Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Aniridiye Bağlı Kornea Bozukluklarının Araştırılması İçin Hasta Spesifik iPSC Kaynaklı Kornea Organoidleri

141 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68556

⸱

28 Temmuz 2026

 ,  ,  ,  , 
1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Izmir International Biomedicine and Genome Institute, Dokuz Eylül University, 3Department of Medical Biology and Genetics, Faculty of Medicine, Dokuz Eylül University

Bu makalede

Özet

Aniridya hastalarından türetilen iPSC'lerden kornea organoidleri üretmek için bir protokol tanımlıyoruz; böylece kornea hastalıklarını incelemek için hastaya özgü bir model oluşturuluyor. Bu organoidler, temel yapısal ve fonksiyonel özellikleri taklit ederek, hastalık mekanizmalarını araştırmak, potansiyel tedavileri test etmek ve ön göz hastalıkları için kişiselleştirilmiş rejeneratif yaklaşımları geliştirmek için güvenilir bir in vitro platform sağlar.

Özet

Aniridyum, irisin kısmi veya tamamen yokluğuyla işaret edilen nadir doğuştan bir göz rahatsızlığıdır ve genellikle kornea opafikasyonu ve limbal kök hücre eksikliğiyle ilişkilidir. Temel genetik mutasyonlar, öncelikle PAX6 genini etkilemekte, korneanın hem gelişimini hem de işlevini bozmaktadır. İris kusurlarının dışında en yaygın göz özellikleri nistagmus, foveal hipoplazi, katarakt, glokom ve aniridiye bağlı keratopati (AAK)'dır. In vivo modeller aniridiye patolojisi hakkında değerli bilgiler sunsa da, hastadan alınan in vitro modeller hastalık mekanizmalarını araştırmak ve potansiyel tedavileri değerlendirmek için hayati öneme sahiptir. Bu çalışmada, hastadan kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC) kullanılarak in vitro bir AAK modeli sunuyoruz. Protokolümüz, iPSC'lerin korneal epitel benzeri hücrelere kademeli olarak ayrılmasını içerir; bu hücreler, kendi kendine kurulmuş üç boyutlu organoidler içinde, yerli kornea mikro ortamını taklit eder. Farklılaşma kültürü koşullarının optimizasyonuyla, insan korneasının temel yapısal ve fonksiyonel özelliklerini özetleyen farklı kornea hücre popülasyonlarına sahip kornea organoidleri başarıyla ürettik.

Giriş

Kornea, gözün en dış tabakasını oluşturan avasküler, şeffaf bir dokudur ve esas olarak üç katmandan oluşur: epitelyal dış tabaka, keratositlerle dolu kollajen açısından zengin ekstraselüler matriks içeren stromal tabaka ve endotel hücretabakası 1. Kornea, iç göz yapılarını koruyarak ve ışığı kırarak görmede hayati bir rol oynar.

Aniridyum, esas olarak çift kutu geni 6'daki heterozigot mutasyonlardan kaynaklanan nadir, doğuştan gelen bir panoküler bozukluktur; bu gen göz gelişiminin ana düzenleyicisidir veiris 2'nin kısmi veya tamamen yokluğuyla karakterize edilir. İris hipoplazisi veya yokluğuna ek olarak, çoğu hasta ilerleyici kornea anormallikleri geliştirir ve bunlar topluca aniridi-ilişkili keratopati (AAK) olarak adlandırılır; bu anormallikler epitel defektleri, limbal kök hücre disfonksiyonu, stromal değişiklikler ve ilerleyici kornea palikifikasyonunu içerir ve nihayetinde görme bozukluğuna yol açar. AAK, aniridya hastalarının yaklaşık %78–%90'ını etkiler ve zamanla şiddetiartar 3. Aniridia hastasından kaynaklanan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC) kornea organoidleri üretmek için ayrıntılı ve tekrarlanabilir bir protokol oluşturmayı hedefledik; böylece hastalıkla ilgili kornea değişikliklerini in vitro modelledik. Hayvan modelleri ve ex vivo çalışmalar aniridyum patogenezi hakkında değerli bilgiler sağlamış olsa da, türe özgü farklılıklar ve hasta dokusuna sınırlı erişim, translasyonel önemlerini kısıtlamaktadır.

