 mg/mL mavi veya kırmızı boya) ekleyebilirsiniz. Bu çalışmada, Physalia physalis'in zehir fraksiyonu, PBS kullanılarak 10 μg/μL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltildi ve ayrıca sükroz çözeltisi ve gıda boyası ile desteklendi.
  3. Sadece tamponu içeren bir negatif kontrol çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi 1 M'lik bir nihai konsantrasyona kadar sükroz ve gıda boyası ile destekleyin. Bu çalışmada, negatif kontrol çözeltisi olarak sükroz ve gıda boyası ile desteklenmiş PBS kullanılmıştır.
  4. Meyve sineği ortamı için18'de verilen protokolü izleyin.

2. Biyolojik materyal bakımı

  1. Sağlıklı, cinsel açıdan olgun yetişkin sinekleri taze hazırlanmış gıda ortamı içeren bir şişeye aktarın. Devam etmek için, sinekleri şişenin dibine hafifçe vurun, açın ve şişeyi ters çevirerek sinek ortamı içeren yeni bir şişeye aktarın. Şişeyi, 25 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü ve %12 nem ile 50 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin. Yeterli senkronize yumurta toplamak için sineklerin gece boyunca (yaklaşık 16-22 saat) yumurta bırakmasına izin verin.
  2. Yumurtlamadan sonra, yetişkin sinekleri atmak için% 70 etanol içeren yeni bir şişe kullanın. Bu, ek yumurtlamayı önler ve minimum yaş varyasyonuna sahip bir yetişkin kohortu elde etmek için çok önemli olan yaşta senkronizasyon sağlar.
  3. Tek tip gelişimi desteklemek için, şişeleri aynı kontrollü koşullar altında (25 °C, 12 saat aydınlık/karanlık döngüsü, %50 nem) koruyun. Yetişkinler 9 veya 10. gün civarında ortaya çıkmaya başlar. Gelişimsel ilerlemenin izlenmesi, yetişkinin ortaya çıkma zamanlamasını tahmin etmeye yardımcı olabilir.
  4. Toplanan sinekleri, tahlil için istenen yaşa ulaşana kadar aynı kontrollü koşullar altında tutun. Ortaya çıktıktan sonraki 24-48 saat içinde kullanın. Bu kontrollü yaşlandırma süreci, değişkenliği en aza indirmeyi ve deneysel sonuçların güvenilirliğini artırmayı sağlar.

3. Negatif jeotaksi testi

NOT: Negatif jeotaksi testinin şematik bir gösterimi Ek Şekil 1'de sunulmuştur.

