Yöntem makalesi

Biyolojik Örneklerde A Vitamininin 13C Zenginleştirilmesinin Gaz Kromatografisi-Yanma-İzotop Oranı Kütle Spektrometresi ile Analizi

491 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68571

⸱

14 Kasım 2025

 ,  ,  , 
1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison

Bu makalede

Özet

Bu yazıda, izleyici uygulamaları için retinol ve retinil esterlerin 13C zenginleştirmesi için serum, anne sütü ve karaciğer örneklerinin analizi açıklanmaktadır. Retinol konsantrasyonlarını saflaştırmak ve ölçmek için yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanılır ve saflaştırılmış ekstraktları analiz etmek için gaz kromatografisi-yanma-izotop oranı kütle spektrometrisi (GC-C-IRMS) kullanılır.

Özet

A vitamini sağlık için kritik öneme sahiptir, ancak A vitamini durumunun değerlendirilmesi zordur. Kanda dolaşan A vitamini homeostatik olarak kontrol edilir ve çoğu zaman A vitamini eksikliğini veya fazlalığını yansıtmaz. 13C-A vitamini kullanımı, toplam vücut A vitamini depolarının izlenmesine ve ölçülmesine ve farmakokinetik ve metabolizma hakkında ek bilgilere izin verir. Bu protokol, gaz kromatografisi-yanma-izotop oranı kütle spektrometrisi (GC-C-IRMS) kullanılarak serum, anne sütü ve doku örneklerinde A vitamininin 13C-izotopik zenginleştirmesinin ekstraksiyonunu, saflaştırılmasını ve belirlenmesini açıklar. GC-C-IRMS kullanılarak yapılan analiz, özellikle doğal bolluk seviyelerine yakın 13C zenginleştirmeye sahip numuneler için hassas ve kesin zenginleştirme değerleri sağlar. Bu, çalışma tasarımlarında daha küçük izleyici dozları ve daha uzun vadeli farmakokinetik örnekleme kullanma esnekliği sağlar. Kısaca, 0.4 ila 1 mL seruma, çökelti proteinlerine etanol eklenir, dahili standart olarak C-23 β-apo-karotenol eklenir ve retinoidleri çıkarmak için heksan kullanılır. Ekstrakt daha sonra metanol içinde yeniden süspanse edilir ve HPLC kullanılarak saflaştırılır. Retinol fraksiyonu daha sonra heksan içinde yeniden süspanse edilir ve GC-C-IRMS sistemine enjekte edilir. Atom yüzdesi (%At), bir element analizörü kullanılarak bir sakaroz standardına göre kalibre edilen karbondioksite göre doğrudan hesaplanır. GC-C-IRMS ile analiz edilen diğer doku tipleri arasında sabunlaştırma sonrası anne sütü ve karaciğer bulunur. Katı faz ekstraksiyon teknikleri, bu veya diğer karmaşık matrislerin saflaştırılmasına yardımcı olmak için kullanılabilir. Ayrıca, gıda numunelerini toplam 13C içeriği açısından analiz etmek için IRMS'ye bir element analizörü takılabilir.

Giriş

A Vitamini (VA), görme, bağışıklık fonksiyonu, hücresel farklılaşma ve metabolik düzenleme için gerekli olan temel bir mikro besindir. Eksikliği veya fazlalığı sağlık sonuçlarını bozabileceğinden, VA durumunu optimize etmek küresel bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. GK durumunun doğru değerlendirilmesi, uygun müdahalelere rehberlik eden klinik veya popülasyon çalışmaları için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, tek başına serum retinol konsantrasyonu, çok çeşitli toplam vücut depolarında (TBS'ler) homeostatik olarak düzenlendiği ve inflamasyon ve diğer besin eksikliklerinden etkilendiği için zayıf bir biyobelirteç ve tanı aracıdır 1,2.

İzotopik olarak etiketlenmiş izleyiciler, retinol izotop seyreltme (RID) testi 3,4,5'i kullanarak TBS'lerin kantitatif değerlendirmesini sağlayarak VA araştırmasını önemli ölçüde dönüştürmüştür. RID için, 13C veya 2H'de zenginleştirilmiş bir VA izleyici uygulanır, vücut depoları ile dengelenir ve serum (veya plazma) retinol izleyici-iz oranı (TTR) MS kullanılarak ölçülür. TBS'leri 5,6 hesaplamak için VA metabolizması ile ilgili spesifik varsayımlarla bir izotop seyreltme denklemi uygulanır.

Serum retinol TTR'sini belirlemek için çok sayıda kromatografi ve MS kombinasyonu kullanılabilir (örneğin, GC-MS, LC-MS, LC-MS/MS). TBS'ler TTR ile ters orantılı olduğundan, doğru RID tahminleri için analitik hassasiyet kritik öneme sahiptir. LC-MS/MS, yoğun şekilde etiketlenmiş izleyiciler ve nispeten yüksek izleyici dozları kullanıldığında yüksek verimli uygulamalar için çok uygundur. Tipik LC-MS/MSyöntemleri, tahlil içi için %3-6 ve tahlil 7 arası için %<8'lik retinol bağıl standart sapmaları (RSD'ler) bildirir, ancak TTR'lerin doğruluğu ve kesinliği hakkında sınırlı veri vardır. Buna karşılık, gaz kromatografisi-yanma-izotop oranı kütle spektrometrisi (GCCIRMS), ~0,02-0,05 8,9'luk tipik 13 C/12C izotop bolluğu RSD'leri ile 13C-retinol zenginleştirmesi için olağanüstü hassasiyet sunar. Bu, zenginleştirmelerin düşük olduğu numunelerde izleyici konsantrasyonlarının hassas bir şekilde belirlenmesine olanak tanır. RID uygulamaları için IRMS'nin kullanılması, izleyicide daha az izleyici kütlesi ve daha az etiketli atom kullanarak yeterli analitik sinyale izin verir ve her ikisi de izleyici dozlarıyla ilişkili maliyetlerden tasarruf sağlar.