İnsan iPSC'sinden türetilen organoidler, insan gelişimi ve hastalıkları modellemek için güçlü in vitro sistemlerolarak ortaya çıkmıştır 4,5. Özellikle kornea organoidleri, geleneksel iki boyutlu monokatmanlı kültürlere kıyasla doğal korneal mimariye daha çok benzeyen üç boyutlu doku benzeri yapıların oluşturulmasını sağlar; bu kültürler mekansal organizasyon, fizyolojik hücre–hücre etkileşimleri ve mikroçevresel karmaşıklıktan yoksun 4,5. SEAM tabanlı ve okuler progenitor odaklı yaklaşımlar dahil olmak üzere birkaç farklılaşma stratejisinin iPSC'lerden kornea benzeri dokular oluşturduğubildirilmiştir 6. Bu yaklaşımlar genellikle okuler soy indüksiyonunun başlangıç aşamasını, ardından ilerleyici doku spesifikasyonu ve heterojen göz açaf popülasyonlarından seçilmeyi içerir. Kornea organoidleri oluşturmak, kornea dokusunda bulunan farklı hücretiplerini inceleme fırsatı sunar 7,8. Ayrıca, aniridia hastalarının iPSC kaynaklı kornea organoidleri, hastalığın genetik arka planının incelenmesini mümkün kılar ve aniridiyi incelemek için benzersiz bir fırsat sunar.

Mevcut protokolde, hem vahşi tip hem de aniridya kaynaklı iPSC hatları, uzun ve haftalık kültür süresi boyunca diferensiasyon (DM), retina farklılaşması (RDM) ve kornea farklılaşma ortamlarına (CDM) ardışık maruziyeti içeren çok aşamalı aynı çok aşamalı farklılaşma stratejisine tabi tutulmaktadır. Kritik deneysel adımlardan biri, yapışkan kültürden süspansiyon koşullarına geçiştir; bu süreçte seçilmiş kornea benzeri bölgeler korunarak epitelal öz-organizasyonu teşvik eder.

Bu yaklaşım, karşılaştırmalı hastalık modellemesi için uygun korneal benzeri epitel yapılarının tekrarlanabilir üretimini desteklese de, yöntemin uygulanabilirliği değerlendirilirken dikkate alınması gereken sinirsel innervasyon veya tam limbal niş organizasyonu gibi karmaşık in vivo özellikleri tam olarak özetlemiyor.

Bu bağlamda, aniridiyle ilişkili PAX6 mutasyonları taşıyan hasta kaynaklı iPSC'lerden kornea organoidleri üretmek için standartlaştırılmış bir protokolü tanımlıyoruz. Önemli olarak, ayırt etme stratejisi vahşi tip ve aniridia-türevi çizgiler arasında değiştirilmez; Bunun yerine, hastaya özgü genetik arka plandan, aksi takdirde uniform bir deneysel çerçevede hastalık-spesifik fenotipler ortaya çıkar.

Genel olarak, bu yöntem kornea gelişimi ve aniridiye ilişkili hastalık mekanizmalarını incelemek için sağlam ve tekrarlanabilir bir platform sağlar ve gelecekteki mekaniksel ve translasyonel çalışmalar için temel oluşturabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm prosedürler etik komitenin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Çalışma, İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaydı (hPSCreg) veritabanına kaydedilmiş ve etik onaylar Fransa Yükseköğretim Bakanı, Araştırmacı ve İnovasyon Bakanı (MESRI; IE-2018-967)9. iPSC'ler AAKIPSi001-A (AAK1), AAKIPSi002-A (AAK2), AAKIPSi003-A (AAK3) ve WT (sağlık bağışçılarından) kodlarıyla adlandırılır. Ayrıca, Hacettepe Üniversitesi etik komitesi, referans numarası 16969557-1213 ile belirtildiği üzere bu araştırmanın kullanımını onaylamıştır. Bu çalışmada kullanılan insan hücre hatları, satın alma sırasında ulusal düzenleyici yetki gerektiriyordu. Onay, yazarlardan birinin dahil olduğu bir konsorsiyum çerçevesi kapsamında verildi. Mevcut el yazması doğrudan o konsorsiyum projesiyle ilgili olmasa da, kullanılan biyolojik materyaller bu etik çerçeve kapsamında alınmış ve onaylanmıştır. Bu nedenle, bu üniversitenin onayı tam düzenleyici şeffaflığı sağlamak için uygun şekilde belirtildi. Bu protokolte kullanılan malzemeler, reaktifler ve ekipmanla ilgili tüm detaylar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir. Tüm deneysel işlemler, steril bir ortam sağlamak için bir laminar akış kabini (BSL-2) içinde gerçekleştirilmiştir. Bu kurulum, çalışmada kullanılan tüm malzeme ve ekipmanların yeterince sterilize edilmesini sağlar, böylece kontaminasyon riskini en aza indirir ve deneysel sonuçların bütünlüğünü sağlar.

1. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) kaynaklı kornea organoidlerinin üretimi

  1. Aniridia-hasta kaynaklı insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (AAK1, AAK2, AAK3)10 beslenme içermeyen koşullu ortamda korunması ve başlangıç kültürü (Şekil 1)
    1. Aşağıdakıları önceden hazırlayın: Bir kuyuyu, 6 kuyruklu bir plakada 1 mL buz gibi soğuk ekstrasellüler matriks (ECM) çözeltisi ile 0.1 mg/mL konsantrasyonda kaplayın. Bu kaplama prosedürü buz üzerinde yapılmalıdır, ECM'nin katılaşması için değil ve üreticinin talimatlarına uygun şekilde 30 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya bırakılmalıdır.
    2. 1 x 106 hiPSC (WT, AAK1, AAK2, AAK3) kriyokonserve aliquotunu eritin. Donmuş hücreleri tamamen eritmeyin; Bunun yerine, kriyovialdaki donmuş hücre süspansiyonunun çözülmesine izin verin, ta ki hacmin yaklaşık yarısı donmuş kalana kadar.
    3. Kısmen çözülmüş süspansiyonu, oda sıcaklığında (RT) 10 μM Rho ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü içeren 1 mL tam bakım ortamına hemen aktarın; bu inhibitör 15 mL'lik bir tüpte önceden alkotlanmıştır. Transfer sırasında pipet kullanma.
    4. 300 x g ile 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı atın.
    5. Daha sonra hücreleri 10 μM ROCK inhibitörü içeren 1 mL tam bakım ortamına yeniden süzülür.
    6. Tripan mavisi hariç tutularak hücre yoğunluğunu belirleyin. Hücreleri tripan mavisiyle canlılık boyamasından sonra hemositometre ile sayın. Kısaca, 20 μL hücre süspansiyonu 1:1 ile 20 μL %0,4 tripan mavisi karıştırın, ardından 60 μL PBS eklenerek orijinal hücre süspansiyonunun son 1:5 seyrelmesi sağlanır. Bu karışımdan hemositometre odasına 10 μL yüklenir. Canlı (trypan mavi–negatif) hücreleri dört büyük karede sayın. Kare başına ortalama hücre sayısını hesaplayın ve 5 (hücre süspansiyon seyrelme faktörü) ve 10.000 ile çarparak nihai hücre konsantrasyonunu (hücreler/mL) belirleyin.
      Hücreler/mL = (Kare başına ortalama hücre sayısı) x 5 x 104
    7. Hücreleri, 6 delikli bir plakada önceden kaplanmış bir ECM kuyusuna tohumlayın; böylece her kuyu başına 2 x 104 hücre/cm2 hücre yoğunluğu sağlanır.
    8. Hücre morfolojisini ve bağlanmasını 10x büyütmede faz kontrast mikroskopisi ile gözlemleyin. Daha sonra, optimal büyüme koşulları sağlamak için 6 kuyu plakalarını %5 CO₂ ile 37 °C'de kuluçka yapın.
      NOT: ROCK inhibitörü sadece hücreler geçişi veya çözülmesi sırasında gece boyunca kullanılmalıdır. Günlük medyum değişimleri sırasında, medyumu kuyunun duvarına nazikçe ekleyin. Su banyosunda tam bakım ortamını ısıtmaktan kaçının; Bunun yerine, ortamı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca dengeleyin.
  2. Kendiliğinden farklılaşma evresi (0 – 2. Gün)
    1. Farklılaşma ortamını (DM) şu maddeleri karıştırarak hazırlayın: %8 KnockOut Serum Replacement (KSR), 1x önemsiz amino asit (NEAA), 1x Glutamax, 1x Penicillin-Streptomisin ve Dulbecco'nun Modified Eagle's Medium/Nutrient Karışımı F-12 Jambonu (DMEM/F-12).
    2. HiPSC kültürleri yaklaşık %70–%80 birleşime ulaştığında, spontan farklılaşmaiçin 8, medium nazikçe aspire edilip tamamen atılır, ardından her kuyuya her gün 1 mL taze DM ile değiştirir; 3. güne kadar deneysel zaman çizelgesine göre retina farklılaşma evresi başlar.
  3. Retinal farklılaşma evresi (3. gün – 47)
    NOT: Retinal farklılaşma ortamı, heterojen göz adyat popülasyonlarının oluşmasına izin vermek için uzun süreler kullanılır.
