Yöntem makalesi

Laboratuvar ortamında Fazla Ayrılmış Dev Unilamellar Veziküller (GUV'ler) İçindeki Hücre İskeleti Ağlarının Sulandırılması

2.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68530

⸱

20 Haziran 2025

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu makale, fazla ayrılmış dev veziküller içindeki hücre iskeleti ağlarının basit bir tek kap sulandırmasını tanıtmaktadır. Yöntem genelleştirilebilir ve çok çeşitli biyomoleküllerin kapsüllenmesi veya hapsedilmesi için uygulanabilir.

Özet

Dev unilameller veziküller (GUV'ler) şeklindeki biyomimetik lipid zarları, GUV'ler içindeki protein sulandırma kolaylığı, görselleştirme ve hücresel zar-protein dinamiklerini anlama nedeniyle hücresel zar davranışını taklit etmek için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, hücre zarları, hücre zarındaki farklı lipitlerin varlığından kaynaklanan lipit sallarını (veya alanlarını) içerir. Model sistemlerdeki bu tür artan karmaşıklık, lipid bileşiminin hassas bir şekilde ayarlanabildiği faz ayrılmış GUV'lara neden olacak şekilde dahil edilebilir. Homojen GUV'lerin üretilmesi için kapsülleme yöntemleri yaygın olarak bilinmesine rağmen, proteinleri fazla ayrılmış GUV'ler içinde kapsülleme yöntemleri sınırlıdır. Burada, bu protokol, farklı hücre iskeleti proteinlerini, yani FtsZ ve aktini verimli bir şekilde kapsülleyen, sıvı düzensiz (Ld) ve sıvı sıralı (Lo) alanlardan oluşan, faz ayrılmış GUV'lerin basitleştirilmiş bir tek kap üretimini sunar ve yöntemi minimal hücre üretimi için çok yönlü bir araç haline getirir. Spesifik olarak, bu yaklaşım, yüksek kapsülleme verimliliğine sahip GUV'ler üretmek için bir emülsiyon transfer protokolü kullanır. Bu yöntemde, ilk olarak, elde edilen GUV'lerde faz ayrımı elde etmek için değişen faz geçiş sıcaklıklarına sahip lipitlerin seçildiği bir lipit/yağ karışımında bir protein çözeltisinin emülsifiye edilmesiyle bir lipit-tek tabaka oluşturulur. Bu emülsiyon, başka bir tüpte yağ içinde lipit çözeltisinin üzerine nazikçe aktarılır ve bu da bir su-yağ arayüzünün oluşmasına neden olur. Çözelti daha sonra yüksek sıcaklıklarda (protein aktivitesini korumak için ideal olarak 37 °C'de) santrifüjlenir, ardından görüntüleme için GUV'ler toplanır. Bu yöntem, hantal bir laboratuvar kurulumu kullanmadan fazla ayrılmış GUV'ler içinde hücre iskeleti proteinlerinin in vitro olarak yeniden oluşturulmasını basitleştirir ve böylece hapsetmede hücre iskeleti-zar etkileşimlerinin mekaniğini incelemek için uygun bir yöntem olarak hizmet eder.

Giriş

Dev veziküller, hücresel işlevleri anlamak için model sistemler olarak hizmet eder 1,2. Biyomoleküllerin üretim kolaylığı, görselliği, ayarlanabilirliği ve in vitro sulandırılması, bu biyomimetik modelleri birçok araştırma çalışması için tercih edilen sistem haline getirmektedir 3,4,5. Elektroformasyon6, cDICE 7,8, emülsiyon transferi ve diğer mikroakışkan tabanlı yöntemler 9,10 gibi GUV'leri yapmak için bilinen birkaç yöntem vardır. Bu tür yöntemlerle GUV üretimi literatürde bildirilmiştir 3,11. Ayrıca, in vitro, GUV'ler içindeki hücre iskeleti ağlarının sulandırılması, herhangi bir karmaşık kurulum gerektirmeyen bu tek kap oluşturma yönteminin kolaylığı nedeniyle daha önce bir emülsiyon transfer yöntemi kullanılarak tanımlanmıştır12. Bununla birlikte, bu tür bir sulandırma, hücresel zarların karmaşıklığını tam olarak taklit etmeyen bir sistem olan homojen GUV'lerde çok yaygın olarak rapor edilmektedir.

Bu protokol, lipid zarının karmaşıklığını sergileyen, fazla ayrılmış GUV'ler içindeki hücre iskeleti ağlarının in vitro olarak yeniden yapılandırılmasını tanımlar. Bu tür ağların daha önce zarın yüzeyine (dışarıda) bağlandığı, ancak dev veziküller13,14 ile sınırlı olmadığı bildirilmiş olsa da, mevcut emülsiyon transfer tekniği, faz ayrımı elde etmek ve aynı zamanda hücre iskeletinin ağ oluşumunun aktivitesini korumak için protokole odaklanmaktadır. Bu teknikteki en büyük zorluklardan biri sıcaklıktır. Faz ayrılmış GUV'ler oluşturmak için standart üretim yöntemleri, bileşen lipitlerin faz geçiş sıcaklığına bağlı olarak değişen yüksek sıcaklıkların kullanılmasını gerektirir. Bununla birlikte, hücre iskeleti proteinleri, bu kadar yüksek sıcaklıklarda daha yüksek dereceli yapılara polimerize olamazlar 15,16,17. Bu nedenle, bu protokol sadece oda sıcaklığında GUV'larda faz ayrımı sağlamak için bir lipit bileşimi kullanmakla kalmaz, aynı zamanda fizyolojik sıcaklıklarda iyi bir GUV verimi üretmek için koşulları optimize eder.

