Yöntem makalesi

Arabidopsis thaliana'da Erkek Mayoz Fazı Sırasında Sentromer Hareketlerinin Canlı Görüntüleme Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/68569

⸱

24 Ekim 2025

 ,  ,  , 
1Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, Institute Jean-Pierre Bourgin for Plant Sciences (IJPB), 78000, Versailles, France

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mayoz fazı sırasında kromozom hareketi, spor oluşumu için temel olan, yeterince anlaşılmamış bir olgudur. Bu protokol, Arabidopsis thaliana erkek mayositlerinde mayotik faz sırasında sentromer hareketlerini elde etmek, analiz etmek ve ölçmek için bir yöntemi açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mayoz, cinsel üreme için gerekli olan hücresel bir bölünmedir. Mayoz faz sırasında, anne ve baba kaynaklı homolog kromozomlar birbirlerini tanır ve nükleoplazmadaki hızlı hareketleriyle kolaylaştırılan bir süreç olan birleşir. Mayoz faz hareketleri, kromozomların nükleer zarfa bağlanmasına ve nükleer zarf yoluyla kromozomlara iletilen sitoplazmik kuvvetlere dayanır. Bitkilerde, anterlerin içindeki erkek mayositlerin sınırlı erişilebilirliği ve kırılganlığı, canlı görüntüleme yaklaşımlarını ve kromozom hareket analizini teknik olarak zorlaştırmaktadır. Gerçekten de, bu hareketler çok hızlıdır ve bunları analiz etmek, en uygun edinim koşullarını bulmayı gerektirir. Burada, erkek mayotik faz sırasında hızlı kromozom hareketlerini yakalamak için etkili bir yöntem Arabidopsis thaliana hızlandırılmış filmlerde, floresan etiketli sentromerlerin hareketlerini takip ederek açıklanmaktadır. Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanılarak 3D ve zaman içinde anter diseksiyonu ve görüntü elde edilmesine dayanır. Her 7 saniyede bir mayotik z-yığınlarının elde edilmesi, etiketli sentromerlerin yörüngelerini yeniden yapılandırmak ve analiz etmek için yeterli çözünürlük sağlar. Çıkarılan veriler daha sonra işlenerek bu kromozomal hareketlerin niceliksel analizi sağlanır. Bu verilerden modellerin geliştirilmesi, bu süreci yönlendiren kuvvetlerin doğası ve yoğunluğu da dahil olmak üzere hızlı kromozom hareketinin mekanizmasını anlamak için gereklidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mayoz, genetik materyalin bir nesilden diğerine sadık bir şekilde aktarılmasını sağlayan temel bir biyolojik süreçtir. Mayoz bölünme süreci, mayoz I ve mayoz II olmak üzere iki ardışık hücre bölünmesi turuna bölünmüştür. Mayoz I'den önce, homolog kromozomların birbirini tanıdığı ve eşleştiği uzun bir faz gelir. Bu uzun faz sırasında çok sayıda biyolojik süreç meydana gelir. Homolog kromozomların eşleşmesinin yanı sıra, bu kromozomlar da sinaps adı verilen bir süreçten geçer. Sinaps, homolog kromozomları uzunlukları boyunca birbirine bağlayan sinaptonemal kompleks olarak bilinen bir protein kompleksinin oluşumunu içerir. Sinaptonemal kompleks, homolog rekombinasyonu teşvik eder, ardından homolog kromozomlar arasında genetik materyal alışverişi ve çaprazlama oluşumu gelir. Bunlar, homolog kromozomlar arasında fiziksel bir bağlantı kurarak, uygun hizalanmalarını ve dengeli ayrılmalarınıkolaylaştırır 1,2.