    1. Retinal farklılaşma ortamını (RDM) şu maddeleri karıştırarak hazırlayın: %8 KSR, 1x NEAA, 1x Glutamax, %2 B27, 1x Penisillin-Streptomisin ve DMEM/F-12.
    2. 2 gün süren spontan farklılaşmadan sonra, kültür ortamını her gün dikkatlice aspire ederek ve yerine her kuyu başına 1 mL taze RDM ortamı koyarak yenileyin. Bunu toplamda 30 gün sürdür.
      NOT: Bu 30 günlük dönemde hücre yoğunluğunda önemli bir artış beklenmektedir. Her kuyunun farklı bölgelerinde hücre yoğunluğunun mikroskobik gözlemleri yapmak çok önemlidir. Hücre kaldırmayı önlemek için yıkamadan kaçınmalı ve orta seviye değişimlerinde dikkatli olunmalıdır. Kuyunun duvarından medyayı ekleyin. Ortamı RT rejiminde kullanmadan önce 15 dakika dengeleyin.
    3. 32. güne gelindiğinde, hücreler görünür bir birleşme durumuna ulaşır ve çok katmanlı 2.5D agregalar oluşturur. Bu aşamada, 1000 μL pipet ucu kullanarak tüm kuyunu nazikçe kazıyarak süspansiyon kültürüne geçişi başlatın. Bu süreçte, hücre tabakası küçük kümelere bölünür.
      NOT: Tüm hücreler kültür yüzeyinden salınmasına rağmen, çok katmanlı 2.5D agregalar tercihli olarak toplanır ve süspansiyon kültürüne aktarılır (Ek Şekil 1), çünkü zenginleşmeleri tek hücrelere veya tek tabakalı parçalara kıyasla daha hızlı kendi kendine toplanmayı ve daha büyük organoidlerin oluşumunu teşvik eder.
    4. Kazımadan hemen sonra, ortaya çıkan hücre kümelerini toplayın ve bunları RDM içeren düşük yapışkanlı 6-kuyruklu kültür plakalarına aktararak askı kültür koşulları oluşturulur.
    5. Hücreleri süspansiyon kültüründe ek 15 gün daha tutun; günlük ortam değişimi için her kuyu başına 2 mL taze RDM kullanılır. Askı kültürünün ilk 2 gününde, küçük hücre kümelerinin kaybını önlemek için orta seviye değişimden kaçının. Askı kültürü sırasında, hücreler yavaş yavaş kendini organize eder ve 3D, şeffaf, kornea benzeri yapılar oluşturur; faz kontrast mikroskopisi ile düzenli olarak 4x ve 10x büyütmede izlenir.
  4. Kornea farklılaşma evresi (48 – 90. Gün)
    1. Kornea farklılaşma ortamını (CDM) şu maddeleri karıştırarak hazırlayın: %8 KOSR, 1x NEAA, 1x Glutamax, 1x N2-MAX, 1x İnsülin-Transferrin-Selenyum, 5 ng/mL FGF2, 10 ng/mL EGF ve DMEM/F-12.
    2. Düşük yapışma plakalarında (37 °C, %5 CO₂) ilk 15 gün boyunca (32. günden 47. güne kadar olan askı kültürün) sonra, 47. günde agregaları askıya koşullarında tutarken RDM CDM ile değiştirilir. CDM'yi her iki günde bir 2 mL ile tazeleyin, böylece organoidler her zaman kültür ortamında tamamen batırılmasını sağlar. Bu dönemde, şeffaf, baloncuk benzeri kornea primordial (CP) yapıları aşamalı olarak ortaya çıkar.
    3. CDM'de askı kültürü 90. güne kadar devam eder, böylece şeffaf CP bölgelerinin daha opak doku bölmelerinden daha fazla olgunlaşma ve mekansal ayrımına olanak tanır.
    4. 90. günde, CP-spesifik aşağı akış analizleri amaçlandığında, şeffaf CP bölgelerini daha opak doku bölmelerinden steril forseps ve cımbız kullanarak mekanik olarak ayırın.
      NOT: CP bölgelerinin mekanik izolasyonu, analizler özellikle CP ile zenginleştirilmiş yapılar gerektirdiğinde yapılır. Diğer doku bölmeleri veya genel organoid mimari ilgi çekiyorsa, organoidler yapısal heterojenliği korumak için sağlam tutulabilir.
    5. Deneysel hedefe bağlı olarak CDM'de izole CP yapıları veya sağlam organoidler için askı kültürü devam ettirin.