Yeniden yapılandırılmış GUV sistemleri üretilirken göz önünde bulundurulması gereken bir diğer husus, gerekli olan kapsüllenmiş biyomoleküllerin hacmidir. Çoğu protein için, daha yüksek hacimler üretmek, birkaç saflaştırma turu içeren pahalı ve zaman alıcı olabilir. Ayrıca, in vitro sulandırma deneyleri genellikle, optimize edilmiş bir iç çözelti içeriği elde etmek için biyomolekül konsantrasyonlarının, tampon bileşimlerinin vb. ilk olarak test edildiği bir ilk keşif aşaması gerektirir. Bu nedenle, bu protokol, yukarıda belirtilen tesislere uyum sağlayan iki farklı tahlil için GUV üretim protokolünü optimize eder. Bir yandan, bu protokol, nispeten daha yüksek hacimlerde protein içeren ve daha sonra görüntüleme 96 oyuklu plakalara aktarılan tüplerde yüksek verimli GUV üretimi üreten standart ters çevrilmiş emülsiyon protokolünü optimize eden bir testi tanımlar. Öte yandan, burada açıklanan yaklaşım, daha düşük hacimlerde biyomolekül (tüplerde üretim için gereken miktarların ~ 1 / 4'ü) kullanan ve seri olarak GUV üretimini mümkün kılan ve tek bir santrifüjleme adımında birçok kapsüllenmiş koşul elde eden görüntüleme kuyusu plakalarında doğrudan faz ayrılmış GUV üretimi için protokolü optimize eder. Bu nedenle, burada sunulan protokol bir kapsülleme yöntemini gösterir, ancak kullanıcının gereksinimlerine göre her iki kurulumu da seçmesine izin verir.

Ayrıca, bu protokol iki farklı hücre iskeleti ağı için kapsülleme için optimize edilmiş bir yöntemi tanımlar: FtsZ ve aktin. Bu iki protein farklı tampon ve kalabalık koşulları gerektirdiğinden, protokol, optimum ağ yeniden yapılandırmasını sağlamak için sonraki gerekli değişiklikleri ele alır. Bu nedenle, burada sunulan yaklaşım, faz ayrılmış GUV'ler içinde gerekli herhangi bir biyomolekülü kapsüllemek için kullanılabilir ve genelleştirilebilir.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Lipid karışımının hazırlanması

  1. 5 mL'lik bir cam şişede 0,5 mL kloroform alın. 17.5 μL DOPC, 7.4 μL DOPG, 29.6 μL DPPC (tümü kloroformda hazırlanan 25 g / L lipid stoklarından), 32.2 μL 10 g / L DPPG ve 20.6 μL 18 g / L Kolesterol ekleyin. 1,2 μL 1 g/L Atto655-DOPE boya ekleyin. Lipid karışımını nazikçe girdaplayın ve kloroformu Azot akışı altında buharlaştırın ve ince filmi toplam 400 μL kloroformda yeniden süspanse edin.
  2. FtsZ'nin kapsüllenmesi için hazırlanan nihai lipit karışımı, %0.001 mol Atto655-DOPE ile etiketlenmiş DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol (17.499: 7.5: 31.5: 13.5: 30 mol oranı) oranındadır. Kapsüllenmiş demetlenmiş aktinli GUV'lerin üretimi için, lipit karışımı biyotinile edilmiş lipitler içerir ve DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol: Biotinyl CAP PE (17.499: 7.5: 30.5: 13.5: 30: 1) oranında hazırlanır.
  3. Lipid karışımını (32 mM, 50 μL) kloroformda çözün ve ~ 15 dakika boyunca N2 gaz akışı altında bir cam şişede kurutun.
  4. Cam şişe daha sonra herhangi bir kalıntı kloroform izinden kurtulmak için bir desikatörde ~ 30 dakika vakum altında saklanır.
  5. Kurutulmuş filmi, 3.2 mM'lik nihai konsantrasyonu elde etmek için cam şişede bir dekan (20 μL) ve mineral yağ (500 μL) karışımında dağıtın ve bir banyo sonikatörü kullanarak ~ 30 dakika boyunca yüksek sıcaklıklarda (~ 50 ° C) sonikat yapın.
  6. Yağ içinde lipid karışımını bir tüpe aktarın ve sonraki adımlara geçmeden önce tüpü 37 ° C'de ~ 10 dakika inkübe edin.
  7. Proteinler için iç kapsülleme karışımını hazırlayın.

