Canlı hücrelerde nükleositoplazmik taşıma dinamiklerini ölçmek için LEXY ve LINuS optogenetik araçlarını ve otomatik görüntü analizini kullanma

Özet

Bu protokol, optogenetik araçlar aracılığıyla nükleositoplazmik taşınmanın izlenmesinden elde edilen canlı hücre görüntüleme verilerinin otomatik analizlerinin nasıl verimli bir şekilde kurulacağını ve gerçekleştirileceğini açıklar.

Özet

Nükleositoplazmik taşıma (NCT), hücresel homeostazı korumak için gereklidir ve bozulması, nörodejeneratif bozukluklar ve amyotrofik lateral skleroz dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda rol oynar. Bu, NCT'yi izlemek ve ölçmek için araçlar geliştirme ihtiyacının altını çizmektedir. Bu araçlar arasında, hızlı ve geri dönüşümlü optogenetik problar, LEXY (ışıkla indüklenebilir nükleer ihracat sistemi) ve LINuS (ışıkla indüklenebilir nükleer lokalizasyon sinyali), canlı hücrelerde NCT dinamiklerinin ölçülmesine izin verir.

Orijinal yayınlar, canlı hücre görüntülemede LEXY ve LINuS yapılarının transfeksiyonu üzerine çekirdek ve sitozoldeki floresan prob sinyalinin manuel segmentasyonunu ve miktar tayinini açıklar. Bununla birlikte, hem transfeksiyon hem de manuel segmentasyon, analiz edilebilecek hücre sayısını sınırlar ve potansiyel kullanıcıya bağlı hatalar nedeniyle belirsizliğe maruz kalır. Optogenetik tarafından sağlanan yüksek hız ve tersine çevrilebilirlik, prensip olarak, NCT dinamiklerindeki değişiklikleri tespit etmede yüksek hassasiyete izin vermelidir, ancak bu, yeterli sayıda hücrenin edinim parametrelerine ve analizine bağlıdır.

Bu nedenle, kararlı hücre hatları oluşturmak için LEXY ve LINuS'u eksprese eden lentiviral vektörler oluşturduk, canlı görüntüleme belirteçlerini ve kontrol koşullarını test ettik ve yüzlerce hücrenin analizine izin veren yarı otomatik bir görüntü analizi boru hattı uyguladık. Bu analiz yöntemi, açık erişimli yazılım FIJI'yi kullanır, biyoinformatiğe yeni başlayanlar için erişilebilirdir ve gelişmiş bilgisayar kurulumları gerektirmez. Burada, numunelerin hazırlanmasından canlı hücre görüntüleme edinimine ve otomatik analize kadar nükleer ihracatı izlemek için bu optogenetik araçların bir örneği olarak LEXY'yi kurmak için adım adım bir protokol sunarken, protokolün herhangi bir laboratuvardaki diğer koşullar, kontroller veya modeller için nasıl uyarlanacağını gösteriyoruz. Bu protokolde kullanılan tüm plazmitler ve hücre hatları bilim camiasının kullanımına sunulacak ve böylece yöntemin erişilebilirliği daha da artacaktır.

Giriş

Anahtar hücresel yolları düzenlemek ve hücresel homeostazı sürdürmek için nükleositoplazmik taşımanın (NCT) önemi son yıllarda iyi çalışılmıştır¹. Sonuç olarak, NCT'nin^{dinamiklerini incelemek} için çeşitli araçlar oluşturuldu ^2,3,4. Bu araçlar arasında, sırasıyla 2014 ve 2016'da yayınlanan LINuS⁵ ve LEXY⁶ optogenetik probları, canlı hücrelerde NCT'yi izlemek için güçlü bir yol sağlar. Bir floresan raportörün indüklenebilir dışa aktarımını (LEXY) veya içe aktarımını (LINuS) takip etmek üzere tasarlanan bu araçlar, mavi ışığa maruz bırakılarak indüklenebilir ve geri dönüşümlüdür.

Kısacası, bu iki küçük prob, Avena sativa⁷ bitkisinin protein fototropin-1'inden LOV2 alanının özelliklerini kullanır. Mavi ışığın yokluğunda, LOV2 alanından gelen Jα sarmalı fotokafeslenir ve protein çekirdeğine gömülür. Jα sarmalı ışık uyaranına yanıt verebildiğinden, mavi ışıkla aydınlatma, konformasyonel bir değişikliğe ve ardından Jα sarmalının LOV2 alanından ayrılmasına neden olur. LEXY ve LINuS'un yazarları, bu ışık hassasiyetini, sırasıyla LINuS ve LEXY için bir Nükleer Lokalizasyon Sinyali (NLS) veya bir Nükleer İhracat Sinyalini (NES) Jα sarmalına kaynaştırmak için kullandılar (Şekil 1). Ortaya çıkan araç, mavi ışık aydınlatması üzerine çekirdeğe (LINuS) veya sitozole (LEXY) yer değiştiren bir probdur.

Probları floresan görüntüleme ile izlemek için, yapılara bir mCherry floresan raportör de eklendi. Son olarak, probların mavi ışık aydınlatmasından önce son lokalizasyonlarında olmadığından emin olmak için sisteme zayıf bir NES (LINuS için) veya NLS (LEXY için) eklendi, bu da çekirdek ve sitozol arasında LEXY veya LINuS translokasyonunun gözlemlenmesini önleyecekti.

