Yöntem makalesi

Hiperpolarize 13C NMR kullanarak canlı hücrelerde gerçek zamanlı metabolik tespit

DOI:

10.3791/68539

⸱

8 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Quantum Life Science, National Institutes for Quantum Science and Technology, 2Institute of Pure and Applied Sciences, University of Tsukuba, 3Department of Applied Biological Chemistry, Graduate School of Agriculture, Osaka Metropolitan University, 4Center of Quantum Life Science for Structural Therapeutics (cQUEST), Chiba University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, canlı hücrelerde gerçek zamanlı piruvat metabolizmasını ölçmek için özel olarak oluşturulmuş bir biyoreaktör sistemini hiperpolarize ¹³C NMR spektroskopisi ile entegre ederek metabolik çalışmalar ve ilaç tarama uygulamaları için tekrarlanabilirliği ve kinetik doğruluğu artırır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, canlı hücrelerdeki piruvat metabolizmasını gerçek zamanlı olarak ölçmek için şirket içi yerleşik bir biyoreaktör sistemini hiperpolarize 13C nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ile entegre etmek için bir yöntem sunar. Protokol, stabil bir hücre kültürü ortamını korurken hiperpolarize substrat enjeksiyonunun ve NMR sinyal alımının hassas zamanlamasına izin veren bir biyoreaktör sisteminin inşasını ana hatlarıyla belirtir. Yöntem, proses boyunca yeterli bir sinyal-gürültü oranını korurken, piruvatın laktata metabolik dönüşümünü 60 s'lik bir ölçüm penceresi içinde güvenilir bir şekilde tespit eder. Sistemin yerinde karıştırma özelliği, NMR sinyal algılamasını hızlandırır ve T1 gevşeme kayıplarını azaltır. Protokol ayrıca, hücreleri kapsüllemek ve bunları biyoreaktör içine yerleştirmek için aljinat jellerin hazırlanması için ayrıntılı talimatlar içerir. Önerilen yöntem, geleneksel yöntemlere kıyasla daha iyi tekrarlanabilirlik ve kinetik doğruluk sergiler, bu da kanser metabolizması çalışmalarında ve ilaç taramasında potansiyel uygulamaları gösterir. Alternatif jel matrislerinin benimsenmesi gibi sistemin daha fazla iyileştirilmesi, çeşitli biyolojik çalışmalarda çok yönlülüğünü artırabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiperpolarize NMR, özellikle dinamik nükleer polarizasyon (DNP) yoluyla, NMR sinyal yoğunluğunu1 önemli ölçüde artırır ve büyük ölçüde geliştirilmiş hassasiyet 2,3 ile metabolik değişikliklerin gerçek zamanlı izlenmesini sağlar. Bu teknik, maya4,5, kanser hücresi modelleri 6,7,8 ve mikroorganizmalar 9,10 dahil olmak üzere çeşitli biyolojik sistemlerde başarıyla uygulanmıştır. Ayrıca glikoliz 11,12, redoks homeostazı13,14 ve pH regülasyonu15,16 gibi temel metabolik yolları izlemek için de kullanılmıştır. Temel araştırmaların ötesinde, hiperpolarize NMR artık MRG yoluyla klinik görüntülemede kullanılmakta ve hücreselden tüm vücut ölçeğine metabolik değerlendirmeye izin vermektedir17. Bu gelişmeler, hiperpolarize NMR'nin çeşitli biyolojik bağlamlarda daha geniş kullanımını kolaylaştıran erişilebilir protokollere yönelik artan talebin altını çizmektedir.

Çok yönlülüğüne rağmen, hiperpolarize NMR kullanarak canlı hücrelerde gerçek zamanlı metabolik ölçümlerin uygulanması teknik olarak zor olmaya devam etmektedir. Konvansiyonel sistemler genellikle tekrarlanabilirliği olmayan ve kapsamlı uzmanlık olmadan çalıştırılması zor olan karmaşık, laboratuvara özel kurulumlara dayanır 8,18,19,20. Bu, biyolojik veya translasyonel araştırmalar için bu teknolojiyi benimsemeyi hedefleyen araştırmacılar için büyük bir engel teşkil etmektedir. Optik görüntüleme veya kütle spektrometresi gibi alternatif yöntemlerle karşılaştırıldığında, hiperpolarize 13C NMR, tahribatlı örnekleme olmadan spesifik metabolik reaksiyonların invaziv olmayan, zaman çözümlü izlenmesine izin verir. Zamansal hassasiyetle doğrudan biyokimyasal bilgi sağlar, bu da onu hücresel metabolizmanın dinamik çalışmaları için çok uygun hale getirir.

Bu sınırlamaları ele almak için, bu çalışma, araştırmacıların canlı hücre metabolizmasının hiperpolarize NMR ölçümlerini minimum teknik engelle gerçekleştirmelerini sağlamak için özel olarak tasarlanmış pratik ve tekrarlanabilir bir protokol sunmaktadır. Canlı hücrelerde piruvat metabolizmasının temel ölçümü için kapsamlı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol diğer 13C etiketli proba uygulanabilirken, piruvat hızlı hücresel alımı, iyi karakterize edilmiş metabolik yolları ve hücresel metabolizmadaki merkezi rolü nedeniyle özellikle uygundur. Prosedür şunlardan oluşur: (i) hücre örneklerinin hazırlanması, (ii) aljinat jellerde kapsülleme, (iii) bir DNP polarizörü kullanılarak hiperpolarizasyon ve (iv) 400 MHz'lik bir spektrometrede gerçek zamanlı 13C NMR ölçümü (Şekil 1). Ek olarak, standart NMR donanımı ile tekrarlanabilirliği ve uyumluluğu sağlamak için biyoreaktör sistemini oluşturmak için temel parametreler sağlanmıştır. Protokol, ticari olarak mevcut bileşenleri kullanarak uygulama kolaylığı için optimize edilmiştir ve araştırmacıların, özellikle de tekniğe yeni olanların, deneysel ihtiyaçlarına uygunluğunu belirlemelerine yardımcı olmayı amaçlamaktadır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Biyoreaktör kurulumu (Şekil 2A-B)

