Genişleme Mikroskopisi: Konvansiyonel Mikroskopla Yüksek Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme

Özet

Burada, kriyofiksasyon ve genleşme mikroskopisi yöntemlerini (Cryo-ExM) birleştiren ayrıntılı bir protokol sunuyoruz; bu protokol, çeşitli biyolojik örneklere uyarlanmış yapısal koruma ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme imkanı sağlıyor. Biyolojik örnekler donduruluyor, şişirilebilir bir polimere gömülüyor, denatüre edilir, genişletilir ve immünoetiketlenerek standart ışık mikroskoplarıyla süper çözünürlüklü görüntüleme yapılmasını sağlar.

Özet

Genişleme mikroskopisi (ExM), biyolojik örnekleri fiziksel olarak büyüten ve konfokal mikroskoplar gibi geleneksel sistemlerle kırınım sınırının ötesine geçmesine olanak tanıyan yenilikçi bir süper çözünürlüklü floresan mikroskopi tekniğidir. Örnekleri şişebilir bir hidrojel matrisine gömmekle, ExM, örneğin izotropik genişlemesini sağlar ve özel nanoskopi ekipmanına ihtiyaç duymadan mekansal çözünürlüğü artırır. Ultrastruktur Genişleme Mikroskopisi (U-ExM) gibi gelişmiş varyantlar, organeller ve makromoleküler montajlar dahil olmak üzere ince hücresel detayları korur.

Belirli hücresel yapıların veya organellerin gözlemi, özellikle aldehit bazlı kimyasal çapraz bağlayıcılar ve soğuk metanol ile protein çökeltmesi yoluyla numuneye uygulanan fiksasyon yöntemine önemli ölçüde bağlıdır. Son zamanlarda, kriyofiksasyonun — altın standartlı bir fiksasyon tekniği — U-ExM yöntemiyle entegre edilmesi, kültürlenmiş memeli hücrelerinden tüm organizmalara kadar neredeyse doğal hallerinde çok çeşitli biyolojik örneklerin nano ölçekli gözlemlerini mümkün kıldı. Genişleme mikroskobi, izole organellerden tüm dokulara kadar ölçekler arası biyolojik yapıları incelemek için güçlü bir araçtır. Kriyofiksasyon ile birleştiğinde, hücresel mimari ve dinamik süreçler hakkında eşi benzeri görülmemiş içgörüler sağlarken, geleneksel fiksasyon yöntemleriyle ilişkili artefaktları en aza indirir. Bu gelişmeler, ExM'i yüksek çözünürlüklü, neredeyse yerli biyolojik görüntüleme için çok yönlü bir çerçeve olarak konumlandırmaktadır.

Mevcut çalışma, çeşitli kökenlerden alınan örneklerin genleşme mikroskobi ile birlikte kriyofiksasyon için ayrıntılı bir protokol ortaya koymaktadır. Bu protokol, örnek fiksasyonu, polimer oluşumu, genişleme, immünboyama ve görüntüleme gibi kritik adımları vurgular ve bu yöntemin herhangi bir laboratuvarda uygulanması için gerekli rehberliği sağlar.

