Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Escherichia coli'den Toksik Bir Nükleazın Aşırı İfade Edilmesi ve Saflaştırılması

1.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68577

⸱

29 Ağustos 2025

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, College of Charleston

Bu makalede

Özet

Bu makale, bir C41 (DE3) ekspresyon sisteminde toksik bir nükleaz olan rekombinant Nsp15'in aşırı eksprese edilmesi için bir metodolojiyi ve ardından afinite ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak etiketli proteinin saflaştırılmasını açıklamaktadır. Bu protokoller diğer zorlu toksik proteinler için uyarlanabilir.

Özet

Escherichia coli , rekombinant proteinler üretmek için bir ekspresyon sistemi olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Yine de, nükleazlar gibi bazı rekombinant protein türlerinin, hücresel DNA veya RNA üzerindeki enzimatik aktiviteleri nedeniyle E. coli'de rekombinant olarak aşırı eksprese edilmesi zor olabilir. Bu tür toksik etkiler yavaş büyümeye ve düşük protein verimine yol açabilir. Böyle bir örnek, koronavirüslerden elde edilen endoribonükleaz Nsp15'tir: vahşi tip (WT) gama-koronavirüs Nsp15'in verimi, katalitik olarak inaktif Nsp15'ten çok daha düşüktür. Bu sorunu çözmek için, toksisiteyi azaltmaya yardımcı olmak için C41 (DE3) hücrelerinin ve aynı gün tek koloni başlangıç kültürlerinin kullanımını kullandık. Bir N-terminal 6xHis-etiketi içeren rekombinant Nsp15, kobalt bazlı afinite kromatografisi ve ardından boyut dışlama kromatografisi (SEC) kullanılarak aşırı eksprese edildi ve saflaştırıldı. Elde edilen saflaştırılmış protein verimleri, biyokimyasal analizler ve kriyo-elektron mikroskobu yapısal çalışmaları için yeterlidir. Bu yaklaşımın, toksik etkilerin azaltılmasında ve daha fazla araştırma analizi için tatmin edici protein verimlerinin elde edilmesinde etkili olduğu kanıtlanmıştır.

Giriş

Escherichia coli (E. coli), rekombinant proteinler üretmek için yaygın olarak kullanılan bir bakteridir. BL21 (DE3) ve türevleri dahil olmak üzere çok sayıda mutant suş, hedef proteinleri1 eksprese etmek için geliştirilmiştir. İşlem tipik olarak kodlanmış bir bakteriyofaj T7 RNA polimeraz tarafından tahrik edilir ve lak baskılayıcı 1,2,3'ü serbest bırakarak lak operonunu aktive edecek bir laktoz analoğu olan izopropil ß-D1-tiyopalaktopiranosid (IPTG) ile indüklenir. Hidrolize edilemediği için sürekli mRNA ekspresyonu ve daha yüksek protein üretimi vardır3.

Bu tür bir sistem birçok protein için uygun ve tutarlı olsa da, bazı rekombinant protein türleri E. coli'de toksisiteye neden olarak düşük protein verimine yol açar. Bakterileri olumsuz etkileyen rekombinant proteinin varlığından kaynaklanan toksisite, indüksiyondan önce sızdıran ekspresyona veya indüksiyon üzerine bakteriye verilen strese bağlı olabilir 3,4. Sonuç, bakterilerin büyüme hızında ve canlılığında bir azalmadır5. Sızdıran ekspresyonun baskılanması, toksik proteinlerin başarılı bir şekilde eksprese edilmesinde önemli bir rol oynayabilir. pLysS plazmitleri ile E. coli'nin ekspresyon suşları (yani, BL21 (DE3) pLysS, C41 (DE3) pLysS, vb.), indüksiyondan önce T7 polimerazı inhibe eden bir T7 lizozimini eksprese ederek sızdıran ekspresyonu baskılar 6,7. C41(DE3) ve C43(DE3) suşları gibi diğer suşlar, mRNA seviyelerini düşürerek T7 polimerazın aktivitesini azaltan mutasyonlar içerir ve lon ve ompT proteazlarını 1,4,8,9,10 uzaklaştırır. Sızıntılı ekspresyonun baskılanması veya rekombinant protein üretim hızının azaltılması (T7 polimeraz regülasyonu veya düşük sıcaklıklar yoluyla) toksik proteinlerinverimini artırmaya yardımcı olur 1,9.