2. Kapsülleme için iç çözeltilerin hazırlanması

  1. FtsZ filament karışımı
    1. FtsZ protein karışımını bir mikrotüp içinde toplam 10 μL hacimde hazırlayın. FtsZ filamentli ağ için 0.87 μL 23 μM FtsZ-YFP-mts, 1.31 μL 381 g/L Ficoll70, 1.11 μL 271 g/L BSA ve 1 μL 25 mM GTP ila 5.71 μL FtsZ reaksiyon tamponu (RB) ekleyin. Çözeltinin toplam hacmi, son çözeltide 2 μM FtsZ-YFP-mts, 50 g/L Ficoll70, 30 g/L BSA ve 2.5 mM GTP içeren 10 μL'dir. GUV'lar içinde kapsülleme için kullanmadan önce buz üzerinde tutun.
      NOT: FtsZ reaksiyon tamponu (RB) 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM GluK, 5 mM GluMg içerir.
  2. Aktin-demet karışımı
    1. Aktin demetlerinin kapsüllenmesi için önce suda %86 G-aktin, %10 Atto488-aktin ve %4 biyotinile aktin içeren 10 μL'lik bir aktin ana karışımı (A-Mix) hazırlayın. Bu adım için, üreticinin talimatlarına göre protein stok çözeltilerini hazırlayın. Daha sonra, 35.42 μM A-Mix'lik bir nihai konsantrasyon için, 6.39 μ L 2 g / L G-aktin, 1.48 μL 1 g / L Atto488-aktin, 1.19 μL 0.5 g / L biyotinile aktin ve 0.9 μL H2O ekleyin. Buz üzerinde tutun ve ışıktan koruyun.
    2. Aktinin GUV'ların dışında ön polimerizasyonunu ve demetlenmesini önlemek için, kapsüllemeden dakikalar önce son aktin çözeltisini hazırlayın. Nihai çözelti, aktin polimerizasyon tamponunda %7 İodiksanol, 0.01 g/L Nötravidin, 2.4 μM A-Mix, 0.6 μM Fascin, 10 g/L BSA, 20 g/L Ficoll70 ve 5 mM ATP'den oluşur.
      1. Her zaman buz üzerinde tutulması gereken bu nihai çözeltiyi hazırlamak için aşağıdaki sırayla ekleyin: 2.92 μL% 60 İodiksanol, 10.25 μL H2O, 2.5 μL 0.1 g / L Nötravidin, 0.92 μL 271 g / L BSA, 1.31 μL 381 g / L Ficoll70, 2.5 μL 10x Aktin Polimerizasyon tamponu, 1.69 μL 35.42 μM A-karışımı, 1.65 μL 9 μM fascin ve 1.25 μL 100 mM ATP. İyice karıştırın ve kapsüllemek için gereken 5 μL'yi hızlı bir şekilde alın.
        NOT: bu iç çözeltinin ozmolaritesini bir ozmometre (~430 mOsm/Kg) ile ölçün. Aynı ozmolariteye sahip eşleşen bir dış çözelti karışımı, aynı ozmolarite değerine ulaşana kadar glikozun su içinde seyreltilmesiyle hazırlanmalıdır (bkz. adım 3.2). 10x Aktin polimerizasyon tamponu 100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM KCl ve 50 mMMgCl2 içerir.

3. GUV üretimi ve in vitro kapsülleme

  1. Tüplerde GUV üretimi: FtsZ'nin kapsüllenmesi
    1. FtsZ kapsüllemesi için, 1,5 mL'lik bir plastik tüpe 500 μL FtsZ reaksiyon tamponu (RB) ekleyin ve bir yağ-su arayüzünün oluşmasına ve bu arayüzde bir lipit tek tabakasının birikmesine izin vermek için nazikçe 200 μL yağda lipid karışımı (yukarıdaki 1.6. adımda hazırlanmıştır) ekleyin.
    2. Emülsiyonu oluşturmak için önce 1,5 mL'lik başka bir tüp alın ve 200 μL yağda lipit ekleyin. Emülsiyonu oluşturmadan önce bu tüpü 37 ° C'de ~ 10 dakika inkübe edin.
    3. İnkübe edildikten sonra, bu tüpe 5 μL FtsZ protein karışımı (2.1.1'de hazırlanmış) ekleyin. Sulu ortamdaki 5 μL protein, bir damlacık olarak tüpün dibine çöker.
    4. Çözelti gözle görülür şekilde bulanıklaşana kadar tüpün altına 5-6 kez hafifçe vurarak bir emülsiyon yapın.
    5. Bu emülsiyonu nazikçe pipetleyin ve yağ-su arayüzünün üzerine yerleştirin (yukarıdaki adım 3.1.1'de hazırlanmıştır).
    6. Bunu önceden ısıtılmış 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca 6000 x g'da santrifüjleyin ve bu sıcaklığı vezikül üretiminin sonuna kadar koruyun.
    7. Görüntülemeden önce numunenin yaklaşık 30 dakika oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
    8. Tüpün üstünden hafifçe pipetleyerek üst yağ tabakasını çıkarın ve görüntüleme için yaklaşık 100-200 μL çözelti bırakın.
    9. Makasla eğimli bir açıyla bir pipet ucu kesin ve tüpün altından 50-100 μL GUV solüsyonunu nazikçe alın. Bu çözüm görüntüleme için kullanılacaktır.
  2. Doğrudan 96 oyuklu plakalarda GUV üretimi: aktinin kapsüllenmesi
    1. Aktin kapsüllemesi için, önce iç aktin karışımı ile aynı ozmolariteye sahip bir dış çözelti karışımı (sudaki glikoz) hazırlayın. İç karışımın ~430 mOsm/Kg'ını eşleştirmek için, 802 μL H2O'ya 198 μL 2 M glikoz ekleyerek bir dış çözelti karışımı yapın.
    2. Vezikülleri doğrudan bir kuyu plakası üzerinde yapmak için, önce 96 oyuklu bir plakanın bir kuyusunu pasifleştirin. Kuyucuğa 100 μL 10 g / L BSA ekleyin ve 10-15 dakika inkübe edin. Ardından, pasifleştirilmiş cam tabana pipet ucuyla dokunmamaya dikkat ederek kuyuyu 100 μL dış solüsyonla beş kez yıkayın. Yıkama işlemini tamamladıktan sonra 100 μL dış çözelti karışımını kuyuya bırakın.
    3. Dış çözeltinin üzerine lipit tek tabakasını hazırlamak için kuyuya yavaşça 50 μL yağda lipid karışımı ekleyin. Yağın sulu fazın üzerine doğru bir şekilde birikmesini sağlamak için, pipet ucunu kuyunun bir tarafına koyun ve yağın kuyu duvarından kaymasına izin verin.
    4. Emülsiyonu oluşturmak için önce 1.5 mL'lik bir tüp alın ve 100 μL yağda lipid ekleyin. Emülsiyonu oluşturmadan önce bu tüpü 37 ° C'de ~ 10 dakika inkübe edin.
    5. 100 μL yağda lipid karışımı içeren tüpe (yukarıdaki adım 1.6) 2.5 μL nihai aktin çözeltisi (adım 2.2.2'den itibaren) ekleyin. Sulu ortamdaki 2.5 μL protein, bir damlacık olarak tüpün dibine çöker.
    6. Çözelti gözle görülür şekilde bulanık hale gelene kadar tüpün altına 10-20 kez hafifçe vurarak bir emülsiyon yapın.
    7. Bu emülsiyonu nazikçe pipetleyin ve yağ-su arayüzünün üzerine yerleştirin (yukarıdaki adım 3.2.3'te hazırlanmıştır). Pipetin ucunu dikkatlice yağ tek tabakasının ortasına batırın ve emülsiyonu biriktirin. Emülsiyon, yağ tek tabaka fazında sınırlı bulanık bir bulut oluşturur.
    8. 96 oyuklu plakayı 200 x g'da önceden ısıtılmış 37 °C sıcaklıkta 20 dakika santrifüjleyin ve bu sıcaklığı vezikül üretiminin sonuna kadar koruyun.
      NOT: Vezikül üretim süresini kısaltmak için 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Ancak, en iyi sonuçlar için bu santrifüj parametrelerine bağlı kalın. 400 x g'ın üzerindeki santrifüjleme, görüntüleme plakasının altında biriken lipit agregatları ile sıkıştırılmış veziküllerle sonuçlanır.
    9. Görüntülemeden önce numunenin yaklaşık 30 dakika oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
      NOT: Doğrudan görüntüleme, üst yağ tabakasının çıkarılmasına veya veziküllerin başka bir odaya/kuyuya aktarılmasına gerek kalmadan bir kuyu üzerinde gerçekleştirilebilir.

