Yöntem makalesi

13C 2-retinil asetat sentezi ve retinol izotop seyreltme testleri için doz hazırlama

595 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68535

⸱

22 Ağustos 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Wisconsin-Madison

Bu makalede

Özet

Retinil asetat, serum ve anne sütü analizi için gaz kromatografisi-yanma-izotop oranı kütle spektrometresi kullanıldığında genellikle iki 13C ile etiketlenir. Bu makale, 13C 2-retinil asetatın sentezini ve pozitif yer değiştirmeli bir pipet veya tüberkülin şırıngası ile verilecek retinol izotop seyreltme testleri için dozların hazırlanmasını açıklamaktadır.

Özet

Retinol izotop seyreltme (RID) testi, referans standart olarak kabul edilen toplam karaciğer rezervlerini tahmin ederek A vitamini durumunu değerlendirmek için en hassas yöntemdir. Gaz kromatografisi-yanma-izotop oranı kütle spektrometresi tespiti için retinol kısmına 13C eklenir. 13C-retinil asetat için sentetik prosedür, doğal olarak oluşan β-iyonon ile başlar. Kısaca C18-tetraen keton, β-iyonondan sentezlenir ve saflaştırılır. Bir 13C 4-retinil asetat isteniyorsa, 13C2 etiketli trietilfosfonoasetatın karbanyonu, C18-tetraen ketonu sentezlemek için asetonun üç karbonunu eklemeden önce β-iyonon parçasına iki 13C eklemek için kullanılabilir. 13C 3-retinil asetat isteniyorsa, asetonun üç karbonu 13C ile etiketlenebilir.

Gaz kromatografisi-yanma izotop oranı kütle spektrometresi ile gelecekteki analizler için en yaygın olarak kullanılan 13C 2-retinil asetat için, modifiye edilmiş bir Wittig-Horner prosedürü kullanılır ve etiketlenmemiş C18 tetraen keton, retinol molekülünün 14 ve 15 pozisyonlarına iki-13C eklemek için 13C2 etiketli trietilfosfonoasetat karbanyonu ile reaksiyona sokulur. Elde edilen etil ester alkole indirgenir ve asetik anhidrit ile 13C 2-retinil asetata esterleştirilir. All-trans izomeri, nispeten zararsız, oldukça uçucu, çözücüler-hekzanlar ve dietil eter kullanılarak% 8 - su ile deaktive edilmiş alümina üzerinde saflaştırılır ve bunlar döner buharlaştırma ve yağ dozlarının sonifikasyonu ile uzaklaştırılır. Ürün, analitik standartlara karşı ultraviyole görünür (UV-Vis) spektroskopisi, ince tabaka kromatografisi (TLC) ve yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ile karakterize edilir. Konsantre doz, -80 ° C'de soya fasulyesi yağında çözünmüş olarak saklanır. Son dozlar soya fasulyesi yağında (~ 200 μL / doz) seyreltilir ve araç soya fasulyesi yağına karşı UV-Vis spektroskopisi ile ölçülür. Dozlar, RID testi için pozitif yer değiştirmeli bir pipet veya tüberkülin şırıngaları ile insanlara verilmek üzere ölçülür. Uygun varsayımlar kullanılarak, toplam vücut depoları hesaplanır ve toplam karaciğer rezervleri tahmin edilir.

Giriş

Retinol izotop seyreltmesi (RID), toplam vücut A vitamini depolarını (TBS) kantitatif olarak ölçen ve uygun varsayımlarla toplam karaciğer rezervlerini (TLR) tahmin edebilen A vitamini durumunun tek biyobelirtecidir. A vitamini durumunu ve önceden oluşturulmuş retinol veya provitamin A karotenoidleri içeren müdahalelerin etkisini ölçmenin en hassas yoludur. Teknik olarak zor olmasına rağmen, RID doğru ve minimal invazivdir, çünkü karaciğer biyopsilerinin aksine sadece kan örnekleri gerektirir1. RID testi, kütle spektrometresi platformuna bağlı olarak döteryumlu veya 13C etiketli retinil asetatın uygulanmasını içerir. Doz uygulamasından önce, 13C-etiketi kullanılırken gerekli olan, ancak rastgele seçilen bir alt grup üzerinde yapılabilen bir başlangıç kan örneği toplanır. 13C etiketli retinil asetat TBS1 ile karıştırıldıktan sonra ikinci bir numune toplanır.

Eksikliği önlemek için A vitamini müdahaleleri arasında gıda takviyesi, biyofortifikasyon, diyet çeşitlendirmesi ve takviye yer alır. Bununla birlikte, bazı ülkelerde, aynı kişileri hedef alan, hipervitaminoz A2'ye yol açan örtüşen müdahaleler olmuştur ve bu nedenle program sonuçlarını değerlendirmek için bir izleme çerçevesi gerektirmektedir. Bu nedenle, A vitamini durumunu kantitatif olarak ölçen yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Üye ülkelerle birlikte çalışan Uluslararası Atom Enerjisi Ajansı (IAEA), RID testinin uygulanmasını destekleyen araştırma ve değerlendirmelerde izotopların barışçıl kullanımını teşvik etmektedir. RID testi ivme kazanmaktadır ve yakında A vitamini müdahalelerini uygulayan ülkelerde A vitamini durumunu eksiklikten fazlalığa değerlendirmek için büyük popülasyon anketlerinde kullanılabilir3.