  1. Deney gününde, sinekleri yavaşça boş bir şişeye aktarın.
  2. Hareketi ve taşıma stresini en aza indirmek için sineklerin transferden önce buz üzerinde kısa bir süre uyuşturulması gerekir. Bunun için sinekleri içeren şişeyi, tüm şişeyi kaplayacak şekilde bir buz kutusunun içine yerleştirin.
  3. 1 dakika sonra, tüm sineklerin uyuşturulduğunu doğrulamak için şişeye hafifçe vurun. Strese neden olmadan veya tırmanma yeteneklerini etkilemeden tam anestezi sağlamak için onları 1 dakika daha buz üzerinde tutun.
    NOT: CO2 gibi bazı anesteziklerin, bozulmuş tırmanma davranışı da dahil olmak üzere sonraki davranışları etkileyebileceğini ve negatif jeotaksi testinin sonuçlarını etkileyebileceğini unutmayın.
  4. Sinekler uyuşturulurken, buzla dolu daha küçük bir kap hazırlayın ve soğutulmuş bir platform oluşturmak için buzun üzerine bir Petri kabı veya düz, temiz bir yüzey yerleştirin. Bu kurulum, sıralama sırasında anestezinin korunmasına yardımcı olur ve iyileşme sırasında sinek hareketini en aza indirir.
  5. Buz üzerinde 2 dakika sonra sineklerin tamamen hareketsiz hale getirildiğini doğrulayarak anesteziyi değerlendirin. Tamamen uyuşturulduktan sonra, tüpü soğutulmuş bir Petri kabı üzerinde ters çevirerek ve serbest bırakmak için hafifçe vurarak sinekleri nazikçe aktarın. Soğuk yüzey, kullanım sırasında sineklerin hareketsiz kalmasına yardımcı olacaktır.
  6. İnce bir boya fırçası kullanarak ve bir stereomikroskop altında (varsa 10x ve 20x büyütmede), erkek ve dişi sinekleri boyut ve pigmentasyon desenleri gibi ayırt edici özelliklere göre nazikçe ayırın. Erkekler genellikle geniş siyah bantlarla daha küçüktür, dişiler ise daha hafif, uzun karınlarla daha büyüktür. Anestezinin sinekler üzerindeki etkisini en aza indirmek için bu adımı mümkün olduğunca hızlı bir şekilde gerçekleştirin.
    NOT: Deney için cinsiyet farklılaşması gereksizse, ayrım adımını atlayın. Maruz kalma süresini en aza indirin ve stresi ve olası davranış değişikliklerini azaltmak için sinekleri nazikçe ele alın.
  7. Sıralanan sinekleri uygun atama ile dikkatlice boş şişelere aktarın. Teste devam etmeden önce kontrollü bir ortamda (25 ° C, 12 saat / 12 saat / 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü,% 50 nem) yaklaşık 30 dakika anesteziden kurtulmalarına izin verin.
  8. Mikrokılcal besleme hazırlığı için, her bir mikrokılcal tüpe 10 μL test solüsyonunu manuel olarak yüklemek için bir pipet kullanın. Besleme koşullarını standartlaştırmak için hacmin tüm numunelerde tutarlı olduğundan emin olun.
  9. Bir pipet kullanarak, mikrokılcal damarın açık ucuna 3-5 μL mineral yağ ekleyin. Bu, deney sırasında numunenin buharlaşmasını ve sızmasını önler.
  10. Önceden doldurulmuş mikro kılcal damarları, güvenli bir şekilde yerleştirildiklerinden emin olarak pamuklu şişe tapalarındaki deliklerden geçirin. Gerekirse, hava akışını engellemeden pamuğu sıkıca oturtmak için önceden kesilmiş uçları kullanın.
  11. Sinekleri içeren şişeleri, 12 saat/12 saat aydınlık/karanlık döngüsüyle 25 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin. Bunları deney süresince bırakın ve tutarlı maruziyeti sağlamak için mikrokılcal damarları günlük olarak taze hazırlanmış yiyeceklerle manuel olarak değiştirin. Maruz kalma süresi, numunenin toksisitesine ve doğasına bağlıdır ve tipik olarak 2 ila 7 gün arasında değişir.
  12. 12 saatlik aralıklarla, lokomotor aktiviteyi değerlendirmek için sinekleri temiz, boş bir şişeye aktarın.
  13. Kalıcı bir işaretleyici kullanarak şişenin altından 7 cm uzakta bir çizgi ölçün ve işaretleyin. Bu yükseklik tırmanma hedefi olarak hizmet edecektir.
  14. Tırmanma davranışını kaydetmek için bir kamera veya telefonu sabit bir yere yerleştirin. Analiz için yeterli aydınlatma ve şeffaf bir arka plan sağlayın. Deney kurulumunun kameranın görüş alanıyla uyumlu olduğunu onaylayın.
  15. Sinekleri dibe getirmek için şişeye hafifçe vurun, ardından hemen kayda başlayın. Sinekleri yaralayabilecek veya yönünü değiştirebilecek aşırı kuvvetten kaçının.
  16. Kayıtları gözden geçirin ve her sineğin işaretli 7 cm'lik çizgiye ulaşması için geçen süreyi ölçün. Maksimum bir süre sınırı belirleyin (örneğin, 30 sn); Bu süreyi çizgiye ulaşamayan herhangi bir sineğe atayın.
  17. Koordinasyonsuz hareket, tırmanmanın gecikmeli başlaması veya düzensiz tırmanma kalıpları gibi anormal davranışlara çok dikkat edin. Bu işaretler, test edilen bileşiğin nörotoksik etkilerini gösterebilir.
    NOT: Yem hazırlama ile ilgili ayrıntılı talimatlar için lütfen Kılcal Besleyici (CAFE) Tahlil protokolüne19 bakın. Bu yöntem, meyve sinekleri için sıvı gıda kaynaklarının hazırlanması, gıda alımının doğru bir şekilde ölçülmesinin sağlanması ve besleme deneylerinde değişkenliğin en aza indirilmesi için kesin yönergeler sağlar.

4. Gerçek zamanlı izleme tahlilleri

NOT: İzleme sistemi bileşenlerinin şematik gösterimi ve kalibrasyon protokolü de dahil olmak üzere kurulum için lütfen önceki yayınları11,12 takip edin. Deneylere genel bir bakış Ek Şekil 2'de sunulmuştur.