4. Görüntüleme ve 3D görüntü rekonstrüksiyonu

  1. 96'lık bir görüntüleme kuyusu plakası alın ve numuneyi görüntüleme kuyusu plakasına aktarmadan önce ~ 10 dakika boyunca BSA ile pasifleştirin (bkz. adım 3.2.2).
  2. GUV çözeltisini pasifleştirilmiş kuyu plakasına aktarın.
  3. Kuyu plakasını 40x su objektifi üzerinde ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop üzerine kurun.
  4. Herhangi bir ilgi alanına (ROI) odaklanın ve seçilen ROI'den sabit z adım aralıklarıyla bir z-yığını görüntü dizisi alın. Protokol, 5-30 μm boyutlu GUV'ler ile sonuçlanır, böylece aralık gerektiği gibi 0,5-1 μm'ye sabitlenebilir.
  5. Her z yığını görüntü dizisini .tiff formatında kaydedin.
  6. Bir görüntü işleme yazılımında (ImageJ/Fiji) ilgilendiğiniz bir görüntü dizisini açın. En yüksek yoğunluğa sahip görüntüyü belirleyin. Parlaklık ve Kontrast penceresini açmak için ctrl + shift + c tuşlarını basılı tutun ve Otomatik'e tıklayın.
  7. ImageJ/Fiji menüsünden, Analiz Et > Ölçeği Ayarla'ya gidin ve her görüntü pikseli için bilinen fiziksel mesafeyi ve birimini girin.
  8. ImageJ/Fiji menüsünden, z yığınından bir 3B görüntüyü yeniden oluşturmak için Görüntü > Yığınları > Z projesine gidin. Projeksiyon türünü Standart Sapma olarak ayarlayın. Varsayılan seçenekler, ayarların geri kalanı için kullanılabilir (Başlangıç dilimi ve Dilimi durdur).
    NOT: 3B rekonstrüksiyonda üst üste binen z-yığınlarından kaynaklanan standart sapma projeksiyon artefaktlarına dikkat edin. Herhangi bir artefakt olmadığından emin olmak için, yalnızca üst yarıdaki çıkıntıyı gözlemlemek için kürenin alt yarım küresindeki z-yığınlarını çıkarın.

5. Boyuta dayalı GUV frekansının istatistiksel analizi

  1. Adım 4.4 ve 4.5'te açıklandığı gibi, ilgilenilen GUV'lerin Z yığını görüntülerini edinin. Geniş bir görüş alanında mümkün olduğunca çok sayıda GUV görüntülemek için 1x veya 2x yakınlaştırmada konfokal yığınlar elde edin.
  2. Z yığını dizilerini 4.6'da açıklandığı gibi bir görüntü işleme yazılımında (bu durumda ImageJ/Fiji) açın.
  3. Görüntünün altındaki c olarak etiketlenmiş çubuğa tıklayarak membran floresan sinyalinin alındığı ekran kanalını seçin. Görüntünün Parlaklığını ve kontrastını 4.6'da açıklandığı gibi ayarlayın.
  4. Açık görüntünün altındaki z çubuğuna tıklayarak elde edilen farklı düzlemler arasında gezinin. Analiz edilecek vezikül çapının en büyük olduğu düzlemi seçin.
  5. ROI Manager'ı Analiz Et >> ROI Yöneticisi'ne tıklayarak ImageJ/Fiji'de ROI yöneticisini açın.
  6. ImageJ/Fiji ana panelinde bulunan araçlardan oval seçime tıklayın.
  7. GUV membranının floresan yoğunluğunu takip ederek GUV'ye uyan bir daire çizin. Bir daire seçimi çizmek için shift tuşuna basın ve daireyi vezikül boyutuna kadar genişletmek için fareyi sürükleyin. Daire seçimi, vezikülün ortasındaki sol fare düğmesine aynı anda tıklanarak ve fareyi istenen konuma sürükleyerek hareket ettirilebilir.
  8. ROI Yöneticisi'nde çizilen daire seçimini, ROI Yöneticisi'nin seçenekler panelinde bulunan Ekle'ye [t] tıklayarak kaydedin.
  9. Vezikülün boyutunu mikron cinsinden elde etmek için, ROI Manager'ın panelinde bulunan Ölç'e tıklayın. Yeni bir pencere açılacaktır. Vezikül çapının ölçümü olarak Majör veya Minör sütunda görüntülenen değeri alın (her iki sütun da elips eksenlerine atıfta bulundukları için aynı değere sahip olmalıdır).
  10. Farklı boyut aralıkları için GUV'lerin fraksiyonunun belirtildiği bir çubuk grafik oluşturmak için çizim yazılımı (Excel, Origin, Prism) kullanın.