  1. NMR Tüpünün Montajı
    1. Boru yerleştirmek için üstü açık kapaklı vidalı bir NMR borusu (10 mm çap, uzunluk 178 mm) kullanın.
    2. Bir silikon/PTFE flakon septumu (9 mm çapında) hazırlayın ve sıkı sızdırmazlık için içinden bir PEEK tüpü yerleştirin (Ek Şekil 1).
    3. Septumu kimyasal olarak dirençli PEEK hortumlu (iç çap 1.0 mm, dış çap 1.6 mm, duvar kalınlığı 0.3 mm, uzunluk 1 m) modifiye edilmiş kapağın açıklığına yerleştirin.
    4. Septumu NMR tüpü ile üstü açık kapağı arasına yerleştirin ve kapağı sıkıca kapatarak sabitleyin. Bu kurulum septumu yerinde tutar ve perfüzyon veya enjeksiyon sırasında sızıntıyı önlemek için yeterli bir sızdırmazlık sağlar.
  2. Orta dağıtım borusunun kurulması (Şekil 2C)
    1. Sürekli perfüzyonu sağlamak için PEEK tüpünü NMR tüpünün giriş ve çıkış portlarına bağlayın. Sızıntıyı önlemek için flanşsız bir bağlantı seti kullanarak bağlantıları sabitleyin.
  3. Orta ısınma bileşenlerinin takılması
    1. PEEK hortumunu yaklaşık 0,2 mL/dk'lık sabit bir akış hızına ayarlanabilen peristaltik bir pompaya bağlayın ve harici bir sirkülasyon kiti aracılığıyla sürekli ortam sirkülasyonu sağlayın. Sıcaklığı korumak için orta rezervuarı 37 °C'ye ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin.
  4. Jel sızıntısı önleme bileşeni ekleme
    1. NMR boru çapına uyacak şekilde yoğun bir sünger kesin. Orta akışa izin verirken aljinat jel sızıntısını önlemek için süngeri tüpün altına yerleştirin.
  5. 3D baskılı sünger sabitleme bileşeninin imalatı ve yerleştirilmesi (Şekil 2D-F)
    1. 3D baskı, stereolitografik 3D baskı ile uyumlu bir fotopolimer reçine kullanarak silindirik bir tutucu (dış çap 9,1 mm, uzunluk 20 mm, 1,5 mm çapında merkezi delik) yazdırın. Tasarım özellikleri ekteki Ek Dosya 1'de verilmiştir.
    2. 3D baskılı tutucunun önceden oluşturulmuş deliğinden bir borosilikat cam kılcal damar (dış çap 1,5 mm, iç çap yaklaşık 0,9 mm, uzunluk 90 mm) yerleştirin.
    3. Süngeri, su geçirmezlik özelliğine sahip UV ile kürlenebilen reçine kullanarak tutucu üzerindeki platforma tutturun. Katılaşmayı sağlamak için UV ışığı altında 30 saniye kürleyin.
    4. Monte edilmiş tutucuyu süngerle NMR tüpüne yerleştirin.

2. Hücre hazırlığı (ölçümden 2 hafta önce başlayın)

  1. Donmuş hücre stoklarını (SCCVII veya HeLa) 37 °C'lik bir su banyosunda hızla çözün. % 10 ( v / h) fetal sığır serumu ve% 1 (h / h) penisilin-streptomisin ile desteklenmiş 10 mL RPMI-1640 ortamına yaklaşık 1 × 10 6 hücre aktarın.
  2. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ile kültür ve % 70 -% 80 birleşmeye ulaşıldığında her 2-3 günde bir geçirin. Yaklaşık% 90 birleşmeye kadar büyütülmüş beş adet 10 cm'lik tabaktan tahmin edilen ~ 4 x 107 hücre elde etmek için yaklaşık 2 hafta boyunca kültürlemeye devam edin (her biri ~ 8 x 106 hücre verir).