Daha önce, 10,11,14,15-13 C 4-retinil asetat, Bergen ve ark. döteryumlu retinil asetat 4,5 için. Bu bileşik, sıçan6 ve analiz7 için uyarlanmış gaz kromatografisi-yanma-izotop oranı kütle spektrometresi (GCCIRMS) ile insan deneylerinde kullanıldı. Bu değerli deneylerden, GCCIRMS'nin o kadar hassas olduğunu belirledik ki, GCCIRMS kullanarak yapılan RID testi için dört adet 13C'ye gerek yoktu. Bu nedenle, retinol molekülünün 14 ve 15 pozisyonlarında sadece iki adet 13C kullanılarak izleyicinin maliyeti azaltılır (Şekil 1). Bu modifikasyon, sentezle ilişkili maliyetleri azaltır ve sentetik yol nedeniyle verimin artmasına yol açar. Burada, sentezi için ölçeklendirilmiş bir protokol açıklanmaktadır.

GCCIRMS, kararlı izotopların8 ölçümü için diğer kütle spektrometresi türlerinden daha hassastır ve diyetteki değişikliklere ve serum retinolündeki doğal 13C-zenginleştirme değişikliklerine yanıt verebilir. Bu, mısır tüketengerbillerde 9 ve insanlarda10ve bir sebze müdahalesine kayıtlı insanlarda11 tarif edilmiştir. Gerçekten de, 13° C'nin doğal bolluğu farklı popülasyonlar arasında değişir ve RID değerlendirmelerine kayıtlı deneklerdebelirlenmesi gerekir 12. Bununla birlikte, Ganalı ve Taylandlı çocuklarda 13,14 ve Taylandlı kadınlarda15 RID ile doğal zenginleştirme ölçümü için küçük alt gruplar kullanılmıştır. Bireysel düzeyde TBS'nin en doğru şekilde belirlenmesi için bireysel referans 13C zenginleştirmesibelirlenmelidir 12.

Protokol

NOT: Araştırma, müdahaleler veya değerlendirici çalışmalar için insan denekleri kaydederken, uygun bilgilendirilmiş onam prosedürleri ile Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onayı alınmalıdır.

1. 13C2 -retinil asetat sentezi (Şekil 2)

NOT: Tüm sentetik prosedürler ve miktar tayini, bileşik bozunmasını ve izomerizasyonu önlemek için altın floresan aydınlatma altında gerçekleştirilir.