2. Korneal organoidlerin karakterizasyonu

  1. Organoidlerin morfolojik ve yapısal değerlendirmesi
    1. Kornea organoidlerini düzenli olarak 4x ve 10x büyütmede parlak alan mikroskopisiyle izleyin. Belirlenen zaman noktalarında boyut, şeffaflık ve genel morfolojiyi değerlendirin ve görsel edinimiyle yapısal değişiklikleri belgeleyin.
  2. İmmünoflüoresans temelli karakterizasyon
    1. Kornea organoid fiksasyonu
      1. Fiksasyondan önce %4 PFA ve %30 sakaroz solüsyonları hazırlayın. Kornea organoidini otoklavlı bir kepçe ile kültürden alın. Organoidi %4 PFA'ya 1,5 mL bir tüpte aktarın ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın.
      2. İnkubasyondan sonra, kornea organoidine zarar vermeden PFA'yı tüpten dikkatlice atarak atın. Tüpe 1 mL %30 sakaroz çözeltisi ekleyin ve 4 °C'ye yerleştirin. 24 saat sonra, OCT fiksasyonu için 5 mL tüpler ve sıvı azot hazırlayın ve etiketleyin.
      3. Tüpteki sakroz çözeltisini dikkatlice atın. Organoidi steril kepçeye aktarın. 20 μL pipet ile organoidden fazla sakaroz çözeltisini dikkatlice çıkarın.
      4. OCT'yi 5 mL'lik tüp kapağına dökün ve organoidi OCT'ye yerleştirin. Organoidi OCT içeren kapağa başka bir steril kepçe ile aktarın.
      5. Kornea organoidinin yüzeyini kaplamak için OCT ekleyin. Balonları iğneyle OCT'ye patlatarak organoidin net kesitlerini elde edin.
      6. 5 mL'lik tüplerin kapağını kapatın ve cımbızla sıvı azota daldırın. Örnekleri -20 °C'de saklayın, ta ki kesitlenmeye kadar.
      7. Bunları 5 μm kalınlıkta kriostat ile kesin ve -20 °C'de boyana kadar saklayın. Tekrarlanabilir boyama sağlamak için kesit kalınlığını ve doku yönelimini tutarlı tutun.
    2. IF boyama
      1. Kornea organoid kesitlerini IF boyama için hazırlamak için, slaytları RT rejiminde 10 dakika boyunca PBS-T (%0,3 Triton X-100) ile 3 kez yıkayın.
      2. Slaytı mendil kağıdıyla temizleyin ve PAP kalemiyle bir kenar yapın. Doku kesitini tamamen kaplamak için uygun miktarda bloklayıcı çözelti ekleyin (genellikle PAP pen sınırına bağlı olarak her slayt başına 100 – 200 μL) ve RT'de 1 saat kuluçka yapın.
      3. Blokaj çözeltiyi aspire edin ve PAP kalemi ile bir kenar yapın. 150 μl primer Ab (PAX6, p63, OCT3/4, NANOG, Na+/K+-ATPase, AQP1, CK3, CK5, CK14, CK19, N-cad, KERA, COLIV, seyrelme oranları Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir) çözeltisi slayta ekleyin ve RT'de 1 saat kuluçka yapın.
      4. 10 dakika boyunca RT süresinde PBS-T (%0,3 Triton X-100) ile 2 kez yıkayın. Kenarı tekrar PAP kalemi ile yapın.
      5. 150 μl ikincil Ab çözeltisi (Anti Rabbit-488, Anti Mouse-594, seyrelme oranları Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir) slayta ekleyin ve RT'de karanlık koşullarda 2 saat kuluçka yapın. RT rejiminde PBS-T (%0,3 Triton-X) ile 2 kez 10 dakika boyunca yıkayın. Sürgüleri temizleyin ve DAPI solüsyonuyla monte edin.
      6. Farklılaşmış iPSC'ler için, fiksasyondan sonra bloklama ve permeabilizasyon yapın ve aynı protokolle boyamaya devam edin. Lekelenmiş örnekleri floresans veya konfokal mikroskopi ile 4x ve 10x büyütmede görselleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İnsan tarafından indüklenen pluripotent kök hücrelerin (hiPSC) kök değerleri