3. Aljinat jel hazırlama

  1. Aljinat çözeltisinin hazırlanması
    1. %2 (a/a) bir çözelti hazırlamak için biyolojik araştırma sınıfı sodyum aljinat tozunu deiyonize suda çözün. Çözeltiyi gece boyunca 25 ° C veya daha yüksek bir sıcaklıkta nazikçe uçtan uca çalkalama ile inkübe edin. Kabarcıkları önlemek ve homojen çözünmeyi sağlamak için yaklaşık 10-20 rpm'ye ayarlanmış bir tüp döndürücü kullanın.
  2. Hücrelerin aljinat jel içinde kapsüllenmesi
    1. 10 cm'lik tabağa 2 mL %0,25 (h/h) tripsin-EDTA ekleyin. Çanağı tüm yüzeyi kaplayacak şekilde eğin ve fazla tripsin-EDTA'yı aspire edin.
    2. Çanağı 37 °C'de 2 dakika inkübe edin.
    3. Yemeğe 10 mL kültür ortamı ekleyin. Hücreleri ayırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Tüm hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın.
    4. Süspansiyonun yaklaşık 10 μL'sini alın ve bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın. Tipik olarak, sonraki prosedürler için yaklaşık 1 × 107 hücre gereklidir, ancak gerçek sayı ölçümle doğrulanmalıdır.
    5. Kalan hücre süspansiyonunu 120 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 4 mL% 2 (a / h) aljinat çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Kabarcık oluşumunu en aza indirmek için yavaşça pipetleyin.
  3. Kalsiyum çapraz bağlama ile jel oluşumu (Şekil 3)
    1. 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 10 mL 50 mM CaCl2 çözeltisi ekleyin (Şekil 3A).
    2. 300 μL hücre-aljinat karışımını 30G, 10 mm'lik bir iğne ile donatılmış 0.5 mL'lik bir şırıngaya alın ve santrifüj tüpünün kapağına sabitleyin (Şekil 3B).
    3. Santrifüj tüpünün kapağını, şırınga sabitlenmiş olarak sıkıca kapatın ve tüm düzeneği 5 dakika boyunca 200 × g'da nazikçe santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatan çözeltiyi çıkarın ve hücre yüklü jeli ortamda yeniden süspanse edin (Şekil 3C-D).
  4. Jelin NMR tüpüne yüklenmesi
    1. Hücre kapsüllü jeli bir Pasteur pipeti kullanarak NMR tüpüne aktarın. Sünger fikstürü yerleştirin ve sıkı bir sızdırmazlık sağlayın.
    2. Adım 1.3.2'de hazırlanan orta rezervuarı (%5 (h/h) D2O içeren) bir su banyosunda 37 °C'ye önceden ısıtın ve koşulları stabilize etmek için yaklaşık 500 μL/s hızında dolaştırın.
    3. NMR tüpünü mıknatısa yerleştirmeden önce sızıntı olmadığından emin olun. PEEK borusunu düz tutarken NMR tüpünü mıknatısın içine yerleştirin. Jel boyutunu, boncuk sayısını ve pipetleme hızını hücre tipine ve deneysel gereksinimlere göre ayarlayın.

4. Bir DNP polarizör kullanılarak hiperpolarize probun hazırlanması (Şekil 4)

  1. Numune şişesinin hazırlanması
    1. Bir numune şişesine 25 mM OX063 katkılı 18 μL [1-13C] pirüvik asit (14.2 M) ekleyin. Şişeyi DNP polarizör sisteminin sıvı yoluna bağlayın.
  2. Numunenin polarizasyonu
    1. Şişeyi DNP polarizörün delik ünitesine yerleştirin (6,7 T, 1,25 K, 1,2 mbar). 60-80 dakika boyunca yaklaşık 188 GHz'de (22 mW) mikrodalga ışınlaması uygulayın.
  3. Polarizasyon sırasında sinyalin izlenmesi
    1. 13C sinyal yoğunluğunu izlemek için DNP sisteminde yerleşik olarak bulunan katı hal NMR spektrometresini kullanın. NMR yazılımını (SPINit) kullanarak her 5 dakikada bir sinyal verilerini kaydedin.
  4. Hiperpolarize çözeltiyi çözün ve hazırlayın
    1. Polarize numuneyi 3.2 mL önceden ısıtılmış çözünme tamponunda (40 mM Tris, 50 mM NaCl, 80 mM NaOH, 100 mg / L EDTA) hızla çözün. NMR ölçümü için aktarmadan önce çözeltinin biyolojik sıcaklığa (308-313 K, pH ~ 7) ulaştığından emin olun.
      NOT: Yüksek basınçlı bileşenleri tutarken dikkatli olun. Verimli transfer ve numune bütünlüğü sağlamak için çözünme tamponunu ~ 461 K'ye önceden ısıtın.

5. NMR kurulumu

  1. NMR spektrometresinin hazırlanması
    1. Numuneyi NMR tüpüne yükleyin ve spektrometreye yerleştirin.
    2. Spektral çözünürlüğü ve sinyal kararlılığını optimize etmek için numune eklenmiş otomatik prosedürü kullanarak NMR konsolunda kilitleme, ayarlama, eşleştirme ve şimleme gerçekleştirin.
  2. Alım parametrelerinin ayarlanması
    1. Proton ayırma etkinken (örneğin, 13-CPD) 13C'lik bir darbe alma dizisi (örneğin, zg2d) yükleyin.
    2. 1 μs'lik bir darbe (P1) kullanarak çevirme açısını 90°'ye ayarlayın. Edinme süresini 1.376 s, spektral genişliği 23.663 Hz ve edinme noktası sayısını (TD) 65.536 olarak ayarlayın. Gevşeme gecikmesini (D1) 0 s'ye ayarlayın.
    3. Sözde 2D modunda 150 sıralı spektrum elde etmek için zaman artışlarının sayısını (TD150) 150'ye ayarlayın. Hiperpolarize örneklerden gelen sinyal doygunluğunu önlemek için alıcı kazancını düşük bir değere (örn. ~1) ayarlayın.
      NOT: Hiperpolarize NMR'nin yüksek sinyal yoğunluğu nedeniyle, alıcı kazancını tipik olarak mevcut maksimum kazancın %1'inden daha azına karşılık gelen düşük bir değere (örn. ~1) ayarlayın. Alıcı kazancı, sinyal amplifikasyonunu kontrol eden dahili, birimsiz bir parametredir. Aşırı yüksek değerler sinyal doygunluğuna neden olabilir.