Giriş

Mikroskopi, biyolojik araştırmalarda kritik bir rol oynar; canlı sistemler boyunca ultrayapı ve organizasyonu benzeri görülmemiş ölçeklerde, tüm organizmalardan bireysel moleküllere kadar görselleştirmemizi sağlar. Mikroskopi alanı iki farklı sistemi kapsar: yüksek çözünürlüklü ancak sınırlı belirli etiketleme kapasitesine sahip elektron mikroskopisi (EM) ve ışık mikroskobi; bu da hücrealtı yapının hassas ve özgün görselleştirilmesini sağlar ancak ışığın kırınım sınırı nedeniyle sınırlı çözünürlükle çalışır. Süper çözünürlüklü floresan mikroskopisi (SRM), hücrelerin alt kırınım çözünürlüklü floresans görüntülemesi için güçlü bir yöntem olarak gelişmiş olsa da, makromoleküler yapıların ultrastruktural detaylarının, örneğin tüm organizmaların görselleştirmesi hâlâ^{zordur 1}. Ayrıca, 10 ila 120 nm arasında çözünürlükler elde eden SRM teknikleri, gelişmiş mikroskoplar ve görüntü yeniden yapılandırma algoritmalarına dayanır ve uzmanlık ile özel mikroskoplar gerektirir; bu da birçok biyoloji laboratuvarına erişimlerini sınırlar. Ortaya çıkan süper çözünürlüklü yöntem olan Genişleme mikroskopisi (ExM), bu sınırlamaları aşmıştır. On yıl önce Edward S. Boyden'ın laboratuvarında geliştirilen ExM, artık süper çözünürlüklü mikroskopi olarak kabul edilen ve özel mikroskoplara ihtiyaç duymadan görüntüleme imkanı sağlayan yenilikçi bir fotonik^{mikroskopi tekniğidir 2}. Gelişmiş görüntüleme teknolojilerine güvenmek yerine, ExM, biyolojik örneklerin izotropik olarak genişleyen şişebilir bir polimere gömülmesini içerir. Bu fiziksel genişleme, örneklem boyutunu dört kat veya daha fazla artırır, çözünürlüğü artırır ve geleneksel ışık mikroskopları kullanılarak gözlemi mümkün kılar. Başlangıçta beyin dilimlerinde geliştirilen ExM protokolleri, çözünürlüğü artırmak ve işlemleri basitleştirmek için evrilmiştir. Bu teknik, ökaryot hücreler, tek hücreli organizmalar, parazitler, dokular ve bütün organizmalar dahil olmak üzere çeşitli biyolojik örnekler için başarıyla uyarlanmış ve çok yönlülüğünü^{göstermiştir} 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14^{, 15}.

Şu anda iki ana protokol sınıfı vardır: pre-expansion ^2,16 ve post-genişleme^17,18; bunlar, biyolojik örnek boyama anını, genleşme prosedüründen önce veya sonra anlamına gelir. Bu makale özellikle, numune denatürasyonu ve genişlemesinden sonra immünoetiketlemenin yapıldığı genleşme sonrası protokole odaklanacaktır.

Bu protokolde, biyolojik örnekler kriyo- veya kimyasal olarak sabitlenir ve kimyasal ajanlarla kuluçka yapılır, böylece proteinlerin gelecekteki polimere sabitlenmesi sağlanır. Örnekler daha sonra akrilamid/bis-akrilamid (elektroforez jellerinde yaygın olarak kullanılır) ve sodyum akrilattan (genleşmeyi mümkün kılan) oluşan şişebilir bir polimere gömülür. Su eklemek, jelin genleşmesini tetikler; bu da jelin genleşmesine orantılı olarak proteinler arasındaki mesafeyi artırır. İlgi duyulan proteinler, belirli antikorlar kullanılarak doğrudan jel içinde etiketlenir (Şekil 1).