Bu makale, GC-C-IRMS kullanılarak kan, anne sütü ve dokulardan 13C-retinol için bir analizi özetlemektedir. Test edilen biyolojik numuneye bağlı olarak, GC-C-IRMS kullanılarak 13C etiketli retinolün analizi, etiketli retinol içeren polar olmayan bileşikleri izole etmek için birkaç potansiyel ekstraksiyon yönteminden biriyle başlar. Serum numuneleri için bu, etanol ve heksan eklenerek ve heksan fraksiyonunun toplanmasıyla sıvı-sıvı ekstraksiyonunu içerir. Anne sütü test ediliyorsa, numuneler önce potasyum hidroksit ile sabunlaştırılır, ardından seruma benzer bir sıvı-sıvı ekstraksiyonu yapılır. Bu anne sütü numuneleri ayrıca kalan diğer lipitlerin miktarını azaltmak için katı faz ekstraksiyon kartuşları kullanılarak saflaştırılır. Bir dokudan (örneğin karaciğer) ekstrakte ediliyorsa, numune suyu çıkarmak için susuz sodyum sülfat ile öğütülür, metilen klorür ile ekstrakte edilir ve döner buharlaştırma için hacimsel veya yuvarlak tabanlı bir şişeye süzülür. Bir alikot kurutulur, etanol içinde yeniden süspanse edilir, sabunlaştırılır ve anne sütü ile aynı yöntem kullanılarak ekstrakte edilir. Her numuneden alınan bu polar olmayan çözeltiler nitrojen altında kurutulur ve yüksek performanslı sıvı kromatografisinde (HPLC) saflaştırma ve miktar tayini için metanol içinde yeniden sulandırılır.

IRMS'nin duyarlılığı, uzun süreli matematiksel modelleme uygulamaları için farmakokinetik numuneler veya VA metabolizmasının hassas takibi için ekstrahepatik doku numuneleri gibi düşük numune zenginleştirmesine sahip numunelerde zenginleştirmenin belirlenmesine olanak tanır. Teorik deneklerde10 etkinliği belirlemek için müdahaleden önce ve sonra VA durumunu değerlendirmek için tek doz, eşleştirilmiş RID testi önerilmiştir ve bu, insanlarda doğrulanırsa umut verici bir yaklaşım olabilir. IRMS, doğal zenginleştirme değerlerine yakın VA izleyicilerini tespit edebilir, bu da uzun takip pencerelerine ve örnekleme protokollerinde esnekliğe olanak tanır.

Anne sütünün VA durum değerlendirmesi için daha az invaziv bir alternatif örnekleme yaklaşımı olduğu gösterilmiştir1. Anne sütü retinol, RID testi için bir örnekleme kaynağı olarak kullanılabilir ve Zambiya'da düşük VA depoları olan kadınlarda serum kaynaklı RID değerleri ile güçlü bir korelasyon göstermiştir11. Dokular ve anne sütü numuneleri için katı faz ekstraksiyon teknikleri, bu numunelerin karmaşık matrislerde saflaştırılmasına yardımcı olabilir. IRMS ayrıca, serum retinol9,12,13'ün doğal 13C bolluğundaki değişiklikleri kullanarak VA'nın gıda kaynaklarını ayırt etmek ve nispi diyet katkılarını belirlemek için kullanılmıştır. Gıda numunelerini toplam 13C içeriği açısından analiz etmek ve bunu VA zenginleştirmesi ile karşılaştırmak için IRMS ile birlikte bir element analizörü de kullanılabilir.

13C etiketlerini kullanırken, hem bireyler hem de popülasyonlar tarafından tüketilen VA kaynaklarına göre değişebilen, doğal olarak oluşan 13 C (toplam karbonun ~%1,1'i) nedeniyle temel 13 Cretinol zenginleştirmesini anlamak çok önemlidir. Bu nedenle, bireysel düzeyde en iyi doğruluk için bir başlangıç kan örneği önerilir. Popülasyon değerlendirmeleri için, rastgele seçilen bir alt grup kullanılarak veya aynı popülasyon grubundan14 ayrı bireyler kullanılarak popülasyona dayalı bir tahmin oluşturulabilir.

Protokol

1. Biyolojik örneklerden retinol ekstraksiyonu

NOT: Tüm numune işleme ve ekstraksiyon prosedürleri, bozulmayı en aza indirmek için sarı veya UV filtreli ışık altında gerçekleştirilir.