  1. Gerçek zamanlı hareket testi (İzleme testi)
    1. Numune ve mineral yağ keçesi ile besleme mikrokılcal damarlarını hazırlamak için 3.8-3.9 adımlarını tekrarlayın.
    2. Her biri yaklaşık 6 cm uzunluğunda şeffaf plastik pipetler kullanarak ayrı hareket odaları hazırlayın. Bu pipetler, kayıtlar için uygun, uygun maliyetli ve şeffaf muhafazalar olarak işlev görür. Tüpler, yüksek verimli davranışsal çalışmalar için 20 tüpü barındıran uyku alanı11 ile uyumlu olmalıdır.
    3. Her pipetin bir ucunu şeffaf bir filmle kapatın ve hava geçirmez bir kapatma sağlayın. Sızdırmaz ucun yakınında, besleme mikrokılcal damarının yerleştirilmesini sağlamak için küçük bir delik oluşturun. Deliğin, test sırasında sızıntıya veya harekete neden olmadan mikrokılcal damarı güvenli bir şekilde tutacak kadar büyük olduğundan emin olun.
    4. Anestezi uygulamak için 3.1-3.6 adımlarını tekrarlayın, isteğe bağlı olarak ayırın ve ince bir boya fırçası kullanarak her tüpe anestezi uygulanmış bir sineği nazikçe yerleştirin. Her tüpün açık ucunu şeffaf bir film veya pamuklu bir tapa ile kapatın, hava akışını ve sinek muhafazasını sağlayın.
    5. Monte edilmiş tüpleri arenaya yerleştirin ve her bir mikrokılcal damarın günlük değiştirme için dışarıda erişilebilir durumda kalmasını sağlayın. Her tüpe önceden doldurulmuş bir mikrokılcal damar yerleştirin. Tahlile başlamadan önce sineklerin yaklaşık 30 dakika iyileşmesine ve alışmasına izin verin.
    6. Cihazı kontrollü çevre koşullarına sahip bir odaya yerleştirin (örn. 25 °C, 12 saat/12 saat aydınlık/karanlık döngüsü, %50 nem). Cihazı ağa veya yerel izleme sistemine bağlayın.
    7. Platforma erişin ve denemeye atanan cihazı bulun. Sistemin, işaretçilerle belirtildiği gibi her uçuşu doğru bir şekilde izlediğinden emin olun. İlgili tüm deneysel meta verileri girin ve testi kaydetmeye başlayın. Gelişmiş veri analizi için, yüksek verimli davranışsal veri analizi için tasarlanmış bir R paketi olan rethomics çerçevesini kullanın11,12.
    8. Mikrokılcal damarlardaki yiyecekleri günlük olarak taze hazırlanmış solüsyonlarla değiştirin. Tipik olarak 3 ila 5 gün arasında uzanan deney süresi boyunca hayatta kalma ve uygun davranışı sağlamak için her sineği günlük olarak görsel olarak inceleyin.
  2. Sirkadiyen ritim değerlendirmesi
    1. Sineklerin sirkadiyen ritmini ve potansiyel değişikliklerini araştırmak için, deneyin tanımlanmış bir aydınlık/karanlık döngüsü ile senkronize olarak başladığından emin olun. Endojen ritimlerin bozulmasını önlemek için kayıt aşaması boyunca 12 saat aydınlık/12 saat karanlık fotoperiyot koruyun. Koşullar ayarlandıktan sonra, tüm prosedürlerin aydınlık/karanlık fazlarda tutarlı bir şekilde gerçekleştirildiğinden emin olarak 4.1.1-4.1.8 adımlarını tekrarlayın.
  3. Açık/Koyu Tercih Davranışının Değerlendirilmesi
    1. Sinekleri hazırlamak ve mikro kılcal damarları beslemek için 3.1-3.11 adımlarını tekrarlayın.
    2. Besleme şişeleri hazırlandıktan sonra, sineklerin test numunesi üzerinde 2 saat (veya önceki lokomotor aktivite verileri tarafından belirlenen başka bir süre) beslenmesine izin vermek için bunları inkübatöre yerleştirin.
    3. Işık tercihi davranışını değerlendirmek için, tanımlanmış bir karanlık alan oluşturmak için her tüpün %50'sini alüminyum folyo ile kaplayan ayrı hareket odaları hazırlayın. Standartlaştırılmış karşılaştırmaya izin vermek için tüm tüplerde tutarlı kapsama alanı sağlayın.
    4. Sinekleri tek tek hareket odalarına aktarmak için 4.1.2-4.1.4 adımlarını tekrarlayın ve mikro kılcal damarların yerleştirilmesini atlayın.
    5. Hazırlanan tüpleri arenaya yerleştirin ve sineklerin yaklaşık 30 dakika alışmasına izin verin.
    6. 4.1.6-4.1.7 adımlarını tekrarlayın ve sineklerin davranışlarını 60 dakika boyunca kaydedin. Azaltılmış hareketin kaydedildiği tüpler, izleme sistemi folyo kaplı bölgede bulunan sinekleri tespit ederek tıkanıklığı işaret etmediği için karanlık bir tercihe işaret edebilir.