6. NMR ölçümü

  1. Ölçüm için hazırlık
    1. Hava sıkışmasını önlemek için giriş borusundan NMR tüpüne kadar olan tüm giriş borusu yolunu çözünme tamponu ile doldurun (Şekil 2B). Giriş borusu hem orta perfüzyon hem de hiperpolarize prob enjeksiyonu için kullanılır.
    2. Bu bölgedeki kabarcıklar NMR ölçümleri sırasında sinyal alımını engelleyebileceğinden, giriş borusunda veya NMR tüpünün içinde hava kabarcığı olmadığını dikkatlice kontrol edin.
  2. Hiperpolarize çözelti enjeksiyonu için hazırlık
    1. Hiperpolarize çözeltiyi giriş borusundan enjekte etmeden önce orta sirkülasyonu geçici olarak durdurmak için peristaltik pompayı durdurun.
    2. Enjeksiyondan sonra NMR algılama bölgesine varışta sinyalin hemen yakalanmasını sağlamak için hiperpolarize substratı çözmeden yaklaşık 10 saniye önce spektral edinimi başlatın.
    3. DNP polarizörden çıktığında bir şırınga ile 1 mL çözelti çekin.
  3. Hiperpolarize çözeltinin enjeksiyonu ve sinyalin doğrulanması
    1. Hiperpolarize çözeltiyi NMR tüpüne enjekte etmek için biyoreaktör girişindeki üç yollu vanayı Konum B'ye getirin.
    2. Orta sirkülasyonu sürdürmek ve geri akışı önlemek için enjeksiyondan sonra valfi tekrar A Konumuna getirin.
    3. Edinme yazılımındaki Serbest İndüksiyon Bozunması (FID) sinyalinde bir artış gözlemleyerek başarılı enjeksiyon ve substrat varışını onaylayın.

7. Veri işleme ve analizi

  1. Spektral verilerin işlenmesi
    1. Zaman çözümlü NMR spektrumunu veri işleme yazılımına yükleyin. Veriler ser dosya biçiminde saklanıyorsa, uygun dosyayı bulun ve yükleyin.
  2. Spektrumları analiz etme
    1. Ham FID'yi frekans alanına dönüştürmek için Fourier Dönüşümünü (FT) gerçekleştirin. Faz düzeltmesini manuel veya otomatik olarak uygulayın. Bozulmaları gidermek için taban çizgisi düzeltmesi yapın.
  3. Metabolit dönüşümünün görselleştirilmesi
    1. Piruvat C1 (~ 171 ppm) ve laktat C1 (~ 183 ppm) için zaman seyri sinyallerini çizin.
  4. Metabolik dönüşümün nicelleştirilmesi
    1. Piruvat ve laktat zirveleri için eğrinin altındaki alanı (AUC) hesaplayın.
    2. Laktatın EAA'sını piruvatınkine bölerek [Laktat]/[Piruvat] oranını belirleyin.
      NOT: Büyük hiperpolarize [1-¹³C] piruvat sinyalinin neden olduğu çınlama artefaktlarının etkisini en aza indirmek için tepe yüksekliği yerine AUC kullanılır. AUC değerleri, her bir tepe noktası için tanımlanan entegrasyon aralığındaki sinyal yoğunluklarının basit bir şekilde toplanmasıyla elde edilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, canlı hücrelerde piruvat metabolizmasını gerçek zamanlı olarak ölçmek için fabrikasyon bir sistem hiperpolarize 13C NMR spektroskopisine bağlandı. 1D 13C NMR spektrumunda tespit edilen ana sinyaller, piruvat (yaklaşık 171 ppm) ve laktata (yaklaşık 183 ppm)21 karşılık geldi ve fizyolojik koşullar altında piruvatın laktata metabolik dönüşümünü değerlendirmemize izin verdi (Şekil 4).

Spektral kalite ve sinyal dinamiği
Hiperpolarize MRG çalışmalarında sıklıkla kullanılan bir fare skuamöz hücreli karsinom hattı olan SCCVII hücreleri kullanılarak aynı numune üzerinde tekrarlanan ölçümlerden elde edilen temsili sonuçlar Şekil 5'te gösterilmektedir. İlk ölçüm, aktif metabolik dönüşümü gösteren laktat sinyalinde net bir artış gösterdi. Bununla birlikte, 1.5 saatlik aralıklarla yapılan sonraki ölçümler, metabolik aktivitede ilerleyici bir düşüş gösterdi. Bu zamana bağlı azalma muhtemelen ilk piruvat enjeksiyonunun neden olduğu biyolojik stresi veya adaptasyonu yansıtır. Özellikle, benzer bir geçici metabolik modülasyon bildirilmiştir in vivo piruvat uygulamasını takiben tümör oksijenasyonunun geçici olarak azaldığı hiperpolarize MRI ve EPRI kullanılarak22. Bu sonuçlar, bu ölçümlerin tekrarlanabilirliğinin, dinamik metabolik değişikliklerin tahribatsız bir şekilde izlenmesini sağladığını göstermektedir - bu, yıkıcı yöntemlerle elde edilmesi zor bir avantajdır23.

Bu protokolün diğer hücre tiplerine uygulanabilirliğini değerlendirmek için, yaygın olarak kullanılan bir insan kanseri hücre hattı olan HeLa hücreleri kullanılarak ek ölçümler yapıldı. Şekil 6'da gösterildiği gibi, HeLa hücreleri ayrıca net piruvattan laktata dönüşüm göstermiştir. T1 gevşemesi nedeniyle sinyal yoğunluğu kademeli olarak azalsa da, sinyal-gürültü oranı 60 s alım süresi boyunca yeterli kaldı. Bu bulgular, mevcut protokolün geniş çapta uygulanabilir olduğunu ve çeşitli hücre tiplerinde gerçek zamanlı metabolik profilleme için çok yönlü bir araç olarak hizmet edebileceğini göstermektedir.