  1. Serumdan ekstraksiyon
    1. 1 mL serumu (veya mümkün olduğu kadar) 13 x 100 mm (veya benzer boyutta) bir cam test tüpüne pipetleyin. Kullanılan serum hacmini kaydedin.
      NOT: Pozitif yer değiştirmeli pipet kullanılması önerilir.
    2. 200 derecelik etanol hacminin 1,5 katını ekleyin.
    3. C-23 β-apo-karotenol (all-trans retinalden sentezlenmiş, abs = 0.9)9 gibi dahili standardın 25 μL'sini ekleyin. Numuneyi kapatın ve 15 saniye boyunca girdap ile karıştırın.
    4. 1 mL heksan ekleyin, girdapla 15 saniye karıştırın ve oda sıcaklığında 2 dakika (~1.300 × g) santrifüjleyin.
    5. Bir Pasteur pipeti kullanarak, üst heksan tabakasını yeni bir cam test tüpüne (12 x 75 mm veya 13 x 100 mm) dikkatlice pipetleyin.
    6. 1.1.4 ve 1.1.5 2x adımlarını tekrarlayın ve üç heksan ekstraktını ikinci tüpte toplayın. Havuzlanmış heksan ekstraktını kuruyana kadar hafif bir nitrojen akışının altına yerleştirin.
    7. Kurutulmuş numuneye 100 μL metanol ekleyin ve hemen kapatın. Çözeltiyi tüpün kenarlarında yukarı ve aşağı döndürün ve ardından numuneyi girdap ile 15 saniye karıştırın.
    8. Numuneleri en az 5 dakika boyunca -80 °C'lik bir dondurucuya koyun.
      NOT: Numuneler bu adımda -80 °C'de ertesi güne kadar saklanabilir.
  2. Anne sütü örneklerinin çıkarılması
    1. Süt numunelerini tamamen çözün ve numunelerin homojen olduğundan emin olmak için birkaç kez hafifçe ters çevirin. 10 mL'lik bir cam vidalı santrifüj tüpüne, 0,5-1,5 mL (standart 1,0 mL) süt alikotunu ölçün ve kullanılan hacmi kaydedin.
    2. 200 derecelik etanol hacminin 1,5 katını (%0,1 bütillenmiş hidroksi toluen (a:h) içeren) ekleyin, 15 saniye boyunca bir girdapla karıştırın.
    3. C-23 β-apo-karotenol (all-trans retinalden sentezlenmiş, abs = 0.9)15 gibi 25 μL dahili standart ekleyin. Numuneyi kapatın ve girdap ile karıştırın.
    4. Suya 50:50 potasyum hidroksitin 0,8 katı süt numunesi hacmi ekleyin (w:v olarak hazırlanır, örneğin, 50 mL suda çözülmüş 50 g KOH), girdap ile 15 saniye karıştırın.
      NOT: KOH:su plastik kaplarda (örn. HDPE) hazırlanmalıdır.
    5. Numuneleri 45 °C'lik bir su banyosunda 1 saat boyunca sabunlaştırın ve her 15 dakikada bir girdap ile kısa bir süre karıştırın.
    6. Başlangıç süt hacmiyle aynı hacimde soğuk deiyonize veya ters ozmoz suyu ekleyin.
    7. 1 mL heksan ekleyin, girdapla 15 saniye karıştırın ve oda sıcaklığında 2 dakika (~1.300 × g) santrifüjleyin.
    8. Bir Pasteur pipeti kullanarak, üst heksan tabakasını yeni bir cam test tüpüne (12 x 75 mm veya 13 x 100 mm) dikkatlice pipetleyin.
    9. 1.2.7 ve 1.2.8 adımlarını iki kez daha tekrarlayın ve hekzanı ikinci tüpte toplayın.
    10. Her numuneyi katı faz ekstraksiyonundan (SPE) geçirin; gerekli SPE kartuşlarını (PE 500 mg/3 mL -NH2) vakum manifolduna bağlayarak başlayın.
    11. Her kartuşu, her kartuştan 3 x 2 mL heksan geçirerek koşullandırın, solvent seviyesinin ambalaj malzemesinin üst kısmının altına düşmesine asla izin vermeyin. Hekzanı 16 x 75 mm'lik bir cam tüpe toplayın ve uygun şekilde atın.
    12. Numuneleri kartuşlara yükleyin ve solvent ambalaj malzemesi seviyesinin hemen üzerine çıkana kadar vakumla çekin. Her kartuşu 3 x 2 mL heksan ile adım 1.2.11 ile aynı şekilde durulayın. Atık çözücüyü atın ve cam toplama tüplerini numune kimliğiyle etiketlenmiş aynı boyuttaki yenileriyle değiştirin.
    13. Retinolü 3 x 2 mL metilen klorür ile yıkayın ve bu fraksiyonu toplayın.
    14. Elüatı nitrojen altında kurutun ve 100 μL metanol (MS sınıfı) içinde sulandırın. Numuneyi girdap ile karıştırın ve çözücüyü tüpün her tarafında döndürün. 20-30 saniye santrifüj.
    15. Numuneleri en az 5 dakika boyunca -80 °C'lik bir dondurucuya koyun.
      NOT: Numuneler bu adımda -80 °C'de ertesi güne kadar saklanabilir.
  3. Karaciğer örneklerinin ekstraksiyonu
    1. 8 cm çapında bir cam huniye katlayın ve 15 cm'lik Whatman #1 filtre kağıdını koni şeklinde yerleştirin. Huninin altına 50 mL'lik hacimsel bir şişe yerleştirin.
    2. Dokuyu çözün ve 0,5 g veya mevcut olduğu kadar numune tartın. Kullanılan doku ağırlığını kaydedin.
    3. Numuneleri bir havan ve havana aktarın ve yaklaşık 5 g sodyum sülfat ile öğütün.
    4. C-2315 gibi 250 μL dahili standart ekleyin.
      NOT: A vitamininin esterlenmiş formları (yani, retinil asetat, retinil bütirat) kullanılmamalıdır, çünkü numune sonunda sabunlaştırılacak ve standardı endojen retinolden ayırt edilemez hale getirecektir.
    5. Çeker ocakta, öğütülmüş karaciğer numunesi ile harca 10-15 mL metilen klorür dökün ve havaneli kullanarak hafifçe karıştırın.
    6. Metilen klorürü filtre kağıdından hacimsel şişeye dökün.
    7. 1.3.5 ve 1.3.6 adımlarını iki kez daha tekrarlayın ve hacimsel şişedeki toplam çözücünün çizginin altında kalmasını sağlayın.
    8. Harcın kalan içeriğini metilen klorür ile huniye durulamak için bir Pasteur pipeti kullanın. Hacimsel şişedeki çözücü çizgiye ulaşana kadar Pasteur pipeti ile huniye metilen klorür eklemeye devam edin. Hacimsel şişenin kapağını kapatın ve kapağı yerine sabitlerken şişeyi birkaç kez ters çevirin.
    9. Yaklaşık 10 mL metilen klorür ekstraktını 25 mL'lik bir Erlenmeyer şişesine dökün. 5 mL çözeltiyi vidalı kapaklı 10 mL'lik bir cam santrifüj tüpüne aktarın. Numuneyi hafif bir nitrojen gazı akışı altında kurutun.
    10. Numuneyi karıştırmak için numuneyi 2 mL etanol + %0.1 bütillenmiş hidroksi toluen ve vorteks içinde sulandırın.
    11. Suya 0,8 mL 50:50 (a:h) potasyum hidroksit ekleyin ve vorteksle 15 saniye karıştırın.
    12. Numuneleri 45 °C'lik bir su banyosunda 1 saat boyunca sabunlaştırın ve her 15 dakikada bir girdap ile kısa bir süre karıştırın.
    13. 0,1 mL soğuk deiyonize veya ters ozmoz suyu ekleyin.
    14. 1 mL heksan ekleyin, girdapla 15 saniye karıştırın ve 2 dakika (~1.300 × g) santrifüjleyin.
    15. Bir Pasteur pipeti kullanarak, üst heksan tabakasını yeni bir cam test tüpüne (12 x 75 mm veya 13 x 100 mm) dikkatlice pipetleyin.
    16. 1.3.14 ve 1.3.15 adımlarını iki kez daha tekrarlayın ve hekzanı ikinci tüpte toplayın.
    17. Havuzlanmış heksanı nitrojen altında kurutun ve 100 μL metanol (MS sınıfı) içinde sulandırın. Numuneyi girdap ile karıştırın ve çözücüyü tüpün her tarafında döndürün. 20-30 saniye santrifüjleyin ve numuneleri en az 5 dakika -80 °C'lik bir dondurucuya koyun.
      NOT: Numuneler bu adımda -80 °C'de ertesi güne kadar saklanabilir.

2. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanılarak numune saflaştırma ve miktar tayini

  1. HPLC sistem 1'i C18 (5 μm, 4,6 x 250 mm) kolon ve 325 nm'ye ayarlanmış UV-Vis dedektörü ile hazırlayın.
  2. Asetonitril ve su hacimlerini ayrı ayrı ölçerek ve ardından suyu asetonitrilin içine dökerek 92:8 asetonitril:suyun mobil fazını hazırlayın. Çözünmüş gazı çıkarmak için karışık çözeltiyi vakumla filtreleyin.
  3. HPLC sistemini 1 açın, gerekirse HPLC'de bir solvent tahliyesi gerçekleştirin, ardından sistemi tamamen dengelemek için akış hızını en az 15 dakika boyunca 1 mL/dk'ya ayarlayın.
  4. HPLC sistemine standartlar ekleyin.
    1. Retinol konsantrasyonlarını ölçmek için, 25 μL C-23 dahili standart çözeltisi enjekte edin ve numunelerle karşılaştırmak için sonucu 3 kez kaydedin.
    2. Fraksiyon toplama ve retinol miktar tayinini yönlendirmek için kullanılan sistem için tam tutma süresini belirlemek için bir retinol standardı enjekte edin.
  5. HPLC sistem 2'yi hazırlayın (bileşenler sistem 1 ile aynıdır). Her iki adım için de bir HPLC sistemi kullanılıyorsa, bileşiklerin numunelerden potansiyel taşınmasını en aza indirmek için birincil saflaştırma için kullanılan sütunu ikinci bir özdeş sütunla değiştirin.
  6. Sistem 2 için, metanolü vakumla filtreleyin, HPLC mobil fazını temizleyin ve ardından dengelemek için 20 dakika boyunca 0,7 mL/dak çalıştırın.
  7. Numuneleri -80 °C dondurucudan birer birer çıkarın ve oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 1.300 × g'da santrifüjleyin.
  8. Peletlenmiş malzemeden kaçınarak numunenin tamamını HPLC'ye enjekte edin. Retinol miktarını ölçüyorsanız kayda başlayın.
  9. Çözücü dedektörden geçerken retinol tepe noktasını küçük bir cam tüpe (12 x 75 mm veya 13 x 100 mm) toplayın. Saflığı en üst düzeye çıkarmak için tepe noktasının orta kısmını, tipik olarak numune retinol konsantrasyonuna bağlı olarak ayarlanabilen 0,1 absorbans biriminden (Şekil 1) büyük absorbans değerlerini toplayın. C-23 tepe noktasının ayrışmasını bekleyin ve kaydı durdurun.
  10. Numuneyi hafif bir nitrojen akışı altında kurutun.
  11. Kurutulmuş numuneye 100 μL metanol (MS sınıfı) ekleyin ve hemen kapatın. Çözeltiyi tüpün kenarlarında yukarı ve aşağı döndürün, ardından numuneyi girdap ile 15 saniye karıştırın. Numuneleri en az 5 dakika boyunca -80 °C'lik bir dondurucuya koyun.
    NOT: Numuneler bu adımda -80 °C'de ertesi güne kadar saklanabilir.
  12. Numuneleri -80 °C dondurucudan birer birer çıkarın. 30 saniye boyunca 1.300 × g'da santrifüjleyin.
  13. Peletlenmiş malzemeden kaçınarak numunenin tamamını HPLC sistemi 2'ye enjekte edin.
  14. Retinol zirvesi ayrıştıkça, çözücüyü dedektörden geçerken konik tabanlı küçük bir cam şişeye (<1 mL) toplayın ve numune şişesini yavaşça 12 x 75 mm'lik bir test tüpüne kaydırın.
  15. Vakum yoğunlaştırıcıyı açın ve kondansatörü 20 dakika soğumaya bırakın.
  16. Numuneleri karuselde dengeli bir şekilde yerleştirin, ısı ayarını yok ve vakumu 05.1'e ayarlayın, kapağı kapatın ve çalıştırma düğmesine basın.
    NOT: Numunelerin kuruması genellikle 10-20 dakika sürer. Gaz kromatografı için numunelerden tüm metanolün çıkarılmış olması önemlidir.
  17. Kuruduktan sonra, HPLC şişesini vidalı kapaklı 4 mL'lik kehribar rengi bir şişeye aktarın ve numuneyi 4-7 μL heksan ile sulandırın.
    NOT: Bu tipik olarak 7 μL'dir, ancak saflaştırma sırasında numunenin düşük konsantrasyonda olduğu belirlendiğinde azalır. Karaciğer örnekleri çok daha konsantre olabilir, bu nedenle daha büyük bir hacimde sulandırılır. 75 ng/μL ile 400 ng/μL arasını hedefleyin.
  18. Yaklaşık 75 ng retinol enjekte etmek için gereken numunenin konsantrasyonuna bağlı olarak yeterli bir sinyal elde etmek için GC-C-IRMS'ye 1-5 μL enjekte edin.