Deneylerde kullanılan insan iPSC'lerinin köklülüğünü değerlendirmek için parlak alan görüntüleme, immünboyama ve qRT-PCR analizi yaptık. İnsan pluripotent kök hücrelerinde plüripotensin ve kendini yenilemenin korunması için gerekli temel transkripsiyon faktörleri olan OCT3/4, SOX2 ve NANOG gibi temel pluripotensi belirteçlerinin ifadesinideğ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kontrol organoidleri ile aniridiya hastalarından elde edilenler arasındaki karşılaştırmalı analiz, epitelyal tabakalaşma, anormal ekstrasellüler matriks birikintisi ve PAX6 geni 9'un düzensiz ekspresyonu ortaya koymaktadır.

Farklı aniridya hasta örneklerinden, özellikle AAK1, AAK2 ve AAK3 hatlarından türetilen iPSC'lerin büyüme hızı, değişkenlik gösterir; bu da potansiyel olarak PAX6 genindeki mutasyonlardan kaynaklana...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar açıklamadı.

Teşekkürler

Bu çalışma, TÜBİTAK 121N276 ve Avrupa Ortak Nadir Hastalıklar Programı tarafından finanse edilmekte ve kısmen Avrupa Birliği tarafından desteklenmektedir (Horizon 2020 ERA Başkan Programı, RareBoost Proje Hibesi no: 952346). A.C.K., YÖK 100/2000 doktora bursu ve TÜBİTAK-BİDEB 2211A burslarıyla desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

```html
Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 mL serological pipettesZA BioteknoLabselect SP-003-10
15 mL Konik TüplerLabselectCT-002-15A
2 mL serological pipettesLabselectLabselect SP-003-2
5 mL serological pipettesCleanteksBiofil GSP010005
50 mL Konik TüplerGolden GateCT-002-50
50 mL serological pipettesBIOFILLGSP020050
Anti Mouse 594Jackson Immuno715-585-150Seyreltme Aralığı: 1:100 - 1:800
Anti Rabbit 488Jackson Immuno711-545-152Seyreltme Aralığı: 1:100 - 1:800
OtoklaV VAPOUR-Line liteVWR chemicalsVAPOUR-Lineeco 25
B27 TakviyesiGIBCO12587010Vit A ile
Tezgah Üstü SantrifüjEppendorf5702
Tezgah Üstü Mikroskop DMI1OlympusCKX41
Biyolojik Güvenlik Kabini Class IIThermoSafe 2020
Sığır Serum Albumini (BSA)Sigma-AldrichA8806
CellBanker 1Worthington IndustriesLABS-20K
Coverslips 24 mm x 50 mmISOLAB280
Cryomatrix, OCTFisher Healthcare30226281
CryovialBioSigmaN403522
DAPINEOFROXX1322
DAPINEOFROXX15390.5 ug/mL
DMEM/F12 MedyaGIBCO31330-038
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS)Gibco141901441X
EGFGIBCOPHG0311
Etanol 100%Sigma64-17-5
Etanol 70%Sigma64-17-5Etanol Seyreltmeleri
Hücre Dışı Matris (ECM)Corning354277LDEV-free
FGF2GIBCOPHG0024
GlutaMaxGIBCO35050061
GoTaq Master MixPromegaM7123
İnkübasyon KabiniMemmert INCO 153 med44043
Insulin-Selenium-TransferrinGIBCO41400045
KnockOut Serum (KOSR)GIBCO10828028
Mikrotom RM2235LeicaRM2235
Montaj maddesiabcamab104135
mTSER MedyaSTEMCELL85850
Mutiwell Kültür Tabakları (6-well)CORNING3516
N2 TakviyesiR&DAR003
Non-essential amino acids (NEAA)LONZABE13-114E
P20, P200 ve P1000 pipetlerGilsonF167350
ParafinVWR chemicals10048502
ParaformaldehitSigma-AldrichF8775
Primer Antikor Aquaporin mAbabcamab9566Seyreltme Aralığı: 1:50-1:200
Primer Antikor CK14Santa Cruz Biotechnologysc-53253Seyreltme Aralığı: 1:50-1:500