Nükleazlar, hücresel DNA veya RNA1'e yönelik enzimatik aktiviteleri nedeniyle bir E. coli ekspresyon sistemi kullanıldığında genellikle toksik ve eksprese edilmesi zor proteinlerdir. Örneğin, koronavirüslerde ve diğer nidovirüslerde bulunan endoribonükleaz Nsp15, bakteriler için toksiktir, bu da daha yavaş bir büyüme oranına ve düşük verime neden olur 11,12,13,14,15,16,17. Katalitik rolü nedeniyle, viral RNA'daki 3' üridini parçalayan Nsp15'in rekombinant olarak eksprese edildiğinde hem kendi başına hem de hücresel mRNA'sı üzerinde etkili olduğu düşünülmektedir, bu da metabolizmanın düzensizliğine ve rekombinant protein ekspresyonunaneden olur 11,14. Nsp15 için, enzimatik aktivite için oligomerizasyon gereklidir. Beta-koronavirüs (SARS ve SARS-CoV-2 gibi) Nsp15 ile ilgili önceki çalışmalar, enzimin esas olarak çözelti içinde bir homoheksamere dönüştüğünü ve monomerik formun inaktif olduğunugösterdi 16,18,19,20. Sadece monomer oluşturacak şekilde mutasyona uğradığında, verimde önemli artışlar görülmüştür14. Ek olarak, katalitik triad içindeki katalitik kalıntılardan biri bir alanine mutasyona uğradığında, WT ile aynı koşullar altında gelişmiş ekspresyon gözlendi, bu da Nsp15'in E. coli'ye karşı toksisitesinin nükleaz aktivitesi 13,16,17 tarafından yönlendirildiğini daha da destekledi. Bu protokolde, WT gama-koronavirüs (Enfeksiyöz Bronşit Virüsü) Nsp15 ile katalitik histidin kalıntılarından birinin (H223A) mutasyona uğratılmasıyla elde edilen katalitik-ölü versiyon arasındaki verim farkını gösteriyoruz.

Burada, bir C41 (DE3) ekspresyon sisteminde rekombinant Nsp15'in aşırı eksprese edilmesi için adım adım bir metodolojiyi ve ardından afinite ve boyut dışlama kromatografisi yoluyla protein saflaştırmasını açıklıyoruz. Proteini izole etmek için kobalt bazlı hareketsizleştirilmiş metal afinite kromatografisine (IMAC) sahip bir N-terminal 6x His-tag kullanılır. Nsp15'i oligomerik duruma göre ayırmak ve aktif heksamerik türleri izole etmek için SEC yoluyla daha fazla saflaştırma gerçekleştirilir. Bu yaklaşım, biyokimyasal ve yapısal çalışmalar için toksik nükleazları aşırı eksprese etmek ve saflaştırmak için bir yöntem sunar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Tampon ve reaktifler için hazırlık

  1. Aşırı ekspresyon reaktifleri
    1. 16 g tripton, 10 g maya özütü, 5 g sodyum klorür (NaCl) ve 900 mL deiyonize suyu 2 L'lik şaşkın bir şişede birleştirerek 1 L 2xTY ortamı hazırlayın. Şişeyi bir sıvı döngüsünde en az 30 dakika otoklavlayın.
      NOT: Saflaştırma başına en az 2 L 2xTY ortam gereklidir.
    2. Plazmid için uygun antibiyotik stoklarını hazırlayın. Nsp15-pET-14b için, 1.5 g ampisilin'i 15 mL'lik konik bir tüpte deiyonize su ile çözerek 15 mL 100 mg / mL ampisilin yapın. İhtiyaç duyulana kadar antibiyotik stoklarını -20 °C'de saklayın.
    3. 500 mL'lik bir cam şişede 2,5 g tripton, 1,25 g maya özütü, 2,5 g NaCl, 3,75 g agaroz ve 250 mL deiyonize suyu birleştirerek 250 mL Lizojen Et Suyu (LB) agar ortamı hazırlayın. Solüsyonu bir sıvı döngüsünde en az 30 dakika otoklavlayarak sterilize edin ve dokunulamayacak kadar ısınana kadar soğutun.
    4. 25 mL ılık LB agar ortamını sterilize edilmiş 250 mL Erlenmeyer şişesine (yapılacak plaka başına 25 mL) aktararak ampisilin ile desteklenmiş LB agar plakalarını hazırlayın. Her 25 mL ortam için 25 μL 100 mg / mL ampisilin ekleyin ve içeriği birleştirmek için döndürün. Serolojik bir pipet kullanarak, steril bir plastik petri kabına 25 mL ortam karışımı ekleyin; Herhangi bir baloncuk sokmaktan kaçının.
      1. Laboratuvar tezgahını %20 etanol ile silerek ve plakaları dökerken steriliteyi korumak için bir Bunsen brülörü yakarak kontaminasyonu önleyin.
      2. Plakaları daha fazla kullanana kadar 4 °C'de saklamadan önce soğumaya bırakın.
    5. 3.574 g IPTG'yi 15 mL konik bir tüpte deiyonize su ile çözerek 15 mL 1 M IPTG hazırlayın. İhtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın. Üç adet 5 mL'lik alikot halinde alikot yaparak tekrarlanan donma/çözülme döngülerinden kaçının.
  2. Saflaştırma reaktifleri
    NOT: Tüm reaktifler saflaştırmadan en az bir gün önce hazırlanmalıdır.
    1. 250 mL lizis tamponu (50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl,% 5 gliserol, 5 mM imidazol) hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın.
    2. 15 mL elüsyon tamponu (50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, %5 gliserol, 250 mM imidazol) hazırlayın ve ihtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklayın.
    3. 250 mL bölünme tamponu (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, %5 gliserol) hazırlayın ve ihtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklayın.
    4. 1 L SEC tamponu (20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM MnCl2) hazırlayın ve vakumlu filtrasyon kullanarak 0.22 μm PES filtreden süzün. FPLC ile 4 °C'de saklayın.
    5. 3.595 g AEBSF'yi 15 mL'lik konik bir tüpte deiyonize su ile çözerek 15 mL 1 M 4- (2-Aminoetil) benzensülfonil florür hidroklorür (AEBSF) hazırlayın. 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde 1 mL alikot yapın ve ihtiyaç duyulana kadar -20 ° C'de saklayın.
    6. İsteğe bağlı: 200 μL stok çözeltisini (250 mM Tris pH 6.8, %8 SDS, %0.1 bromofenol mavisi, %40 gliserol, 100 mM DTT) 400 μL deiyonize suda seyrelterek Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) jel yüklemeli tampon ana karışımını hazırlayın.
    7. Saflaştırmayı izlemek için jel numune tüplerini hazırlayın. Her tüpe 30 μL 1x yükleme tamponu aktarın.
    8. 30 g Tris bazı, 144 g glisin ve 20 g SDS'yi 1000 mL deiyonize suda çözerek 1 L 10x Tris-Glisin çalışma tamponu hazırlayın. 1x çözelti için, 10x çözeltinin 100 mL'sini 1 L'lik bir şişede 900 mL deiyonize su ile seyreltin. Her iki reaktifi de daha fazla kullanana kadar oda sıcaklığında saklayın.