Sonuçlar

İlk adım olarak, modifiye edilmiş bir ters emülsiyon yaklaşımı izlenerek membran faz ayrımlı GUV'ler üretilmiştir (Şekil 1A). Bu, Ld alanı üzerindeki Atto 655-DOPE etiketi ve etiketlenmemiş L o alanlarına karşılık gelen koyu bölgeler ile temsil edildiği gibi, Ld ve Lo alanlarına karışmış bir zar sergileyen yüksek birGUV verimi ile sonuçlanır (Şekil 1B). Bu yöntem, yüksek sıcaklıklarda (tüm adımlar 37 °C'de gerçekleştirilir ve RT'de görüntülenir) 5-30 μm arasında değişen boyutlarda fazla ayrılmış GUV'ler verir (Şekil 1C). Ayrıca, santrifüjleme hızları, orijinal bileşen lipidlerinin GUV'lara dahil edilmesini sağlamak ve aşırı aşırı popülasyonu önlemek için ayarlandı.

Ayrıca, mevcut protokolde açıklanan emülsiyon yöntemi kullanılarak biyomoleküllerin başarılı bir şekilde kapsüllendiğini göstermek için, hem FtsZ hem de aktin ağları bireysel deneylerde yeniden oluşturuldu. FtsZ ağları, 2.5 mM GTP ve 50 g/L Ficoll70 (Şekil 2'de gösterildiği gibi) varlığında membran hedefleme dizileri (MTS) aracılığıyla tercihenLD alanlarına bağlanan filamentler olarak ortaya çıkan GUV'ların içinde özetlenir. Ağlar, kapsülleme adımından yaklaşık 1 saat sonra gözlemlendi. Bununla birlikte, aktomiyosin ağları, GUV'ler içinde sulandırıldıktan sonra ince demetler (kalın FtsZ ağlarının aksine) olarak ortaya çıkar (Şekil 3). Biyotinile lipidlerin, aktomiyosin ağlarının GUV'lerin zarına bağlanmasında çok önemli bir rol oynadığına dikkat edilmelidir. Biyotinile lipidler olmadan, aktomiyosin demetleri kavisli bir konfigürasyon benimseyemez ve uzun demetlerden oluşan dolaşık bir ağ olarak zara yapışmak yerine lümende düz, kısa ve sert demetler halinde kalamaz (Şekil 4).

Modifiye edilmiş emülsiyon protokolünde, santrifüjleme hızı, daha önce belirtildiği gibi, fazla ayrılmış GUV'lar elde etmek için ayarlanır. Gerçekten de, aktomiyosin ağları içeren numunelerle (15 dakika boyunca 600 x g ) daha yüksek santrifüjleme hızları, veziküllerin üretim kuyusu içinde doku benzeri bir konfigürasyonda toplanmasına neden olur. Bu nedenle, aktomiyosin ağlarının tüm standart sulandırma deneylerinde, toplanmamış GUV'ler elde etmek için optimum santrifüjleme hızı 200 x g'ye ayarlanmıştır (Şekil 5).