  1. β-iyonil asetatı ticari olarak temin edilebilen β-iyonondan büyük bir partide sentezleyin. Örneğin, sodyum hidrit (NaH) (4 g, 0.16 mol) 100 mL eter ile kaplayın. Etiketlenmemiş trietilfosfonoasetat (36 g, 0.16 mol) 100 mL eter damlasına ekleyin ve 2 saat karıştırın.H2 serbest bırakılır ve ilk süspansiyon berrak ve kehribar rengi olur.
    DİKKAT: Sodyum hidrit (NaH), çok çeşitli kimyasal reaksiyonlarda yararlı olan güçlü bir indirgeyici ajandır. Bununla birlikte, atmosfer 16,17'deki su ile yüksek ekzotermik reaksiyonu nedeniyle laboratuvar yangınları meydana gelebilir. Bir Güvenlik Bilgi Formuna erişilmesi önerilir; NaH gibi orta derecede piroforik katıların işlenmesi için ek kılavuzlar yayınlanmıştır18. Reaksiyon kaplarını ve inert gazlı (nitrojen veya argon gibi) saklama kaplarını tutarken, yıkarken, reaksiyon kabını soğuturken ve kuru bir ortamda tutulan kapalı kaplarda saklarken yağda veya reaktif olmayan çözücüde asılı tutun. Laboratuvarımızda, NaH, nitrojen ortamı altında küçük miktarlarda (~ 1 g) şişelere aktarılır ve daha sonra kullanıma kadar kapalı bir desikatörde saklanır.
  2. 40 mL eter içine β-iyonon (21 g, 0.12 mol) ekleyin ve gece boyunca reaksiyona girin (20 ° C'de ~ 15 saat). 2. günde, reaksiyonu suyla söndürün ve etil-β-iyoniliden asetatı hekzanlara çıkarın ve geri kazanımı en üst düzeye çıkarmak için bir dizi ayırıcı hunide tekrar tekrar suyla yıkayın. Organik tabakayı (susuz MgS04) kurutun, süzün ve konsantre edin
    NOT: İnce tabaka kromatografisi (TLC) genellikle sentezin bu aşamasında sadece küçük safsızlıkları tespit eder. Bu, sonraki adımlara geçmeden önce -80 °C'de uzun bir süre saklanabilir.
  3. Etil-β-iyoniliden asetat (28 g, 0.11 mol) dietil eter içinde 120 mL 1 molar lityum alüminyum hidrit (LiAlH4) ile reaksiyona sokun. Reaksiyon kabını kuru buz aseton banyosuna daldırın ve çözeltiyi β-iyoniliden etanol elde etmek için sürekli karıştırın.
    DİKKAT: Lityum alüminyum hidrit (LiAlH4) güçlü bir indirgeyici ajandır. Bir Güvenlik Bilgi Formuna erişin ve LiAlH418,19 gibi orta derecede piroforik katıların işlenmesi için ek yönergelere bakın. Çoğu güvenlik önleminin birincil amacı, LiAlH4'ün atmosfere maruz kalma riskini en aza indirmek ve kaçak reaksiyonları önlemektir. Bu genellikle, bu bileşiklerin elleçleme sırasında yağda veya reaktif olmayan çözücü içinde asılı tutulmasını, reaksiyon kaplarının ve inert gazla (nitrojen veya argon gibi) saklama kaplarının yıkanmasını, reaksiyon kabının soğutulmasını ve LiAlH4'ün kuru bir ortamda tutulan kapalı kaplarda saklanmasını içerir. Laboratuvarımızda, lityum alüminyum hidrit, toz form yerine kapalı 1 molar şişelerde satın alınmakta, gerekli hacimler bir şırınga ile çıkarılmakta ve şişenin atmosferi nitrojen ile değiştirilmektedir.
  4. 28 g (0.12 mol) β-iyoniliden etanolü 300 mL heksan içinde çözün. 3 gün boyunca (51 g, 52 g ve 54 g) günde yaklaşık 50 g% 90 MnO2 ekleyin ve reaksiyon karışımını daha uzun süre karıştırın (genellikle 20 ° C'de 2 gün). Son olarak, 35 g MnO2 ekleyin ve gece boyunca yaklaşık 15 saat bekletin; Reaksiyon yaklaşık% 90 oranında tamamlanmıştır. MnO2'deki β-iyoniliden asetaldehiti diklorometan ile süzün ve yıkayın.
  5. Ham β-iyoniliden asetaldehiti (22 g, 0.10 mol) sürekli karıştırarak 150 mL aseton içinde çözün ve damla damla 10 mL 1 N sodyum hidroksit ekleyin. Reaksiyonu 6 saat bekletin.
  6. C18 tetraen ketonu heksanlarla çıkarın ve geri kazanımı en üst düzeye çıkarmak için bir dizi ayırıcı huni kullanarak tekrar tekrar suyla yıkayın. Ham cis-trans C18 tetraen keton elde etmek için elde edilen çözeltiyi döner bir buharlaştırıcı ile kurutun. Trans izomeri insan çalışmaları için en çok arzu edildiğinden, karışımı heksan içinde %0-10 etil asetatın yavaş bir gradyanı kullanarak %4 su ile deaktive edilmiş silika jel (300 g) üzerinde saflaştırın.
  7. NaH'yi (1.2 g, 0.05 mol) 50 mL eter ile karıştırın. 50 mL eter içinde çözülmüş 13C 2-trietilfosfonoasetat (11 g, 0.049 mol) ekleyin ve 2 saat karıştırın. C18 tetraen ketonu (12 g, 0.044 mol) 50 mL eter içinde çözün ve gece boyunca 20 ° C'de yaklaşık 15 saat reaksiyona girin.
  8. Reaksiyonu su ile söndürün ve 14,15-13 C 2-retinoik asit etil esteri hekzanlarla ekstrakte edin ve bir ayırma hunisinde su ile yıkayın. Organik tabakayı susuz MgS04 ile kurutun ve konsantre edin; CIS/Trans izomerleri elde etmek için heksan gradyanında yavaş %0 ila 3 dietil eter ile %8 su ile deaktive edilmiş nötr alümina (400 g) üzerinde saflaştırın.
    NOT: Genellikle, ilk arıtma, TLC tarafından değerlendirildiği gibi kirleticilere sahiptir. Kirleticiler, TLC plakasının iyot buharı ile reaksiyona sokulmasıyla görselleştirilir. Kirleticiler mevcut olduğunda, saf 14,15-13 C2-retinoik asit etil ester elde etmek için 400 g %8 su ile deaktive edilmiş nötr alümina üzerinde %100 hekzan ile yeniden arıtmak çok önemlidir.
  9. 14,15-13 C 2-retinoik asit etil esteri (3.7 g) kuru buz aseton banyosunda 15 mL 1 molar lityum alüminyum hidrit ile 14,15-13 C2-retinol verecek şekilde karıştırarak azaltın (Şekil 1).
  10. 14,15-13 C 2-retinol (3.5 g) 20 mL trietilamin içinde çözün. Çözeltiyi karıştırırken, 3.5 mL asetik anhidrit ile 7 mL trietilamin karıştırın ve şişeye damla damla ekleyin. 14,15-13 C 2-retinil asetat (yaklaşık 15 saat) oluşumu için şişeyi bir gece buzdolabında bırakın.
  11. 3.9 g ham 14,15-13 C 2-retinil asetat heksanlara ekstrakte edin, kurutun, konsantre edin ve heksan gradyanında yavaş% 0-3 dietil eter ile 500 g% 8 su ile deaktive edilmiş nötr alümina üzerinde saflaştırın. 325 nm'de ultraviyole görünür (UV-Vis) spektrofotometre ile fraksiyonları izleyin. Kalan tüm çözücüleri bir roto-buharlaştırıcı ile çıkarın. Cis/trans oranını belirlemek için nihai ürünü HPLC ve fotodiyot algılama ile değerlendirin. Ultra basınçlı sıvı kromatografisi kullanarak cis/trans profilini ayırmak için gelişmiş bir gradyan sistemi örneği, Ek Şekil S1'de mevcuttur.
    NOT: Bu aşamada cis/trans oranı genellikle %>95 all-trans'tır.
  12. Depolama için, all-trans 14,15-13 C 2-retinil asetatı gıda sınıfı soya fasulyesi yağında başka hiçbir katkı maddesi olmadan çözün ve -80 °C'de nitrojen ile yıkanmış amber camda saklayın ve konsantre stok olarak etiketleyin.