Yukarıda bahsedilen tüm görüntüleme teknikleri, elektron mikroskobi, fotonik mikroskopi, süper çözünürlüklü mikroskopi ve ExM dahil olmak üzere biyolojik örnek fiksasyonu gerektirir. Aldehit bazlı fiksasyon, proteinler arasında çapraz bağlantı oluşturur ve fotonik veya elektron mikroskopi için gereken işlemler sırasında hücresel organizasyonu korur. Ancak, fiksasyon hücrede artefaktlara ve morfolojik değişikliklere de yol açabilir; bunlar klasik ışık mikroskopisinde ince olabilir ancak SRM'nin ilerlemesi ve gelişimiyle giderek daha belirgin hale gelmiştir; bu da bilim insanlarının fiksasyon yöntemlerinin sonuçlarını yeniden değerlendirmesine neden^{olmuştur 19}. Fiksasyonla ilgili artefaktları aşmanın bir yolu, hücresel yapıların neredeyse doğal hallerinde dinamik görselleştirilmesini sağlayan canlı mikroskopi kullanmaktır. Ancak, canlı mikroskopinin birkaç dezavantajı vardır; özellikle transgen ifadesine olan ihtiyaç, bu da hücre fizyolojisini etkileyebilir ve protein davranışını endojen muadillere göre değiştirebilir. Ayrıca, canlı mikroskopi genellikle sabit mikroskopiden daha düşük çözünürlük sunar ve sınırlı etiketleme seçenekleri sunar; çünkü floresan etiketler canlı koşullarda toksik olmayan ve stabil olmalıdır, bu da mevcut işaretleyicileri kısıtlar. Elektron mikroskopisi alanı, yüksek çözünürlüğü nedeniyle, subhücre veya makromoleküler yapıları sabitlemek için optimal yöntemlerin geliştirilmesine önemli katkı sağlamıştır ve doğal durumlarını korur. On yıllar önce, kriyofiksasyon Dubochet, Frank ve Henderson laboratuvarları tarafından geliştirilmiş, hücrenin vitreus haldeki suyun hızlı fiksasyonunu içeriyor ve bunun doğal ultrastruktur ^20,21'i korumanın tek yaklaşımı olduğunu göstermiştir. Saflaştırılmış moleküller doğrudan vitreus buzda kriyoelektron mikroskopi kullanılarak gözlemlenebilirken, hücrelerin reçine gömülüp gözlemden önce kesitlenmesi gerekir. Örnekleri mümkün olan en doğal durumda daha da stabilize etmek için örnekler dondurma ikame ile tabi tutulur. Bu süreçte, buz molekülleri sıvı hale döndüklerinde, hemen sudan daha yüksek difüzyon katsayısına sahip asetonla değiştirilir. Suyun uzaklaştırılması sırasında, ilgi çekici moleküller toplanıp çökebilir; bu, kimyasal çapraz bağlama fiksasyonunda olduğu gibi. Bu agregasyonu sınırlamak için, düşük sıcaklıklarda donma yerine geçme yapılır ve hücre içi^{viskoziteyi 22} artırarak agregasyonu azaltır. Bu kontrollü yaklaşım, büyük agregaların oluşumunu sınırlar ve hücresel ultrayapıyı doğal haline daha yakın korur.

2022 yılında, kimyasal fiksasyonun artefaktlar getirdiğine dair artan kanıtlar ve genleşme mikroskobideki gelişmeler birleşince, Guichard/Hamel laboratuvarı, kriyofiksasyonu genleşme mikroskobu ile entegre eden 'Cryo-ExM'23' adlı bir yöntem geliştirmeye yol açtı. Bu yaklaşım, biyolojik yapıları minimum bozulma ile koruyarak her iki tekniğin güçlü yanlarını kullanır. Örnekler, yüksek basınçlı dondurma veya manuel daldırma ile kriyo-dondurulur; her ikisi de elektron mikroskopi laboratuvarlarında veya çekirdek tesislerinde yaygın olarak bulunan özel ekipman gerektirir.

Bu makale, kriyofiksasyon ve ardından genleşme mikroskopisi için adım adım bir protokolü özetliyor ve iki deneysel modelden temsil eden sonuçlar sunmaktadır: insan kültürlü hücreler ve uyku hastalığının neden olan tek hücreli paraziti Trypanosoma brucei . Kriyofiksasyonun geleneksel fiksasyon yöntemlerine kıyasla sunduğu iyileştirmeleri vurgulayacak ve teknikle ilişkili en yaygın tuzakları ve fiksasyon artefaktlarını vurgulayacağız.

Protokol

NOT: Bu protokolte kullanılan reaktifler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir. Bu protokol, küçük değişikliklerle, farklı biyolojik örneklerdeki çeşitli hücresel süreçlerin gözlemlenmesine uyarlanmıştır (maya^24,25, Toxoplasma^{gondii 26}, yakın akraba hayvan^{türleri 27}, yeşil algler^28,29, mikrobiyal^{ökaryotlar 30}, ayrıca fare²³ ve insan^örnekleri 23,31,32,33 ). Protokolü bu farklı örneklere uyarlamak için yapılan değişiklikler bu makalede belirtilmemiştir, çünkü bunlar orijinal yayınlardan alınabilmektedir. Burada, RPE1 hücreleri ve Trypanosoma brucei memeli hücreleri ve parazitler için vekil olarak kullanılır. Bu protokol, biyolojik örneklerin fiksasyon ve genişleme adımlarını vurgular; Bu nedenle, örnek kültürle ilgili bilgiler bu makalede sunulmamaktadır.