Homolog kromozom tanıma sırasında, Hızlı Profaz Kromozom Hareketlerinin (RPM'ler) çok önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Birkaç model türde yapılan çalışmalar, leptoten sırasında kromozomların nükleer zarfa (NE) bağlandığını göstermiştir. LINC (Nükleoskeleton ve Hücre İskeleti Bağlayıcısı) protein kompleksi3 aracılığıyla NE yoluyla sitoplazmik hücre iskeletine bağlanırlar. Sitoplazmada üretilen kuvvetler, LINC kompleksi aracılığıyla kromozomlara iletilir ve kromozom hareketini sağlar.

RPM'lerin incelenmesi, mayoz bölünmenin temel mekanizmalarını, özellikle de homolog kromozomların tanınmasında rol oynayanları anlamak için gereklidir. Bununla birlikte, bu hareketleri incelemek, belirli canlı görüntüleme deneyleri gerektirir. A. thaliana'daki canlı görüntüleme çalışmalarının çoğu somatik dokulara ve vejetatif organlara odaklanmaktadır. Bu çalışmalar, hücrelerin organları nasıl oluşturduğunu belirlemek için yapılmıştır4. Bu tür çalışmalar meristemler5ve kökler6 üzerinde yapılmıştır. Son zamanlarda, birkaç ekip, Mayoz bölünme de dahil olmak üzere çiçek gelişimini birkaç günlük periyotlar boyunca A. thaliana'da gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için teknikler geliştirdi 7,8. Bununla birlikte, bu protokoller aynı zamanda çok sayıda numune için zorlu ve kurulması zor olabilir.

Bu makale, A. thaliana'da mayoz bölünme sırasında canlı hücre görüntüleme ve kromozom dinamiklerinin analizi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Kromozomların floresan etiketlenmesi ile birlikte numune hazırlama için basit bir teknik olan konfokal mikroskopi kullanılarak, kromozom hareketi kısa zaman dilimlerinde yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle yakalandı. Protokol, bitki dokusunun görüntüleme için hazırlanmasını, fototoksisiteyi en aza indirmek ve görüntü kalitesini en üst düzeye çıkarmak için görüntüleme parametrelerinin optimizasyonunun yanı sıra görüntü işleme ve veri analizini özetlemektedir. Bu yöntem, başarılı gamet oluşumunun altında yatan kromozom davranışını anlamak için çok önemli olan mayoz bölünme sırasında sentromer dinamiklerinin kesin olarak ölçülmesini sağlar. Bu bilginin, özellikle doğurganlığı ve genetik çeşitliliği etkileyen kromozom eşleşmesi ve rekombinasyon süreçlerinin incelenmesini kolaylaştırarak mahsul ıslah programlarının iyileştirilmesinde tarım için doğrudan etkileri vardır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, GFP-CENH3 ve NUP54-RFP transgenlerini 9,10 eksprese eden transgenik A. thaliana bitkilerini kullanır. CENH3 işaretleyicisi, sentromerlerin hareketinin izlenmesine izin verir. NUP54 işaretleyicisi nükleer gözenekleri etiketler ve böylece çekirdeğin ayırt edilmesine yardımcı olur. Başka işaretleyiciler de kullanılabilir, ancak numune sürekli aydınlatıldığı için bunların ışıkla ağartmaya karşı dayanıklı olması gerekir. İşaretleyicinin ışıkla ağartmaya uğramadığından emin olmak için deneyi aynı lazer koşulları ve toplama parametreleri altında gerçekleştirin ve sinyalin görüntü alma süresi boyunca sabit kaldığını kontrol edin. Kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Bitki büyümesi ve kültürü

  1. Tohumları doğrudan seradaki saksılara ekin.
  2. Saksıları aşağıdaki koşullar altında bir seraya yerleştirin: 16 saat gündüz/8 saat gece, 20 °C, %70 nem.
  3. Bitkilerin serada yaklaşık 4 hafta gelişmesine izin verin. Bitkiler 5/6 çiçek sapına sahip oldukları bir aşamaya ulaşmalıdır (bkz. Şekil 1A).