Şekil 1: LEXY ve LINuS problarının gösterimi. Her iki prob da ışığa duyarlı LOV2 alanına kaynaşmış bir mCherry proteininden oluşur. İki araç arasındaki fark, Jα-sarmal tarafından gizlenen sinyalleşme dizisinde bulunur: LEXY için bir NES ve LINuS için bir NLS. Her iki prob da ilk lokalizasyonlarını kontrol etmek için zayıf bir sinyal dizisine sahiptir: LEXY için zayıf bir NLS ve LINuS için zayıf bir NES. Bu nedenle, sistemlerin mavi ışık aydınlatması ile etkinleştirilmesi, kullanıcıların nükleer ihracatı veya ithalatı izlemesine olanak tanıyarak ya LEXY için ihracatını ya da LINuS için ithalatını tetikler. Kısaltmalar: LEXY = ışık kaynaklı nükleer ihracat sistemi; LINuS = ışıkla indüklenebilir nükleer lokalizasyon sinyali; NLS = nükleer lokalizasyon sinyali; NES = nükleer ihracat sinyali. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

mCherry floresansının lokalizasyonu, çekirdekler ve sitozol arasındaki LEXY ve LINuS problarının mekiğini bildirir ve bu nedenle canlı hücre görüntülemede takip edilebilir ve kullanıcıların NCT'yi izlemesine olanak tanır. Basit problar olarak kullanılmanın yanı sıra, LEXY ve LINuS, in vitro ^5,6,8,9 veya in vivo^10,11 gibi lokalizasyonu kontrol etmek ve ilgilenilen proteinleri incelemek için de tasarlanabilir.

LEXY ve LINuS yayınlarında önerilen miktar tayini yöntemi, probların nispi nükleer yoğunluğunu göstermektedir. Önerilen analiz manuel olarak yapılır ve çekirdek ve sitozoldeki bir İlgi Bölgesinin (ROI) ölçümüne dayanır. Bu yöntem, probun sinyalinin zaman içinde iyi bir temsilini verse de, özellikle deneyler ve koşullar tekrarlandığında çok uzun ve sıkıcıdır. Önemli olan, bu yöntem, tasarlanan bölmenin yalnızca küçük bir kısmı temsil edildiğinden doğruluktan da yoksundur.

Burada LEXY ve LINuS floresan sinyal ölçümü için yeni bir protokol öneriyoruz. Analizleri kolaylaştıran ve daha fazla doğruluk sağlayan otomatik teknikler uyguladık. Bu, bu araçların yeni kullanıcıları için süreci kolaylaştıracak ve verimi artırmaya yardımcı olacaktır. Niceleme protokolümüz yalnızca bir arayüz, FIJI'nin açık kaynaklı TrackMate¹² eklentisini kullanır. Özellikle, niceliklerin güvenilirliğini artırmak için, TrackMate¹² ile probun floresan sinyalinin izlenmesi ve ölçülmesi ile birlikte, eğitimli bir evrişimli sinir ağı olan StarDist¹³ ile tüm çekirdek segmentasyonunu gerçekleştirmek için canlı görüntüleme uyumlu bir uzak kırmızı DNA işaretleyicisi kullandık.

Elde edilen veriler daha sonra, tanımlanan her bir çekirdeğin bağıl nükleer yoğunluğunu elde etmek için sağlanan ve kullanıma hazır elektronik tabloya (Ek Tablo S1) kolayca aktarılabilir. Bu protokol ayrıca, Yoo ve Mitchison^14'te olduğu gibi, elde edilen zaman seyri eğrisinin tek üstlü bir modele uydurulmasıyla elde edilen değerlerin bir grafikte nasıl toplanacağını ve test edilen farklı koşullar için taşıma oranının nasıl hesaplanacağını da açıklar. Bu protokol ve analiz için sağlanan elektronik tablo ile kullanıcılar, sınırlı biyoinformatik becerilere sahip olsalar bile canlı hücre görüntüleme verilerini kolayca ölçebilecekler.

Protokol

NOT: LEXY'nin probu ile nükleer ihracatın izlenmesi için aşağıdaki protokol açıklanmıştır. LINuS için ayarlanacak ayarlarla ilgili ayrıntılar bölüm 5'te sunulmuştur.

1. Hücre kültürü

NOT: Bu bölümdeki prosedür doku kültürü dereceli bir başlıkta gerçekleştirilmelidir. Aşağıda açıklanan adımlar, ortam olarak% 10 fetal sığır serumu ve% 1 Penisilin-Streptomisin ile desteklenmiş DMEM (veya belirtildiğinde fenol kırmızısı içermeyen DMEM) kullanılarak NIH / 3T3 fare fibroblast¹⁵ hücre hattı için optimize edilmiştir ( bkz. Bununla birlikte, kullanıcılar prosedürü diğer hücre tipleri için uyarlayabilir. Protokol, transfekte edilmiş hücreler veya stabil hücre hatları için uygundur. Ancak, tartışma bölümünde belirtildiği gibi kararlı hücre hatları oluşturmanızı öneririz.

1. Kaplama solüsyonunu steril 1x PBS'de 23 μg/mL kollajen ve 2 μg/mL fibronektin ile hazırlayın. Her canlı görüntüleme kabına 800 μL kaplama solüsyonu ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve inkübatörde 90 dakika bekletin.
2. Kaplama karışımını steril 1x PBS ile yıkayın ve ertesi gün bir çekim için ortamdaki canlı görüntüleme kaplarına 60.000 hücre tohumlayın.
3. Gerekirse, kullanılan hücre tipine en uygun transfeksiyon yöntemine göre hücreleri LEXY plazmidi ile transfekte edin. Bu protokolü takip etmek için, verimliliği artırmak için LEXY:boş vektör için 1:5 oranında probun boş bir vektörle birlikte transfeksiyonunu gerçekleştirin. Hücreleri karanlık bir kutuda veya alüminyum folyo ile ışıktan koruyun ve bir gün boyunca büyümelerine izin verin.
4. Edinimden önce, hücreleri fenol kırmızısı içermeyen bir ortamda, canlı hücre görüntülemeyle uyumlu uzak kırmızı bir DNA işaretleyicisi ile boyayın ve edinime kadar ışıktan tamamen korunduklarından emin olun.
   NOT: Bizim durumumuzda, alımlardan önce en az 1 saat inkübe edilmiş 1 μM'de SiR-DNA¹⁶ kullanıyoruz.
5. İhracatı kontrol etmek için, alımlardan 1 saat önce hücrelere uygulanan 0.5 nM (hafif ihracat inhibisyonu) ve 1 nM'de (güçlü ihracat inhibisyonu) nükleer ihracat inhibitörü Leptomisin B^17'yi kullanın.