Primer Antikor CK19ProteinTech14965-1-APSeyreltme Aralığı: 1:150-1:600
Primer Antikor CK3NOVUSNBP2-91997 0.1 MLSeyreltme Aralığı: 1:50-1:200
Primer Antikor CK5ThermoMA517057Seyreltme Aralığı: 1:200-1:1000
Primer Antikor Kollajen Tip IVabcamab6586Seyreltme Aralığı: 1:100-1:500
Primer Antikor KeratocanBiossbs-11054RSeyreltme Aralığı: 1:50-1:200
Primer Antikor Na/K - ATPaseSanta Cruz Biotechnologysc-21712Seyreltme Aralığı: 1:50-1:500
Primer Antikor N-Cadherinabcamab76011Seyreltme Aralığı: 1:50-1:500
Primer Antikor p63SANTACRUZsc-25268Seyreltme Aralığı: 1:50-1:500
Primer Antikor Pax6NovusNBP2-44576Seyreltme Aralığı: 1:50-1:200
RNA izolasyon kitiMacherey–Nagel740984.50
Rock İnhibitörü (Y-27632)TOCRIS1254
LamelerStarFrostMBB-0302-55AYapışkan, taşlanmış
Paslanmaz çelik forseps no:5SigmaF6521-1EA
Paslanmaz Çelik Skalpel Steril N 21Swann-Morton1033060
The OneScript Plus cDNA Sentez KitiApplied Biological MaterialsG236
Triton-X100NEOFROXX8500
TRIzol reaktifiThermo15596026
Tripan mavisiGIBCO15250061
Ultra düşük yapışma (ULA) 6-well plakCorning3471
Su banyo

Kaynaklar

  1. Hassell, J. R., Birk, D. E. The molecular basis of corneal transparency. Exp Eye Res. 91 (3), 326-335 (2010).
  2. Daruich, A., et al. Congenital aniridia beyond black eyes: From phenotype and novel genetic mechanisms to innovative therapeutic approaches. Prog Retin Eye Res. 95, 101133(2023).
  3. Eden, U., Riise, R., Tornqvist, K. Corneal involvement in congenital aniridia. Cornea. 29 (10), 1096-1102 (2010).
  4. Huch, M., Koo, B. K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).
  5. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  6. Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  7. Foster, J. W., et al. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 7, 41286(2017).
  8. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
  9. Koc, A. C., et al. Patient-derived cornea organoid model to study metabolomic characterization of rare disease: aniridia-associated keratopathy. BMC Ophthalmol. 25 (1), 14(2025).
  10. Ilmarinen, T., et al. Production and Limbal Lineage Commitment of Aniridia Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells. 41 (12), 1133-1141 (2023).
  11. Chambers, I., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).
  12. Okur, F. V., Cevher, I., Ozdemir, C., Kocaefe, C., Cetinkaya, D. U. Osteopetrotic induced pluripotent stem cells derived from patients with different disease-associated mutations by non-integrating reprogramming methods. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 211(2019).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  14. Lima Cunha, D., Arno, G., Corton, M., Moosajee, M. The Spectrum of PAX6 Mutations and Genotype-Phenotype Correlations in the Eye. Genes (Basel). 10 (12), 1050(2019).
  15. Hayashi, R., et al. Co-ordinated ocular development from human iPS cells and recovery of corneal function. Nature. 531 (7594), 376-380 (2016).
