Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Retinal Ganglion Hücrelerinin Anatomik Özelliklerinin N-metil-D-aspartik Asit (NMDA) ile İndüklenen Eksitotoksisite Altında İncelenmesi

1.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68537

⸱

19 Eylül 2025

 ,  , 
1Ruiz Department of Ophthalmology and Visual Science, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center at Houston (UTHealth)

Bu makalede

Özet

Burada, NMDA kaynaklı eksitotoksisite altında fare retinalarının anatomik özelliklerini ve fenotiplerini araştırmak için genetik olarak yönlendirilmiş bir alkalin fosfataz (AP) etiketleme yönteminin kullanımını açıklıyoruz. Birkaç retinal ganglion hücresi (RGC) alt tipine özgü raportör hattı ile birlikte, dejeneratif süreç boyunca ölmekte olan RGC'lerde yeni fenotipleri ortaya çıkarıyoruz.

Özet

Retina ganglion hücreleri (RGC'ler), görsel bilgilerin beyne iletilmesinden sorumlu retinanın çıkış nöronlarıdır. Olgun fare retinasında, genomik, morfolojik ve fonksiyonel özelliklere dayalı olarak 40'tan fazla RGC tipi tanımlanmıştır. RGC dejenerasyonu, glokom ve travmatik optik nöropati dahil olmak üzere çeşitli zayıflatıcı retina hastalıklarının ayırt edici özelliğidir. Farklı hastalık koşullarında RGC dejenerasyonunun, hayatta kalmasının ve dayanıklılığının altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmalar hakkında daha derin bilgi edinmek, etkili terapötik müdahaleler geliştirmek için çok önemlidir. RGH dejenerasyonunu araştırmak için, daha önce RGH morfolojileri ve merkezi projeksiyon için retina geliştirme çalışmalarında yaygın olarak kullanılan basit ama güçlü bir teknik benimsedik. Burada, NMDA kaynaklı eksitotoksisite altında RGC'lerin anatomik fenotiplerini değerlendirmek için bu yöntemi uyguluyoruz. Bu yaklaşım, zaman içinde çok sayıda dejenere RGC'nin görselleştirilmesini sağlayarak, dejeneratif olayların sırasını haritalamamıza, ölmekte olan RGC'lerin ayırt edici fenotiplerini belirlememize ve NMDA kaynaklı hasara dirençli RGC'leri ayırt etmemize olanak tanır.

Giriş

Travmatik beyin hasarı (TBI), beyinde nöronal hasara neden olan ani bir yaralanmadır. Araba kazaları veya spor çarpışmaları ve patlamalardan kaynaklanan patlama yaralanmaları gibi ciddi TBI formlarında, mekanik kuvvetler hücre mimarisini bozarak iltihaplanmaya, oksidatif strese, eksitotoksisiteye ve sonunda nöronal ölüme yol açabilir 1,2.

Merkezi sinir sisteminin (CNS) en erişilebilir kısmı olan retina, eksitotoksisitenin altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek ve terapötik müdahale için stratejiler geliştirmek için model bir TBI sistemi olarak hizmet etmiştir 3,4,5. TBH çalışmaları için en uygun retina modelleri, optik sinir ezilme modeli ve retinaların N-metil-D-aspartik asit (NMDA) ile indüklenen eksitotoksisitesidir. NMDA'nın neden olduğu eksitotoksisite retina modelinde, retina ganglion hücreleri (RGC'ler) en duyarlı retina nöron tipi olarak tanımlanmıştır, çünkü RGC'ler ana uyarıcı nörotransmitter olarak glutamatı ve akson potansiyelini tetiklemek için AMPA reseptörleri (AMPAR'lar), KAPA reseptörleri (KAPAR'lar) ve NMDA reseptörleri dahil olmak üzere çeşitli glutamat reseptörlerini kullanır6. RGHC'lere ek olarak, diğer retina hücreleri ve nöral devreler de NMDA tedavisinden etkilenebilir 7,8,9. NMDA'nın intravitreus uygulaması, NMDA reseptörünün uzun süre açılmasını sağlar, bu da hücrelere aşırı kalsiyum akışına yol açarak aşırı uyarıcı nöronal aktiviteye ve dengesiz kalsiyum homeostazına neden olur 10,11,12,13.