Hızlı sinyal bozulması, DNP tabanlı NMR'nin doğal bir sınırlaması olsa da, yerinde karıştırma sistemimiz çözünme ve ölçüm arasındaki gecikmeyi en aza indirerek algılama hassasiyetini artırır. Jel matris bileşiminin optimize edilmesi gibi daha fazla iyileştirme, bu yöntemin uygulanabilirliğini daha geniş bir biyolojik sistem yelpazesine genişletebilir.

figure-results-1
Şekil 1: Hücre kültüründen hiperpolarize NMR ölçümüne kadar genel iş akışının şematik diyagramı. İşlem, hücre kültürü (~ 2 hafta) ile başlar, ardından stabil ölçüm için hücreleri kapsüllemek için aljinat jel hazırlığı (~ 60 dakika) ile devam eder. Daha sonra, bir DNP polarizör sistemi (~ 60 dakika) kullanılarak hiperpolarizasyon gerçekleştirilir ve NMR ölçümü bir 400 MHz NMR spektrometresi (~ 5 dakika) kullanılarak gerçekleştirilir. Sağdaki fotoğraflar, bu iş akışında kullanılan ilgili araçları göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Hiperpolarize NMR ölçümü için biyoreaktör kurulumu. (A) Biyoreaktör kurulumunun şematik diyagramı. Kültür ortamı, giriş A'dan NMR tüpüne verilir ve daha sonra atığa yönlendirilir. Canlı hücreler içeren aljinat boncuklar NMR tüpünün içine yerleştirilir. Hiperpolarize NMR ölçümleri sırasında, hiperpolarize prob, hiperpolarize prob girişi olarak etiketlenen B girişinden enjekte edilir. (B) Giriş ve çıkış boruları açıkça etiketlenmiş olarak tüm biyoreaktör kurulumunun fotoğrafı. (C) Giriş A (orta perfüzyon) ve giriş B'yi (hiperpolarize prob enjeksiyonu) gösteren giriş borusu anahtarının yakından görünümü. (D) CAD tasarımı ve (E) NMR tüpünün içine yerleştirilen 3D baskılı sünger sabitleme bileşeninin temsili fotoğrafı. Bileşen, hiperpolarize substrat çözeltisini ileten bir cam kılcal damarı yönlendirmek için bir delik ve bir süngeri tutmak için bir platform içerir. Bileşenin kendisi NMR tüpünün iç duvarına sıkıca oturmuyor; (F) bunun yerine, boşluğu doldurmak için etrafına bir sünger yerleştirilir. Bu yapı, bileşeni stabilize eder ve atık ortamın süngerden yukarı doğru akmasına izin vererek ek bir çıkış deliği ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Aljinat jel hazırlama. (A) Aljinat jel topu oluşturma aparatının şematik gösterimi ve (B) fotoğrafı. Soldaki resim, modifiye edilmiş kapağına sabitlenmiş bir şırınga ile santrifüj tüpü de dahil olmak üzere tüm kurulumu göstermektedir. Sağ üstteki resimde şırınga ucu için küçük bir deliği olan bir kapak gösterilirken, sağ alttaki resimde sabit şırınga konumlandırması için kare açıklıklı bir kapak gösterilmektedir. Santrifüj tüpü, 10 mL kalsiyum klorür çözeltisi ile önceden doldurulur, bu da şırınga ucundan çıkan aljinat çözeltisinin jelleşmeye uğramasına ve aljinat jel topları oluşturmasına izin verir. (C) Aljinat jel toplarının morfolojisini gösteren temsili mikroskobik görüntü. (D) HeLa hücreleri içeren aljinat jel toplarının morfolojisini gösteren temsili mikroskobik görüntü. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: NMR ölçümü ve hiperpolarizasyon için hazırlık adımlarının şematik gösterimi. ~60 dakikalık DNP oluşturma işlemi sırasında, gecikmeleri en aza indirmek için NMR kurulumu paralel olarak gerçekleştirilir. Hazırlık, NMR tüpüne aljinat boncuk yüklenmesini ve ardından sistemin anında ölçüme hazır olmasını sağlamak için 1H kilit ayarı, şimleme ve prob ayarını içerir. Çözünme ve yerinde karıştırmadan sonra, zamanla çözülen 13C NMR spektroskopisi, berrak piruvat ve laktat piklerini ortaya çıkarır. Yaklaşık 171 ppm, 179 ppm ve 183 ppm'de gözlenen tepe noktaları sırasıyla piruvat, piruvat hidrat ve laktata karşılık gelir. NMR ölçümü için aljinat jel içinde kapsüllenmiş yaklaşık 4 ×10 7 HeLa hücresi kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Tekrarlanan ölçümlerde piruvat ve laktat sinyallerinin zamana bağlı tespiti. Aynı SCCVII hücre kapsüllü numunenin hiperpolarize 13C NMR spektrumları, tekrarlanan tahribatsız ölçümlerin fizibilitesini değerlendirmek için 1.5 saatlik aralıklarla elde edildi. Piruvat (açık daireler) ve laktat (doldurulmuş daireler, 1000× ölçeklendirilmiş) tepe yoğunlukları, her edinim için zaman içinde çizilir. (A) İlk ölçüm. (B) İkinci ölçüm, 1,5 saat sonra, laktat üretiminde belirgin bir azalma olduğunu ortaya koymaktadır. (C) Üçüncü ölçüm, 1.5 saat sonra, sürekli düşük metabolik aktiviteyi doğruladı. Eğrinin altındaki alana (AUC) dayalı kantitatif analiz, [Laktat]/[Piruvat] oranının 0.00134'ten (ilk ölçüm) 0.00019 (ikinci) ve 0.00027'ye (üçüncü) düştüğünü gösterdi. Aljinat jelindeki son hücre konsantrasyonu yaklaşık 1.0 × 107 hücre / mL idi (4 mL'de 4 × 107 hücre). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: HeLa hücrelerinde piruvatın laktata dönüşümü. Canlı HeLa hücrelerinde zamanla çözülen hiperpolarize 13C NMR piruvat ve laktat sinyalleri ölçüldü. Piruvat sinyal yoğunluğu, sıfır zamanında maksimum değerine normalize edilir. Laktat sinyal yoğunluğu, görünürlük için 10:3 faktörü ile ölçeklendirilir. Eğrinin altındaki alana (AUC) dayalı kantitatif analiz, 0.00121'lik bir [Laktat]/[Piruvat] oranı gösterdi. Aljinat jeldeki son hücre konsantrasyonu yaklaşık 7.5 × 106 hücre / mL idi (4 mL'de 3 ×10 7 hücre). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 