2. Anterlerin diseksiyonu ve slayt hazırlığı

  1. Bir cam slayt hazırlayın, ortasına bir ara parça (9 mm çapında, 0,12 mm derinliğinde çift taraflı yapıştırıcı) yerleştirin ve her iki taraftaki koruyucu filmleri çıkarmaya dikkat edin. Bu ara parça numuneyi tutacak ve slayt ile lamel arasında boşluk yaratacaktır.
  2. Ara parçanın ortasına 8 μL musluk suyu bırakın.
  3. Forseps kullanarak, ana gövdelerden birinden bir çiçek salkımı seçin (bkz. Şekil 1B) (ortaya çıkan gövdelerden küçük çiçek salkımları kullanmayın).
  4. Çiçek salkımını bir cetvelle donatılmış bir stereomikroskop altında yeni bir slayt üzerine yerleştirin. Yaklaşık 0,5 mm uzunluğunda çiçek tomurcukları seçin (Şekil 1C).
  5. Keskin iğneler kullanarak tomurcukları yavaşça açın, sadece anterleri tutmak için çanak yaprakları ve yaprakları ayırın. Anterlere zarar vermemeye ve kurumasına izin vermemeye dikkat edin.
  6. Anter demetlerini ara parça boşluğundaki suya hassas bir şekilde aktarın. Dehidrasyonu önlemek için, bunu sepals ve yaprakları çıkardıktan hemen sonra yapın.
  7. Ara parça boşluğunun içine birkaç anter demeti bırakın.
  8. Hava kabarcıklarından kaçınarak slaytı bir lamel ile örtün. Bunu yapmak için, bir lamel üzerine 8 μL su ekleyin ve ara parça boşluğundaki su damlası ile lameli dikkatlice ters çevirin. Anter demetlerinin toplam 16 μL suya daldırıldığından ve lamel ara parçaya iyice yapıştırıldığından emin olun (bkz. Şekil 1D; Şekil 2).

3. Konfokal mikroskopi hızlandırılmış gözlem – Görüntüleme kurulumu

NOT: Görüntüleme parametrelerini ayarlamanın yolu, kullanılan konfokal sisteme bağlıdır. Görüntüleme parametrelerinin daha fazla değerlendirilmesi için Tartışma bölümüne bakın. Görüntüler CLSM ve 20x suya daldırma lensi kullanılarak elde edildi. Suya daldırma hedefinin kullanılması, biyolojik numune suya monte edildiğinden daha iyi bir kırılma indisi eşleşmesi sağlar.