2. Kararlı izotop etiketli retinil asetatın yağlı çözeltilerinin doz hazırlanması

NOT: İzotopik olarak etiketlenmiş retinil asetat, kapsül20'de veya 250 μL pozitif yer değiştirmeli pipet21 veya tıbbi şırınga22 ile verilen yağ çözeltilerinde uygulanmıştır (Şekil 3). Aşağıda açıklanan kapsüllerin stabilitesini test ettik (Şekil 4).

  1. Sentezden hemen sonra, etiketli retinil asetatı kristalleşmeye başlamadan önce ~ 15 mL takviye edilmemiş bitkisel yağ (örneğin, gıda sınıfı soya fasulyesi yağı) içinde çözün ve son dozları hazırlamaya hazır olana kadar -30 ila -80 ° C'de 24 mL'lik kehribar şişede saklayın.
    1. Etiketli retinil asetat satın alınmışsa, vakumla kapatılmış ampulün üst kısmını bir eğe ile çizerek veya vidalı bir şişedeki mührü kırarak dikkatlice koparın. İhtiyaç duyulan kütleye bağlı olarak, 24 mL'lik kahverengi kehribar şişeye tartılmış bir miktar koyun ve az miktarda bitkisel yağ ekleyin (10 mL muhtemelen yeterli olacaktır). Karışımı berrak bir çözelti haline gelene kadar sonikleştirin.
  2. Denek sayısını 200 μL ile çarparak ihtiyaç duyulan nihai yağ miktarını tahmin edin. Örneğin, 60 denek kaydedilecekse, israf için yeterli olacak şekilde yaklaşık 70 doz oluşturun (yaklaşık% 10-20). Böylece 70 × 200 μL 14 mL'dir.
    NOT: Sentetik yağın veya kristallerin kütlesine güvenmeyin. Dozları ölçmek için bir spektrofotometre kullanmanız gerekir. Tüm sentetik A vitamini artık çözücüler içerir. Bunlar, sonifikasyon veya hafif bir nitrojen akışı altında dağıtılabilir, ancak izotop dozlarını belirlemek için kütlenin tek başına kullanılamamasının ana nedenidir.
    Etiketli retinil asetat çözeltileri kullanılmadan dondurucuda çok uzun süre tutulursa, önemli bir bozulma olup olmadığını belirlemek için yeniden analiz edilmelidir.
  3. Retinil asetat miktarını belirlemek için:
    1. UV-Vis spektrofotometresini (taramalı çift ışınlı spektrofotometre tercih edilir) ve varsa bağlı bilgisayarı açın. Üreticinin talimatlarını izleyerek UV-Vis spektrofotometresini başlatın. Okumadan önce spektrofotometrenin en az 30 dakika ısınmasına izin verin.
    2. İki adet 25 mL'lik hacimsel şişe ve kapak kurun ve her birini neredeyse çizgiye kadar 25 mL heksanla doldurun. Bir şişeyi "Yağ" veya "Boş" ve diğerini "A Vitamini" veya "Doz" olarak etiketleyin; daha sonra, boşluklar çalıştırılana kadar A vitamini şişesini bir kenara koyun.
    3. Tek kullanımlık plastik bir bardağa biraz saf soya fasulyesi yağı dökün ve sistemi boşaltmak için Yağ şişesine 20-40 μL ekleyin.
      NOT: Genellikle 20 μL kullanırız, ancak boş ve izotop doz hacmi aynı olduğu sürece daha fazla kullanılabilir.
    4. Yağı ve hekzanları karıştırmak için 4-5x ters çevirin, ardından her iki spektrofotometre kuvars küvetini bu solüsyonla durulayın ve her ikisini de ~%75 oranında doldurun.
    5. Her iki küveti de spektrofotometreye koyun, şeffaf ön ve arkaya dokunmamaya dikkat edin (yalnızca buzlu taraflardan tutun). En iyi doğruluk için, eşleşen her küvetin numaralı ön tarafını kullanıcıya doğru çevirin.
    6. Numunelerin üzerindeki ışığı engelleyen kapıyı kapatın.
    7. Blank ( Boş) veya Baseline (Taban Çizgisi ) işlevine tıklayın ve sistemin yağ ve hekzanların temel emilimini ölçmesine izin verin. Bu, Boş Yağ Hekzan çözeltisinin emilimini düzeltir. 260 ila 400 nm arasında tarama; Bu işlem bittikten sonra okumanın 400 nm'de "sıfır" olduğunu onaylayın. Değilse, sıfır düğmesine basın ve taramayı yeniden çalıştırın. Tamamlandığında, sistem retinil asetat dozu emilimini ölçmeye hazırdır.