1. Stok çözelti hazırlığı

1. Poli-lizin çözeltisi
   1. Poli-L veya poli-D-lizin hidrobromid (Malzeme Tablosu) suya yeniden süzülerek 1 mg/mL oranında poli-lizin stok çözeltisi elde edilir. Bu stok çözeltiyi -20 °C'de saklayıp kapak kapaklarını kaplamak için 0,2 mg/mL ile suya daha da seyreldin (Tablo 1, Malzeme Tablosu).
2. Ankrajlama çözümü
   1. Kimyasal kapağın altında, 38 μL formaldehit (%36,5-38; Malzeme Tablosu) ve 50 μL akrilamid (%40 , Malzeme Tablosu) 912 μL PBS ile 1 mL çözelti elde etmek için kullanılır.
3. APS (başlatıcı) olmadan jelasyon çözeltisi
   1. 500 μL %38 sodyum akrilat (%19 final), 250 μL %40 akrilamid (%10 final), 50 μL %2 bis-akrilamid (%0,1 final), 50 μL TEMED (%0,5 final) ve 100 μL 10x PBS (1x final) ekleyerek karışım çözeltisi hazırlayın. Aliquot, en fazla 2 jel (80-90 μL) için uygun ve kullanımdan önce en az 12 saat boyunca -20 °C'de saklanır (uzun vadeli koruma için Tablo 1'e bakınız).
      NOT: Lütfen belirtin: Jelleşme çözeltisi karışımını hazırlamak için gösterilen hacm, nihai hacmi 1 mL elde etmek için hesaplanmıştır, ancak çözeltinin gerçek hacmi 950 μL olup, APS (her biri toplam hacmin 1/20'sini temsil eder) doğaçlı olarak eklenir. Jelleşme^{çözeltisi 17'nin} orijinal depolama süresi, jel katılığı veya genleşme verimliliği zarar vermeden -20 °C'de 1 aya kadar korunabileceğini gözlemledikten sonra uzatıldı.
4. TEMED ve APS
   1. APS %10 w/v: APS tozunu suda, aliquot'ta seyreldin ve -20 °C'de saklayın.
   2. TEMED %10 v/v: TEMED'i suda, aliquot'ta seyreldin ve -20 °C'de sakla.
5. Sodyum akrilat (SA) %38
   1. Saflaştırılmış SA'dan %38 SA (AK scientific veya Sigma; Malzeme Tablosu)
      1. 38 g sodyum akrilatı 100 mL suya sürekli karıştırma altında yeniden askıya alın (önemli). Agregaları önlemek için SA'yı kademeli olarak dahil edin ve tam resüspsiyon için gece boyunca 4 °C'de karıştırın. Çözeltinin saydam ve renksiz ya da hafifçe sarı olduğundan emin olun. Aliquot ve 4 °C'de 1 yıla kadar sakla.
   2. Akrilik asitten %38 SA (Sigma; Malzeme Tablosu)
      1. 90 mL %38 sodyum akrilat hazırlamak için kimyasal bir başlık altında NaOH ile akrilik asidi nötralize edin.
      2. 29 mL suyu 25 mL akrilik asit ile karıştırırken karıştırın.
         NOT: Bu adımdan itibaren, reaksiyon ekzotermik olduğu için pH ve sıcaklık üzerinde sürekli kontrol edilerek buz üzerinde gerçekleştirilmelidir.
      3. Pasteur pipetiyle 10 N NaOH damla-damla ekleyin.
         NOT: Sıcaklığın 25 °C'yi aşmadığından emin olun (eğer geçiyorsa, NaOH eklemeyi bırakın ve sıcaklığın soğumasını bekleyin).
      4. pH 7-8'e ulaşana kadar nötralizasyona devam edin ve buzda 1 saat çaltasyonla devam edin.
         NOT: pH aniden 10'un üzerine çıkarsa, akrilik asit ekleyin ve pH 7-8'e düşsün.
      5. Çözeltiyi gece boyunca kapalı bir kapta saklayın. Çözelti çökelttiyse, 10 dakika boyunca 1.000 × g sıcaklıkta santrifüj yapın. Süpernatantı (aliquot) topla ve -20 °C'de sakla.
6. Denatürasyon çözümü
   1. TrisBase 1 M: 121,14 g TrisBase'i 1 L suya salın, pH HCl ile 9'a ayarlayın ve RT'de saklayın.
   2. Denaturasyon tamponu: 200 mM Sodyum Dodesil Sülfat (SDS), 200 mM NaCl, 50 mM TrisBase suda karıştırın. 200 mL bir çözelti için, 124,9 mL ddH₂O içine 10 mL Tris-BASE 1 M (pH 9) ekleyin, karıştırırken 57,1 mL SDS (%20/700 mM stok) ve 8 mL NaCl (5 M stok) ekleyin. RT'de depolayın (Tablo 1).