2. Görüntüleme

NOT: Alımlar, seçilen edinimlerin bir modelini oluşturma yeteneğine ve pulsatil 458 nm lazer aydınlatmasına sahip canlı görüntüleme uyumlu bir konfokal mikroskop ile yapılabilir. Görüntülememiz karanlıkta, 37 °C'lik bir odacıkta (%5 CO₂ ile) rezonant taramalı konfokal mikroskopta gerçekleştirildi. Kurulum, 20x objektif ile optimize edilmiştir, bu nedenle aynı görüş alanındaki birden fazla hücrenin aynı anda görüntülenmesine izin verir. Görüntüleme dizisi Şekil 2'deki gibi üç fazdan oluşur.

1. Kararlı faz
   1. Her 15 saniyede bir mCherry (LEXY, 561 nm lazer) ve uzak kırmızı (SiR-DNA, 633 nm lazer) sinyalleri alın ve toplam 150 saniye boyunca 10 kez tekrarlayın. Bu noktada ne ağartma ne de LEXY'nin sitozole translokasyonunun gözlenmediğinden emin olun.
      DİKKAT: Bu aşamada sistemin mavi ışıkla aydınlatılması, LEXY'yi aktive edecek ve bu da hemen sitozole aktarılmasına neden olacaktır.
2. Aydınlatma aşaması
   NOT: Bu aşama, 15 kez tekrarlanan üç adımdan oluşur.
   1. Mavi ışıkla (458 nm lazer), 36 ms darbelerle 150x tekrarlanan, toplam ~5 s süre boyunca pulsatil aydınlatma gerçekleştirin.
   2. mCherry (LEXY, 561 nm lazer) ve uzak kırmızı (SiR-DNA, 633 nm lazer) floresan sinyallerinin bir alımını gerçekleştirin.
   3. 15 saniye duraklayın.
3. İyileşme aşaması
   1. Her 15 saniyede bir mCherry (LEXY, 561 nm lazer) ve uzak kırmızı (SiR-DNA, 633 nm lazer) sinyallerin bir alımını gerçekleştirin, toplam 375 saniye boyunca 25 kez tekrarlayın.
      NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve kullanıcılar kurtarmayı değil, yalnızca probun dışa aktarılmasını gözlemlemek istiyorlarsa kaldırılabilir.

Şekil 2: LEXY'nin üç fazının konfigürasyonu. LEXY ile nükleer ihracatı izlemek için mikroskop yazılımında üç faz ayarlanmalıdır. Üst kısım, LEXY'nin canlı hücre görüntüleme alımları için kullanılacak konfigürasyonu gösterir. Bu konfigürasyon, sinyalin çekirdekte kararlı olmasını sağlamak için kararlı bir fazdan, LEXY'nin çekirdekten sitozole translokasyonunu indüklemek için bir aydınlatma fazından ve LEXY'nin çekirdeğe geri döndüğünü gözlemlemek için bir geri kazanım fazından oluşur. Şeklin alt kısmı, canlı hücre görüntüleme ile beklenen sonuçları göstermektedir. Kırmızı renkteki mCherry, LEXY'nin lokalizasyonunu gösterir. Gri renkte, SiR-DNA hücrelerin çekirdeğini boyar. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. LEXY için Analiz

NOT: Tüm segmentasyon ve izleme analizi, açık kaynaklı bir Fiji eklentisi olan TrackMate¹² ile FIJI kullanılarak yapılmıştır ( Sürüm Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak açıklanmıştır).