3. GC-C-IRMS ile numune analizi

  1. GC'yi bir kolon (%100 dimetilpolisiloksan, polar olmayan, 15 m, 0,25 mm ID, 0,25 μm film) ve 1,2 mL/dak helyum akış hızı ile hazırlayın.
  2. Sızıntı olmadığından ve IRMS kaynağının 44, 45 ve 46 kütlelerine düzgün bir şekilde odaklandığından emin olmak için sistem kontrolleri gerçekleştirin.
    Alıkonma süresini belirlemek ve sistem performansını doğrulamak için ilk enjeksiyon olarak her gün 2 μL 75 ng/μL 13C ile zenginleştirilmiş retinol standardı enjekte edin.
  3. Edinme yazılımında, cihaz yöntemini yükleyin, numunenin adını yazın ve numuneyi çalıştır'a basın. GC-C-IRMS sistemi, bir ön enjeksiyon sistemi kurulum rutini gerçekleştirecektir. GC'nin önündeki yeşil Enjeksiyona Hazır ışığı yandığında, önceden belirlenmiş hacimde numuneyi Programlanabilir Sıcaklık Buharlaştırıcı PTV enjektörüne enjekte edin, şırıngayı çıkarın ve Başlat düğmesine basın.
  4. PTV enjektörünü PTV Bölünmesiz modda, simüle edilmiş bir kolon içi enjeksiyon için koruma kolonu enjektör ekinin üstüne oturacak şekilde çalıştırın. Enjektör programını 50 °C'lik bir başlangıç sıcaklığıyla başlayacak, 1,05 dakika bekletecek, 14,5 °C/s hızında 200 °C'ye çıkaracak, 200 °C'de 1 dakika tutacak, 14,5 °C/s'de 300 °C'ye geçecek şekilde ayarlayın, ardından bir sonraki enjeksiyon için 50 °C'ye dönmeden önce 50 mL/dk'lık bir helyum bölünmüş akışıyla enjektörü 4 dakika boşaltmak için basılı tutun.
  5. GC fırın sıcaklığını 50 °C'lik bir başlangıç sıcaklığına programlayın, 1 dakika tutun, 30 °C/dk'yı 150 °C'ye, ardından 15 °C/dk'dan 265 °C'ye, ardından 40 °C/dk'da 295 °C'ye kadar programlayın, ardından bir sonraki enjeksiyon için 50 °C'ye soğutmadan önce 2,50 dakika tutun.
  6. Her kromatogramın, sükroza (IAEA-CH-6) karşı kalibre edilmiş üç CO2 darbesi (%99,999 saflık) ile başladığından emin olun. Edinme yazılımındaki sonuçlara erişin.
  7. Her enjeksiyondan sonra, retinol zirvesinin mevcut olduğunu ve entegrasyonun uygun olduğunu doğrulamak için her kromatogramı inceleyin. Manuel entegrasyonlardan kaynaklanan olası önyargıyı en aza indirmek için retinol tepe noktalarını mümkün olduğunca otomatik olarak entegre etmek için yazılımı kullanın. 20 mV/s'lik standart başlangıç ve bitiş eğimi algılama ayarlarını kullanın.
    NOT: 200 mV veya daha düşük bir tepe genliği, doğru bir 13C oran ölçümü sağlamak için çok küçüktür.
  8. Kromatogram verilerini bir elektronik tablo programına aktarın. Aşağıdaki temel veri kategorilerini ekleyin: Örnek adı, tepe tutma süresi, kütle 45'te tepe genliği ve AT%.
    NOT: Dışa aktarılan veriler, tanımlanmış bir dışa aktarma yöntemi kullanılarak belirtilebilir. δ değeri yorumlama kolaylığı açısından faydalıdır ancak hesaplamalar için gerekli değildir.

4. A vitamini toplam vücut depolarının ve karaciğer konsantrasyonlarının hesaplanması

  1. Retinol izotop seyreltme denklemleri.
    NOT: Bazı araştırmacılar tarafından kullanılan tercih edilen izotop dengesi denklemi ve karşılık gelen gösterim, Uluslararası Temel ve Uygulamalı Kimya Birliği16'nın tavsiyelerine dayanmaktadır. Bazı araştırma gruplarının, RID denklemlerinde kullanılan faktörlerin tarihsel kullanımını sürdürmeye çalışan gösterim kullandığını not ediyoruz. Ayrıca, çalışma tasarımına, deneysel modele ve analitik sonuçlara bağlı olarak, faktörlerin ve destekleyici literatürün, TBS'ler veya karaciğer VA konsantrasyonları hesaplamalarına daha doğrudan uygulanıp uygulanmadıkları konusunda farklılık gösterebileceğini not ediyoruz.
    1. Aşağıdaki denkleme göre yanmayı takiben 13CCO2'nin izotopik bolluğunu kullanarak serum retinol TTR'yi belirleyin:
       figure-protocol-1    
      Burada F, izleyici dozunun izotopik bolluğudur (izotop miktarı fraksiyonu olarak da bilinir, 'x' olarak kısaltılır) (Fa), başlangıçta serum retinolü (Fb) ve dozlama ve vücut havuzuyla karıştırıldıktan sonra serum retinolü (Fc). Kullanılan karıştırma süreleri insanlar için tipik olarak 14-21 gün civarındadır ancak spesifik çalışma tasarımına bağlı olarak daha kısa veya daha uzun olabilir.
    2. VA TBS'yi aşağıdaki temel denkleme göre hesaplamak için RID denklemlerini kullanın.
      figure-protocol-2
      Nerede
      figure-protocol-3
      NOT: Emilim ve depolama için kullanılan faktörler şunları içerir: i) dengeleme sırasında doz depolama (Doz Emilimi), sağlıklı bireyler için tipik olarak% 75 ila% 90 arasında tahmin edilir. Enflamasyon varsa tahmin azaltılabilir. ii) Dozun tutulması; Sabit: e-kt; k = ln(2)/retinolün yarı ömrü; Çocuklar için 32 ila 136 gün; yetişkinler için 140 gün); t = dozlamadan bu yana geçen günler (genellikle 14-21 gün); serum/karaciğer izleyici bölümlemesi: TTRserum / TTRliver; Karıştırma periyodu sırasında VA alımı ile 0.65-0.9; Düşük izleyici dozu, kontrollü VA alımı ve açlık örneklemesi kullanılıyorsa 0.9-.1.
      figure-protocol-4
    3. Karaciğer ağırlığı ve karaciğerdeki VA TBS fraksiyonu için ek varsayımlarla karaciğer VA konsantrasyonlarını hesaplayın.
      figure-protocol-5
      Nerede
      figure-protocol-6
      Karaciğer/vücut ağırlığı oranı genellikle yaşa özgü bir sabit olarak tahmin edilir: bebekler: %4-4,2; çocuklar: %3; yetişkinler: %2,4; Karaciğerdeki TBS fraksiyonu A vitamini durumuna göre değişir. Daha önce kullanılan tahminler marjinal veya düşük VA durumudur: 0,5; yeterli VA durumu: 0.8-0.9.

Sonuçlar

Protokol bölüm 2 için 325 nm'de izlenen örnek bir serum numunesi kromatogramı sağlanmıştır (Şekil 1). Kullanılan spesifik sisteme ve kolona bağlı olarak, retinol için tipik tutma süresi 4-6 dakika ve dahili standart için 6-8 dakikadır. Yeşil gölgeli alan, safsızlıkları en aza indirmek için retinol fraksiyonu için hedef toplama aralığını gösterir. Retinolün serumdan ekstraksiyon verimliliği tipik olarak %85'≥ iken, sabunlaştırılmış anne sütü ve doku numuneleri ortalama ~%70-80 ile daha düşük verimliliğe sahip olma eğilimindedir. HPLC saflaştırması sırasında ana all-trans zirvesinden kısa bir süre önce veya sonra az miktarda retinol cis-izomerlerinin salındığı gözlemlenebilir. Şekil 1'de sunulan numunede kayda değer bir cis-izomer gözlenmedi, ancak referans 17'nin Ek Şekil 1'inde görülebilir. Çoğu zaman, ikinci HPLC saflaştırması sırasında (gösterilmemiştir) veya GC ayrımı sırasında ek bir izomer ayrılacaktır (Şekil 2).