2. Kriyofiksasyon ve genleşme prosedürü

1. Numune hazırlama ve kriyo-fiksasyon
   NOT: Bu protokol, 12 mm örtülü örtüklerde yetiştirilen ve yüklenen örnekler için optimize edilmiştir. Lütfen çözümün sesini başka destekler için revize edin.
   1. Numune hazırlama
      1. Örneği, biyolojik numuneye uyarlanmış bir durumda, doğrudan 12 mm örtülü (memeli yapışkan hücreler) veya süspansiyon (T. brucei) üzerinde yetiştirin.
      2. Poli-lizinle önceden kaplanmış kaplama (T. brucei) üzerine numune yüklemesi yapıldı: kısa süreliğine, 12 mm örtü kapaklarını poli-lizinde (0,2 mg/mL) 37 °C'de 1 saat kuluçka edin, hızlıca yıkayıp hava ile kuruttur.
      3. Parazitleri oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 300 g santrifüjle yapın. Kriyofiksasyondan 5-10 dakika önce %10 kültür ortamı ile takviye edilmiş PBS ile tekrar süzülür ve örtü örtülerine yüklenir.
   2. Daldırma kurulumu (Şekil 2A-C)
      DIKKAT: Asetonu manipüle ederken kimyasal bir kapüşon altında, eldiven ve laboratuvar önlüğüyle çalışın. Sıvı azot ve sıvı etan kullanılırken laboratuvar önlüğü ve gözlüğü kullanın.
      1. Kimyasal bir kapak altında, hava kirliliğini önlemek için bir şırınga ve bir iğne kullanarak 5 mL tüpleri (1 kapak/tüp) 1 mL ekstra kuru asetonla doldurun.
         NOT: Daha iyi biyolojik membran koruması için paraformaldehit (PFA)/Glutaraldehit (GA) (%0,1/0,02) eklenmesi gereklidir. Tüpü örtü kuşağının çapına göre uyarlayın (12 mm > kapak kaymaları 5 mL'lik tüplere sığmaz).
      2. Tüpleri dik tutmak için soğuk sıcaklığa dayanıklı plastik veya metal bir raf kullanarak sıvı azotta dondurun.
      3. Polistiren kutunun yarısını (30 cm x 30 cm / kalın duvarlar) kuru buzla doldurun.
      4. Vitrobot tipi dewar'ı buharlaşmayı durdurana kadar sıvı azotla doldurun ve sıcaklığın stabilizasyonunu 10-15 dakika bekleyin. Örümceğin kullanımı, sistemin soğumasını kolaylaştırmak için gereklidir (Şekil 2B, yıldız). Gerekirse doldurun.
      5. Örümceği çıkarın ve metalik daldırma odasını sıvı etanla doldurun.
      6. Etanın dengelenmesi için 10 dakika bekleyin.
         NOT: Gerekirse deney sırasında daldırma sistemini sıvı etanla doldurun (bu noktada örümceği artık kullanmayın). Gaz halinden sıvı etana geçiş zordur. Uygun basınç, sıvı etan oluşumu için kritik öneme sahiptir. Yüksek basınç, metal odada sürekli gaz taşmasıyla sıvı oluşumunu engellerken, düşük basınç metal odada ve dolum borusunda katı etan oluşturur. Deney için buz oluşumundan kaçınmak çok önemlidir. Sıvı/hava arayüzünde dolum ucu tutulması, katı etan oluşumunu önlemeye yardımcı olur.
   3. Dalma (Şekil 2A-C)
      DIKKAT: Sıvı azot ve sıvı etan kullanılırken laboratuvar önlüğü ve gözlüğü kullanın.
      1. İnce cımbızlı 12 mm örtülü bir örtü alın.
      2. Fazla malzemeyi mendil kağıdıyla emin.
      3. Kapak kağızını cımbızla yarıya kadar tutun ve kriyo-pistona uyarlanmış bir kelepçe halkası kullanın.