    8. Numune küvetinin içeriğini atın ve Doz hekzan çözeltisi ile doldurun. Numuneyi uygun yere yerleştirin ve spektrumları tarayın. Tepe noktasını seçin ve absorbansı okuyun. Saf retinil asetat, 325 nm'de maksimum yalnızca bir lambdaya sahiptir.
      NOT: Birden fazla tepe noktanız varsa veya 280 nm'de bir tepe noktanız varsa, retinil asetat bozulmuştur ve dozlama için kullanılmamalıdır.
  4. Adım 2.3 için hesaplamalar
    NOT: Retinol için E% 1, 1 cm, heksanlarda 325 nm'de 1.810'dur. Retinil asetatın retinol eşdeğerlerinde miktarını belirleyeceksiniz.
    1. μg/mL çözeltiyi elde etmek için absorbansı 0.181'e bölün.
    2. 20 mikrolitre yağ çözeltisinde μg'yi elde etmek için 25 mL ile çarpın.
      NOT: Örnek: 25 mL hekzan içinde 20 μL yağın emilimi 0.295'tir.
      0.295/0.181 = 1.630 μg/mL × 25 mL = 40.75 μg 20 μL yağ içinde
      Doz için 286 μg'a ihtiyacınız varsa, bu 140.4 μL'dir. Bu 1 μmoldür, ancak etiket nedeniyle bağırsakta 288 μg 13C 2-retinol yapılacaktır. 200 μL doz miktarına yaklaşmak için bir seyreltme yapmak ve yukarıdaki niceliği yeniden yapmak isteyebilirsiniz.
  5. Stabiliteyi test etmek için kapsüllerin hazırlanması
    1. Kapsülleri daha büyük beyaz tabana ve daha küçük mavi kapaklara ayırın.
    2. Beyaz kapsül tabanlarını pipet ucu kutularına (kutu başına 96 kapsül) yerleştirin ve tozun kapsüllere girmesini önlemek için kapatın ve mavi kapakları gece boyunca fermuarlı bir plastik torbaya koyun. Çatlamış kapsülleri atın.
    3. Retinil asetat yağı çözeltisinin oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Kullanılmayan küçük bir plastik bardağa az miktarda (~ 5 mL) dökün.
    4. 5 mL şırıngayı (burada 1 = 100 μL) yükleyerek ve tetik başına 2 μL dağıtmak için "200" ye ayarlayarak bir tekrarlayıcı pipet hazırlayın.
    5. Yükleme kolunu yukarı çekerek retinil asetat yağını tekrarlayıcı pipete yükleyin. Uçtaki hava kabarcıklarını temizlemek için en az 4 x 200 μL alikotu bardağa geri dağıtın.
    6. Pipetin ucunu kapsülün iç duvarına hafifçe dokundurarak ve tetiğe basarak beyaz kapsül tabanı başına 1 x 200 μL alikot dağıtın.
    7. Tekrarlayıcı pipet boşalmaya yaklaştığında daha fazla yağ çekin.
    8. 96 kapsüllük bir setin tamamını tamamladıktan sonra, yağı tekrar bardağa dağıtın ve ardından kapakları çatlatmamaya dikkat ederek mavi kapakları her beyaz tabana hafifçe kaydırmaya başlayın.
    9. Tüm kapaklar kapsüllerin üzerine geldikten sonra, her bir kapsülü kaldırın, kapağın sıkıca takıldığından hafifçe emin olun, ardından uç kutusuna yerleştirin.
    10. Kapsülleri seçilen sıcaklık ve koşullarda saklayın. Kapsüller alüminyum folyo altındaki raflarda saklanarak karanlık elde edilebilir. Aşağıda örnekler verilmiştir:
      a.  dondurucuda: -20 °C karanlıkta
      b.  buzdolabında: Karanlıkta 4 °C
      c. tezgahta: karanlıkta 20 °C (oda sıcaklığı)
      d. bankta ancak dışarıda bırakıldığında: 20 °C (oda sıcaklığı) standart floresan aydınlatmaya maruz kalır
      e.  bir fırında, diğer yerlerde daha yüksek ortam sıcaklıklarını çoğaltır: karanlıkta 37 °C

3. Doz uygulaması

NOT: Pozitif yer değiştirmeli pipet, teknisyenler arasında doğruluğu ve hassasiyeti belirlemek için doğrudan tüberkülin şırıngalarıyla karşılaştırılmıştır (Şekil 5).

Dozlar 250 μL Rainin pozitif deplasmanlı pipetler veya 1 mL tüberkülin şırıngaları kullanılarak uygulanır.