Bir standart, serum numunesi ve boş için örnek GC-C-IRMS kromatogramları, protokol bölüm 3 için gösterilmiştir (Şekil 2)9. Her numune, bir IAEA sükroz standardına (IAEA-CH-6) göre kalibre edilmiş 13C zenginleştirmeli referans CO2piklerini içerir.

13C/toplam C izotopik bolluğu için deneysel IRMS kesinliği (%CV): 1) referans CO2 stabilite için 0.012 ve doğrusallık için 0.031 idi (n = her biri 10); 2) retinol standardı günler arası stabilite için 0.036 ve gün içi doğrusallık için 0.022 idi (n = her biri 4); ve 3) deneysel, gerbillerde başlangıç ve sekiz diyet tedavisi grubunda 0.073 ± 0.061 idi (n = 9 grupta 46)9.

Aşağıda, elde edilen serum GC-C-IRMS verilerinin, Yöntem 4 için RID denklemi kullanılarak doz uygulamasından 14 gün sonra belirlenen TBS ve karaciğer VA konsantrasyonlarını hesaplamak için nasıl kullanıldığına dair bir örnek verilmiştir:

Çalışma katılımcısı özellikleri:

Yaş:4 yıl
Vücut ağırlığı:16,0 kg
Fa (etiketli 2 karbon artı doğal bolluk):0.11
Fb:0.010757
Fc:0.011057
Uygulanan izleyici dozu:1,0 μmol
Dozlamadan bu yana geçen süre:14 gün
VA yarı ömrü:32 gün
Soğurma:0.8
Serum/karaciğerdeki TTR oranı (diyet kontrollü değil):0.9
Karaciğerde TBS fraksiyonu:0.8

Hesaplama:

TTR = (Fc-F b)/(Fa-F c)
TTR = (0,0110568 - 0,010757) / (0,11 - 0,0110568) = 0,0030300213
1/TTR = 1 / 0,0030300213 = 330,03

Doz tutma = 32 günlük yarı ömür ve 14 günlük örnekleme süresi ile e-kt
k= ln(2)/36 = 0.693147181 / 36 = 0.021660849
t = 14
e-kt = e-0.02166 x 14= 0.738413073

figure-results-1

TBS = 1 × 330.03 x 0.8 x 0.738413073 × 0.9 = 175 μmol

Karaciğer VA konsantrasyonlarının hesaplanması için:
Karaciğer ağırlığı (g) = 1.000 × vücut ağırlığı (kg) × %3 (çocuklar için tahmini)
Karaciğer ağırlığı = 1.000 x 16,0 x 0,03 = 480 g
figure-results-2
Karaciğer VA konsantrasyonu = (175 / 480) x 0,8 = 0,29 μmol/g

figure-results-3
Şekil 1: İnsan serum örneğinin HPLC kromatogramı. İzokratik mobil faz 90:10 MeOH:H 2 O ve 325 nm'de algılama ile HPLC sistem1. Retinol tepe noktası, ~0.1'in (yeşil gölgeli alan) üzerindeki absorbans değerleri için toplanır. Bu adım sırasında serum retinol konsantrasyonunu (istenirse) ölçmek için dahili standart C-23 β-apo karotenol kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 2: Retinol 13 C/12 C tayinini gösteren GC-C-IRMS kromatogramları. (A) retinol standardının GC-C-IRMS kromatogramı, (B) serumdan saflaştırılmış retinol ve (C) Gannon ve ark.9'dan uyarlanan boş enjeksiyon. Üç iz kütle 44 (12C16O2'ye karşılık gelir), 45 (13C16O 2 veya 12C16O17 O'ya karşılık gelir) ve 46(esas olarak 12C16O18O'ya karşılık gelir, bu da kütle 45'i 17O katkısı için düzeltmek için kullanılır). 200 s'den önceki üç geniş tepe noktası, bir Sükroz 13C Referans Malzemesine kalibre edilmiş CO 2referans tepe noktalarıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

GC-C-IRMS kullanılarak retinolün 13C zenginleştirmesini ölçmek için açıklanan yöntemler, diyet müdahalelerini değerlendirmek,18 A vitamini kinetiğinin modellenmesi,19,20,21 klinik araştırmalar veya VA durumunun22 daha iyi tahminleri için RID'yi içeren popülasyon çalışmaları için değerli veriler sağlayabilir.

Bu testte, biyolojik bir numuneden saflaştırılan retinol, numunede kalan safsızlıklardan ayrılarak bir sıcaklık gradyanı ile araştırma sınıfı helyum (%>99.999999 saflık) ile GC sütunu boyunca taşınır. Retinol, CO2 ve su oluşturmak üzere yakılır ve su uzaklaştırılır. CO2 , 44, 45 ve 46 kütlelerinin ölçüldüğü IRMS'ye taşınır ve δ ve AT% bir CO2 gaz referansına göre belirlenir, ek olarak sükroz standardına (IAEA-CH-6) göre kalibre edilir .

Enjeksiyon için retinolün hazırlanmasında, ekstrakte edilen retinol, tekrarlanabilir izotop oranları elde etmek ve kapsamlı temizlikler arasında analitik platformun ömrünü en üst düzeye çıkarmak için en yüksek saflıkta olmalıdır. Ekstraksiyon için kullanılan çözücüler, genellikle MS sınıfı olan mevcut en yüksek saflık derecesinde olmalıdır. Ekstraksiyon tüpleri, Pasteur pipetleri ve HPLC enjeksiyon şişeleri gibi tüm cam eşyalar, MS analizi için yeterince temizlenmeleri zor olduğundan yeni olmalıdır. GC ve yanma kolonlarında biriken ekstraktlardaki plastikleştiricileri en aza indirmek için plastik yerine cam tüpler ve pipetler kullanmak önemlidir.