      4. Örtü kapağını tutan cımbızları kriyo-pistonun tutucusuna yerleştirin. Kalan fazla ortamı Whatman kağıdıyla temizleyin.
      5. Cryo-plunger'ı aktive ederek coverslip'i metal odadaki etan çözeltisine batırın.
      6. Coverslip'i hızla donmuş aseton içeren tüpe (1 coverslip/tüp) aktarın.
         NOT: Örnekleri toplamak ve battırmak için aynı cımbızları kullanmayın, böylece kültür ortamıyla kontaminasyon önlenebilir. 12 mm (15 veya 18 mm çapında örtü kaymaları taşıyıcıya uyuyor ama batırılması daha zor olabilir) örtü kaydırmaları kullanırken özellikle dikkatli >olun. Bu aşamada, kap kazağı daldırdıktan sonra sıvı azotla daldırmak ve numuneyi dondurarak Eppendorf'a aktarmayı kolaylaştırmak mümkündür. Aseton -96 °C'de donduğundan, dondurma ikamesi için örtü kapaklarını donmuş asetonun üzerine yerleştirmek gereklidir.
   4. Dondurma ikamesi ve yeniden hidrasyon
      DIKKAT: Dondurma ikame sırasında örnekleri manipüle ederken dikkatli çalışın. Sıcaklığın yükselmesi tüp içinde basınç oluşturur ve bu da bir tüp patlamasına yol açabilir.
      1. Tüpleri yaklaşık 45° eğim açısıyla kuru buzda kuluçka edin.
      2. Yörünge sallayıcısında gece boyunca tahrik edin. Kapalı kutuyu 4 °C veya RT sıcaklıkta bir silkeleyiciye yerleştirerek sıcaklığın -180 °C'den -80 °C'ye yükselmesini sağlayın.
      3. Kutudan kuru buzun çoğunu çıkarın (sadece birkaçını kutunun dibine bırakın), tüpleri hızlıca açıp kapatarak basıncı boşaltın ve yörünge sallayıcısında 45 dakika boyunca çaltmaya devam edin ki sıcaklık -80 °C'den -20 °C'ye yükselmeye devam etsin.
      4. Kapak kaşlarını önceden soğutulmuş saf etanol (%100) çözeltisi içeren 12 delikli bir plakaya (veya uygun herhangi bir kapa) aktarın. 5 dakika kuluçka yapın ve aşağıdaki gibi yavaş yavaş rehidrasyona devam edin: EtOH %100 (5 dakika) - EtOH %95 (3 dakika) - EtOH %95 (3 dakika) - EtOH %70 (3 dakika) - EtOH %50 (3 dakika) - EtOH %25 (3 dakika) - H₂O %100%.
      5. Kapak sliplerini PBS'ye aktarın ve mikroskop altında (yüzeyi bir uçla çizerek) yöneltin ki hepsi yukarı bakacak şekilde olsun.
         NOT: EtOH %100 ve %95 -20 °C'de, EtOH %70 ve %50 4 °C'de, EtOH %25 ve ddH_2ORT'de depolanır ve RT'ye kadar sıcaklığı yükseltmeye devam eder. Membran etiketleme için, aseton ve rehidrasyon çözeltilerinde PFA/GA (%0,1/%0,02) eklenmesi gereklidir, ddH₂O hariç.
2. Genişleme
   1. Protein sabitleme
      1. PBS 1x içinde taze %1,4 formaldehit / %2 akrilamid (FA/AA) çözeltisi hazırlayın.
      2. Coverslips'i 0.5/1 mL AA/FA ile doldurulmuş 4/12 kuyu plakasına yerleştirin.
      3. 37 °C'de 3-5 saat boyunca kışkırtmadan kuluçka yapın.
         NOT: Formaldehit, serbest amin grupları olan proteinleri akrilamid ile bağlar. Fazla akrilamid, formaldehit tarafından normalde indüklenen protein çapraz bağlanmasını sınırlamaya yardımcı olur ve proteinleri gelecekteki genleşme polimerine sabitler. Biyolojik numuneye bağlı olarak protein sabitleme adımı uzatılması gece boyunca gerekebilir. Her halükarda, daha uzun kuluçka aşağıdaki adımların hiçbirini etkilemez. Boş kuyuları suyla doldurun veya buharlaşmadan kaçınmak için nemli bir odaya yerleştirin.