1. FIJI'yi yükleyin ve ardından StarDist¹³ ve TrackMate eklentilerini indirin. Eklentileri yüklemek için Yardım | Güncelleme ... | Güncelleme Sitelerini Yönetin ve CSBDeep, StarDist ve Trackmate-StarDist'i işaretleyin, ardından Değişiklikleri uygula'ya tıklayın. Fiji'yi yeniden başlatın.
2. Bazı mikroskoplar her bir edinim aşamasını (Kararlı-Aydınlatma-Kurtarma) birlikte alabilirken, diğerleri (örneğin, referans alınan konfokal mikroskop) bunları ayrı ayrı kaydeder. Bu nedenle, bu konfigürasyon kullanılıyorsa ek bir adım, aşamaları bir araya getirmektir: üç dizinin görüntülerini açın, üç hızlandırılmış aşamayı tek bir dosyada derlemek için birleştirme işlevini çalıştırın: Görüntü | Yığınlar | Araçlar | BİRLEŞTİRİN....
3. Kararlı fazı Image1 olarak, aydınlatma fazını Image2 olarak ve kurtarma fazını Image3 olarak seçin. Elde edilen görüntü, mCherry (kanal 1) ve SiR-DNA (kanal 2) kanallarının birleştirildiği üç fazın hızlandırılmış çekimi için tek bir görüntüdür.
4. Elde edilen görüntüyü daha sonraki segmentasyon adımı için saklayın ve kaydedin: Dosya | Farklı Kaydet | Tiff....
5. Aşağıdaki analizler için mCherry kanalını tek başına bölün: Görüntü | Renk | Kanalları Böl ve kaydet: Dosya | Farklı Kaydet | Tiff....
6. Alım sırasında nihai ağartma olup olmadığını kontrol etmek için, mCherry kanalında Z Ekseni Profilini Çiz komutunu çalıştırın: Görüntü | Yığınlar | Z ekseni Profilini çizin. Oluşturulan tabloda, Veri | 1. Veri Setini kopyalayın ve bu protokolle birlikte verilen kullanıma hazır elektronik tabloya (Ek Tablo S1), Z ekseni profil hücresinin altına yapıştırın.
7. Bir çekirdeğin ortalama boyutunda dairesel bir ilgi alanı (ROI) çizin ve kaydedin: Analiz | Araçlar | Yatırım Getirisi Yöneticisi.... Yatırım getirisini ekleyin ve kaydedin: Daha Fazla | Kurtarmak...
   NOT: Analiz edilen tüm koşullar için arka planı ölçmek için aynı ROI kullanılmalıdır.
8. Kaydedilen ROI'yi tüm zaman atlamalı boyunca hücresiz bir bölgeye yerleştirin ve ROI arayüz işleviyle bu ROI içindeki ortalama yoğunluğu ölçün. İlk olarak, Analiz | Ölçümleri ayarlayın. Ardından, Daha Fazla | Çoklu Ölçüm. Kene 50 dilimin tümünü ve dilim başına bir çiği ölçün ve tamam'a tıklayın.
9. Sağlanan elektronik tabloda (Ek Tablo S1) görüntülenen tüm değerleri "ROI Arka Planı" hücresinin altına kopyalayıp yapıştırın.
10. Fiji'de, görüntüyü yalnızca mCherry kanalıyla kapatın ve birleştirilmiş mCherry ve SiR-DNA kanallarıyla önceden kaydedilmiş görüntüyü seçin.
11. TrackMate eklentisini açın: Eklentiler | Takip | Parça arkadaşı.
12. Zaman noktalarının sayısının doğru olup olmadığını kontrol edin (önerilen aşamalar izlendiyse 0 ila 49 ) ve İleri'ye tıklayın.
13. StarDist dedektörünü seçin ve İleri'ye tıklayın.
14. Çekirdekleri segmentlere ayırmak için kanal 2'yi (SiR-DNA) seçin ve İleri'ye tıklayın. Segmentasyon işleminin bitmesi için birkaç saniye bekleyin. Elde edilen segmentasyonun çekirdeğin sınırına karşılık geldiğini görsel olarak inceleyin ve İleri'ye tıklayın (Şekil 3). Yanlış segmentasyon durumunda, adım 3.26'da daha fazla analizden hariç tutmak için karşılık gelen çekirdek tanımlayıcısını (SpotID) not edin.
15. Varsayılan parametreleri bırakın ve ilk eşik ayarı penceresinde İleri'ye tıklayın. Bu pencere, 50 zaman noktası arasındaki parçalı noktaların (çekirdekler) sayısını verir.
16. Noktalarda filtreleri ayarlayın: filtreler oluşturun ve ayarlayın:
    1. Analizleri çarpıtabilecek çok yoğun veya çok zayıf sinyale sahip çekirdekleri çıkarmak için parametre olarak Ortalama yoğunluk ch1 ile iki filtre oluşturun: bir filtre tanımlanan eşiğin üzerindeki değerleri seçmek için, diğeri ise eşiğin altındaki değerleri seçmek için. Yalnızca çok düşük veya doymuş sinyali kaldırmak için değeri tanımlayın.
       NOT: Kararlı hücre hatları kullanılıyorsa bu filtrelere ihtiyaç duyulmayabilir. Tüm koşullar için yeniden uygulanmaları gerektiğinden bu değerlere dikkat edin.
    2. İstenmeyen nesneleri (enkaz, ölmekte olan veya bölünen hücreler) analizlerden çıkarmak için iki filtre alanı oluşturun: bir filtre tanımlanan eşiğin üzerindeki değerleri seçmek için, diğeri ise eşiğin altındaki değerleri seçmek için. İleri'ye tıklayın.
       NOT: Bu değerleri tüm koşullar için yeniden uygulayın.
17. Bir izleyici seçin: Basit TUR izleyiciyi seçin ve İleri'ye tıklayın.
18. İzleme için parametreleri seçin. Bağlantı maksimum mesafesini (burada, 30 μm) ayarlayın - çerçeveler arasındaki nesnelere bağlanmasına izin verilecek maksimum mesafe. Aynı izi hariç tutmadan tek bir parçanın kaç noktasının atlanabileceğini tanımlamak için Boşluk kapatma maksimum mesafesini (burada, 15 μm) ve Boşluk kapatma maksimum kare boşluğunu (burada, 3) kullanın. İleri'ye tıklayın (Şekil 3).
    NOT: Önerilen bu parametreler, deneme yanılma yaklaşımı kullanılarak kurulumumuz ve hücresel modelimiz için optimize edilmiştir ve deneysel olarak ayarlanması gerekebilir.
    Özellikle hücreler çok hareket ediyorsa, bir çekirdekten diğerine yanlış izlemeyi önlemek için maksimum bağlantı mesafesinin ayarlanması gerekir.
19. Hesaplamalardan sonra İleri'ye tıklayın ve parçalarda filtreleri ayarlayın. Yalnızca tüm zaman seyri boyunca izlenen çekirdekleri seçmek için (önerilen diziyle 50 zaman noktası), parçadaki en yüksek nokta sayısını seçin (önerilen dizi için imleci 49'un üzerine getirin). İleri'ye tıklayın.
    NOT: Bu, analizi kolaylaştıracaktır, ancak yalnızca tüm zaman boyunca yeterli çekirdek izlenmişse mümkündür, değilse: tartışmaya bakın.
20. Görüntüleme seçenekleri: Daha sonraki analizlerde her bir çekirdeği yeniden izleyebilmek için Nokta adlarını görüntüle'yi işaretleyin. Görüntülenen özellikleri kullanıcının tercihlerine göre özelleştirin.
21. Sayfanın alt kısmında, Parçalar | Tüm ölçümleri içeren tabloyu kaydetmek için CSV'ye aktarın. Tabloyu kapatın ve İleri'ye tıklayın.
22. İsteğe bağlı olarak, X ekseni olarak T (zaman) ve Y ekseni için ch1'in Ortalama yoğunluğu ile iz özelliklerini çizin. Arsa özellikleri'ne tıklayın. Grafiği kapatın ve İleri'ye tıklayın.
    NOT: Bu, kullanıcılara ihracatın genel eğilimi hakkında bir fikir verecektir. Bu noktada, arka plana ve başlangıç yoğunluğuna normalleştirilmez.
23. Tıklamak Yerleşimi eylem olarak yakala ve Yürüt | TAMAM. Oluşturulan görüntü, niceliksel çekirdekleri tanımlamak için kullanılacaktır. Kaydet: Dosya | Farklı Kaydet | Tiff....
24. Bir elektronik tablo dosyasında, TrackMate ile elde edilen CSV dosyasını içe aktarın: Veri sekmesinde, Verileri Al ve Dönüştür grubunda, Metinden/CSV'den ve İçe Aktar'a tıklayın.
25. İlgili harfe tıklayarak aşağıdaki dört sütunun tamamını seçin ve bunları sağlanan elektronik tablonun (Ek Tablo S1) en üstüne, A'dan D'ye kadar olan sütunlara, arka planla birlikte kopyalayıp yapıştırın: Nokta Kimliği (B), İz Kimliği (C), Çerçeve (I), Ortalama yoğunluk ch1 (M).
    NOT: Yapıştırılan ölçülerin başlangıcının Ek Tablo S6'in 1. satırından başladığından emin olun. Aksi takdirde, ölçümler bir veya daha fazla hücreden kaydırılabilir ve bu nedenle yanlış olabilir. Beklenen eğilimin bir örneğine sahip olmak için Ek Tablo S2'nin elektronik tablosuna bakın.
26. Sonuçları alfabetik olarak sıralayın, önce B5 hücresindeki oka tıklayarak TrackID'ye (tek tek çekirdek) ve C5 hücresindeki oka tıklayarak Çerçeveye (zaman noktası) göre.
27. Arka plan gürültüsünü gidermek için, adım 3.8'de elde edilen değerleri, Ortalama yoğunluk ch1'de elde edilen her değerden çıkarın (sağlanan elektronik tabloda önceden hesaplanmıştır, Ek Tablo S1'e bakın).
28. LEXY'nin sinyalini normalleştirmek için, kararlı fazda (0 ila 9 arasındaki kareler) mCherry floresan sinyalinin ortalama yoğunluğunu hesaplayın. Ardından, Ortalama yoğunluk ch1'de elde edilen tüm sonuçları, kararlı fazın ortalama yoğunluğuna bölün (sağlanan elektronik tabloda önceden hesaplanmıştır, Ek Tablo S1'e bakın).
    NOT: Elde edilen sayı, LEXY'nin ortalama nükleer floresan yoğunluğudur. Tüm ölçüler zaten L sütunundaki çekirdekler tarafından görüntülenir ve bir grafikte çizilebilir.