2. Nsp15 aşırı ifadesi

NOT: Kontaminasyon riskini önlemek için tüm reaktifler ve malzemeler mümkün olduğunca steril tutulmalıdır.

  1. Dönüşüm
    1. C41 (DE3) E. coli hücrelerini -80 ° C'den çıkarın ve buz üzerinde 10 dakika çözün. 1 μL plazmit DNA'yı C41 hücrelerini içeren bir tüpe pipetleyin. 30 dakika buz üzerinde oturarak kuluçkaya yatmasına izin verin.
      NOT: Plazmid konsantrasyonları değişebilse de, burada açıklanan veriler için dönüşüm başına 10-20 ng DNA eklenmiştir. C41 (DE3) hücreleri için ticari protokol, transformasyon başına 10-50 ng DNA önerir. Bu protokol, T7 promotör sistemini kullanan herhangi bir plazmide uygulanabilir; bununla birlikte, burada, daha önce yayınlanmış bir pET14b plazmid kodlaması, kodon için optimize edilmiş Nsp15, N-terminal 6xHis-etiketi ve trombin bölünme bölgesini takip eden bir TEV bölgesi ile, SARS-CoV-2 Nsp15'in IBV Nsp15 dizisi ile değiştirilmesiyle modifiye edildi (GENBANK: WIL95322.1, 5989-6324)19.
    2. Hücreleri plazmitleri almak için ısı şoku vermek için tüpü 45 s boyunca 42 ° C'de bir ısı bloğuna yerleştirin. Tüpü buz üzerinde 2 dakika inkübe edin.
    3. C41 (DE3) hücrelerini ve plazmitleri içeren tüpe 200 μL geri kazanım ortamı (SOC veya diğer zengin ortam) pipetleyin. 210 rpm'de 37 °C'de 1 saat çalkalayın.
    4. Ampisilin takviyeli LB agar plakalarını 4 °C'den çıkarın ve 37 °C'ye ayarlanmış sallanmayan bir inkübatöre yerleştirin.
    5. Agar plakasındaki bakterileri pipetleyin. Steril bir yayıcı kullanarak, hücreleri agar plakasına yayın. Plakayı 14-16 saat büyümesi için 37 °C'ye ayarlanmış sallanmayan bir inkübatöre yerleştirin.