  1. GFP'yi 488 nm'de uyararak ve 494 nm ile 547 nm arasında bir hibrit dedektörle tespit ederek mikroskobu kurun.
    NOT: Hibrit dedektör ofset kazancı 100'e ayarlandı. RFP, 561 nm'de uyarılır ve 584 ile 629 nm arasında bir hibrit dedektör ile algılanır. Hibrit dedektör ofset kazancı 130'a ayarlandı. Tarama hızı 400 Hz'dir ve tarama çift yönlüdür. Satır ortalaması 2 uygulanır. Edinme süresini en aza indirmek için iki kanal aynı anda satın alındı. Lazer gücü 488 nm lazer için %15 ve 561 nm lazer için %30 olarak ayarlandı.
  2. Parlak alan aydınlatmasını kullanarak anteri lokalize edin.
  3. Parlak alan kanalını kullanarak, hücrelerin şekline göre mayotik aşamayı belirleyin.
    NOT: RPM'leri gözlemlemek için zigoten veya pakiten aşamaları gereklidir. Odağın Z ekseni boyunca değişmesi, hücrenin 3B şeklinin tahmin edilmesini sağlar. Leptoten aşamasında, mayositler belirgin bir şekilde kare bir şekil sergiler ve nükleolus çekirdeğin merkezinde konumlandırılır, bu da onları kolayca tanımlanabilir hale getirir. Zigoten ve pakiten aşamaları sırasında, mayositler yamuk bir şekil almaya başlar ve nükleolus nükleer zarfa doğru göç eder. Diploten aşamasına göre, mayositler tamamen yuvarlak bir morfoloji10 sergiler.
  4. Anteri yazılım üzerinde görselleştirin. RFP sinyali ayrıca hücrelerin mayotik aşamasının iyi bir göstergesidir.
    NOT: Zigoten / pakiten aşamasındaki mayositler, bu aşamalarda NE'nin sınırlı bir bölgesinde nükleer gözeneklerin kümelenmesine karşılık gelen hilal şeklinde NUP54 etiketlemesi sergiler (Şekil 3A). Gerekirse, anteri yatay olarak yerleştirilecek şekilde döndürün (bkz. Şekil 3).
  5. 400 piksele 150 piksellik bir görüntü boyutu tanımlayın ve 4 dijital yakınlaştırma ile anteri görüntüde ortalayın.
  6. Mümkün olduğu kadar çok sayıda bozulmamış mayosit elde etmek için görüntülenecek numunenin kalınlığını tanımlayın. Ancak, edinme süresini en aza indirmek için z dilimlerinin sayısını sınırlamak önemlidir. 15 μm kalınlık için 16 z-dilimi yapılır. 1.04 μm adım boyutunda Z-yığınları elde edildi.
  7. Sürekli alımlar gerçekleştirmek için zaman bölümünde zaman aralığını sıfır olarak ayarlayın. Mikroskop ve yukarıda açıklanan parametrelerle, 16 dilim için çekim süresi yaklaşık 6-8 saniyedir. Minimum çekim süresi 2 dakikadır, ancak 20 dakikaya kadar çıkabilir.
  8. Satın alma işlemini başlatın.

4. Görüntü analizi – Sentromer hareket takibi

NOT: Sentromer hareketlerinin yeniden yapılandırılması, 3D hareketi izleyebilen görüntü analiz yazılımı gerektirir. Yazılım, her alım sırasında tanımlanan parametrelere dayalı olarak bir nesneyi bir floresan sinyaline atayacaktır. Ardından, izleme aracı hareketli nesneleri otomatik olarak analiz eder ve bir köken grafiği oluşturur.