Şekil 3: FIJI kullanarak TrackMate analizi. Üstte, TrackMate analizlerinin şematik gösterimi, altta FIJI analizlerinden elde edilen görüntüler. Soldaki ilk gösterim, çekirdeğin bir belirteci olan bölünmemiş SiR-DNA boyamasını gri renkte göstermektedir. İkinci panel, Stardist tarafından SiR-DNA kanalı ile gerçekleştirilen otomatik segmentasyonu temsil eder. Çekirdekler, görselleştirmeyi ve son adımı kolaylaştırmak için mCherry kanalının yoğunluğuna göre renklendirilir. Üçüncü panel, tüm canlı hücre görüntüleme dizisinin zaman noktalarında SiR-DNA boyamanın izlenmesiyle elde edilen izleri gösterir. Sağdaki son panel, her bir zaman noktası için ölçülecek olan segmentasyon tarafından tanımlanan alanda LEXY'nin floresan sinyalini kırmızı olarak gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Taşıma oranı, istatistikler ve rakamlar

1. Bağıl nükleer yoğunluk grafiğini çizin.
   1. GraphPadPrism'i açın ve bir sayfa oluşturun: Verileri yeni bir tabloya girin veya içe aktarın'a tıklayın ve seçeneklerde, X için geçen süreleri ve Y için yan yana alt sütunlardaki çoğaltma değerleri için maksimum segmentli çekirdek sayısını seçin. Oluştur'a tıklayın ve elde edilen verileri tabloya yapıştırın.
   2. X değerleri (zaman) için, edinme parametreleri önerildiği gibi tutulduysa, sağlanan elektronik tablodaki 'zaman' altındaki sütunu kopyalayıp yapıştırın. Aksi takdirde, değerleri kullanılan parametrelere göre ayarlayın.
   3. Bağıl nükleer yoğunluğun grafiğini oluşturmak için Grafikler bölümüne gidin. Grafik ailesi olarak XY'yi seçin ve grafik türü olarak hata çubuklu Noktalar ve bağlantı çizgisi'ni seçin.
   4. Çizim bölümünde, Ortalama, Hata ve SEM'i seçin ve grafikleri görmek için Tamam'a tıklayın. Ölçekleri ve görselleri seçilen parametrelere göre değiştirin.
2. Bağıl nükleer yoğunluğu tek üstel bir modele sığdırın.
   1. Veri Tablosu bölümünde, Yeni Veri Tablosu'na tıklayın.
      1. X değerlerini X olarak girin'i seçin ve her nokta için Y olarak tek bir Y değeri girin ve çizin ve Oluştur'a tıklayın.
      2. X sütununda, süreleri yalnızca kararlı ve aydınlatma aşamaları için ondalık sayılar olarak bildirin; Önerilen alım parametreleri korunduysa, sağlanan elektronik tablodaki 'ondalık zaman' altındaki sütunu kopyalayıp yapıştırın, Ek Tablo S1.
      3. Bağıl nükleer yoğunluk olarak elde edilen değerleri sadece kararlı ve aydınlatma fazları için tabloya yapıştırın.
      4. Sonuçlar bölümünde aşağıdaki analizi seçin: XY analizleri | Üstel | Doğrusal Olmayan Regresyon (Eğri Uyumu) ve Tamam'a tıklayın.
      5. Parametrelerde, Plato'yu ve ardından Model olarak bir faz bozunmasını seçin ve sınırlama parametrelerinde, X0 (aydınlatmanın başlangıç zamanı) olarak 2,25'e eşit bir sabit, Y0 (aydınlatmanın başlangıcındaki bağıl nükleer yoğunluk) olarak 1'e eşit bir sabit, plato için 0'a eşit bir sabit (bağıl nükleer yoğunluğun dayanması gereken değerler), ve K'nin (dışa aktarma oranı) 0'dan büyük olması gerektiğini belirtin. Diğer parametreleri varsayılan olarak bırakın. Tamam'a tıklayın.
      6. Sonuçlar bölümünde, K satırı, test edilen koşulun çekirdekleri için tüm dışa aktarma oranlarını gösterir.
      7. Gerekirse diğer koşullar için 4.2.1 ila 4.2.1.5 arasındaki adımları tekrarlayın.
3. Dışa aktarma oranı grafiğini oluşturun.
   1. Yeni bir tablo oluşturun: X değerlerini X olarak girin ve Enter'ı seçin ve her nokta için Y olarak tek bir Y değeri çizin ve oluştur'a tıklayın.
   2. Her koşul için (sütunlar halinde), önceki adımda elde edilen K değerlerini yapıştırın ve transpoze edin.
   3. Dışa aktarma oranının grafiğini oluşturmak için Grafikler bölümüne gidin, grafik ailesi olarak sütunu seçin ve Kutu ve keman bölümünde, Keman grafiği ile grafik türü olarak Keman arsası'nı seçin. Tüm noktaları çizim olarak göster. Grafiği görmek için Tamam'a tıklayın. Gerekirse verileri temsil etme şeklini özelleştirin.
   4. Dışa aktarma hızı için istatistiksel bir test çalıştırmak için, aşağıdaki adımları izleyerek Yoo ve Mitchison^14'te açıklandığı gibi iki taraflı bir Welch t testi gerçekleştirin:
      1. Tüm koşulların dışa aktarma oranlarını içeren tabloda, Analiz Et | Grup Karşılaştırma | T-Testi (ve parametrik olmayan testler), test edilecek koşulları seçin ve Tamam'a tıklayın. Eşleşmemiş, Evet parametrik test kullanın ve Welch düzeltmesi ile Eşleştirilmemiş t testini işaretleyin. SD'lerin eşit olduğunu varsaymayın ve Tamam'a tıklayın.
   5. Sonuçlar bölümündeki tabloda analiz sonuçlarını gözlemleyin ve gerekirse dışa aktarma oranı grafiği hakkında rapor oluşturun.