  1. Dondurulmuş dozları çözün veya tarla sahasına gidiyorsanız buz paketleri ile bir soğutucuya koyun. Taşıma sırasında, dozlar genellikle çözülür.
  2. Amber cam şişeyi soğutucudan çıkarın ve açın. Devrilmesini önlemek için şişeyi bir "kupa" veya beherde saklayın.
  3. Pipet ucunu veya tüberkülin şırıngasını yağın içine yerleştirin ve az miktarda çekin. Oluşmuş olabilecek kabarcıkları çıkarmak için pistona hızlı bir şekilde bastırın. Pipete veya şırıngaya gereken hacim miktarını yavaşça çekin. Kabarcık olmadığından emin olun.
  4. Ucun dışını bir mendille silin. Pipet ucunun veya şırınganın ucuna dokunmayın çünkü bu sıvıyı çekecektir.
  5. Ucu katılımcının ağzına koyun, yağı ağzına bırakın ve kişiye ağzını kapatmasını ve yutmasını söyleyin.
    NOT: Katılımcıların dozlama için başlarını hafifçe geriye eğebilmeleri yararlıdır.
  6. Dozdan sonra, en az 10 g yağ sağlayan bir "kovalayıcı" veya yağlı bir atıştırmalık uygulayın. Küçük çocuklar için, kovalayıcı olarak plastik bir kaşıkla verilen 1 mL takviye edilmemiş yağ uygulayın. Daha büyük çocuklar ve yetişkinler için yarım fıstık ezmeli sandviç, kızarmış beyaz patates veya çikolatalı bir baget iyi takip atıştırmalıklarıdır.
    NOT: Hangi atıştırmalıkların yerel olarak kabul edilebilir olduğunu belirlemek için bilgilendirici araştırmalar yapılmalıdır.

Tartışma

Ticari döteryumlu ve 13C etiketli retinil asetat kaynakları olsa da, yetenekli organik kimyagerler için literatürde retinol için birden fazla sentetik yol vardır. Döteryumlu retinil asetatın izlemesi için sentetik bir yol seçtik ve yukarıda özetlenen retinol parçasının omurgasına 13C eklemek için uygun ayarlamalar yaptık. 14,15-13 C 2-retinil asetat sentezi, ticari olarak temin edilebilen β-iyonon ile başlayan yedi aşamalı bir prosedür kullanılarak gerçekleştirildi. β-İyonon, doğal olarak oluşan bir bitki bileşenidir ve güllerden elde edilen kokulara katkıda bulunur. Sentetik yoldaki en önemli adım, C18 tetraen ketonun oluşumudur. Bu ara bileşiğin, sonraki adımların iyi verim elde etmesi için en az %90 saf olması gerekir.

Etiketleme, ticari olarak temin edilebilen 13C 2-trietilfosfonoasetat ile modifiye edilmiş bir Wittig-Homer prosedürü kullanılarak gerçekleştirildi. Etiketli bileşikler, TBS'yi belirlemek ve TLR'yi tahmin etmek için RID testinde kullanılır. Yöntem, etiketli bileşiklerin fizyolojik seviyeleri ile dozlanmış bireylerin serum veya anne sütünden saflaştırılmış retinolün analizi için GCCIRMS'yi kullanır. En yaygın dozlar çocuklar için 1 μmol ve yetişkinler için 2 μmol'dür. GCCIRMS analizi izotop zenginleştirme için hassas olsa da, serum analizi, GC'ye giriş için yeterli retinol kütlesi elde etmek için en az 400 μL serum gerektirir.

13C-RID testi, klinik çalışmalarda23,24 veAfrikalı çocuklardan oluşan gruplarda 25 kullanılmıştır ve gelecekte popülasyon temelli çalışma için erişilebilir hale getirme planları vardır. Bu modifikasyonların popülasyon çalışması için uygun olup olmadığını araştırmak için deneyleri kapsüller ve şırıngalarla gerçekleştirdik. Kapsüllerin dik konumda olması gerekiyordu ya da sızdılar; Saha kullanımı için normal amber hap şişelerinde saklanabilecekleri fikrini çabucak bir kenara attık. Kapsüller, buzdolabı ve dondurucu sıcaklıklarında sadece ~ 9 ay boyunca stabildi. Sızdırmaz kapsüllerin üretimi, depolama sırasında atmosfere küçük maruziyeti azaltarak stabiliteyi artırabilir. Kapsüllerin kullanımı, uygulamadan önce kullanıcı grupları tarafından test edilmeli ve doğrulanmalıdır.

Nihai yağ çözeltileri oda sıcaklığında ~ 2 ay boyunca stabildir, ancak bir kez bozulmaya başladıklarında bozunma hızla devam eder. TBS'nin hesaplanmasında dozlanan miktar kullanıldığından, RID testleri için kabul edilebilir kısmi bir aktivite yoktur. Çözeltileri kullanım sırasında sahada buz paketleri üzerinde tutmak ve dozlama tamamlandıktan sonra mümkün olan en kısa sürede yeniden dondurmak en iyisidir. Gün için gerekenden sadece birkaç doz daha fazla getirmek ve geri kalanını donmuş halde tutmak en iyisidir. Donma ve çözülme bu çözeltileri etkilemez çünkü yağın içinde antioksidanlar vardır. Yağ çözeltileri kan örneklerinden daha sağlamdır, ancak yine de her zaman karanlıkta tutulması ve kullanılmadığında dondurulması gerekir.