NMDA reseptörü, üç alt birimden oluşan heteromerik bir komplekstir: GluN1, GluN2 ve GluN3 14,15,16,17,18. Grin1 tarafından kodlanan GluN1, Grin1'in alternatif eklenmesi nedeniyle farelerde sekiz izoform içerir. Dört ayrı gen tarafından kodlanan dört farklı GluN2 alt birimi (ad) vardır: Grin2a-2d. Grin3a ve 3b tarafından kodlanan iki farklı GluN3 alt birimi (a ve b) vardır. scRNA-seq verilerine19,20 göre, Grin1 çoğu RGC alt tipinde (Şekil 1A) ve ayrıca zayıf ila orta ekspresyon seviyelerine sahip birkaç amakrin hücre (AC) alt tipinde yüksek oranda eksprese edilir (Şekil 1B). Grin2a, daha az RGC ve AC alt tipinde zenginleştirilirken, Grin2b, çoğu RGC ve birçok AC alt tipinde orta derecede eksprese edilir (Şekil 1A, B). RGC'lerde ve AC'lerde Grin2c, Grin2d ve Grin3b'nin ekspresyon seviyeleri son derece düşüktür (Şekil 1A,B). Grin3a ekspresyonu birkaç RGC alt tipinde ve birkaç AC'de zayıf olarak görülebilir (Şekil 1A,B). NMDA reseptörlerinin rolüne ek olarak, kalsiyum geçirgen AMPAR'lar yoluyla kalsiyum akışıyla tetiklenen eksitotoksisite, birden fazla hastalık modelinde tanımlanmıştır21. NMDA reseptör alt birimlerinin ekspresyonu, NMDA ile indüklenen eksitotoksisitenin neden esas olarak RGC'leri ve ayrıca AC'leri 9,10,14,22,23 hedeflediğine dair ipuçları sağlayabilir.

Brüt NMDA ile indüklenen retina fenotiplerini değerlendirmenin geleneksel yöntemleri arasında histolojik anormallikleri saptamak için hematoksilen ve eozin (H&E) boyama, hücre ölümü için TUNEL testi ve hücre tipine özgü bir biyobelirteç 8,10,24,25,26 kullanılarak immünofloresan (IF) boyama yer alır . Hücresel düzeyde, NMDA ile indüklenen retina modelinde ölmekte olan RGH'lerdeki olayların sırasını araştırmak için konfokal görüntüleme ve boya doldurma teknikleri kullanılmıştır. Bu yöntemler, ölmekte olan RGC'lerin hücre altı bölmeleri hakkında değerli bilgiler sağlamış ve NMDA hakareti27,28 altında hayatta kalan esnek RGC tiplerinin tanımlanmasına izin vermiştir.

Burada, NMDA kaynaklı eksitotoksisite 29,30,31 altında fare retina nöronlarının anatomik özelliklerini ve fenotiplerini araştırmak için genetik olarak aktive edilmiş alkalin fosfataz (AP) boyaması kullanıyoruz. Bu yöntemin seçilmesinin mantığı, basitliği, maliyet etkinliği ve tüm retinadaki nöronal alt tiplerin anatomik özelliklerine kapsamlı bir genel bakış elde etme yeteneğinden kaynaklanmaktadır, bu da onu brüt değerlendirmeler ve büyük ölçekli karşılaştırmalı analizler için çok uygun hale getirmektedir. Bu yaklaşım, farklı, genetik olarak işaretlenmiş retina nöronlarının NMDA'ya hem brüt hem de hücre altı seviyelerde nasıl tepki verdiğine dair yeni bilgiler sağlar. Bu stratejinin, nöronal mimariyi ve sinaptik organizasyonu etkileyen çeşitli hastalık modellerindeki morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için geniş çapta uygulanabilir olacağını tahmin ediyoruz 4,26,32,33.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Laboratuvar Hayvanlarının İnsani Bakımı ve Kullanımına İlişkin ABD Halk Sağlığı Hizmeti Politikasını takip etti ve Houston'daki Texas Üniversitesi McGovern Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Çözeltilerin bileşimleri Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Tamoksifen enjeksiyonu