figure-results-1
Şekil 1: Çift emülsiyon transfer yöntemini kullanan faz ayrılmış GUV'lerin tek hazneli üretimi. (A) Çift emülsiyon transferi yoluyla faz ayrılmış veziküllerin tek hazne üretimindeki temel adımların deneysel şeması. (B) A'da açıklanan yöntem izlenerek oluşturulan sonuçta elde edilen GUV'lerin konfokal Z-projeksiyon görüntüsü. Ölçek çubuğu 50 μm'dir. (C) Çaplarına göre oluşturulan faz ayrılmış GUV'lerin fraksiyonu ile çubuk grafik. Yapılan deneyler n = 3, deney başına analiz edilen toplam GUV sayısı = 100. Ortalama değerler olarak gösterilen veriler, bireysel veri noktaları üç bağımsız deneydir. Hata çubukları, üç deneyin standart sapmasını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Kapsüllenmiş FtsZ ağlarına sahip faz ayrılmış veziküller. (A) Bir FtsZ ağı içeren fazla ayrılmış bir GUV'nin tamamen elde edilmiş bir z-yığını üzerinde gerçekleştirilen konfokal 3D projeksiyon görüntüleri. (B) Vezikülün sadece üst yarısında gerçekleştirilen konfokal Z-projeksiyon görüntüleri. GUV yüzeyi üzerindeki alanların heterojen oluşumu nedeniyle, elde edilen konfokal dilimlerin 3D rekonstrüksiyonu, vezikülün üst ve alt bölgelerinden lipit alanlarının örtüşmesini gösterir. Çakışmayı önlemek ve etki alanlarının görsel incelemesini kolaylaştırmak için, alınan z-yığınlarının alt yarısı dosyadan kaldırılır. Elde edilen üst yarısı daha sonra standart sapma yoluyla 3D projeksiyonu için kullanılır. Ölçek çubuklarının her ikisi de 20 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Kapsüllenmiş aktomiyosin ağlarına sahip faz ayrılmış veziküller. (A) Vezikül üretiminden sonra kuyunun uzaklaştırılmış görünümü ile elde edilen tüm bir yığının konfokal Z-projeksiyon görüntüleri. Elde edilen yüksek vezikül verimi, veziküller içindeki farklı aktomiyosin yapılarının incelenmesine izin verir. Ölçek çubuğu 50 μm'dir. (B) Bir vezikülün üst yarısında gerçekleştirilen konfokal Z-projeksiyon görüntüleri. Lipid alanlarının görsel analizini kolaylaştırmak için, 3D projeksiyon gerçekleştirmek için görüntü dilimlerinin yalnızca üst yarısı kullanılır. Ölçek çubuğu 10 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Fazla ayrılmış veziküller içinde zara bağlı aktomiyosin ağlarının oluşumu için biyotinile lipidlerin önemi. Bağlı olmayan aktomiyosin ağları ile faz ayrılmış vezikülleri gösteren konfokal 3D projeksiyonlar. Biyotinile lipidler karışıma dahil edilmezse, aktomiyosin yapıları lümende oluşur ve veziküllerin iç broşüründe kavisli bir konfigürasyon elde etmez (sağ panel, Atto488 ile etiketlenmiş aktin). Ölçek çubuğu 50 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Santrifüjleme hızının emülsiyon transferi yoluyla faz ayrılmış veziküllerin üretimi üzerindeki etkisi. 15 dakika boyunca 600 x g'lık bir santrifüj kuvveti kullanılarak oluşturulan bir GUV örneğini gösteren konfokal 2D görüntüler. Kullanılan santrifüj hızı, optimize edilmiş 200 x g'den daha yüksek, veziküllerin kuyu içinde doku benzeri bir konfigürasyonda toplanmasına neden olur. Ölçek çubuğu 100 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Membran bazlı model sistemlerin in vitro sulandırılması için en büyük zorluklardan biri, proteinlerin yüksek sıcaklıklarda hazırlanmaları nedeniyle fazla ayrılmış GUV'ler içinde kapsüllenmesidir. Gerçekten de, bu tip fazla ayrılmış veziküllerin tek kap sentezi yoluyla üretilmesi, proteinlerin yüksek sıcaklıklarda bozunmasından kaynaklanan zorluklara yol açabilir. Bu nedenle, bu protokol, kapsüllenmiş proteinlerin aktivitesini korurken, aynı zamanda fizyolojik sıcaklıklarda GUV üretimi için çift emülsiyon yöntemini takiben membran faz ayrımını gözlemlemek için optimize edilmiş koşulları tanımlar. Bu yaklaşım, elektrostatik etkileşimler bir ön koşul olduğunda, istenen herhangi bir proteinin bağlanmasını kolaylaştırmak için her iki alana da negatif bir yük getirir. FtsZ'nin kapsüllenmesi durumunda, her iki alanda da negatif yükün varlığına rağmen, hücre iskeleti ağları gelişir ve tercihenLD alanlarına bağlanır, bu da negatif yük ile birlikte zarın akışkanlığının protein bağlanması için temel bir gereklilik olduğunu gösterir18. Ayrıca, aktin kapsüllenmesi durumunda, ağlar, biyotinile lipidlerin dahil edildiği zar bölgeleri üzerinde gelişir19.

Emülsiyon transfer testi literatürde yaygın olarak kullanılmasına rağmen, sadece homojen GUV'lerin üretimine uygulanmıştır. Bu nedenle, bu protokol, zarda alan oluşumunun gözlemlenmesine izin veren tahlilin birkaç değiştirilmiş yönünden oluşur. Bu konudaki en önemli hususlardan biri sıcaklıktır. Alanları gözlemlemek ve proteinlerin işlevselliğini (özellikle hücre iskelet ağı oluşumu) korumak için bu protokol, GUV'leri üretmek için 37 °C kullanır. Bir yandan, GUV'ler daha yüksek bir sıcaklıkta üretildiğinde, kapsüllenmiş proteinler işlevlerini kaybeder, lümende bulunur ve daha yüksek dereceli yapılara polimerize olmaz. Öte yandan, GUV'lar daha düşük bir sıcaklıkta üretilirse, membranda faz ayrışması gözlenmez. Böylece deneylerde 37 °C GUV üretimi için en uygun sıcaklık haline gelmektedir.

Bu protokolün, aynı emülsiyon transfer prensibini izleyerek GUV'leri üretmek için iki olası tahlil sistemi sağladığına dikkat etmek önemlidir: tüpler ve kuyu plakaları içinde. Her ikisi de, kullanıcının hangi sistemin ihtiyaçlarına en uygun olduğunu belirlemek için deneysel planlama aşamasında dikkate alması gerekebilecek avantajlar ve dezavantajlar sunar. Gerçekten de, plastik tüpler, kuyu plakaları için bir rotor ile donatılmış bir santrifüj gerektirmez, kullanımı daha kolaydır ve üretimden sonra ve görüntülemeden önce veziküllerin seyreltme faktörü üzerinde kontrol sağlar. Bununla birlikte, daha yüksek hacimler (hem yağ hem de sulu fazlar için) ve GUV ekstraksiyonu için üretimden sonra yağ tabakasının çıkarılmasını gerektirirler, bu da bu adım dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmezse görüntüleme kuyusunda yağ kalıntıları bırakabilir. Alternatif olarak, kuyu plakaları daha az numune hacminin kullanılmasını gerektirir, farklı iç koşulların seri olarak ve aynı anda kapsüllenmesine izin verir ve veziküller aynı üretim kuyusunda üretimden hemen sonra görüntülenebildiğinden GUV ekstraksiyonu gerektirmez. Kuyu plakalarının ana dezavantajı, veziküllerin toplanması ve tüplerde gözlemlenene benzer bir vezikül üretim verimine ulaşmak için santrifüjleme parametrelerinin ayarlanması ihtiyacıdır.