Dozlar 250 μL Rainin pozitif deplasmanlı pipetler veya 1 mL tüberkülin şırıngaları kullanılarak uygulanır. Hava yer değiştirmeli pipetler, yağda çözünen dozlar için uygun değildir. Laboratuvarımız bu iki yöntemi deneysel olarak karşılaştırmıştır (bkz. Pipet veya şırınga ile uygulama, birkaç sapma ile benzerdir. Rainin pozitif yer değiştirmeli pipetler araştırma veya klinik çalışmalar için önerilir, ancak şırıngalar popülasyona dayalı çalışmalar için kullanılabilir. Doz hassasiyetini en üst düzeye çıkarmak için ucunda çok az ölü hacim bulunan şırıngalar önerilir (ör., Norm-Ject).

RID testi için hesaplamalar, uygulanan doz miktarını içerir ve uygulanan doz miktarındaki hata, sonuçta elde edilen TBS tahminindeki hatayla orantılıdır. Pozitif deplasmanlı pipetlere karşı tüberkülin şırıngalarının kullanımı için, ortalama normalleştirilmiş şırınga iletimi 1'e yakındı, bu da şırıngaların popülasyon çalışmaları için doğru doz iletimi sağlayabileceğini gösteriyor. % 95 güven sınırları, hedef doz uygulamasının yaklaşık% 8'inden ± idi. Şırıngalarla ilgili daha önce deneyime sahip teknisyenler, daha az deneyime sahip teknisyenlere (± %10) kıyasla daha dar bir %95 CI'ye (%± %6) ve teknisyenden daha düşük varyans katkısına sahipti. Bu, sahada uygulamadan önce araç yağı kullanılarak bir eğitim protokolü ve doğrulamanın yapılması gerektiğini göstermektedir. Bu sonuçlar, popülasyon temelli çalışmalarda doz-yanıt ve RID testlerinde dozları uygulamak için uygun maliyetli ve zaman kazandıran bir dağıtım yöntemi olarak tek kullanımlık tüberkülin şırıngalarını kullanmak isteyen her laboratuvarda daha fazla doğrulamayı hak etmektedir.

Rapor edilen doğruluk ve hassasiyetleri %≤1 olduğundan, bireysel düzeyde doğruluğu en üst düzeye çıkarmak için RID testini kullanan araştırma ve klinik çalışmalar için pozitif yer değiştirmeli pipeti tercih ettik. Karşılaştırıldığında, modifiye edilmiş nispi doz yanıt testi kalitatiftir ve1 verilen doz miktarına dayalı hiçbir hesaplama yapılmamıştır. Bu nedenle, popülasyon temelli anketlerde test için şırınga kullanılmasını ve dozun yaklaşık 0.7 mL araçta çözülmesini önerdik.

RID testi, TBS'yi ölçmek ve A vitamini durumunu değerlendirmek için referans standart olan TLR'yi tahmin etmek için hassas bir yöntemdir. Döteryum veya 13C etiketlemesi kullanılarak birçok araştırma uygulamasında kullanılmıştır. Mevcut ve gelecekteki uygulamalar, klinik ortamlarda RID testini ve anketlerde popülasyon alt gruplarını kullanacaktır. Bu uygulamalar için dozajlamanın basitleştirilmesi önemli olacaktır.

Açıklamalar

Yazarların bu makalenin içeriği ile herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH-R01 DC019357 ve IAEA Koordineli Araştırma Projesi E43035 tarafından finanse edilmiştir. Wisconsin-Madison Üniversitesi İstatistiksel Danışmanlık grubundan Nicholas Keuler'e tek kullanımlık şırınga yöntemi karşılaştırmasının analizindeki yardımı için teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
asetik anhidritSigma Aldrich242845
asetonSigma Aldrich179124
alüminyum oksitSigma Aldrich199974
BeherlerHerhangiHerhangi bir cam tedarik şirketi 
beta-iyononSigma AldrichW259500
eterSigma Aldrich673811
Cam Pastör PipetleriHerhangiHerhangi bir cam tedarik şirketi 
HekzanlarSigma178918
etiketli trietilfosfonoasetatSigma Aldrich293202
Lityum Alüminyum Hidrit ÇözümüAcros organikleri199511000
manganez oksitSidma Aldrich310700
Pozitif Yer Değiştirmeli PipetlerYağmur17008579
Retinil asetatSigma AldrichR4632 Serisi
ayırma hunileriHerhangiHerhangi bir cam tedarik şirketi 
silika jelSigma Aldrich1.07734
sodyum hidritAtalay223441
sodyum hidroksitFisher BilimselS318-100
SpektrofotometreHerhangi bir taramaÇift kiriş tercih edilir
trietilaminSigma Aldrich471283
trietilfosfonoasetatAtalayT61301 Serisi
tüberkülin şırıngasıNorm-Ject19G334 Serisi
sebze yağısoyaBakkal
hacimsel şişeler (25 mL)HerhangiHerhangi bir cam tedarik şirketi 