  1. 30 mg tamoksifeni 30 μL etanol ile karıştırın. Kaynama noktasının altındaki suda 1 mL ayçiçeği tohumu yağını ve tamoksifen/etanol karışımını ısıtın.
  2. Tamoksifen etanol içinde çözüldükten sonra, tamoksifen çözeltisine hızla 1 mL ısıtılmış ayçiçeği tohumu yağı ekleyin. Pipetleyerek iyice karıştırın.
  3. Her iki cinsiyetten de 2 ila 6 ay arasında çeşitli yaşlarda fareler kullanıldı. Tamoksifen solüsyonunu bir insülin şırıngası kullanarak intraperitoneal olarak 100 μg/g vücut ağırlığı dozunda enjekte edin. Fare çizgisine göre tamoksifen enjeksiyonlarının sayısını belirleyin. Bu protokolde, tamoksifen art arda dört gün boyunca günde bir kez uygulandı.
    NOT: Tamoksifen çözeltisi yoğun yağ ile karıştırıldığından, çıkarılabilir iğnesi olan bir şırınga ile tutulması zordur. Bu nedenle, tamoksifen enjeksiyonu için iğne takılı bir insülin şırıngası tercih edilir.
  4. Fareyi ayrı ayrı havalandırılan kafeslerde en fazla 5 kişilik gruplar halinde barındırın. NMDA enjeksiyonuna kadar.

2. NMDA solüsyonunun fare gözlerine enjeksiyonu

  1. Steril 1x PBS'de 20 mM NMDA çözeltisi hazırlayın. Nano enjektörü %100 etanol 20x kullanarak takılı 35G iğne ile yıkayın, ardından 20x daha steril ultra saf suyla yıkayın. Nano enjektörü 1 μL NMDA çözeltisi ile doldurun.
  2. Fareyi 1X PBS (vücut ağırlığının kg'ı başına 80/10 mg) çözelti karışımında bir ketamin / ksilazinin intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun. Kuyruk ve ayak parmağı sıkışmasına refleks geri çekilme tepkisi ile bilinç kaybını değerlendirin.
  3. Anestezi uygulanmış fareyi bir stereomikroskop üzerine yerleştirin. Fareyi sağ gözü yukarı bakacak ve burnu sağ tarafa bakacak şekilde konumlandırın. Lokal anestezi için sağ göz küresine bir damla %0,5 proparakain hidroklorür solüsyonu uygulayın.
  4. Limbusu saat 7 konumunda delmek için steril bir 30G enjeksiyon iğnesi kullanın ve küçük bir delik oluşturun. İğnenin yerini ve yönünü stereomikroskop altında izleyin. Kolay yerleştirmeye izin vermek için enjeksiyon iğnesinin boyutunun nano enjeksiyon iğnesinden biraz daha büyük olduğundan emin olun.
  5. Enjeksiyon iğnesini göz küresinden dikkatlice çıkarın ve uygun şekilde atın. Kılavuzluk için stereomikroskobu kullanın, nano enjeksiyon iğnesini limbustan vitreusa 45° açıyla sokun.
  6. Vitreusa yavaşça 1 μL NMDA çözeltisi enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, enjekte edilen solüsyonun dışarı akmasını önlemek için nano enjeksiyon iğnesini yaklaşık 10 saniye vitreusta tutun.
  7. Nano enjeksiyon iğnesini dikkatlice ve yavaşça gözden çekin. Enjekte edilen gözün korneasına% 0.5 eritromisin oftalmik merhem sürün.
  8. Fareyi bir ısıtma yastığının üzerindeki bir kafese yerleştirin. Anesteziden tamamen kurtulana kadar fareyi her 15 dakikada bir izleyin. Doku toplanana kadar fareyi bir ila iki hafta bekletin.