3. Büyüme

  1. Tek koloni toplama
    NOT: Logaritmik büyüme fazındaki hücreleri aşılamak için gece boyunca başlangıç kültürü yerine aynı gün tek koloni başlatıcıları kullanıldı. Gece boyunca kültürler için, hücreler tipik olarak, özellikle toksik proteinlerle durağan veya ölüm aşamasındadır. Ek olarak, daha uzun kültür süreleri göz önüne alındığında, kirleticiler veya mutantlar toksik nükleazdan daha fazla rekabet edebilir.
    1. Her L kültür için bir adet 50 mL sterilize edilmiş Erlenmeyer şişesi ve 2-3 ek başlatıcı kullanın. Optik yoğunluk (OD) kontrolleri için şişelerden birini bir yıldızla etiketleyin. Bu şişeden toplanan OD, şişeler arasında görsel bir fark olmadıkça tüm büyümeyi temsil edecektir.
      NOT: Erlenmeyer şişelerinin 15 mL başlangıç tüplerinden daha iyi havalandırma sağladığı bulunmuştur.
    2. 10 mL x N sayıda başlatıcı kullanarak 2xTY artı uygun antibiyotiklerin ana karışımını oluşturun. 4 L'lik bir büyüme için 6 başlangıç kültürü yapın. Ana karışım 60 μL ampisilin stoğu (-20 °C'den çözülmüş) ve 60 mL 2xTY (1:1000 seyreltme) olacaktır. Karıştırmak için döndürün ve her bir Erlenmeyer'e 10 mL aliquot.
    3. Dönüştürülen plakayı inkübatörden çıkarın. Steril bir kürdan veya pipet ucu kullanarak plakadan izole edilmiş tek bir koloniyi koparın. Kolonlu kürdanı ortamlı bir şişeye aktarın. Her şişe bir kürdan içerene kadar tekrarlayın.
    4. Aşılanmış marş şişelerini 210 rpm, 37 °C'de çalkalama inkübatörüne yerleştirin. Başlangıç şişelerinin ~5-7 saat büyümesine izin verin.
  2. Kültür aşılaması
    1. 5 saat sonra, bir mikro küvet ve spektrometre kullanarak bir yıldızla işaretlenmiş şişenin 600 nm'de (OD600) OD'sini kontrol edin. Şişeden 1 mL kültürü çıkarın ve bir mikro küvete aktarın. OD600 0.8-1.0'a ulaşana kadar ölçümleri periyodik olarak tekrarlayın.
    2. Aşılamadan 30 dakika ila 1 saat önce (OD600 0.4'e ulaştığında), 2 L 2xTY şişelerini 37 °C'de ısıtın. Sıcak besiyeri, başlangıç kültürü ile aşılamayı takiben gecikme süresini azaltır.
    3. 100 mg / mL ampisilin stoğunu -20 ° C'den çözün. Hedef OD600'e ulaşıldığında, 1 mL 100 mg / mL ampisilin (1:1000 seyreltme) ekleyerek 1 L 2xTY ortamı ile dört adet 2 L'lik şişe hazırlayın.
    4. Aşılamak için, bir başlangıç şişesinin içindekileri 2 L'lik bir şişeye dökün. Her 2 L'lik şişe aşılanana kadar tekrarlayın. Hücreleri daha kolay hasat etmek için kürdanı şişeye dökmekten kaçının.
    5. Aşılanmış 2 L'lik şişeleri, ilk OD600'ü kontrol etmeden önce 3 saat boyunca 210 rpm, 37 °C'de çalkalama inkübatörüne yerleştirin.
  3. IPTG ile İndüksiyon
    1. Serolojik bir pipet ile bir şişeden 1 mL ortam çıkararak OD600'ü kontrol edin. OD600 0.8-1.0'a ulaşana kadar tekrarlayın.
    2. Hedef OD600'e ulaşıldığında, aşırı ekspresyonu indüklemek için 1 mM'lik (-20 ° C'den çözülmüş) bir son konsantrasyon için 1 mL 1 M IPTG ekleyin.
    3. 2 L'lik şişeleri gece boyunca indüksiyon (14-16 saat) için 210 rpm, 16 °C'de çalkalanan bir inkübatöre aktarın.
      NOT: Daha düşük sıcaklık, E. coli hücrelerinin büyümesini yavaşlatır, protein üretimini ve nükleaz aktivitesini yavaşlatarak toksisiteyi azaltır.
  4. Hasat
    1. İndüklenen şişeleri çalkalama inkübatöründen çıkarın ve içindekileri ayrı 1 L'lik santrifüj şişelerine dökün. Şişeleri deiyonize su kullanarak dengeleyin. Hücreleri 4500 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da döndürün.
    2. Süpernatanı çıkarın ve peleti bir spatula kullanarak 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Peletleri tek bir konik tüpte birleştirin. Daha fazla kullanana kadar -80 °C'de saklayın.

4. Nsp15 arıtma

NOT: Tüm tamponlar ve tüpler buz üzerinde tutulmalıdır. Tüm santrifüjleme adımları 4 °C'de gerçekleştirilmelidir. Aşağıdaki protokol, His etiketli bir proteini varsayar.

İSTEĞE BAĞLI: Her adımdan sonra, saflaştırma ilerlemesini takip etmek için jel numuneleri alınabilir.