  1. Görüntü ön işleme
    1. Hareketlerin analizini kolaylaştırmak için, çekim sonrası görüntü işleme gerçekleştirin. Örneğin, ince yapıları ve ayrıntıları ortaya çıkarmak ve görüntü kalitesini iyileştirmek için uyarlanabilir bir bilgi çıkarma işlemi (ters evrişim algoritması) kullanılabilir.
  2. Küresel sentromer takibi
    1. Görüntünün tüm sentromerlerini takip edin: Spotları otomatik olarak takip etmek için bir spot modülü kullanın (zaman içinde).
    2. Kaynak kanalı seçin, bu durumda yeşil. GFP-CENH3 işaretli sentromer için XY çapını (1 μm) belirtin. Nesne algılama, görüntüdeki tüm nesneleri tanımlar (Şekil 3B).
    3. Kontrol penceresinin altındaki grafiği kullanarak sinyal yoğunluğuna göre algılama kalitesini değiştirin.
    4. Yörüngeleri izlemek için otomatik regresif bir hareket izleme algoritması kullanın (Şekil 3C). Tüm yörüngelerin görselleştirilmesi, mayositlerin somatik dokulardan tanımlanmasını kolaylaştırır (Video 1).
  3. Tek bir mayositte sentromerlerin izlenmesi
    NOT: Bir 3D görselleştirme yazılımı kullanarak çekirdekleri ve yörüngeleri kontrol edin ve yalnızca sağlam olan ve satın alma sırasında herhangi bir noktada kırpılmamış çekirdekleri analiz edin. Kesilmiş bir mayositin analizi hatalı verilerle sonuçlanır.
    1. Otomatik sentromer takibi
      NOT: Tek bir çekirdeği analiz ederken, süreç baştan yeniden başlatılır.
      1. Seçilen çekirdekteki noktaları (zaman içinde) izlemek için spot modülünü kullanın, Yalnızca bir İlgi Bölgesi segmentine ayır seçeneğini kullanarak karşılık gelen bir İlgi Bölgesi (ROI) tanımlayın ve noktaları takip edin (zaman içinde).
      2. Çekirdeği her üç boyutta ve zaman içinde uygun şekilde içeren bir yatırım getirisi seçin. (Şekil 4A).
      3. Sentromer tespiti (Şekil 4B) ve izleme (Şekil 4C) için tüm anter ile aynı parametreleri kullanın.
      4. Bir soy grafiğinde (Şekil 4F), tüm yörüngeler belirtilmiştir. Analiz edilen mayosit dışındaki yörüngeler çıkarılabilir (Şekil 4C). Parçaları seçin ve klavyedeki Sil tuşunu kullanarak silin. Bunlar, yazılımın 3D görüntüleyicisi kullanılarak kolayca tanımlanabilir.
    2. Manuel sentromer izleme düzeltmesi
      NOT: Çoğu durumda, izleme yazılımı birbirine çok yakın olan sentromerleri ayırt edemediği için yörüngelerin manuel olarak düzeltilmesi gerekir.
      1. Bir nesneyi silmek veya eklemek için Düzenleme modunu kullanın. Nesnenin doğru düzlemde eklendiğinden emin olun.
      2. Hücrenin 3D olarak dikkatli ve kapsamlı bir kişisel analizinden sonra, soy grafiğini kullanarak İzleri Düzenle modunda yeni nesneleri manuel olarak bağlayın. Şekil 4E,G, sırasıyla mayosit görüntüsü ve doğrusal çizim üzerinde düzeltilmiş yörüngeleri göstermektedir. Video 2 , düzeltmeden sonra bir mayositin yörüngelerini gösterir.
      3. Verileri dışa aktarma
        1. Daha fazla veri işleme ve analizini kolaylaştırmak için izleme verilerini bir elektronik tablo program formatına aktarın. Bu dosyalar, yazılım ile gerçekleştirilen takip sonucunda ortaya çıkan ölçüm tablolarını içerir.
        2. Dışa aktarılan elektronik tablo dosyasının aşağıdaki değişkenleri içerdiğinden emin olun: Her ölçümün zaman noktasını kaydeden Zaman; her parçayı benzersiz olarak tanımlayan izleme kimliği; Her zaman noktasında üç boyuttaki konum değişikliğini temsil eden Yer Değiştirme Deltası X, Y, Z; ve her nesnenin uzaydaki mutlak konumunu saklayan X, Y, Z Konumu.

5. Veri analizi

NOT: Bu bölüm,RStudio 12'de yürütülen R11 komut dosyalarını kullanan veri analizi iş akışını açıklar. Data INRAE deposundan şu adresten alınabilirler: 10.57745/V1NNFI. Tüm rakamlar, hesaplanan metrikleri görselleştirmek için ggplot213 kullanılarak oluşturulur. Komut dosyaları sırayla aşağıdaki adımları gerçekleştirir: meiomove-sub-config. R betiği ilk olarak R ortamını başlatmak, gerekli kitaplıkları yüklemek ve genel değişkenleri tanımlamak için yürütülür. Komut dosyasının bağlantısı: https://doi.org/10.57745/V1NNFI