3. Doku toplama ve Alkalen Fosfataz (AP) boyama

  1. Fareyi CO ile ötenaziyapın2 boğulması, ardından servikal çıkık. Göz küresine ve optik sinire bağlanan kasları Vanna makası ile dikkatlice kesin.
  2. Göz küresi daha sonra forseps ile alındı ve ayrı etiketli 2.0 mL'lik tüplere aktarıldı.
  3. Gözbebeklerini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %10 nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin. Retinaları aşağıda açıklandığı gibi bir selüloz nitrat membran filtresine düz bir şekilde monte edin.
    1. Gözbebeklerini 1x PBS içeren 10 cm'lik Petri kaplarına aktarın. Forseps kullanarak göz küresine bağlı herhangi bir kas dokusunu tutun. 30G enjeksiyon iğnesi kullanarak limbusta bir delik oluşturun. Vanna makasının ucunu deliğe sokun ve ora serrata'nın etrafını kesin. Forseps kullanarak lensi vizör adaptöründen çıkarın.
    2. Göz lastiğinde 3-4 kesi yapın ve RPE'yi tutmak için forseps kullanın ve RPE'yi retinadan nazikçe çıkarın.
    3. Küçük bir parça selüloz nitrat membran filtreyi kesin ve 1x PBS'ye batırın. İzole retinayı filtreye yerleştirin. Retinanın kenarını filtreye tutturmak için ince bir boya fırçasının ucuyla retinanın periferik bir bölgesini hafifçe itin.
    4. Filtrenin kenarını tutun ve yavaşça 1x PBS'den dışarı çekin, retinanın filtreye bağlı kalmasını ve düzleşmesini sağlayın. Bağlı retinanın filtreye sabitlenmesine yardımcı olmak için retinayı/filtreyi 1 dakika boyunca bir kağıt havlu üzerine yerleştirin.
    5. Retinayı/filtreyi 1x PBS'li bir petri kabına geri aktarın. Forseps ve/veya ince bir boya fırçası kullanarak retinadaki kalıntıları, saçları ve vitreusu mümkün olduğunca dikkatlice temizleyin. Enjekte edilen ve edilmeyen retinaları ayırt etmek için filtreleri farklı şekillerde kırpın.
  4. Retinayı/filtreyi bir Petri kabına geri aktarın. Retinayı% 10 nötr tamponlu formalin içinde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak sabitleyin.
  5. 65 °C'lik bir su banyosu hazırlayın. 30 mL'lik bir cam beherde 1 mL 50x PBS'yi önceden ısıtın. Retinayı/filtreleri doğrudan önceden ısıtılmış 1x PBS'ye aktarın. Retinaları 65°C'de 30 dakika inkübe edin.
    NOT: Isıl işlem, retinada arka plan lekelenmesine neden olan endojen AP aktivitesini etkisiz hale getirir. Bu arka planı etkili bir şekilde ortadan kaldırmak için retinayı ısıtılmış solüsyonda tedavi etmek çok önemlidir.
  6. Isıl işlemden sonra retinaları AP tamponu (100 mM Tris, pH 9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2) içeren 30 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
  7. AP tamponundaki retinaları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca hafif çalkalayarak inkübe edin.
    NOT: Bu adım, retinadaki tamponu 1x PBS'den AP tamponuna değiştirerek renk gelişimi sırasında kimyasal çökelmeyi önler.
  8. AP tamponunu boyama solüsyonu ile değiştirin (10 mL AP tamponunda 30 μL 10 mg/mL BCIP ve 60 μL 10 mg/mL NBP).
  9. Petri kabını ışık içermeyen bir kutuya yerleştirin. AP reaksiyonunu, AP boyamanın yoğunluğu görüntüleme için tatmin edici olana kadar hafif çalkalama ile 1 ila 2 gün boyunca oda sıcaklığında geliştirin.
  10. Retinaları 1x PBS ile oda sıcaklığında 5 dakika, 2x hafifçe çalkalayarak yıkayarak reaksiyonu durdurun.
  11. Retinaları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %10 nötr tamponlu formalin ile hafif çalkalama ile sabitleyin.
  12. Retinaları 1x PBS ile oda sıcaklığında 5 dakika, 3x hafifçe çalkalayarak yıkayın. Retinaları %30 etanol içinde inkübe ederek kurutun, ardından oda sıcaklığında her biri 30 dakika boyunca %50 etanol ile hafif çalkalayarak kurutun.
  13. Retinaları filtre kağıdından nazikçe çıkarmak için ince bir boya fırçası kullanın. Filtresiz retinaları 30 dakika boyunca %70 etanol içinde dehidre edin, ardından oda sıcaklığında %100 etanol içinde hafif çalkalama ile 30 dakikalık iki inkübasyon yapın.
  14. Retinaları bir cam Petri kabında benzil benzat/benzil alkol (2:1, v/v) temizleme solüsyonu ile oda sıcaklığında 30 dakika ila 2 saat boyunca hafif çalkalayarak temizleyin.
    NOT: Bu temizleme prosedürü gece boyunca yapılmamalıdır, çünkü uzun süreli inkübasyon genellikle AP boyamasının kaybına neden olabilir. Temizleme solüsyonu plastiği eritebilir, bu nedenle prosedür bir cam kapta yapılmalıdır.
  15. Retinaları bir cam slayt üzerine monte etmek için, lamel ve retina için bir platform oluşturmak üzere slayta çift taraflı bant uygulayın. Retinaları lam üzerine yerleştirin, boşluğu temizleme solüsyonu ile doldurun, lamel uygulayın ve retinayı ve lamel sabitlemek için lamı oje ile kapatın.
  16. AP ile boyanmış retinaları bir Zeiss Apotome mikroskobu kullanarak görüntüleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Vitreusta NMDA uygulaması, geleneksel olarak histolojik boyama veya RGC belirteçleri ile immünofloresan (IF) boyama kullanılarak tespit edilen RGC ölümüne neden olur. Deneysel ortamımızda, bir pan-RGC belirteci RBPMS ile geleneksel IF stratejisini kullanarak, NMDA enjeksiyonundan 1 hafta sonra RGC sayısının yaklaşık e oranında azaldığını doğruladık (Şekil 2E-G). Önceki çalışmalar, Tbr2 eksprese eden RGC'lerin gerçekten de ipRGC'ler34,35