  1. Hücre lizisi ve lizat arıtması
    1. Her 1,2 g pelet için 2 mL lizis tamponu ekleyerek bakteri peletini yeniden süspanse edin. Bir proteaz inhibitörü olarak her 10 mL lizis tamponu için 100 μL 1 M AEBSF ekleyin. 4 L'den kombine bir pelet kullanılıyorsa, 200 U'luk bir nihai konsantrasyon için 100 μL DNaz I ekleyin.
      NOT: L başına bir EDTA içermeyen proteaz inhibitörü kokteyl tableti, bir proteaz inhibitörü olarak ikame edilebilir.
    2. Pelet ve tamponun karışmasına izin vermek için tüpün içeriğini 30 saniye boyunca kısaca girdaplayın. Girdaplanmış peleti bir Dounce doku öğütücüsüne aktarın. Gevşek bir havaneli ile içindekileri homojenize edin (~ 10 vuruş).
    3. Homojenize numuneyi sonikasyon için metal bir behere aktarın.
      1. Maksimum numunenin elde edildiğinden emin olmak için, orijinal peleti içeren tüpü 5 mL lizis tamponu ile durulayın ve tüpü kısa bir süre girdaplayın. İçeriği Dounce homojenizatöre dökün, ~ 5 vuruş uygulayın ve ardından sonikasyon kabına aktarın.
    4. Metal behere için, membran lizisi ve çözünmesine yardımcı olmak için 75 μL Triton X-100 ekleyin. Sonikasyon sırasında numunenin soğuk kalmasını sağlamak için metal kabı bir buz banyosuna yerleştirin.
    5. Sonikasyon probunu metal behere yerleştirin ve numuneyi her 2 saniyede bir darbelerle ve %70'te amplifikasyonla 6 dakika ve 30 saniye boyunca sonikleştirin.
      DİKKAT: Sonikatör probu kapalı değilse işitme koruması kullanın.
    6. Serolojik bir pipet kullanarak, lizatı bir santrifüj tüpüne aktarın. Aynı tüpe, taze bir proteaz inhibitörü olarak 1:100 seyreltmede 1 M AEBSF ekleyin. Lizatı 50 dakika boyunca 26.915 x g'da santrifüjleme yoluyla netleştirin.
  2. Yerçekimi filtrasyonu ile afinite kromatografisi
    NOT: Kobalt reçinesi, nikel reçinesi21 ile karşılaştırıldığında spesifik olmayan metal bağlayıcıları önemli ölçüde azaltır.
    1. Sonikasyon yaparken, 2 mL kobalt reçine bulamacı elde edin ve yeni bir konik tüpte 25 mL lizis tamponu ile yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse reçineyi 500 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, herhangi bir reçine kaybetmemeye dikkat ederek süpernatanı dökün.
    2. İki ayrı 25 mL lizis tampon yıkaması ve ardından santrifüjleme ile tekrarlayın. Toplu bağlanmaya hazır olana kadar son yıkamanın süpernatanını dökmeyin. Hazır olduğunda, son reçine yıkamasından lizis tamponunu boşaltın ve reçineyi 10 mL taze lizis tamponu (1 mL reçine başına 10 mL tampon) ile yeniden süspanse edin.
    3. Çözünür fraksiyonu tüpe ekleyin ve 6x His etiketli proteinin 4 ° C'de 45 dakika boyunca bir külbütör üzerindeki reçineye toplu olarak bağlanmasına izin verin.
      NOT: Parti bağlama hacmi 50 mL'yi aşarsa, bu adımı 250 °C'de çok yavaş bir hızda karıştırma çubuklu 4 mL'lik bir beherde gerçekleştirin. Bu adımı lizis tamponu kullanarak gerçekleştirirken tüm reçineyi behere aktarın.
    4. Toplu bağlamadan sonra, içeriği bir yerçekimi filtrasyon kolonuna dökün ve akışı 125 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde toplayın. Şişenin içindeki içerik, reçineye bağlanmayan herhangi bir protein olmalıdır; His etiketli Nsp15 reçineye bağlanacaktır. Toplama için ayrı bir şişe kullanarak, reçineyi serolojik bir pipet kullanarak toplamda en az 200 mL (orijinal hacmin ~ 5 katı) için 8 x 25 mL tamponla yıkayın.
      NOT: Verimsiz veya düzensiz yıkamaya yol açabilecek reçine yatağının bozulmasını önlemek için tamponu doğrudan ortadan aşağı değil, kolonun yanından aşağıya yavaşça ekleyin.
  3. Protein elüsyonu
    1. His etiketli Nsp15'i elüsyon tamponu ile üç elution içinde elute edin. Elution 1 ve 2 2 2 mL'lik elüsyondur ve elüsyon 3 1 mL'lik bir elüsyondur.
    2. Bradford reaktifinin suda 1: 1 oranında seyreltilmesi yaparak "hızlı ve kirli" bir Bradford testi yapın. Her elüsyonun 10 μL'sini tüplere aktarın ve karıştırmak için ters çevirin. Çözelti, protein varlığında maviye dönmelidir. Elutions'ın nasıl birleştirileceğini belirlemek için renk değişimini değerlendirin.
      NOT: 1 ve 2 numaralı elution güçlü ve 3 zayıf ise, 1 ve 2 numaralı elutiyonları birleştirin ve devam edin. Hepsi zayıfsa, üç tüpü de birleştirin.
  4. Protein konsantrasyonu ve etiket bölünmesi