Ek Şekil 1. Biyoreaktör sisteminde kullanılan flakon septumun temsili görüntüleri. (A) Kullanmadan önce silikon/PTFE septum (9 mm çap). (B) Gerçek kullanımda aynı septum, PEEK boruları delinmiş deliklerden sokulur. Septum malzemesinin elastikiyeti, hiperpolarize substrat enjeksiyonu sırasında hava geçirmez koşulları koruyarak borunun etrafını yeniden kapatmasına izin verir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın

Ek Şekil 2: Harici karıştırmadan sonra elde edilen zamanla çözülen hiperpolarize 13C NMR spektrumu. [1-13C] piruvat metabolizmasının temsili zaman çözümlü spektrumu, hiperpolarize piruvat ve NMR tüpü dışındaki hücrelerin harici olarak karıştırılmasından sonra bir tezgah üstü NMR sistemi kullanılarak ölçülmüştür. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın

Ek Dosya 1: Silindirik tutucunun CAD tasarımı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolün kritik adımları
Bu protokolün başarısı birkaç kritik adıma bağlıdır. İlk olarak, yüksek bir sinyal-gürültü oranını korumak için hiperpolarize 13C piruvatın uygun şekilde çözünmesini ve transferini sağlamak önemlidir. Pirüvatın laktata erken metabolik dönüşümünü yakalamak için, hiperpolarize probun enjeksiyonunun zamanlaması ve NMR edinimi senkronize edilmelidir. Ayrıca, deney boyunca hücre canlılığını korumak önemlidir. Bu parametrelerden sapmalar, metabolik aktivitenin azalmasına ve sinyal kaybına neden olabilir.

Yöntemin değiştirilmesi ve sorun giderme
Bu protokol gerçek zamanlı metabolik izleme için sağlam bir yaklaşım sağlarken, bazı değişiklikler uygulanabilirliğini artırabilir. Örneğin, NMR alımının çevirme açısını ayarlamak, veri toplamayı optimize etmek için sinyal yoğunluğunu ve polarizasyon bozulmasını dengeleyebilir. Ek olarak, belirli bir boyuttaki aljinat jellerin stabil bir şekilde hazırlanması için bir yöntem ortaya atılmış olsa da, oluşturulacak jellerin boyutu bir şırınga veya iğne seçilerek kolayca ayarlanabilir. Bu, hücrelerin NMR tüpünden kaçmasını önlemenin yanı sıra hipoksik bir ortamın24 yeniden üretilmesine katkıda bulunabilir. Ek olarak, aljinat jeli, özellikle NMR ölçüm alanında, NMR tüpünün içinde yoğun ve viskoz hale gelir. PEEK tüpünden kültür ortamını veya hiperpolarize probu enjekte ederken hava girerse, NMR ölçüm bölgesinde kalması muhtemeldir ve bu da spektrumun kalitesinde bir azalmaya yol açacaktır.

Yöntemin sınırlamaları
Hiperpolarize ölçümler, NMR sinyallerinin yüksek hassasiyet avantajına sahip olsa da, doğal sınırlamaları vardır. Hiperpolarize 13C piruvatın T1 gevşemesi nedeniyle, metabolik ölçümlerin süresi yaklaşık 1 dakika ile sınırlıdır ve bu da uzun süreli metabolik kaymaların gözlemlenmesini sınırlar. Ek olarak, bir hücre örneğini bir kez ölçüldükten birkaç saat sonra ölçmek zordur, bu da bir ölçümde büyük miktarda piruvat damlaması ile ilgili olabilir. Bu, ilgili grupların bir gün sonra18 spektrumu ölçtüğü ve ölçüm aralığının o kadar uzun olması gerektiği gerçeğiyle aynıdır.

Mevcut tekniklere kıyasla yöntemin önemi
Konvansiyonel metabolik tahlillerle karşılaştırıldığında, yöntemimiz, hücresel metabolizma hakkında gerçek zamanlı bilgi sağlaması bakımından kütle spektrometresi ve biyokimyasal tahliller gibi son nokta ölçümlerine göre bir avantaja sahiptir. Benzer hiperpolarize NMR spektrumları bir biyoreaktör kullanılmadan elde edilebilse de, gevşeme hızı göz önüne alındığında, yerinde karıştırma ile ölçümlere hemen başlama yeteneği faydalıdır. Ek olarak, hücreler enjeksiyondan önce stabil bir ortamda önceden ayarlanabilir, bu da metabolik analizin tekrarlanabilirliğini ve kinetik doğruluğunu artırır. Bu avantaj, harici karıştırmadan sonra bir tezgah üstü NMR sistemi kullanılarak zamanla çözülen spektrumların elde edildiği ek bir deney (Ek Şekil 2) ile desteklenmektedir. Bu kurulumda, karıştırma ve sinyal alımı arasında yaklaşık 30 s'lik bir gecikme, özellikle laktatın tespitini etkileyen önemli polarizasyon kaybına yol açtı. Bu, yerinde karıştırmanın, hızlı T1 bozunması olan koşullar altında kinetik ölçümlerin doğruluğunu artırdığını doğrular. Bununla birlikte, bu yerinde kurulumdaki sinyal yoğunluğunun, muhtemelen orta perfüzyonun neden olduğu seyreltme nedeniyle daha düşük olduğunu belirtmekte fayda var - bu, optimize edilmesi gereken bir sorun.