  1. Verileri okuma ve seçme
    NOT: Kullanılacak komut dosyası şu şekilde saklanır: meiomove-sub-loader.R."
    1. İzleme verilerini içeren tüm Excel dosyalarını tek tek toplayın ve bunları tek bir birleştirilmiş dosyada birleştirin.
    2. Diğer veri işleme adımlarıyla uyumluluğu sağlamak için birleştirilmiş dosyayı TSV formatında (sekmeyle ayrılmış değerler) kaydedin.
    3. Zaman içindeki yer değiştirme değerlerini toplayarak x, y, z konumlarını hesaplayın ve izlenen her nesnenin uzamsal yörüngesinin doğru bir şekilde yeniden yapılandırılmasını sağlayın. Bu, yazılımda yanlış XYZ konumlarını dışa aktaran bir hatayı telafi etmek için yapıldı.
  2. Veri temizleme
    NOT: Kullanılacak komut dosyası şu şekilde saklanır: meiomove-sub-clean.R."
    1. Minimum süresi 50 sn olan kısa izleri kaldırın. Bu izler, gürültü veya yanlışlıklara neden olabileceğinden anlamlı analiz için yeterli veri noktası içermez.
    2. Konumun (X, Y, Z) zaman içinde sabit kaldığı izleri belirleyin ve silin, çünkü bunlar analizle ilgili olmayan artefaktları veya statik yapıları gösterir.
    3. Veri bütünlüğünü sağlamak ve sonraki adımlarda hesaplama hatalarını önlemek için eksik yer değiştirme değerlerini (NA girişleri) filtreleyin.
    4. Görüntü analiz yazılımından elde edilen yer değiştirme değerlerinin yeniden hesaplananlardan önemli ölçüde farklı olduğu izleri tespit edip silin, böylece izleme verilerinde tutarlılık ve güvenilirlik sağlayın.
  3. Mayoz hücre kaymasını düzeltme
    NOT: Kullanılacak komut dosyası aynı zamanda şu şekilde de saklanır: meiomove-sub-clean.R."
    1. Mayoz ve somatik sentromerler arasında ayrım yaparak edinim sırasında olası kaymayı hesaba katın. Bu adım, gözlemlenen hareketlerin deneysel eserlerden ziyade biyolojik süreçlere karşılık gelmesini sağlar.
    2. Mayoz hücrelerinin kararlı bir referans görevi gören somatik hücrelere göre konumlarını ayarlayarak sapma düzeltmesi uygulayın.
  4. Çıktı üretimi
    NOT: Kullanılacak komut dosyası şu şekilde saklanır: meiomove-sub-metrics.R."
    1. Zaman içinde hareket hızındaki değişiklikleri izlemek için her zaman adımında anlık hızı hesaplayın.
    2. Ardışık zaman adımları arasındaki hareket yönündeki değişimi temsil eden ve yörünge modellerine ilişkin bilgiler sağlayan dönüş açısını hesaplayın. Sonuç şu şekilde depolanır: results/dataframes/metrics-by-step.tsv (Çıkış 1).
    3. İzlenen bir nesnenin başlangıç konumuna göre ne kadar hareket ettiğini ölçen ve keşif davranışının bir göstergesini veren celltrackR14'ü kullanarak erişim oranını hesaplayın. Sonuç şu şekilde depolanır: results/dataframes/metrics-celltrackr.tsv (Çıkış 2).
    4. Tüm gözlem süresi boyunca hareket özelliklerini özetlemek için her bir iz için ortalama hızı hesaplayın. Genel hareket yönlülüğünü ve davranış kalıplarını analiz etmek için pist başına ortalama dönüş açısını hesaplayın. Sonuç şu şekilde depolanır: results/dataframes/metrics-by-id.tsv (Çıkış 3).
    5. Her hücre izi için her zaman adımında ağırlık merkezi konumunu belirleyin. Ağırlık merkezi, belirli bir mayositteki sentromer konumlarının ortalamasıdır.
    6. Sentromerlerin ortalama konumları etrafındaki uzamsal dağılımının bir ölçüsünü sağlayan her zaman adımında ağırlık merkezi boyutunu hesaplayın. Zaman içinde ağırlık merkezi boyutunun değişimleri, sentromer izleri arasında küresel tutarlılık hakkında bilgi verir. Sonuç şu şekilde depolanır: results/dataframes/metrics-by-cell.tsv (Çıkış 4).