Bu numune analizi iş akışında, spesifik çalışma tasarımına ve örnekleme kaynağına bağlı olarak değişiklikler yapılabilir. Örneğin, bir HPLC sistemi muhtemelen retinol saflaştırması için optimize edilebilir. Deneyimlerimize göre, bu, mobil fazda su gerektirir ve ya bir mobil faz gradyanı gerektirir ya da GC-C-IRMS'ye enjeksiyondan önce artan numune kuruma süresi gerektirir. Kısa izokratik yöntemlere sahip iki HPLC sistemi kullanmanın, GC-C-IRMS'de net sinyaller elde ederken analitik gereksinimleri dengelediğini bulduk (Şekil 2). LC-MS/MS kullanımı, RID örnekleri için daha akıcı bir analitik iş akışı sağlayabilir7. Bununla birlikte, GC-C-IRMS'nin duyarlılığı, daha düşük doz ve izotop etiketleme miktarları kullanabilme, izleyicileri daha uzun zaman noktalarında ölçebilme ve düşük numune zenginleştirmeli numuneleri analiz edebilme gibi belirgin avantajlara sahiptir.

Bu yöntemin sınırlamaları arasında birden fazla cihaz gerektirmesi, vasıflı teknik işlem ve daha uzun numune hazırlama süreleri nedeniyle numune verimi kısıtlamaları yer alır. HPLC saflaştırma adımları izokratik yöntemler kullandığından ve tutarlı analit tutma süreleri sağladığından, her bir numuneyi hazırlamak için gereken kişi-zaman, otomatik fraksiyon toplama yeteneklerine sahip bir HPLC uygulanarak iyileştirilebilir. Yöntem, yalnızca bir HPLC saflaştırması kullanacak şekilde optimize edilebilir. Verimi artırmak ve hekzanda sulandırılmadan ve GC-C-IRMS'ye enjeksiyondan önce numunenin kurutulmasını kolaylaştırmak için paralel olarak iki sistem kullanıyoruz.

GC-C-IRMS, izotop oranlarını belirlemek için son derece hassas olsa da, yeterli retinol sinyali için daha fazla toplam numune retinol kütlesi gerektirir. Numune gereksinimleri hem numune miktarına hem de numune VA konsantrasyonuna bağlıdır. Tipik olarak, 75 ng retinol, GC transferinde ve yanma verimliliğinde değişikliklere izin veren güçlü bir zirve için hedeflenir. Uygulamada, optimum çalışma koşulları altında, 25 ng kadar düşük GC-C-IRMS enjeksiyonları ile sonuçlanan numunelerle yeterli sinyal elde ettik. Bu, daha düşük hacimli (~0.4 mL), düşük retinol konsantrasyonuna (~0.5 μmol/L) ve ekstraksiyon ve saflaştırma prosedürlerinde küçük kayıplara sahip bir serum örneğine karşılık gelir. RID yönteminin analitik geliştirilmesinde, bir PTV enjektörüne geçmek önemli bir gelişmeydi. Düşük başlangıç sıcaklığı, numuneyi taşıyan heksanın çok hızlı genişlemesini önleyerek numunelerin simüle edilmiş kolon üstü enjeksiyonlarına olanak tanır. Doğrudan kolona enjekte etmek, biraz daha kötü tepe şekli ve daha sürekli bakım dezavantajı ile retinol sinyalini en üst düzeye çıkarır.

RID testinde serum örneklerinin yerine anne sütü önerilmiştir. Bu, büyük ölçüde düşük VA11 depolarına sahip olan Zambiyalı emziren kadınlarda doğrulanmıştır. Yüksek gelirli ülkelerde veya diyet alımı, gıda takviyesi ve takviye dahil olmak üzere birden fazla VA kaynağı tüketen popülasyonlarda olduğu gibi, önceden oluşturulmuş VA alımı daha yüksek olan kadınlarda henüz doğrulanmamıştır.

Anne sütü VA değerlendirmesinin, VA durumunun diğer biyokimyasal göstergelerine göre çeşitli avantajları vardır. Anne sütünün toplanması genellikle kandan daha kolaydır çünkü flebotomistlere ihtiyaç duyulmaz ve anne sütü toplamanın denekler için genellikle daha az invaziv olduğu kabul edilir23. Sıradan anne sütü örneklerinin kullanımı uygundur ve sadece 5 mL süt gerektirir. Ayrıca, numunelerin hemen işlenmesine gerek yoktur, bu da özellikle saha ortamlarında numune işleme süresini kısaltır. Bununla birlikte, tam anne sütü numuneleri için numune toplamanın standardizasyonu kritiktir, çünkü yağ ve retinol konsantrasyonları son sütte ön sütten daha yüksektir ve süt yağı ve retinol konsantrasyonları günün saatine ve son beslemeden bu yana geçen süreye göre değişme eğilimindedir 1,24. Sıradan numuneler için, retinol konsantrasyonu en iyi g süt yağı başına ifade edilir. Süt yağının ideal olarak krematokrit yöntemi25 kullanılarak toplandıktan hemen sonra belirlenmesi gerekir. Numuneler ışıktan korunmalıdır. HPLC analizi için alikotların (tipik olarak 1 ila 5 mL) toplama sırasında hazırlanması gerekir çünkü süt dondurulup çözüldükten sonra homojen değildir.

Karaciğerde VA'nın 13C-zenginleştirmesinin ölçülmesinin mümkün ve ilgi çekici olabileceği iki temel durum vardır. En yaygın durum, karaciğer toplandığında hayvan çalışmalarında 13C etiketli retinol kullanılmasıdır. VA'nın hesaplanan TBS'leri, HPLC/UPLC tarafından belirlendiği gibi karaciğerdeki VA konsantrasyonu ile karşılaştırılacaktır, ancak karaciğer depolarının 13C-zenginleştirmesi, izleyicinin uzun vadeli depolara göre dolaşımda nasıl dağıldığını belirlemek için de yararlıdır. Ek olarak, bazı benzersiz durumlarda, onay vermiş ve ayrıca etiketli bir A vitaminidozu almış insanlardan karaciğer biyopsi örnekleri almak mümkündür 26,27. Bu numuneler ayrıca 13C-retinol karışımının doğrulanması ve test edilmesi için de yararlıdır. Karaciğer numunesi işleme, suyu hapsetmek ve dokuyu parçalamak için ölçülen bir numunenin susuz sodyum sülfatla öğütülmesiyle başlar. Bu daha sonra filtre kağıdından 50 mL metilen klorür ile ekstrakte edilir. Bir fraksiyon nitrojen altında kurutulur ve koruyucu olarak %0.1 bütillenmiş hidroksi toluen eklenerek etanol içinde sulandırılır. Numune sabunlaştırılır ve anne sütü için kullanılan aynı prosedürle ekstrakte edilir.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH-R01 DC019357 ve IAEA Koordineli Araştırma Projesi E43035 tarafından finanse edildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
VPDB-LSVEC ölçeğine (Sukroz) izlenebilir 13C Referans MateryaliUluslararası Atom Enerjisi AjansıIAEA-CH-6 Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü adı: RM 8542
Asetonitril (HPLC derecesi)Fischer ScientificUN1648
Etanol (saf 200 proof, susuz ≥ 99.5%)Sigma459836
Cam pasteur pipetleriHerhangi
Cam test tüpleriHerhangi
Helium (araştırma lütfü, (>%99,9995 saflık)Herhangi
HeksanlarSigma178918
Metanol (MS derecesi)VWRMSPP-A-456
Harç ve pestel, seramikHerhangi
Pozitif yer değiştirmeli pipet 3-25 & mikro; LGilsonFD10002
Pozitif yer değiştirmeli pipet 10-100 ve mikro; LGilsonFD10004
Pozitif yer değiştirmeli pipet 50-250 ve mikro; LGilsonFD10005
Pozitif yer değiştirmeli pipet 100-1000 ve mikro; LGilsonFD10006
Potasyum hidroksitFisher ScientificUN1813
Nitelikli filtre kağıdı #1 150 mmWhatman1001-150
Ayırıcı bacalarHerhangi
Sodyum sülfat, susuzFischer ScientificS415-212
Hacimsel şişeler (50 mL)Herhangi