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, çeşitli RGC ve AC alt tiplerinde NMDA'nın neden olduğu dejeneratif olayları incelemek için bir dizi genetik olarak manipüle edilmiş fare çizgisi ile birlikte genetik olarak yönlendirilmiş seyrek bir AP etiketleme sistemi kullandık ve birkaç ayırt edici fenotip 29,31,39'u ortaya çıkardık. En göze çarpan fenotip, NMDA enjekte edilen retinalarda RGC'lerin ve AC'lerin önemli ölçüde aza...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri-Ulusal Göz Enstitüsü'nden CAM'a (EY024376) verilen hibelerle ve kısmen Ulusal Göz Enstitüsü Vision Core Grants P30EY028102 (UTHealth) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Stephen Lasher Endowment (UTHealth) ve Raye White Endowment'ın (UTHealth) mali desteğini de kabul ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.5% eritromisin oftalmik merhem Bausch+Lomb24208-910-55
%0.5 proparakain hidroklorür Bausch+Lomb24208-730-06
%10 nötr tamponlu formalin VWR89370-094
10 cm yaprakCorning430167
10x PBSFisher BilimselBP399 Serisi1x PBS ve otoklav oluşturmak için suyla seyreltin. 
2.0 ml tüpVWR525-1136
30 gauge enjeksiyon iğnesiEXELINT Uluslararası26437
30 mm petrikDoğan35208
Benzil alkol Acros Organik447000010
Benzil benzatAcros Organik105860010
Selüloz nitrat membran filtreCytiva7188-002
Kapak kaymasıElektron Mikroskobu Bilimleri72204-01
Çift taraflı bantViski597020
EtanolDecon Laboratuvarları2716AP boyamasından sonra dehidtrasyon için Fisher Bioreagents'tan (Cat#: BP2818) kaçının. Bu reaktif retinaları bozar.
ForsepsTED PELLA505
Isıtma yastığıTeratermik710298-001
İnsülin şırıngasıBD329424
KetaminDechra Hakkında17033010110
MikroskopZeissAksiyo Görüntüleyici 2
OjeElektron Mikroskobu Bilimleri72180
Nanofil enjektörDünya Hassas AletlerNANOFIL
Nanofil iğnesiDünya Hassas AletlerNF25BL
NBT/BICP reaktif kitiDavetliN6547 Serisi
NMDA'nınSigma-AldrichM3262 Serisi
Boya fırçasıKral sanatı6650
Sürgülü camFisher Bilimsel12-550-15
Stereo mikroskopMotikDM143
Ayçiçeği tohumu yağıSigma-AldrichS5007 Serisi
TamoksifenSigma-AldrichT5648 SerisiTamoksifen çözeltisini 4 ° C ışık geçirmez bir kutuda. Tamoksifen solüsyonunu bir hafta içinde kullanın.
Vanna makası Güzel Bilim Araçları15000-00
Su banyosuLaboratuvar Hattı18052
KsilazinDechra Hakkında17033-0099-05Ürün adı: Rompun