5. Veri analizi

  1. Kimlik, tedavi, bileşik ayrıntılar, tahlil süresi ve diğer ilgili değişkenler gibi gerekli tüm bilgileri dahil ederek meta veri şablonunu hazırlayın. Bir şablon örneği ve ilgili veri işleme işlem hattı Ek Tablo 1'de yer almaktadır.
  2. Tamamlanan meta veri dosyasını CSV biçiminde kaydedin. Uyumluluğu sağlamak için, gereksiz karakterler veya biçimlendirme sorunları içermediğini doğrulamak için CSV dosyasını bir metin düzenleyicide açın. Varsa tüm yabancı karakterleri kaldırın.
  3. Veri analizine devam etmeden önce verilerin bir yedeğini oluşturun. Bir terminal açın ve şu komutu uygulayın: sudo python backup_tool.py. Bu adım, verileri analiz sırasında olası kayıp veya bozulmaya karşı korur.
  4. Deneye karşılık gelen veri dosyalarının konumunu belirleyin ve not edin. Bu dosyaların analiz için erişilebilir olduğundan emin olun.
  5. Rethomics kullanarak verileri analiz edin. RStudio'yu açın ve davranışsal veri analizi için gerekli Rethomics paketlerini yükleyin. Ayrıntılı talimatlar ve öğreticiler Rethomics web sitesinde mevcuttur: https://rethomics.github.io/scopr.html

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Örnek olarak, bu protokol Physalis physalis zehir fraksiyonunun nörotoksik potansiyelini değerlendirmek için kullanıldı. Tedavi edilen grup, sükroz çözeltisi (1 M'lik bir nihai konsantrasyona kadar) ve test zehiri fraksiyonu ile takviye edilmiş fizyolojik bir tampon ile beslenen sineklerden oluşuyordu. Kontrol grubu, test bileşiği olmadan sadece fizyolojik tampon ve sükroz çözeltisi aldı. Tüm deneyler W118 suşu üzerinde gerçekleştirildi.