    7. İzlenen farklı nesnelerin hareket dinamikleri arasındaki ilişkileri analiz etmek ve potansiyel koordineli davranışları ortaya çıkarmak için hız çapraz korelasyonunu hesaplayın. Sonuç şu şekilde depolanır: results/dataframes/metrics-correlations.tsv (Çıkış 5).
    8. Hareket tipini karakterize etmek için belirli zaman aralıklarında (zaman gecikmeleri) sentromerlerin kat ettiği ortalama kare mesafeyi ölçen önemli bir ölçüm olan her iz için ortalama kare yer değiştirmeyi (MSD) hesaplayın.
      NOT: MSD'nin artan zaman gecikmesi ile nasıl geliştiğini inceleyerek, hareketin ağırlıklı olarak dağınık mı yoksa sınırlı mı olduğu sonucuna varılabilir, böylece altta yatan dinamik davranış hakkında fikir verilir. Sonuç şu şekilde depolanır: results/dataframes/metrics-msd.tsv (Çıkış 6).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arabidopsis thaliana'da mayoz bölünme sırasında kromozom hareketlerini görselleştirmek için hızlı bir protokol geliştirildi ve çoklu hızlandırılmış edinimlere ve dolayısıyla büyük bir veri kümesinin analizine izin verdi. Sentromerlerin görselleştirilmesine izin veren bir GFP işaretleyicisini eksprese eden mayositler ve çekirdeğin görselleştirilmesine izin veren bir RFP işaretleyicisi, açıklanan protokolü takiben 4 dakikalık bir süre boyunca görün...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, Arabidopsis thaliana'da mayotik faz sırasında sentromer hareketinin in vivo görüntülenmesini ve analizini sağlar. Bu protokol, dik veya ters çevrilmiş bir konfokal mikroskopla uygulanabilir ve bu da onu konfokal teknoloji ile donatılmış çoğu laboratuvar için erişilebilir hale getirir. Konfokal sistemler tarama hızı, hassasiyet, dedektörler ve dalga boylarını ayırma yeteneği açısından farklılık gösterse de, iyi zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip görün...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Institut Jean-Pierre Bourgin'in Bitki Gözlemevi teknolojik platformları PO-Plants ve PO-Cyto'nun desteğinden yararlanmıştır. Bu araştırma ANR tarafından finanse edilmiştir (MeioMove ANR-21CE12-0042 : M.G., P.A., L.C., S.L. ve DYSCORD ANR-23-CE20-0036-02, M.G., L.C.). Jean-Pierre Bourgin Enstitüsü, Saclay Bitki Bilimleri'nin (ANR-17-EUR0007) desteğinden yararlanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Üreme alanıTREF (Jiffy)101820/02227861
Konfokal mikroskopLeicaTCS SP8 AOBS (Akusto-Optik Tışın Ayırıcı)
Konfokal yazılımLeicaLAS X 3.5.0.18371 yazılımı
Kapak SlipleriPaul Marienfeld GmbH10705222x22 No1,5H
ForsepsIdeal-Tek4.SA.0Yüksek hassasiyetli cımbızlar
GFP:CENH3Ravi ve ark. 2010Burada kullanılan Arabidopsis thaliana tohumları
ggplot2  ggplot2: Veri Analizi için Zarif Grafikler  Reference13https://ggplot2.tidyverse.org
İğne sapıHammacherHalka sapı, uzunluğu 170 mm
ImarisOxford enstrümanlarıImaris 9.7.2Görüntü analizi - "Spot" modülü
LensLeicaHC PL APO CS2 20×/0.75 IMM
YıldırımLeicaAdaptif DekonvolüsyonKonfokal verilerden otomatik akıllı bilgi çıkarımı
IşıklarVEGELEDApollo LL252-Gen2
İğnelerWatkins& DoncasterE3 pinleri .0124"(.31mm) x 25mm
NUP54:RFPCromer ve ark. 2024Burada kullanılan Arabidopsis thaliana tohumları
SaksılarTEKU (POPPELMANN)VDF 7x7x6,5 cm
RRCore TakımıR: İstatistiksel için bir dil ve ortam;   Bilgisayar. R İstatistiksel Hesaplama Vakfı, Viyana, Avusturya.  Reference11https://www.R-project.org/  
RstudioPosit Takımı  RStudio: R. Posit Software için Entegre Geliştirme Ortamı, PBC, Boston, MA. Reference12http://www.posit.co/
SlaytlarÖRGÜ CAM10000326x76x1,0mm
AralıklarTermo-balıkçıGüvenli Mühürlü Aralık, 8 kuyup, 9 mm çap, 0,12 mm derinlikHer ara parçayı ayrı ayrı kesin
StereomikroskoplarNikonSMZ800