5. LINuS için uyarlamalar

NOT: Yukarıda açıklanan protokol, aşağıdaki değişiklikler uygulanarak LINuS ile nükleer ithalatı izlemek için kolayca uyarlanabilir.

1. Hücre kültürü
   1. Adım 1.5'teki Leptomisin B yerine, edinimden önce 1 saat boyunca 10 μM konsantrasyonda nükleer inhibitör olarak importazol¹⁸ kullanın.
2. Görüntüleme
   1. Sistemin en iyi şekilde içe aktarılmasını sağlamak için, adım 2.2.1'deki 458 nm lazer tarafından 36 ms aydınlatma darbesinin 150 tekrarını, toplam ~9 sn süreyle 250 tekrarla değiştirin.
      NOT: dizi zamanlaması hücre tipine bağlı olabilir ve sistemler hücre tipine özgü^19,20 olan NLS ve NES'in tanınmasına bağlı olduğundan, her iki prob için parametrelerin optimal olması için ayarlanması gerekebilir.
3. Taşıma hızı, istatistikler ve rakamlar
   1. Adım 4.2.1.5'te bir Plato'ya bir eğri uydurmak ve ardından bir faz bozunması yerine, Plato'yu seçin ve ardından bir faz ilişkilendirme analizi yapın.
   2. X0'ı 2,25 ile, Y0'ı 1 olarak ve K'yi (LINuS durumunda içe aktarma oranı) 0'dan büyük olarak sınırlayın.
      NOT: LINuS'un TrackMate ile yaptığı analizler LEXY'ninkiyle aynıdır. Bağıl nükleer yoğunluk hala ölçülen ve analiz edilen değerdir, ancak probun dışa aktarılmasından kaynaklanan bir azalmayı gözlemlemek yerine, mavi ışık aydınlatmasından sonra çekirdekteki floresan sinyalinin zenginleşmesi gözlemlenmelidir.

Sonuçlar

Yukarıda belirtilen protokol, kullanıcıların canlı hücre görüntülemede edinim sırasında probun lokalizasyonunu ve translokasyonunu görselleştirmesine izin vermelidir. LEXY ile nükleer ihracatı görselleştirmek için elde edilen beklenen görüntülerin bir örneği Şekil 4'te gösterilmektedir. Birkaç tur mavi ışık aydınlatmasından sonra çekirdekten gelen sinyalin hızlı bir şekilde azalması ve sitozolde bir zenginleşme gözlenmelidir. Prob sinyalinin aşamalı olarak geri kazanılması, aydınlatma döngüleri durdurulduktan sonra görülebilir. Sistemi kontrol etmek için, bir dışa aktarma inhibitörü olan Leptomisin B, LEXY'nin mavi ışık aydınlatması üzerine dışa aktarılmasını önlediği için, dışa aktarmadaki bir değişikliğin analizlerle görselleştirilebileceğini doğrulamaktadır (Şekil 4).

Şekil 4: LEXY'nin sinyalinin zaman içindeki görselleştirilmesi. Canlı hücre görüntüleme ile elde edilen kararlı, aydınlatma ve geri kazanım aşamalarının temsili zaman noktalarının yakalanması. Metanol koşulu, kontrol koşulunu temsil eder. Pulsatil mavi ışık yandığında, kırmızı renkte, LEXY'nin konumunu bildiren mCherry floresan sinyali, çekirdekten sitozole yer değiştirir. Aydınlatmayı durdurduktan sonra, sinyal çekirdekte geri kazanılır. 1 nM veya 0.5 nM'de ihracat inhibitörü Leptomisin B ile tedavi, ihracat bloke edildiğinde LEXY'nin ihracatının yokluğunu veya azaldığını gösterir. Ölçek çubuğu = 30 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Analizlerle ilgili olarak, kararlı faz sırasında bağıl nükleer yoğunluk eğrisinin değerlerinin 1 civarında olması gerekirken, mavi ışık aktivasyonundan sonra, aydınlatma fazının sonunda bir platoya ulaşana kadar yavaş bir düşüş göstermelidir (Şekil 5A). Azalma çok hızlı veya çok yavaşsa, alım parametreleri optimize edilebilir (tartışmaya bakın). Yeterli konsantrasyonlarda leptomisin B muamelesi, analizlerin ve tekniğin, nükleer ihracatın tamamen engellendiğini gösterecek kadar hassas olduğunu ve nispi nükleer yoğunluk değerlerinin tüm deney için yaklaşık 1'de sabit kaldığını doğrulayabilir. Bununla birlikte, orta Leptomisin B konsantrasyonları, hafif bir nükleer ihracat göstermelidir (Şekil 5A). Bu görsel gözlemler, ihracat oranının elde edilmesiyle nicel olarak doğrulanmalıdır (Şekil 5B).