Önemi ve potansiyel uygulamaları
Bu yöntem, çeşitli yaşam formlarının metabolik özelliklerini anlamada uygulamaların önünü açabilir. Metabolik akışların gerçek zamanlı ölçümü, araştırmacıların metabolik inhibitörlerin etkilerini dinamik olarak değerlendirmelerini sağlar. Bu yaklaşımı diğer ölçüm teknikleriyle entegre etmek, hücre içi metabolizma analizinin doğruluğunu daha da artırabilir.

Aday yolları tanımlamak için yıkıcı, yüksek verimli metabolomiklerin kullanıldığı ve ardından canlı hücrelerdeki enzim fonksiyonunu ve akı dinamiklerini değerlendirmek için hiperpolarize 13C NMR kullanarak gerçek zamanlı doğrulamanın yapıldığı pratik bir deneysel iş akışı öngörüyoruz. Bu yaklaşım, fizyolojik koşullar altında geçici metabolik tepkilerin doğrudan tespit edilmesini sağlar - tipik olarak statik metabolit seviyelerini ölçen veya eksojen problar gerektiren immünolojik testler veya floresan sensörleri kullanılarak elde edilmesi zor bir şey. Floresan görüntüleme ve immünolojik testler, sırasıyla mekansal lokalizasyon ve yüksek verimli tarama için vazgeçilmez olsa da, hiperpolarize NMR, reaksiyon kinetiğini tahribatsız bir şekilde yakalayan tamamlayıcı bir fonksiyonel okuma sağlar. Bu strateji sadece hücresel düzeyde mekanik içgörüleri kolaylaştırmakla kalmaz, aynı zamanda doku veya organizma ölçeğinde tanısal uygulamalara doğru bir köprü görevi görür. Özellikle, fonksiyonel metabolik değişimleri gerçek zamanlı olarak yakalama yeteneği, karmaşık biyolojik sistemlerde metabolik bozuklukların ve terapötik yanıtların erken tespitini destekleyebilir.