Kaynaklar

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of nutrition for development (BOND)-vitamin A review. J Nutr. 146 (9), 1816S-1848S (2016).
  2. Gannon, B. M., et al. Selected laboratory-based biomarkers for assessing vitamin A deficiency in at-risk individuals. Cochrane Database Syst Rev. 5 (5), CD013742(2025).
  3. Furr, H. C., et al. Stable isotope dilution techniques for assessing vitamin A status and bioefficacy of provitamin A carotenoids in humans. Public Health Nutr. 8 (6), 596-607 (2005).
  4. Lietz, G., et al. Current capabilities and limitations of stable isotope techniques and applied mathematical equations in determining whole-body vitamin A status. Food Nutr Bull. 37 (2 Suppl), S87-S103 (2016).
  5. Gannon, B. M., Tanumihardjo, S. A. Comparisons among equations used for retinol isotope dilution in the assessment of total body stores and total liver reserves. J Nutr. 145 (5), 847-854 (2015).
  6. Bausch, J., Rietz, P. Method for the assessment of vitamin A liver stores. Acta Vitaminol Enzymol. 31 (1-5), 99-112 (1977).
  7. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of β-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  8. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
  9. Gannon, B. M., et al. 13C natural abundance of serum retinol is a novel biomarker for evaluating provitamin A carotenoid-biofortified maize consumption in male Mongolian gerbils. J Nutr. 146 (7), 1290-1297 (2016).
  10. Green, M. H., Green, J. B. Use of the paired retinol isotope dilution test, but with a single isotope dose, to assess the impact of a vitamin A intervention on vitamin A stores in theoretical children with low stores. J Nutr. 154 (10), 3151-3156 (2024).
  11. Kaliwile, C., et al. Breast milk-derived retinol is a potential surrogate for serum in the 13C-retinol isotope dilution test in Zambian lactating women with vitamin A deficient and adequate status. J Nutr. 151 (1), 255-263 (2021).
  12. Howe, J. A., Valentine, A. R., Hull, A. K., Tanumihardjo, S. A. 13C natural abundance in serum retinol acts as a biomarker for increases in dietary provitamin A. Exp Biol Med (Maywood). 234 (2), 140-147 (2009).
  13. Sheftel, J., Gannon, B. M., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Provitamin A-biofortified maize consumption increases serum xanthophylls and 13C-natural abundance of retinol in Zambian children. Exp Biol Med (Maywood). 242 (15), 1508-1514 (2017).
  14. Gannon, B. M., et al. Comparison of total body vitamin A stores using individual versus population 13C-natural abundance of serum retinol in preschool children and women residing in six diverse African countries. J Nutr. 153 (4), 949-957 (2023).
  15. Tanumihardjo, S. A., Howe, J. A. Twice the amount of α-carotene isolated from carrots is as effective as β-carotene in maintaining the vitamin A status of Mongolian gerbils. J Nutr. 135 (11), 2622-2626 (2005).
  16. Coplen, T. B. Guidelines and recommended terms for expression of stable-isotope-ratio and gas-ratio measurement results. Rapid Commun Mass Spectrom. 25 (17), 2538-2560 (2011).
  17. Tanumihardjo, S. A., et al. Synthesis of 13C2-retinyl acetate and dose preparation for retinol isotope dilution tests. J Vis Exp. (222), e68535(2025).
  18. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  19. Gannon, B. M., Valentine, A. R., Davis, C. R., Howe, J. A., Tanumihardjo, S. A. Duration of retinol isotope dilution studies with compartmental modeling affects model complexity, kinetic parameters, and calculated vitamin A stores in US women. J Nutr. 148 (8), 1387-1396 (2018).
  20. Lopez-Teros, V., et al. The "super-child" approach is applied to estimate retinol kinetics and vitamin A total body stores in Mexican preschoolers. J Nutr. 150 (6), 1644-1651 (2020).
  21. Green, M. H., et al. Use of population-based compartmental modeling and retinol isotope dilution to study vitamin A kinetics and total body stores among Ghanaian women of reproductive age. Curr Dev Nutr. 8 (11), 104484(2024).
  22. Engle-Stone, R., et al. Filipino children with high usual vitamin A intakes and exposure to multiple sources of vitamin A have elevated total body stores of vitamin A but do not show clear evidence of vitamin A toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  23. Stoltzfus, R. J., Underwood, B. A. Breast-milk vitamin A as an indicator of the vitamin A status of women and infants. Bull World Health Organ. 73 (5), 703-711 (1995).
  24. Ruel, M. T., Dewey, K. G., Martinez, C., Flores, R., Brown, K. H. Validation of single daytime samples of human milk to estimate the 24-hour concentration of lipids in urban Guatemalan mothers. Am J Clin Nutr. 65 (2), 439-444 (1997).
  25. Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br Med J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
  26. Furr, H. C., Clifford, A. J., Bergen, H. R. 3rd, Jones, A. D., Anderson, D. P., Olson, J. A. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  27. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Vitamin A Zenginle tirme13C Vitamin ARetinoid EkstraksiyonuSerum AnaliziAnne S t AnaliziHPLC PurifikasyonuElementel Analiz rKat Faz Ekstraksiyonu

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.