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zickler, D., Kleckner, N. Meiotic chromosomes: Integrating structure and function. Annu Rev Genet. 33 (1), 603-754 (1999).
  2. Zickler, D., Kleckner, N. Meiosis: Dances between homologs. Annu Rev Genet. 57 (1), 1-63 (2023).
  3. Kim, H. J., Liu, C., Dernburg, A. F. How and why chromosomes interact with the cytoskeleton during meiosis. Genes (Basel). 13 (5), 901(2022).
  4. Harline, K., Roeder, A. H. K. An optimized pipeline for live imaging whole Arabidopsis leaves at cellular resolution. Plant Methods. 19 (1), 10(2023).
  5. Prunet, N. Live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers. J Vis Exp. (122), e55156(2017).
  6. Peng, Z., Jiao, Y., Wang, Y. Live imaging of Arabidopsis shoot primordia via a confocal laser scanning microscope. STAR Protoc. 4 (2), 102217(2023).
  7. Prusicki, M. A., et al. Live cell imaging of meiosis in Arabidopsis thaliana. eLife. 8, e42834(2019).
  8. Valuchova, S., et al. Imaging plant germline differentiation within Arabidopsis flowers by light sheet microscopy. ELife. 9, e52546(2020).
  9. Ravi, M., Chan, S. W. L. Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination. Nature. 464 (7288), 615-618 (2010).
  10. Cromer, L., et al. Rapid meiotic prophase chromosome movements in Arabidopsis thaliana are linked to essential reorganization at the nuclear envelope. Nat Commun. 15 (1), 5964(2024).
  11. R: A language and environment for statistical computing. , at https://www.R-project.org/ (2021).
  12. RStudio: Integrated development environment for R. , at http://www.posit.co/ (2025).
  13. Wickham, H. Data Analysis. ggplot2. , 189-201 (2016).
  14. Wortel, I. M. N., et al. CelltrackR: An R package for fast and flexible analysis of immune cell migration data. Immunoinformatics. 1 - 2, 100003(2021).
  15. Lee, C. -Y., et al. Mechanism and regulation of rapid telomere prophase movements in mouse meiotic chromosomes. Cell Rep. 11 (4), 551-563 (2015).
  16. Nozaki, T., Weiner, B., Kleckner, N. Rapid homologue juxtaposition during meiotic chromosome pairing. Nature. 634 (8036), 1221-1228 (2024).
  17. Fang, Y., Spector, D. L. Centromere positioning and dynamics in living Arabidopsis plants. Mol Biol Cell. 16 (12), 5710-5718 (2005).
  18. Arpòn, J., Gaudin, V., Andrey, P. A method for testing random spatial models on nuclear object distributions. Plant Chromatin Dynamics: Methods and Protocols. 1675, 493-507 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kromozom HareketiKonfokal MikroskopiAnter DiseksiyonuFloresan aretlemeZaman Atlamal G r nt lemeKromozom Y r ngeleri

İlgili makaleler