   2. Jelasyon
      1. Jelleşmeden 10 dakika önce buz üzerinde eritme, APS (%10) ve jelasyon çözeltisi (Sodyum akrilat %19, Akrilamid %10%, bis-akrilamid %0,1%, %0,5 TEMED 10x PBS ile seyreltilmiş %0,5) ile yapılmış.
      2. İnce bir ıslak doku tabakası ve parafilm içeren nemli bir oda hazırlayın, ardından 4 °C'de 10 dakika boyunca saklayın.
      3. Nem odayı buzun üzerine koyun.
      4. Örtü kağıtlarını protein sabitleme çözeltisinden çıkarın ve fazla çözeltiyi bir mendil kağıdıyla (üst üste 2 tane) çıkarın.
      5. APS (son konsantrasyon %0,5) jelleşme çözeltisine ekleyin, 2-3 saniye girdap bırakın ve nemli odanın parafilmine 2 damla 35 μL yükleyin.
      6. Her damlayı örtü slip ile örtün, hücreler jelleşme çözeltisine bakacak şekilde örtün.
      7. Jelin nüfuz etmesini sağlamak için 5 dakika buzda kuluçka yapın.
      8. 37 °C'de 30-60 dakika kuluçka yapın.
   3. Denatürasyon
      1. Jeli biyopsi delme aleti ile (0,4 cm çapında, Şekil 2D) delin ve 1 mL denaturasyon tamponu ile dolu 6 kuyruklu bir plakaya 10/15 dakika boyunca karıştırın, jeller kapak kaymalarından ayrılana kadar.
      2. Jeli, taze denatürasyon tamponu ile doldurulmuş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      3. 95 °C'de 1 saat 30 kuluçka yapın.
      4. Jeli ddH₂O ile 10 dakika geçirin ve denaturasyon tamponunu düzgünce yıkamak için 3 kez tekrarlayın.
      5. Jel genleşme faktörünü değerlendirmek için jeli milimetre kağıdı veya kaliper ile ölçün.
      6. Jeli immünboyama için PBS'ye aktarın.
      7. Alternatif olarak, jelleri PBS-azide %0,02 içinde 4 °C'de kısa bir süre (Tablo 1) veya daha uzun süre saklamak için -20°C'de (Tablo 1) depolayabilirsiniz. Uzun süre depolama için jeller birkaç su banyosunda kuluçka içindedir: gliserol %50 çözeltisi 2-3 saat çalkalama altında ve -20 °C'de yeterli bir çözelti hacmine konur; bu çözelti jel boyutuna uyarlanmalıdır.
         NOT: Tercih edilirse jel tam tutulabilir (Şekil 2D, E) (adım 2.2.3.1). Bir tüpte en fazla 5 punch (tüm bir jele eşdeğer) toplanabilir (adım 2.2.3.2). Denatürasyon sıcaklığı ve süresine saygı gösterilmelidir (adım 2.2.3.3). Yüksek ısı, tüplerin açılmasına neden olabilir, bu da denaturasyon tamponu buharlaşmasına ve/veya jelin dışarı atılmasına yol açabilir. Güvenli kilitli tüpler kullandığınızdan veya onları kapattığınızdan emin olun. Denatürasyondan sonra jelin yıkanması damıtılmış suda yapılmalıdır çünkü PBS SDS çökelmesini tetikleyecek ve yıkamanın verimliliğini etkiler. Bu adım, jelin hafif bir genişlemesini tetikleyecek ve protokolün aşağıdaki adımları üzerinde hiçbir etkisi olmayacaktır (adım 2.2.3.4). Gliserol, büyük jellerde yer tasarrufu sağlamak için PBS ile seyreltilebilir. 0.4 mm punch için jeller ideal olarak 3 mL su olan gliserol, 12 kuyuyla dolu bir plakada saklanır.