  16. Gonzalez, G., Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Limbal stem cells: identity, developmental origin, and therapeutic potential. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 7 (2), (2018).
  17. Ji, H. P., et al. MicroRNA-28 potentially regulates the photoreceptor lineage commitment of Muller glia-derived progenitors. Sci Rep. 7 (1), 11374(2017).
  18. Hatou, S., et al. Role of insulin in regulation of Na+-/K+-dependent ATPase activity and pump function in corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (8), 3935-3942 (2010).
  19. Higa, K., et al. Aquaporin 1-positive stromal niche-like cells directly interact with N-cadherin-positive clusters in the basal limbal epithelium. Stem Cell Res. 10 (2), 147-155 (2013).
  20. Chen, Q., et al. Stromal fibroblasts derived from mammary gland of bovine with mastitis display inflammation-specific changes. Sci Rep. 6, 27462(2016).
  21. Soiberman, U., Foster, J. W., Jun, A. S., Chakravarti, S. Pathophysiology of Keratoconus: What Do We Know Today. Open Ophthalmol J. 11, 252-261 (2017).
  22. Lima Cunha, D., et al. Restoration of functional PAX6 in aniridia patient iPSC-derived ocular tissue models using repurposed nonsense suppression drugs. Mol Ther Nucleic Acids. 33, 240-253 (2023).
  23. Harding, P., et al. Variant-specific disruption to notch signalling in PAX6 microphthalmia and aniridia patient-derived hiPSC optic cup-like organoids. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871 (6), 167869(2025).
  24. Cunha, D. L., Smits, J., Zhou, H. Q., Moosajee, M. Transcriptomic analysis of aniridia iPSC-derived limbal epithelial stem cells reveals early changes linked to the limbal niche. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2821(2023).
  25. Harding, P., et al. Generation of human iPSC line (UCLi013-A) from a patient with microphthalmia and aniridia, carrying a heterozygous missense mutation c.372C>A p.(Asn124Lys) in. Stem Cell Res. 51, (2021).
  26. Theerakittayakorn, K., et al. Differentiation Induction of Human Stem Cells for Corneal Epithelial Regeneration. Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).
  27. Bar-Nur, O., et al. Small molecules facilitate rapid and synchronous iPSC generation. Nat Methods. 11 (11), 1170-1176 (2014).
  28. Maiti, G., et al. Single cell RNA-seq of human cornea organoids identifies cell fates of a developing immature cornea. PNAS Nexus. 1 (5), pgac246(2022).
  29. Dorot, O., et al. The antipsychotropic drug Duloxetine rescues PAX6 haploinsufficiency of mutant limbal stem cells through inhibition of the MEK/ERK signaling pathway. Ocul Surf. 23, 140-142 (2022).
  30. van Velthoven, A. J. H., et al. Future directions in managing aniridia-associated keratopathy. Surv Ophthalmol. 68 (5), 940-956 (2023).
  31. Kocak, G., et al. Generation of Anterior Segment of the Eye Cells from hiPSCs in Microfluidic Platforms. Adv Biol (Weinh). 8 (5), e2400018(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

T pSay 233Say 233Bu Ay JoVE deSayorganoidhastal k modeli

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.