Şekil 5: LEXY'nin beklenen bağıl nükleer yoğunluğu ve taşıma hızı. (A) Grafik, LEXY'nin floresan sinyalinin zaman içindeki bağıl nükleer yoğunluğunu temsil eder ve kararlı fazın mCherry ortalama yoğunluğuna normalize edilmiştir. Metanol (kontrol, kırmızı) koşulunun nispi nükleer yoğunluğu, 0.5 nM (açık mavi) veya 1 nM (koyu mavi) konsantrasyonda, ihracat inhibitörü Leptomisin B ile muamele edilen hücrelerin aksine, aydınlatmadan sonra yarı yarıya azalır. Hata çubukları: SEM. (B) Eğrinin monoüstel bir modele uydurulmasıyla elde edilen kontrol ve Leptomisin B koşullarının dışa aktarma hızı. İhracat Leptomisin B tarafından bloke edildiğinde elde edilen değerler, kontrol koşulundan önemli ölçüde düşüktür. Metanol (kırmızı) için N = 18 hücre, Leptomisin B 0.5 nM (açık mavi) için 19 hücre ve Leptomisin B 1 nM (koyu mavi) için 15 hücre. P değerleri iki taraflı Welch t testi ile hesaplandı. : P < 1×10⁻⁴, ****: P < 1×10⁻⁵. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo S1: Önceden tanımlanmış hesaplamaları içeren elektronik tablo. Bu elektronik tablo, analizi kolaylaştırmak için sağlanmıştır. TrackMate ile elde edilen yoğunluk değerleri, normalleştirilmiş bağıl nükleer yoğunluk değerlerini elde etmek için doğrudan kopyalanabilir ve elektronik tabloya yapıştırılabilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo S2: LEXY analizinin bir kontrol koşulu için beklenen sonuçların örneği. Elektronik tablo, LEXY'nin kararlı hücre hattının bir kontrol koşulu için elde edilen değerlerin bir örneğini temsil eder. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Protokolde belirtildiği gibi, kararlı hücre hatlarının oluşturulması, analizlerin kalitesini büyük ölçüde artırır. İlk olarak, probları ifade eden hücrelerin %100'üne sahip olmak, izlenen ve analiz edilen çekirdek sayısını artırır ve bu da analizlerin sağlamlığını güçlendirir. İkincisi, probların aşırı ekspresyonu ve kullanılan transfeksiyon reaktiflerinin toksisitesi ile indüklenen hücre ölümünü azaltır. Ve son olarak, hücreler arasındaki floresan sinyallerin güçlü heterojenliğini azaltır. Bu parametre önemlidir, çünkü doymuş bir sinyal, aydınlatmadan sonra yoğunluk değişiminin düzgün bir şekilde tespit edilmesine izin vermeyecektir. Aynı sonuç, farklılıkların nicelleştirilmesine izin vermeyen veya ağartabilen zayıf sinyaller için de geçerlidir. Bu nedenle, düzgün çalıştıklarından emin olmak için önce probları transfeksiyon yoluyla test etmenizi, alım parametrelerini ayarlamanızı ve ardından hızlı bir şekilde kararlı hücre hatları oluşturmanızı öneririz. Hem LEXY hem de LINuS probları için istek üzerine paylaşılabilen lentivirüs vektörleri ve bu lentivirüslerle oluşturulan NIH / 3T3 LEXY veya LINuS kararlı hatları oluşturduk.

Problar transfekte edilirse veya hücreler seyrekse, önerilen parametreler muhtemelen tespit edilen iz sayısını azaltacak ve analizler daha az sağlam olacaktır. Bu durumda, kullanıcılar, filtrenin parçadaki nokta sayısını azaltarak izlemede atlanan noktalar konusunda daha hoşgörülü olabilir (50 noktadan en az 45'ini tutmanızı öneririz). Dikkat: Bu filtre azalırsa, sağlanan Excel dosyası (Ek Tablo S1) manuel olarak ayarlanmalıdır: aslında, içe aktarılan CSV'den yapıştırılan değerler boşlukları hesaba katmayacaktır. Kullanıcının TrackID numarasıyla eksik noktaların nerede olduğunu bulması ve bunları genellikle birkaç kopyala-yapıştır turu alan çekirdek numarasıyla ilişkilendirmesi gerekir.

Deneyin başarısını garanti altına almak için kritik bir parametre, hücreleri karanlıkta tutmaktır. Problar mavi ışığa tepki verdiğinden, kullanıcılar hücrelerin alımdan önce en az 30 dakika karanlıkta taşınmasını sağlamalıdır. Çanağı örtmek için küçük bir kapalı kutu veya alüminyum kullanmak yeterlidir. Benzer şekilde, mCherry ışığını mikroskopta hücreleri aramak için sadece kullanmaya çok dikkat etmek gerekir, çünkü mavi ışıkla aydınlatma hücreleri harekete geçirir. Mikroskop altında nihai bir aydınlatma meydana gelirse, edinme için başka bir uzak alan arayın. Adım 3.6'da Z ekseni Profilinin çizilmesi, hücrelerin bir aydınlatmadan etkilenip etkilenmediğini, eğrinin bir plato olmak yerine azalıp azalmadığını bilmeye yardımcı olacaktır.

Görüntüleme dizisi üç aşamadan oluşacak şekilde ayarlanmıştır. Birincisi, potansiyel ağartmayı değerlendirmek ve aynı zamanda LEXY'nin lokalizasyonunun aktivasyon olmadan sabit kalmasını sağlamak için stabil faz (1). İkincisi, LEXY'nin çekirdekten sitozole translokasyonunu indüklemek için pulsatil mavi ışık aydınlatması turlarından oluşan aktivasyon fazı (2). Son olarak, sinyalin kademeli olarak çekirdekteki ilk konumuna geri döndüğü isteğe bağlı kurtarma aşaması (3).