Kaynaklar

  1. Blennow, K., et al. Traumatic brain injuries. Nat Rev Dis Primers. 2, 16084(2016).
  2. Zetterberg, H., Blennow, K. Fluid biomarkers for mild traumatic brain injury and related conditions. Nat Rev Neurol. 12 (10), 563-574 (2016).
  3. Mohan, K., Kecova, H., Hernandez-Merino, E., Kardon, R. H., Harper, M. M. Retinal ganglion cell damage in an experimental rodent model of blast-mediated traumatic brain injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (5), 3440-3450 (2013).
  4. Lund, B. J., Rule, G. T. Pressure wave dosimetry for "Retinal ganglion cell damage in an experimental rodent model of blast-mediated traumatic brain injury". Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (3), 1348-1349 (2014).
  5. Peterson, S. L., et al. Retinal Ganglion Cell Axon Regeneration Requires Complement and Myeloid Cell Activity within the Optic Nerve. J Neurosci. 41 (41), 8508-8531 (2021).
  6. Boccuni, I., Fairless, R. Retinal Glutamate Neurotransmission: From Physiology to Pathophysiological Mechanisms of Retinal Ganglion Cell Degeneration. Life. 12 (5), 638(2022).
  7. Shen, Y., Luo, X., Liu, S., Nawy, S. Rod bipolar cells dysfunction occurs before ganglion cells loss in excitotoxin-damaged mouse retina. Cell Death Dis. 10 (12), 905(2019).
  8. Lambuk, L., et al. Dose-dependent effects of NMDA on retinal and optic nerve morphology in rats. Int J Ophthalmol. 12 (5), 746-753 (2019).
  9. Asami, Y., et al. Age-dependent changes in the severity of capillary degeneration in rat retina following N-methyl-D-aspartate-induced neurotoxicity. Curr Eye Res. 40 (5), 549-553 (2015).
  10. Siliprandi, R., et al. N-methyl-D-aspartate-induced neurotoxicity in the adult rat retina. Vis Neurosci. 8 (6), 567-573 (1992).
  11. Chidlow, G., Osborne, N. N. Rat retinal ganglion cell loss caused by kainate, NMDA and ischemia correlates with a reduction in mRNA and protein of Thy-1 and neurofilament light. Brain Res. 963 (1-2), 298-306 (2003).
  12. Shi, J. M., Jiang, Y. Q., Liu, X. Y. Morphological changes of retina after N-methyl-D-aspartate induced damage in rats. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 29 (3), 287-291 (2004).
  13. Nakazawa, T. Mechanism of N-methyl-D-aspartate-induced retinal ganglion cell death. Nippon Ganka Gakkai Zasshi. 113 (11), 1060-1070 (2009).
  14. Shen, Y., Liu, X. L., Yang, X. L. N-methyl-D-aspartate receptors in the retina. Mol Neurobiol. 34 (3), 163-179 (2006).
  15. Bai, N., et al. NMDA receptor subunits have different roles in NMDA-induced neurotoxicity in the retina. Mol Brain. 6, 34(2013).
  16. Cull-Candy, S., Brickley, S., Farrant, M. NMDA receptor subunits: diversity, development and disease. Curr Opin Neurobiol. 11 (3), 327-335 (2001).
  17. Wang, J. X., Furukawa, H. Dissecting diverse functions of NMDA receptors by structural biology. Curr Opin Struct Biol. 54, 34-42 (2019).
  18. Chou, T. H., Kang, H., Simorowski, N., Traynelis, S. F., Furukawa, H. Structural insights into assembly and function of GluN1-2C, GluN1-2A-2C, and GluN1-2D NMDARs. Mol Cell. 82 (23), 4548-4563.e4 (2022).
  19. Tran, N. M., et al. Single-Cell Profiles of Retinal Ganglion Cells Differing in Resilience to Injury Reveal Neuroprotective Genes. Neuron. 104 (6), 1039-1055.e12 (2019).
  20. Yan, W., et al. Mouse Retinal Cell Atlas: Molecular Identification of over Sixty Amacrine Cell Types. J Neurosci. 40 (27), 5177-5195 (2020).
  21. Guo, C., Ma, Y. Y. Calcium Permeable-AMPA Receptors and Excitotoxicity in Neurological Disorders. Front Neural Circuits. 15, 711564(2021).
  22. Lucas, D. R., Newhouse, J. P. The toxic effect of sodium L-glutamate on the inner layers of the retina. AMA Arch Ophthalmol. 58 (2), 193-201 (1957).
  23. Karl, M. O., et al. Stimulation of neural regeneration in the mouse retina. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (49), 19508-19513 (2008).
  24. DeParis, S., Caprara, C., Grimm, C. Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are resistant to N-methyl-D-aspartic acid excitotoxicity. Mol Vis. 18, 2814-2827 (2012).