Çeşitli metabolik yolları hedefleyen metabolik probların ve spesifik enzimler için tasarlanmış sentetik substratların geliştirilmesinde de ilerleme kaydedilmiştir ve metabolik araştırma olanaklarını genişletmektedir25,26. Ayrıca, hiperpolarize substratların manyetik bir tünel27 aracılığıyla doğrudan polarizörden NMR'ye iletilmesi gibi hiperpolarizasyon tekniklerindeki ilerlemeler, sinyal tutulmasını iyileştirebilir ve bu yöntemin biyomedikal araştırmalardaki potansiyel uygulamalarını genişletebilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, 23KJ2179 ve 24K17833 (T.U.'ya), 23K27561 (Y.T.'ye) JSPS KAKENHI Hibe Numarası ile desteklenmiştir; MEXT Q-LEAP [JPMXS0120330644 (Y.T.'ye)]; ve MEXT Ortak Kullanım/Araştırma Sistemi Geliştirilmesinin Teşviki Projesi: Araştırma Mükemmeliyet Programı için Üniversiteler Koalisyonu (CURE) Hibe Numarası JPMXP1323015488 (Spin-L programı No. spin24XQ007).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
[1-13C] pirüvik asitCambridge Isot ope Laboratuvarları, Inc.CLM-8077 Serisi
3D YazıcıElegooSatürn 2
Kalsiyum klorürNacalai Tesque, Inc.06729-55
D2OSigma-Aldrich151882
Pompa için Harici Sirkülasyon KitiBİR OLARAK1-4141-02
Fetal Sığır SerumuGibco10270106
Flanşsız Bağlantı SetiGL Bilimleri A.Ş.6010-46390
Çekirdekli Cam Kılcal DamarNarishige HakkındaGDC-1.5İç çap ~0,9 mm, uzunluk 90 mm
Manyetik Sirkülasyon PompasıBİR OLARAK1-4141-01
MestReNovaMestrelab AraştırmasıNMR spektral işleme ve analiz yazılımı
Shot ŞırıngamNipro Şirketi82770,5 mL/100U, 30G x 10 mm, 140 adet
OX063 Serisi  Oxford Instruments Co. Ltd.  ve Polarize IVS Co. Ltd. -
PEEK TüpüBİR OLARAK3-780-05
penisilin-streptomisinNacalai Tesque, Inc.26252-94
Peristaltik Biyo Mini PompaATTO1221200Kararlı orta akış için yüksek hassasiyetli, geniş akış hızı tipi
ReçineSiraya TeknolojiDumanlı Siyah
RPMI-1640 OrtaNacalai Tesque, Inc.30264-85
Silikon/PTFE flakon septumGL Bilimleri A.Ş.1030-50009
Sodyum Aljinat 80-120FUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi194-13321
SPINit yazılımıRS2DDNP polarizöründeki NMR yazılımı
Sünger--Jel stabilizasyonu için boyuta göre kesilmiş ticari olarak temin edilebilen sünger
Üç MuslukBİR OLARAK3-6247-04
En İyi DöndürmeBrukerNMR veri toplama ve işleme yazılımı
Tripsin-EDTA (%0,25)Thermo Fisher Bilimsel07086-74
UV ile kürlenebilen ReçineBONDİKBD-SKCJ
Su banyosuBİR OLARAK1-5832-41Termal Robot TR Serisi TR-1α 37 ° C sıcaklığı
Wilmad Vidalı kapaklı NMR tüpüSigmaZ271977Frekans 400 MHz, çap 10 mm, L 178 mm.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of >10,000 times in liquid-state NMR. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  2. Comment, A., Merritt, M. E. Hyperpolarized magnetic resonance as a sensitive detector of metabolic function. Biochemistry. 53 (47), 7333-7357 (2014).
  3. Balzan, R., et al. Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR. J Vis Exp. (108), e53548(2016).
  4. Liu, M., Hilty, C. Metabolic measurements of nonpermeating compounds in live cells using hyperpolarized NMR. Anal Chem. 90 (2), 1217-1222 (2018).
  5. Sannelli, F., Jensen, P. R., Meier, S. In-cell NMR approach for real-time exploration of pathway versatility: substrate mixtures in nonengineered yeast. Anal Chem. 95 (18), 7262-7270 (2023).
  6. Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (43), 18131-18136 (2009).
  7. Rao, Y., et al. Hyperpolarized [1-13C]pyruvate-to-[1-13C]lactate conversion is rate-limited by monocarboxylate transporter-1 in the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (36), 22378-22389 (2020).
  8. Mathiassen, T. B. W., et al. Hyperpolarized 13C NMR for longitudinal in-cell metabolism using a mobile 3D cell culture system. J Magn Reson Open. 16 - 17 (100131), 100131(2023).
  9. Meier, S., et al. Hyperpolarized 13C NMR reveals pathway regulation in Lactococcus lactis and metabolic similarities and differences across the tree of life. Molecules. 29 (17), 4133(2024).
  10. Sriram, R., et al. Detection of bacteria-specific metabolism using hyperpolarized [2-13C]pyruvate. ACS Infect Dis. 4 (5), 797-805 (2018).
  11. Park, J. M., et al. Hyperpolarized sodium [1-13C]-glycerate as a probe for assessing glycolysis in vivo. J Am Chem Soc. 139 (19), 6629-6634 (2017).
  12. Singh, J., et al. Probing carbohydrate metabolism using hyperpolarized 13C-labeled molecules. NMR Biomed. 32 (10), e4018(2019).
  13. Bohndiek, S. E., et al. Hyperpolarized [1-13C]-ascorbic and dehydroascorbic acid: vitamin C as a probe for imaging redox status in vivo. J Am Chem Soc. 133 (30), 11795-11801 (2011).
  14. Yamamoto, K., et al. Real-time insight into in vivo redox status utilizing hyperpolarized [1-13C] N-acetyl cysteine. Sci Rep. 11 (1), 12155(2021).
  15. Düwel, S., et al. Imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled zymonic acid. Nat Commun. 8 (1), 15126(2017).
  16. Chen, J., Hackett, E. P., Singh, J., Kovács, Z., Park, J. M. Simultaneous assessment of intracellular and extracellular pH using hyperpolarized [1-13C]alanine ethyl ester. Anal Chem. 92 (17), 11681-11686 (2020).
  17. Eills, J., et al. Spin hyperpolarization in modern magnetic resonance. Chem Rev. 123 (4), 1417-1551 (2023).
  18. Keshari, K. R., et al. Hyperpolarized 13C spectroscopy and an NMR-compatible bioreactor system for the investigation of real-time cellular metabolism. Magn Reson Med. 63 (2), 322-329 (2010).
  19. Sriram, R., et al. Real-time measurement of hyperpolarized lactate production and efflux as a biomarker of tumor aggressiveness in an MR compatible 3D cell culture bioreactor. NMR Biomed. 28 (9), 1141-1149 (2015).
  20. Mangas-Florencio, L., et al. A DIY bioreactor for in situ metabolic tracking in 3D cell models via hyperpolarized 13C NMR spectroscopy. Anal Chem. 97 (3), 1594-1602 (2025).
  21. Hill, D. K., et al. Model free approach to kinetic analysis of real-time hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy data. PLoS One. 8 (9), e71996(2013).
  22. Saito, K., et al. 13C-MR spectroscopic imaging with hyperpolarized [1-13C]pyruvate detects early response to radiotherapy in SCC tumors and HT-29 tumors. Clin Cancer Res. 21 (22), 5073-5081 (2015).
  23. Sengupta, D., Pratx, G. Imaging metabolic heterogeneity in cancer: from PET to hyperpolarized MRI. Mol Cancer. 15, 43(2016).
  24. Read, G. H., et al. Three-dimensional alginate hydrogels for radiobiological and metabolic studies of cancer cells. Colloids Surf B Biointerfaces. 171, 197-204 (2018).
  25. Meier, S., Jensen, P. R., Karlsson, M., Lerche, M. H. Hyperpolarized NMR probes for biological assays. Sensors. 14 (1), 1576-1597 (2014).
  26. Kondo, Y., Nonaka, H., Takakusagi, Y., Sando, S. Design of nuclear magnetic resonance molecular probes for hyperpolarized bioimaging. Angew Chem Int. Ed. 60 (27), 14779-14799 (2021).
  27. Milani, J., et al. A magnetic tunnel to shelter hyperpolarized fluids. Rev Sci Instrum. 86 (2), 024101(2015).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Piruvat MetabolizmasBiyoreakt r SistemiH cre Enkaps lasyonuAljinat JelDinamik N kleer PolarizasyonLaktat D n mMetabolik Profillemela Tarama

İlgili makaleler