    1. Kombine elüsyon örneğini 30 kD MWCO yoğunlaştırıcıya (veya ilgilenilen protein için uygun boyuta) aktarın. 10 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyerek proteini ≤2 mL'ye konsantre edin. Konsantre numuneyi 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Gerekirse bölünme tamponu ile son numune hacmini 2 mL'ye getirin.
    2. Üreticinin talimatlarına göre tek kullanımlık bir tuz giderme sütunu (örn. PD-10 sütunu) hazırlayın. 2 mL numuneyi sütuna ekleyin. Kolonu temiz bir 50 mL konik tüpe yerleştirin ve 2 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleme ile elüte edin.
      NOT: Bu adım, değişimi tamponlamak için MWCO yoğunlaştırıcıları kullanırken konsantrasyona bağlı agregasyonu önlerken trombin bölünmesine müdahale eden imidazolün hızla giderir.
    3. Elüata için, her biri 2 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar β-Me ve CaCl2 ekleyin. 50 μL'lik 1 U/μL'lik trombin stoğu ekleyin. Tüm bileşenler eklendikten sonra, tüpü dik bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve reaksiyonun hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında 4 saat inkübe edilmesine izin verin.
      NOT: 4 °C'de gece bölünmesi bazı proteinler için işe yarayabilir; Nsp15'in gelişmiş verimi, gece boyunca 4 ° C'lik bir bölünmeye kıyasla RT'de 4 saatlik bir bölünme ile gözlendi.
    4. Yerçekimi filtrasyon kolonunu bölünme tamponunda yeniden dengeleyin (3 kez 25 mL bölünme tamponu ile yıkayın). Durdurma musluğunun kapalı olduğundan emin olun ve reçinenin kurumasını önlemek için 5 mL bölünme tamponu ekleyin. Bölme süresi boyunca kolonu 4 °C'de saklayın.
  5. Parçalanmış proteinin parçalanmış His-tag ve bölünmemiş proteinden ayrılması
    1. Serolojik bir pipet kullanarak, bölünme reaksiyonunu doğrudan reçinenin üzerine dikkatlice pipetleyin ve elüatı 15 mL'lik konik bir tüpe toplayın.
    2. Reçineyi 2 mL bölünme tamponu ile yıkayın ve aynı 15 mL'lik tüpte toplayın. Toplam iki yıkama için tekrarlayın. Bittiğinde, 10 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için trombini söndürmek için tüpe AEBSF ekleyin.
    3. Repass örneğini yeni bir 30 kD MWCO yoğunlaştırıcıya aktarın. Proteini 10 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleme ile ≤500 μL'ye kadar konsantre edin. Konsantre numuneyi 0,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  6. Boyut dışlama kromatografisi
    1. Üreticinin spesifikasyonlarına göre bir S200 artırma analitik sütunu (veya ilgilenilen protein için başka bir uygun boyutlandırma sütunu) çalıştırın. SEC tamponunda dengeleyin ve FPLC fraksiyon boyutunu 500 μL'ye ayarlayın.
    2. Seçilen fraksiyon tüplerini tepe noktalarından yeni 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve saflaştırılmış Nsp15'i azaltılmış tutmak için her fraksiyona 2.5 μL 1 M DTT (nihai konsantrasyon 5 mM) ekleyin.
    3. Bir nano spektrofotometre kullanarak her fraksiyonun A280 değerlerini ölçün. Ölçümleri toplamadan önce cihazı SEC tamponu ile boşaltın. Saflaştırılmış Nsp15 numunelerini daha fazla kullanılana kadar 4 °C'de saklayın.
  7. İsteğe bağlı: Arıtma kontrolü
    1. Jel numune tüplerini 95 °C'lik bir ısı bloğunda 10 dakika ısıtın. Herhangi bir yoğuşmayı azaltmak için ısıttıktan sonra tüpleri kısa bir süre santrifüjleyin. Numuneleri %4-20 Lekesiz Mini-Protean TGX jel/s'ye yükleyin ve 17 dakika boyunca 300 V'ta çalıştırın. Saflığı kontrol etmek için jeli/jelleri görüntüleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Nsp15'in bir nükleaz olarak toksisitesi nedeniyle, başlangıç kültürlerinin 0.8-1.0'lık bir OD600'e ulaşması için genellikle toplam ~ 7 saat gerekliydi. Aşılandıktan sonra, indüksiyon için 0.8-1.0'lık aynı optimal OD600 için tipik olarak toplam ~ 3-5 saat gerekliydi. Bu durumda, ikiye katlama süresi ~ 1 saat olarak ortaya çıktı. Nsp15'in katalitik ölü bir mutantı eksprese edildiğinde, E. coli hücreleri için iki katına çıkma normal göründü (~ 20 dakika), nükleaz aktivitesinin toksisiteden sor...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Toksik bir nükleazın E. coli'de başarılı bir şekilde aşırı ekspresyonu ve afinite ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak saflaştırılması ile sonuçlanan ayrıntılı bir protokol sunduk. Gece boyunca başlangıç kültürleri yerine aynı gün 10 mL tek koloni başlangıç kültürlerinin uygulanması, büyüme sürelerinde tutarlılığı ve büyümeler boyunca protein verimini artırdı. Rekombinant protein toksisitesiniyönetmeye yardımcı olmak için T7 polimeraz aktivitesini...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması bildirmemiştir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Charleston Koleji Doğa ve Çevre Bilimleri Okulu başlangıç fonu, Charleston Koleji Lisans Araştırma ve Yaratıcı Etkinlikler Fakülte hibesi ile Yaz Lisans Araştırması ve P20GM103499'den SC INBRE DRP Alt Ödülü tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 &mikro; m PES, Sterilizasyon, Düşük Protein Bağlama, Filtre Sistemi, 1 LCorning431098