  25. Fogo, G. M., Shuboni-Mulligan, D. D., Gall, A. J. Melanopsin-Containing ipRGCs Are Resistant to Excitotoxic Injury and Maintain Functional Non-Image Forming Behaviors After Insult in a Diurnal Rodent Model. Neuroscience. 412, 105-115 (2019).
  26. Cui, Q., Ren, C., Sollars, P. J., Pickard, G. E., So, K. F. The injury resistant ability of melanopsin-expressing intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. Neuroscience. 284, 845-853 (2015).
  27. Christensen, I., et al. The Susceptibility of Retinal Ganglion Cells to Glutamatergic Excitotoxicity Is Type-Specific. Front Neurosci. 13, 219(2019).
  28. Yang, N., Young, B. K., Wang, P., Tian, N. The Susceptibility of Retinal Ganglion Cells to Optic Nerve Injury is Type Specific. Cells. 9 (3), 677(2020).
  29. Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480 (4), 331-351 (2004).
  30. Badea, T. C., Nathans, J. Morphologies of mouse retinal ganglion cells expressing transcription factors Brn3a, Brn3b, and Brn3c: analysis of wild type and mutant cells using genetically-directed sparse labeling. Vision Res. 51 (2), 269-279 (2011).
  31. Jamal, L., Kiyama, T., Mao, C. A. Genetically Directed Sparse Labeling System for Anatomical Studies of Retinal Ganglion Cells. Methods Mol Biol. 2092, 187-194 (2020).
  32. Hinds, J. W., Hinds, P. L. Early ganglion cell differentiation in the mouse retina: an electron microscopic analysis utilizing serial sections. Dev Biol. 37 (2), 381-416 (1974).
  33. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
  34. Mao, C. A., et al. T-box transcription regulator Tbr2 is essential for the formation and maintenance of Opn4/melanopsin-expressing intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 34 (39), 13083-13095 (2014).
  35. Chen, C. K., et al. Characterization of Tbr2-expressing retinal ganglion cells. J Comp Neurol. 529 (15), 3513-3532 (2021).
  36. Zhang, X. M., et al. Highly restricted expression of Cre recombinase in cerebellar Purkinje cells. Genesis. 40 (1), 45-51 (2004).
  37. Kiyama, T., et al. Essential Roles of Tbr1 in the Formation and Maintenance of the Orientation-Selective J-RGCs and a Group of OFF-Sustained RGCs in Mouse. Cell Rep. 27 (3), 900-915.e5 (2019).
  38. Kiyama, T., Chen, C. K., Zhang, A., Mao, C. A. Differential Susceptibility of Retinal Neurons to the Loss of Mitochondrial Biogenesis Factor Nrf1. Cells. 11 (14), 2203(2022).
  39. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23 (6), 2314-2322 (2003).
  40. Mao, C. A., et al. Eomesodermin, a target gene of Pou4f2, is required for retinal ganglion cell and optic nerve development in the mouse. Development. 135 (2), 271-280 (2008).
  41. Shi, M., et al. Genetic interactions between Brn3 transcription factors in retinal ganglion cell type specification. PLoS One. 8 (10), e76347(2013).
  42. Muzyka, V. V., Brooks, M., Badea, T. C. Postnatal developmental dynamics of cell type specification genes in Brn3a/Pou4f1 Retinal Ganglion Cells. Neural Dev. 13 (1), 15(2018).
  43. Liu, S., Aldinger, K. A., Cheng, C. V., Kiyama, T., Dave, M., McNamara, H. K., Zhao, W., Stafford, J. M., Descostes, N., Lee, P., et al. NRF1 association with AUTS2-Polycomb mediates specific gene activation in the brain. Mol Cell. 81 (22), 4663-4676.e8 (2021).
  44. Kiyama, T., Altay, H. Y., Badea, T. C., Mao, C. A. Pou4f1-Tbr1 transcriptional cascade controls the formation of Jam2-expressing retinal ganglion cells. Front Ophthalmol. 3, 1175568(2023).
  45. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

NMDA EksitotoksisitesiRGC DejenerasyonuFare RetinasıHücre MorfolojisiHücre SağkalımıHücre DayanıklılığıRetinal HastalıklarAnatomik FenotiplerHücre Etiketleme
Retinal Ganglion Hücrelerinin Anatomik Özelliklerinin N-metil-D-aspartik Asit (NMDA) ile İndüklenen Eksitotoksisite Altında İncelenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.