Edinimler için açıklanan dizi, hücre tipine özgü^19,20 olabilir. İlk deney için kullanıcı, sistemin çekirdek ve sitozol arasında aşamalı olarak yer değiştirdiğini görmek için lazer gücünü ve zamanlamalarını test etmeli ve değiştirmelidir. Önemli olan, çok kısa bir duraklama olarak çok güçlü bir lazer gücü, ilerleyici bir translokasyon görmeyi engelleyebilir, bunun yerine aydınlatmadan sonra mCherry yoğunluğunun acımasız bir düşüşü / zenginleşmesi (kullanılan proba bağlı olarak) olabilir.

Dizinin optimizasyonu sorunu çözmezse, NES ve/veya NLS'nin kullanılan hücre tipi için uygun olmaması muhtemeldir. Kullanıcılar, probları tasarlamak ve değiştirmek için LINuS yöntemi makale^8'e başvurabilir. Kullanıcılar ayrıca LINuS'u bir epifloresan mikroskobu ile görüntülemek için bu makaleye başvurabilirler.

Çekirdek segmentasyonu, analizin kritik bir adımıdır. Probların canlı hücre görüntülemesi için sağlam ve güvenilir bir nükleer belirteç kullanılmalıdır. Mavi ışıkla aydınlatma, probun translokasyonunu aktive ettiğinden ve problar mCherry floresan proteini ile izlendiğinden, bu işaretleyici uzak kırmızı spektrumda veya yakın renkte görünür olmalıdır. Bizim durumumuzda, 1 ila ~ 24 saatlik inkübasyon sırasında hücreleri boyayan SiR-DNA kullanıyoruz, ancak SPY-DNA 650 kullanmak da bir seçenektir (referanslar için Malzeme Tablosuna bakınız).

Son olarak, TrackMate'in filtrelenmiş takibi ile birlikte StarDist ile segmentasyon verimliliğini kanıtlarsa, kullanıcının segmentasyon sonuçlarını ve nicelleştirmeyi her zaman görsel olarak kontrol etmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Bölünen veya ölmekte olan bir hücre, nicelemeye dahil edilebilir, oysa dahil edilmemelidir. Bu tür olayların analiz risklerini azaltmak için, sağlanan Excel sayfası bağıl nükleer yoğunluğa bir renk kodu atfeder (mavi = düşük değerler, kırmızı = yüksek değerler). GraphPad Prism'de değerleri çizmeden önce renkleri inceleyerek, kullanıcı olağandışı değerleri fark edebilmelidir. Örneğin, LEXY'nin bağıl nükleer yoğunlukları, kararlı faz sırasında yüksekten (çekirdekteki probun kırmızı, güçlü miktarları) ile aydınlatma fazının sonunda düşüke (mavi, çekirdekteki probun azaltılmış miktarları) kadar değişmelidir, geri kazanım aşamasında ( Ek Tablo S2'de gösterildiği gibi) yüksek değerlere (kırmızı) geri dönmeden önce.

Bu protokol, daha önce önerilen yöntemlere göre çeşitli avantajlar sunmaktadır ^5,6. Yarı otomatik boru hattı, LEXY ve LINuS nükleositoplazmik taşınmasının analizini kolaylaştırır ve daha önce önerilen manuel miktar tayininden daha fazla doğruluk sağlar ^5,6. Protokolümüzü kullanmak, alana yeni başlayanların verimli analizler yapmalarını sağlayacak, aynı zamanda nükleositoplazmik taşınmanın yarı otomatik analizlerini gerçekleştirmek için yalnızca bir açık erişimli arayüze ihtiyaç duyacak deneyimli kullanıcılar için yeni bir araç sağlayacaktır.

Bu yöntem, NIH3T3 hücre hatlarında küresel nükleositoplazmik taşıma hızının incelenmesinden daha ileri uygulamalar için kullanılabilir. Gerçekten de, birkaç optimizasyon adımıyla, çeşitli hücre tiplerinde veya canlı hayvanlarda probun taşıma hızını incelemek için uyarlanabilir⁸. Ayrıca, ilgilenilen bir proteini LEXY veya LINuS ile kaynaştırarak, taşıma hızını veya çekirdeğin içine veya dışına ışık kaynaklı translokasyonunun aşağı akış etkilerini incelemek de mümkündür. Örneğin, LEXY ile sitoplazmada bir proteini tecrit etmek veya LINuS 5,6,21,22,23 ile çekirdeğe lokalizasyonunu zorlamak mümkündür. Son olarak, açıklanan analizler, bölümlere ayrılabilen hücre altı bölmeler arasında yer değiştiren herhangi bir sinyali izlemek için LEXY ve LINuS'tan daha fazla uygulamaya genişletilebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kollajen	Sigma-Aldrich	08-115
Konfokal mikroskop	LEICA	SP8
DMEM	Gibco	31966021
Excel	Microsoft
FBS'nin	Sigma-Aldrich	F7524 Serisi
Fibronektin	Sigma-Aldrich	F1141 Serisi
FIJI yazılımı	FİJİ		ResimJ 2.16.0/1,54p; Java1.8.0_322
Floroglar	Dutscher	FD3510-100 Serisi	Alternatif: Attoflor odası (Invitrogen #A7816)
GraphPad Prizma 10.4.1	GraphPad Yazılım A.Ş.
İthalatazol	Sigma-Aldrich	SML0341
Leptomisin B	Sigma-Aldrich	L2913 Serisi
LEXY plazmidi	Addgene	72655	pDN122
LINuS Plazmidi	Addgene	61347	pDN77
Pencillin-Streptomisin	Gibco	15140-122
Fenol kırmızısı içermeyen DMEM	Gibco	21063-029
SiR-DNA	Spirokrom	SC007 Serisi	Alternatif: SPY-DNA650 (Spirokrom #SC501)
Stardist 2D eklentisi	Yıldız Dağıtımı		StarDist_0.3.0
TrackMate eklentisi	Parça Arkadaşı		TrackMate-7.14.0