Tarif edilen yöntemde, tedavi edilme...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Öncelikle, öldürücü olmayan (subletal) bir doz oluşturmak, nörotoksisite deneylerini yürütmek için kritik bir ilk adımdır. Bu, sineklerin çalışma boyunca canlı kalmasını sağlar ve kafa karıştırıcı mortalite faktörü olmadan davranışsal ve lokomotor etkilerin gözlemlenmesine izin verir. Çalışmamızda Physalia physalis zehir fraksiyonunun subletal dozu 10 μg/μL olarak belirlenmiştir. Sağlam ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, her biri on sinek ve en az üç teknik kopyadan ol...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar Zuzanna Tomkielska, Mesosystem S.A. tarafından istihdam edilmiştir ve yazar Ana Casas da Mesosystem S.A.'ya bağlıdır. Kalan yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yürütüldüğünü beyan eder.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, AÇA Hibeleri projesi MOD tarafından finanse edilmiştir. PN. FRM.059.PT.V03 – Physalia physalis: Yenilikçi ve Kullanılmamış Yüksek Katma Değerli Kozmetik Ürünler Kaynağı; Yeni Nesil AB Avrupa Fonu ve Portekiz Kurtarma ve Dayanıklılık Planı (PRR) tarafından finanse edilen WP5 – Algae Vertical içindeki "Pacto da Bioeconomia Azul" (Proje No. C644915664-00000026) tarafından; ve Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) tarafından CBA (UIDB/05292/2020 ve UIDP/05292/2020) aracılığıyla.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alüminyum folyo --
Mavi boya   RAYNER-Rayners mavi boya 28ml
Kamera Modülü 2 NoIRAhududu Pi 096-4062Mauser.pt'da tedarik edilir
Pamuk fitiliSigma-AldrichBR28205
Drosophila Stok ŞişeleriVWRVWRI734-1249Şişe Sineği Yuvarlak 60Z
Drosophila ŞişeleriVWRWRI734-2255 Serisi
Cam Petri kabıSigma-AldrichBR455701
Mikro hematokrit kılcal damarSigma-AldrichBR749321
MicroSD kart--Producent, Raspberry Pi OS kurulumları için en az 32 GB depolama alanına sahip bir SD kart kullanmanızı önerir
Mikro USB güç kaynağıAhududu Pi 096-4585Mauser.pt'da tedarik edilir
Mineral Yağ BIYO-RAD#1632129
Boya fırçası--
Fosfat tamponlu saliin (PBS)Çeşitli şirketlerden temin edilen bileşenler-Kontrol grubu için yiyecek hazırlamak için kullanılan ve numune seyreltme için kullanılan tampon; 10 mM pH 7
Drosophila Flakonları ve Şişeleri için FişlerVWRVWRI734-2875
Drosophila Flakonları ve Şişeleri için FişlerVWRVWRI734-2673
Sızdırmazlık FilmiSigma-AldrichHS234526C
Tek tahta bilgisayar  (3 Model B)Ahududu Pi 096-5700Mauser.pt'da tedarik edilir
SükrozSigma-AldrichS9378 Serisi
Şeffaf plastik pipet--Etoskopik uyku arenası ile uyumlu olan herhangi biri (6,5 cm x 0,5 cm)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
  2. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat Rev Neurosci. 11 (7), 514-522 (2010).
  3. Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 74-83 (2010).
  4. Gupta, S. C., et al. Chlorpyrifos induces apoptosis and DNA damage in Drosophila through generation of reactive oxygen species. Ecotoxicol Environ Saf. 73 (6), 1415-1423 (2010).
  5. Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. Lancet Neurol. 13 (3), 330-338 (2014).
  6. Bal-Price, A., et al. International STakeholder NETwork (ISTNET): creating a developmental neurotoxicity testing roadmap for regulatory purposes. Arch Toxicol. 89 (2), 269-287 (2015).
  7. Cabrita, R., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541(2022).
  8. Mendes, C. S., Bartos, I., Akay, T., Márka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking wild-type and sensory deprived Drosophila melanogaster. Elife. 2, e00231(2013).
  9. Dubovický, M., et al. Evaluation of developmental neurotoxicity: some important issues focused on neurobehavioral development. Interdiscip Toxicol. 1 (3-4), 206-210 (2008).
  10. Pereira, T. D., Shaevitz, J. W., Murthy, M. Quantifying behavior to understand the brain. Nat Neurosci. 23 (12), 1537-1549 (2020).
  11. Geissmann, Q., et al. Ethoscopes: an open platform for high-throughput ethomics. PLoS Biol. 15 (10), e2003026(2017).
  12. Geissmann, Q., Garcia Rodriguez, L., Beckwith, E. J., Gilestro, G. F. Rethomics: an R framework to analyse high-throughput behavioural data. PLoS One. 14 (1), e0209331(2019).
  13. Blackhurst, L., Gilestro, G. F. Ethoscopy and ethoscope-lab: a framework for behavioural analysis to lower entrance barrier and aid reproducibility. Bioinform Adv. 3 (1), vbad132(2023).
  14. gilestrolab/ethoscopy. , https://github.com/gilestrolab/ethoscopy (2025).
  15. Bilder, D., Irvine, K. D. Taking stock of the Drosophila research ecosystem. Genetics. 206 (3), 1227-1236 (2017).
  16. Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).
  17. Affleck, J. G., Walker, V. K. Drosophila as a model for developmental toxicology: using and extending the Drosophotoxicology model. Methods Mol Biol. 1965, 139-153 (2019).
  18. Frias, J., Simoes, N. Fruit Fly Potato Culture Media. protocols.io. , (2020).
  19. Diegelmann, S., et al. The Capillary Feeder (CAFE) Assay measures food intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), e55024(2017).
  20. Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., VandenBrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Sci Rep. 5, 15298(2015).
  21. Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nat Protoc. 7 (5), 995-1007 (2012).
  22. Ardekani, R., et al. Using GFP Video to Track 3D Movement and Conditional Gene Expression in Free-Moving Flies. PLoS One. 7 (7), e40506(2012).
  23. Mackay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482, 173-178 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Drosophila N rotoksisitesiT rmanma DeneyiDavran sal TaramaGer ek Zamanl zlemeNegatif GeotaksiMikrok lcal BeslemeMotor BozuklukAktivite TakibiI k Tercihi

İlgili makaleler