Kullanılan kapsülleme sisteminden (tüpler veya kuyu plakaları) bağımsız olarak, bu yaklaşım, kapsüllenmiş proteinlerin polimerizasyonunu kolaylaştırmanın yanı sıra GUV'leri üretmek için en uygun kalabalıklaşma koşullarının gerekli olduğunu göstermektedir. Özellikle, bu protokolü takiben, kapsüllenmiş FtsZ'li GUV'ler için en iyi durum 30 g/L BSA ve 50 g/L Ficoll7018 ile gözlenmiştir; aktin için ise 10 g/L BSA, %7 İodiksanol ve 20 g/L Ficoll70 karışımı gerekliydi19.

GUV üretiminin bir diğer önemli yönü de santrifüjleme hızı ve süresidir. Yukarıda belirtilen kalabalık konsantrasyonları altında FtsZ ağlarının oluşumu için, 30 dakika boyunca 6000 x g'da santrifüjleme, görüntüleme kuyusu plakası üzerinde iyi dağılmış ve ayrılmış bir GUV popülasyonu oluşturur. Tersine, aktin için 20 dakika boyunca 200 x g , yüksek bir GUV üretim veriminin elde edilmesini sağlar. Santrifüjleme hızı veya süresi azalırsa, GUV'lerin verimi etkilenirken, söz konusu değerlerin üzerine çıkarılması GUV'ların toplanmasına yol açar. Söz konusu koşullar altında, bu protokol, maksimum kapsülleme verimliliğine sahip GUV'lerin yanı sıra birbirine yapışmayan bireysel GUV'ler üretir.

Bu protokol herhangi bir lipid ve kapsüllenmiş biyomoleküle genelleştirilebilirken, istenen zar bileşimi ve veziküllerin içeriği, fazla ayrılmış veziküllerin üretilmesine izin veren santrifüjleme parametrelerini belirler. Bu nedenle, bu protokol, membran alanlarına sahip çeşitli veziküllerin üretimini sağlamak için bir kılavuz görevi görür.

Fazla ayrılmış GUV'ler içinde bu tür in vitro sulandırma metodolojileri, hücre zarlarının karmaşıklığını göz önünde bulundururken, lipid alanlarının aracılık ettiği karmaşık protein-zar dinamiklerini anlamak için çok önemlidir14. Bu lipid alanlarının küçük boyutu ve oldukça dinamik doğası, arayüzey etkileşimlerinin karakterizasyonunu in vivo olarak zorlaştırır. Bu nedenle, GUV'ler, göreceli hazırlama kolaylıkları ve fiziksel-kimyasal modülasyonlarının yanı sıra ışık mikroskobu20 ile analize uygunlukları nedeniyle hayati bir araç olarak hizmet eder.

Ek olarak, fonksiyonel moleküllerin heterojen biyoarayüzler içinde kapsüllenmesi, nanotıp alanında umut verici uygulamalar sunmaktadır. Özellikle, biyomoleküllerin yüzeylerinde sınırlı alanlara asimetrik dağılımı ve bölünmesinden kaynaklanan farklı özelliklere sahip işlevselleştirilmiş ilaç taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesi21. İlaç-lipid etkileşimleri, ilaçların taşınması, dağılımı ve birikimi gibi farmakokinetik özelliklerinde önemli bir rol oynar ve bu da sonuçta kullanılan ilaçların etkinliğini etkiler22. Bu nedenle, bu etkileşimlerin ilaçların farmakokinetik özellikleri üzerindeki rolünü anlamak, etkili ilaçların geliştirilmesinde kritik öneme sahiptir. Model lipid membranları, peptitler, polimerler ve nanotaşıyıcılar ile etkileşim mekanizmalarını anlamak için araştırılabilir23. Bu nedenle, belirli hastalık koşullarında hücrelerin ve dokuların lipid bileşimindeki değişiklikler, hedefe özgü ilaçlar ve ilaç dağıtım sistemleri geliştirmek için araştırılabilecek biyofiziksel etkileşimleri değiştirebilir24.

Sonuç olarak, burada açıklanan protokol, iç lipid broşürlerine tutturulmuş kapsüllenmiş proteinler ile fazla ayrılmış GUV'ler oluşturmak için kolay bir strateji sağlar. Bu veziküler sistemlerin oluşturulması, hücre benzeri işlevleri taklit etmek için karmaşık işlevlere sahip çok bileşenli montajların yenilikçi çözümler ve yeni uygulamalar getirebileceği biyoteknoloji ve sentetik biyoloji gibi alanlarda umut verici bir kullanıma sahiptir.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Teşekkürler