AEBSF serin proteaz inhibitörüAltın Biyografi30827-99-7
Agar, bakteriyolojikAmrescoJ637 Serisi
Ä KTA go arıtma sistemiCytiva29383015
Amicon Ultra 15 mL, 30 kDa MWCO yoğunlaştırıcıKırlangıçUFC903024
Ampisilin sodyumAltın BiyografiA-301-25
Şaşkın sallama şişeleriNalgene F0527 Serisi
Tezgah üstü santrifüjEppendorf 5920R Serisi
Biyofotometre artıEppendorf BelediyesiE-BP6132
Sığır trombiniBiyo İlaç91-030
Bradford boya reaktifiBoston Biyo ÜrünleriBPA-200
Bromofenol mavisiSigma-Aldrich114931
Kalsiyum klorürSigma-AldrichC4901 (İngilizce)
Dijital kuru banyoBiyo Rad1660562
Tek kullanımlık yayıcılar, L-şekilliMedSupply İş Ortakları62-1014-1
DitiyotreitolAltın Biyografi27565-41-9
Sığır pankreasından DNaseISigma-AldrichD4527
Douce doku öğütücü, 40 mLWheaton357546
Ekonomik sütunlu kromagtografi sütunlarıBiyo-Rad737-1532
Enduro minimix nutating mikseriLaboratuvar ağıS0600 Serisi
EtanolSigma-Aldrich459844
Excella E25R Inc/Ref ShakerEppendorf BelediyesiNB-E25R Serisi
Hızlı Pette V2Laboratuvar ağıP2000 Serisi
Fiberlite F10-4x1000 LEX sabit açılı rotorThermo Fisher Bilimsel096-041075
Fiberlite F21-8x50y sabit açılı rotorThermo Fisher Bilimsel096-084275
Gel Doc EZ GörüntüleyiciBiyo-Rad1708270
GliserolSigma-AlrichG5516 Serisi
GlisinBiyo-Rad161-0718
HEPESSigma-AldrichH3375 Serisi
Sıcak plaka karıştırıcıVWR12365-346
Hidroklorik asitVWRBDH3028
İmidazolAltın BiyografiI-902-25
İzopropil-ß-D-tiyogalaktiosit (IPTG)Altın Biyografi12481C25
Lemo21(DE3) yetkin E. coli hücreleriNew England BiyolaboratuvarlarıC2528J
Manganez(II) klorür tetrahidratSigma-AldrichM3634 Serisi
Mikrosantrifüj tüpleri, 0,5 mLVWR87003-290
Mikrosantrifüj tüpleri, 1,7 mLMedSupply İş Ortakları15-1151
Mikrosantrifüj tüpleri, 2 mLAxygenMCT-200-C
Mini-PROTEAN tetra dikey elektroforez hücresiBiyo-Rad10025025
Mini-Protean Tris-glisin jelleri, %4-20Biyo-Rad4568094
MyFuge mini santrifüjMedSupply İş OrtaklarıC1008-B
Nalgene 1 L süper hızlı santrifüj şişesiThermo Fisher Bilimsel3141-1006
Nalgene meşe sırtı santrifüj tüpüThermo Fisher Bilimsel31139-0050
NanofotometreImplen3769
Sallanmayan inkübatörLaboratuvar ağıI 5110 
Aşırı eksprese C41(DE3) kimyasal olarak yetkin hücrelerBiyoarama Teknolojileri60442-1
Aşırı eksprese C41(DE3) kimyasal olarak yetkin hücrelerSigma-AldrichCMC0017Üretilmiyor; Biosearch C41(DE3) hücreleri veya NEB Lemo21 hücreleri bir alternatiftir
Petri kaplarıMedSupply İş Ortakları62-1077-3
Plazmitler (pET-14b omurgası)Genel komut dosyasıÖzel sipariş
Plastik mikro küvetlerFisher Bilimsel14955127
PowerPacuniversal güç kaynağıBiyo-Rad1645070
Hassas kayma iğnesiBecton Dixon305198
Precision plus protein boyanmamış standartlarBiyo-Rad1610363
Ekspresyon için geri kazanım ortamı Sigma-AldrichCMR0001K
S-4x1000 Sallanan Kova RotoruEppendorf BelediyesiEP-S4X1
Serolojik pipet, 10 mlCephe357551
Serolojik pipet, 25 mlCephe35725
Serolojik pipet, 5 mLCephe35743
Serolojik pipet, 50 mLPr1maPR-Sero-50
Sodyum klorürSigma-AldrichS9888 Serisi
Sodyum dodesil sülfatSigma-AldrichL3771 Serisi
Sodyum hidroksitSigma-Aldrich567530
Sonik ayırıcıFisher BilimselFB505 Serisi
Sorvall Lynx 4000 SantrifüjThermo Fisher Bilimsel75006580
Spephadex G-25 M PD-10 sütunuCytiva17085101
ß-MerkaptoetanolKırlangıç444203
Paslanmaz çelik Griffin kabıPolar Ware13977-010-EA
Steril Falcon tüpleri, 15 mLDoğan352097
Steril Falcon tüpleri, 50 mLDoğan352098
Superdex 200 10/300 GL sütunCytiva28990944
Şırıngalar, 1 mLHava Tite A1
Şırıngalar, 3 mLBecton Dixon309657
TALON metal afinite reçinesiTakara635503
Kür -danYaratıcılık SokağıPAC3690-01
Tris tabanıAltın BiyografiT-400-1
Triton X-100MP Biyomedikal807423
TriptonAraştırma Ürünleri UluslararasıT60065 Serisi
VornadoKriterBV101-G
Maya özüAraştırma Ürünleri UluslararasıYıl20025