Kaynaklar

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of nutrition for development (BOND) - Vitamin A review. J Nutr. 146 (9), 1816S-1848S (2016).
  2. Tanumihardjo, S. A., Kaliwile, C., Boy, E., Dhansay, M. A., van Stuijvenberg, M. E. Overlapping vitamin A interventions in the United States, Guatemala, Zambia, and South Africa: case studies. Annals NY Acad Sci. 1446 (1), 102-116 (2019).
  3. Sheftel, J., Loechl, C., Mokhtar, N., Tanumihardjo, S. A. Use of stable isotopes to evaluate bioefficacy of provitamin A carotenoids, vitamin A status, and bioavailability of iron and zinc. Adv Nutr. 9 (5), 625-636 (2018).
  4. Bergen, H. R., Furr, H. C., Olson, J. A. Synthesis of tri-, tetra-, and penta-deuterated forms of vitamin A. J Labelled Cpd Radiopharm. 25 (1), 11-21 (1988).
  5. Tanumihardjo, S. A. Synthesis of 10, 11, 14, 15-13C4- and 14, 15-13C2-retinyl acetate. J Labelled Cpd Radiopharm. 44 (5), 365-372 (2001).
  6. Tanumihardjo, S. A. Vitamin A status assessment in rats using 13C4-retinyl acetate and gas chromatography-combustion isotope ratio mass spectrometry (GCCIRMS). J Nutr. 130 (1), 2844-2849 (2000).
  7. Gannon, B. M., Valentine, A. R., Davis, C. R., Howe, J. A., Tanumihardjo, S. A. Duration of retinol isotope dilution studies with compartmental modeling affects model complexity, kinetic parameters, and calculated vitamin A stores in US women. J Nutr. 148 (8), 1387-1396 (2018).
  8. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
  9. Gannon, B. M., et al. 13C natural abundance of serum retinol is a novel biomarker for evaluating provitamin A carotenoid-biofortified maize consumption in male Mongolian gerbils. J Nutr. 146 (7), 1290-1297 (2016).
  10. Sheftel, J., Gannon, B. M., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Provitamin A-biofortified maize consumption increases serum xanthophylls and 13C-natural abundance of retinol in Zambian children. Exp Biol Med. 242 (15), 1508-1514 (2017).
  11. Howe, J. A., Valentine, A. R., Hull, A. K., Tanumihardjo, S. A. 13C natural abundance in serum retinol acts as a biomarker for increases in dietary provitamin A. Exp Biol Med. 234 (2), 140-147 (2009).
  12. Gannon, B. M., et al. Comparison of total body vitamin A stores using individual versus population 13C-natural abundance of serum retinol in preschool children and women residing in 6 diverse African countries. J Nutr. 153 (4), 949-957 (2023).
  13. Newton, S., et al. Vitamin A status and body pool size of infants before and after consuming fortified home-based complementary foods. Arch Public Health. 74, 10(2016).
  14. Pinkaew, S., et al. Triple-fortified rice containing vitamin A reduced marginal vitamin A deficiency and increased vitamin A liver stores in school-aged Thai children. J Nutr. 144 (4), 519-524 (2014).
  15. Nimmannun, K., et al. Breast milk retinol concentrations reflect total liver vitamin A reserves and dietary exposure in Thai lactating women from urban and rural areas. J Nutr. 152 (12), 2689-2698 (2023).
  16. A campus laboratory fire involving lithium aluminum hydride. , https://ehs.stanford.edu/reference/campus-laboratory-fire-involvinglithium- aluminum-hydride (2025).
  17. Merlic, C. A., Ferber, C. J., Schroder, I. Lessons learned− lithium aluminum hydride fires. ACS Chem. Health Saf. 29 (4), 362-365 (2002).
  18. Chandra, T., Zebrowski, J. P. A safety guidance document for lithium aluminum hydride (LAH) reduction: A resource for developing specific SOPs on LAH manipulations. ACS Chemical Health & Safety. 31 (2), 162-171 (2024).
  19. Procedures for safe use of pyrophoric solids accessed. , https://ehs.ucsc.edu/programs/research-safety/documents/ucla-pyrophoric-solid.pdf (2025).
  20. Tang, G., et al. Green and yellow vegetables can maintain body stores of vitamin A in Chinese children. Am J Clin Nutr. 70 (6), 1069-1076 (1999).
  21. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  22. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2024).
  23. Valentine, A. R., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A isotope dilution predicts liver stores in line with long-term vitamin A intake above the current Recommended Dietary Allowance for young adult women. Am J Clin Nutr. 98 (5), 1192-1199 (2013).
  24. Sheftel, J., et al. Findings in 3 clinical trials challenge the accuracy of the Institute of Medicine's estimated average requirements for vitamin A in children and women. Am J Clin Nutr. 113 (5), 1322-1331 (2021).
  25. Suri, D., et al. Association between biomarkers of inflammation and total liver vitamin A reserves estimated by 13C-retinol isotope dilution among preschool children in five African countries. J Nutr. 153 (3), 622-635 (2023).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

A Vitamini Statüsü13C Retinil AsetatKaraciğer A VitaminiGaz Kromatografisiİzotop Oranı Kütle SpektrometrisiWittig-Horner Senteziİnce Tabaka KromatografisiUV-Vis SpektroskopisiYüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.