Yazarlar, protein saflaştırmasında yardım için MPIB Çekirdek Tesisine, plazmit klonlama için Michaela Schaper'a, protein saflaştırması için Kerstin Röhrl'e ve lipit preparatları için Sandra Ortmeier'e teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Adrián Merino-Salomón ve Shunshi Kohyama'ya kalabalık koşulları ve protein kapsüllemesi hakkındaki yararlı tartışmalar için teşekkür eder. M.R.-L. Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF) ve Federal Hükümet ve Länder'in Mükemmellik Stratejisi kapsamında Bavyera Özgür Eyaleti tarafından desteklenen IMPRS-ML ve ONE MUNICH Projesi'nin bir parçasıdır. Yazarlar ayrıca Münih'teki Nanobilim Merkezi'nin (CeNS) desteğini de kabul etmek isterler.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfo-(1'-rak-gliserol) (sodyum tuzu) (DOPG)Avanti Polar lipidler840475Kloroformda
1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC)Avanti Polar lipidler850375Kloroformda
1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-(kap biyotinil) (sodyum tuzu) (18:1 Biotinyl Cap PE)Avanti Polar lipidler870273In kloroform
1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfo-(1'-rak-gliserol) (sodyum tuzu) (DPPG)Avanti Polar lipidler840455Kloroformda
1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DPPC)Avanti Polar lipidler850355kloroformda
96-Kuyulu Düz Tabanlı Mikroplaka (SensoPlate)
Aktin (alfa-aktin iskelet kası, tavşan)HYPERMOL8101-01
Atto488-Aktin (alfa-aktin iskelet kası, tavşan)HYPERMOL8153-01
Atto655-DOPEATTO-TECAD 655-16Toz
Banyosu SonikatörBranson 1510R-MTHBransonic Ultrasonik Temizleyici
Biotin-Actin (alfa-aktin iskelet kası, tavşan)HYPERMOL8109-01
BSASigma AldrichA6003
SantrifüjEppendorf5424R
SantrifüjEppendorf5804 R
KloroformSigma Aldrich67-66-3
Kolesterol (sığır)Avanti Polar lipidler700000Kloroform
Dekane'deTCI Deutschland GmbHD0011
Fascin (insan, rekombinant)Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)CS-FSC01-A
Ficoll70Sigma AldrichF2878
Iodixanol (OptiPrep)Sigma AldrichD1556
LSM800 konfokal lazer tarama mikroskobuCarl ZeissC-Apochromat 40  &zamanlar;  /1.2 suya daldırma hedefi. Diyot pompalı katı hal lazerleri: 488 & thinsp; nm ve 640 & ince; Nm.
Mineral yağSigma Aldrich8042-47-5
Miyozin II (tavşan iskelet kası)Hücre iskeleti Inc (Tebubio GmbH)MY02-A
NeutravidinThermo Fisher Scientific Inc.31000
OzmometreFiske AssociatesFiske Mikro-Ozmometre modeli 120
Greiner Bio-One  GmbH07-000-109

Kaynaklar

  1. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  2. Imai, M., Walde, P. Giant unilamellar vesicles: From protocell models to the construction of minimal cells. The Giant Vesicle Book. , (2019).
  3. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Res Lett. 8 (1), 102(2013).
  4. Litschel, T., Schwille, P. Protein Reconstitution Inside Giant Unilamellar Vesicles. Annu Rev Biophys. 50 (1), 100620-114132 (2021).
  5. Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. J Phys Condens Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
  6. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss Chem Soc. 81 (0), 303-311 (1986).
  7. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  8. Dürre, K., Bausch, A. R. Formation of phase separated vesicles by double layer cDICE. Soft Matter. 15 (47), 9676-9681 (2019).
  9. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  10. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nat Commun. 7 (1), 10447(2016).
  11. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  12. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the Inverted Emulsion Method for High-Yield Production of Biomimetic Giant Unilamellar Vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  13. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys J. 91 (11), 4064-4070 (2006).
  14. Lopes dos Santos, R., Malo, M., Campillo, C. Spatial Control of Arp2/3-Induced Actin Polymerization on Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. ACS Synth Biol. 12 (11), 3267-3274 (2023).
  15. Sun, Q., Fu, Y., Wang, W. Temperature effects on hydrophobic interactions: Implications for protein unfolding. Chem. Phys. 559, 111550(2022).
  16. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of temperature on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 25 (21), 6432-6438 (1986).
  17. Concha-Marambio, L., Maldonado, P., Lagos, R., Monasterio, O., Montecinos-Franjola, F. Thermal adaptation of mesophilic and thermophilic FtsZ assembly by modulation of the critical concentration. PLoS One. 12 (10), e0185707(2017).
  18. Kanwa, N., Kohyama, S., Fröhlich, L., Desai, A., Schwille, P. Mutual dependence between membrane phase separation and bacterial division protein dynamics in synthetic cell models. Angew Chem Int Ed Engl. 64 (6), e202417800(2025).
  19. Reverte-López, M., et al. Self-organized spatial targeting of contractile actomyosin rings for synthetic cell division. Nat Commun. 15 (1), 10415(2024).
  20. dos Santos, R. L., Campillo, C. Studying actin-induced cell shape changes using Giant Unilamellar Vesicles and reconstituted actin networks. Biochem Soc Trans. 50 (5), 1527(2022).
  21. Staufer, O., et al. Microfluidic production and characterization of biofunctionalized giant unilamellar vesicles for targeted intracellular cargo delivery. Biomaterials. 264, 120203(2021).
  22. Lopes, D., Jakobtorweihen, S., Nunes, C., Sarmento, B., Reis, S. Shedding light on the puzzle of drug-membrane interactions: Experimental techniques and molecular dynamics simulations. Prog Lipid Res. 65, 24-44 (2017).
  23. Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical interactions with model lipid membranes: applications in drug discovery and drug delivery. Mol Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
  24. Schulz, M., Werner, S., Bacia, K., Binder, W. H. Controlling Molecular Recognition with Lipid/Polymer Domains in Vesicle Membranes. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (6), 1829-1833 (2013).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Faz Ayr m GUV larProtein Enkaps lasyonuLipid SallarEm lsiyon TransferiLipid DomainleriFtsZ ProteiniAktin Enkaps lasyonuMembran Proteini Dinamikleri

İlgili makaleler