Kaynaklar

  1. Francis, D. M., Page, R. Strategies to optimize protein expression in E. coli. Curr Protoc Protein Sci. 61 (1), 5.24.1-5.24.29 (2010).
  2. Dumon-Seignovert, L., Cariot, G., Vuillard, L. The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3). Protein Expr Purif. 37 (1), 203-206 (2004).
  3. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 5, 1-17 (2014).
  4. Wagner, S., et al. Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).
  5. Kato, Y. Extremely low leakage expression systems using dual transcriptional-translational control for toxic protein production. Int J Mol Sci. 21 (3), 705(2020).
  6. Dubendorf, J. W., Studier, F. W. Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J Mol Biol. 219 (1), 45-59 (1991).
  7. Studier, F. W. Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system. J Mol Biol. 219 (1), 37-44 (1991).
  8. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
  9. Schlegel, S., Genevaux, P., de Gier, J. W. De-convoluting the genetic adaptations of E. coli C41(DE3) in real time reveals how alleviating protein production stress improves yields. Cell Rep. 10 (10), 1758-1766 (2015).
  10. James, J., et al. Protein over-expression in Escherichia coli triggers adaptation analogous to antimicrobial resistance. Microb Cell Fact. 20 (1), 13(2021).
  11. Shi, Y., et al. A dimerization-dependent mechanism drives the endoribonuclease function of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp11. J Virol. 90 (9), 4579-4592 (2016).
  12. Nedialkova, D. D., et al. Biochemical characterization of arterivirus nonstructural protein 11 reveals the nidovirus-wide conservation of a replicative endoribonuclease. J Virol. 83 (11), 5671-5682 (2009).
  13. Zhao, J., et al. Coronavirus endoribonuclease ensures efficient viral replication and prevents protein kinase R activation. J Virol. 95 (7), e02103-e02120 (2021).
  14. Joseph, J. S., et al. Crystal structure of a monomeric form of severe acute respiratory syndrome coronavirus endonuclease nsp15 suggests a role for hexamerization as an allosteric switch. J Virol. 81 (12), 6700-6708 (2007).
  15. Xie, Y., et al. Diversity for endoribonuclease nsp15-mediated regulation of alpha-coronavirus propagation and virulence. Microbiol Spectr. 11 (6), e02209-e02223 (2023).
  16. Guarino, L. A., Bhardwaj, K., Dong, W., Sun, J., Holzenburg, A., Kao, C. Mutational analysis of the SARS virus nsp15 endoribonuclease: identification of residues affecting hexamer formation. J Mol Biol. 353 (5), 1106-1117 (2005).
  17. Xu, X., et al. New antiviral target revealed by the hexameric structure of mouse hepatitis virus nonstructural protein nsp15. J Virol. 80 (16), 7909-7917 (2006).
  18. Bhardwaj, K., et al. Structural and functional analyses of the severe acute respiratory syndrome coronavirus endoribonuclease nsp15. J Biol Chem. 283 (6), 3655-3664 (2008).
  19. Pillon, M. C., et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 12 (1), 636(2021).
  20. Kim, Y., et al. Crystal structure of nsp15 endoribonuclease NendoU from SARS-CoV-2. Protein Sci. 29 (7), 1596-1605 (2020).
  21. Chaga, G., Hopp, J., Nelson, P. Immobilized metal ion affinity chromatography on Co2+ carboxymethylaspartate-agarose Superflow, as demonstrated by one-step purification of lactate dehydrogenase from chicken breast muscle. Biotechnol Appl Biochem. 29 (1), 19-24 (1999).
  22. Cao, J., Wu, C. C., Lin, T. L. Turkey coronavirus non-structure protein NSP15 - an endoribonuclease. Intervirology. 51 (5), 342-351 (2008).
  23. Andersen, K. R., Leksa, N. C., Schwartz, T. U. Optimized E. coli expression strain LOBSTR eliminates common contaminants from His-tag purification. Proteins. 81 (11), 1857-1861 (2013).
  24. Saida, F., Uzan, M., Odaert, B., Bontems, F. Expression of highly toxic genes in E. coli: special strategies and genetic tools. Curr Protein Pept Sci. 7 (1), 47-56 (2006).
  25. Godoy, A. S., et al. Allosteric regulation and crystallographic fragment screening of SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 51 (10), 5255-5270 (2023).
  26. Otter, C. J., et al. SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease antagonizes dsRNA-induced antiviral signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (15), e2320194121(2024).
  27. Wang, X., Zhu, B. SARS-CoV-2 nsp15 preferentially degrades AU-rich dsRNA via its dsRNA nickase activity. Nucleic Acids Res. 52 (9), 5257-5272 (2024).
  28. Zheng, A., et al. Insight into the evolution of nidovirus endoribonuclease based on the finding that nsp15 from porcine deltacoronavirus functions as a dimer. J Biol Chem. 293 (31), 12054-12067 (2018).
  29. Huang, T., et al. Kinetic analysis of RNA cleavage by coronavirus nsp15 endonuclease: evidence for acid-base catalysis and substrate-dependent metal ion activation. J Biol Chem. 299 (6), 104787(2023).
  30. Zhang, L., et al. Structural and biochemical characterization of endoribonuclease nsp15 encoded by Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Virol. 92 (22), e00893-e00918 (2018).
  31. Jernigan, R. J., et al. Room-temperature structural studies of SARS-CoV-2 protein NendoU with an X-ray free-electron laser. Structure. 31 (2), 138-151.e5 (2023).
  32. Ricagno, S., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of nsp15 from SARS coronavirus. Acta Crystallogr F Struct Biol Cryst Commun. 62 (4), 409-411 (2006).
  33. Canal, B., et al. Identifying SARS-CoV-2 antiviral compounds by screening for small molecule inhibitors of nsp15 endoribonuclease. Biochem J. 478 (13), 2465-2479 (2021).
  34. Bhardwaj, K., Guarino, L., Kao, C. C. The severe acute respiratory syndrome coronavirus nsp15 protein is an endoribonuclease that prefers manganese as a cofactor. J Virol. 78 (22), 12218-12224 (2004).
  35. De Marco, A. Strategies for successful recombinant expression of disulfide bond-dependent proteins in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 8 (1), 26(2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Protein Aşırı İfadesiAfinite KromatografisiBoyut Dışlama KromatografisiNsp15 SaflaştırmaRekombinant Protein EkspresyonuKriyo Elektron MikroskobuRNA Kesim DeneyiHis Etiketi Uzaklaştırma
Escherichia coli'den Toksik Bir Nükleazın Aşırı İfade Edilmesi ve Saflaştırılması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.