3. İmmunboyama ve nihai genişleme

1. PBS banyosunu 15 dakikalık kuluçka için değiştirin.
2. Tüm jeli 4 eşit parçaya kesin.
3. Jel parçaları/delikleri uyarlanmış bir taşıyıcıya aktarın (Şekil 2D, E) ve PBS-BSA %2 ile 3 saat boyunca bir gece boyunca çaltımarak birincil antikorlarla inkübe edin (ayrıntılı koşullar için Tablo 2 ve Tablo 3'e bakınız).
4. Jelleri 3 kez PBS+Tween 0.1% ile 10 dakika RT boyunca çaltımlayarak çalkalayın.
5. Jeli ikincil antikorlara ve Hoechst'e PBS-BSA %2 içinde 3 saat ile gece boyunca kışkırtma ile inkübe edin (ayrıntılı koşullar için Tablo 2 ve Tablo 3'e bakınız).
6. PBS+Tween 0.1% ile 3 kez jel ile 10 dakika RT süreyle çaltım.
7. İsteğe bağlı: Tüm proteomun pan-etiketlenmesi yapılarak jelin NHS-ester ile inkübe edilmesiyle ( ayrıntılar için Tablo 2'ye bakınız) PBS'de RT altındaki 1 saat 30 boyunca çaltlama altında yapılması, ardından PBS+Tween 0.1% ile 10 dakika boyunca 3 kez yıkanın.
8. Jeli uyarlanmış bir taşıyıcıya aktarın ve damıtılmış suda (ddH₂O) kuluçka yoluyla jel genleşmesine devam edin.
   NOT: Antikor yıkamalarında kullanılan deterjan konsantrasyonu ve türü (Tween, Triton-X100, Saponin) biyolojik örneklere uyarlanabilir. Suyu birkaç kez değiştirmek, tam genleşmeyi engelleyen tuz izlerini ortadan kaldırmak için çok önemlidir.

4. Montaj ve görüntüleme

1. Kaplama örtü örtülerini poli-lizinle (bkz. bölüm 1.1) yaklaşık 200 μL poli-lizinle kapatarak, RT'de 1 saat kuluçka içinde ve fazla poli-lizini çıkarmak için ddH₂O ile 3 kez yıkanarak örtü örtülüyor. Kapak örtülerini kurutsun ve 4°C'de kullanana kadar sakla.
2. Genişletilmiş jelleri, görüntüleme odasındaki kaplamasız kapak kapaklarına yerleştirerek örneklerin yönünü floresan mikroskobu kullanarak kontrol edin.
3. Yönlendirildikten sonra, fazla suyu çıkarmak için tüy içermeyen bir kağıda kuru jeller uygulayın ve poli-lizin kaplı örtüklere monte edin (protokol için adım 1.1'e bakınız).
4. Örnekleri ters mikroskopla gözlemleyin.

Sonuçlar

Bu makale, iki farklı örnek türü üzerinde kriyofiksasyonun genleşme mikroskobu ile birleştirilmesinin sonuçlarını vurgulamaktadır: kültürlenmiş memeli hücreleri ve T. brucei parazitleri. Her iki örnek de genleşme ve immünboyamadan önce ya kriyo-sabitlenmiş ya da kimyasal olarak %4 PFA'da sabitlenmiştir. Diğer kimyasal fiksasiyonların belirli organeller (örneğin metanol veya glutaraldehit gibi) için daha uygun olabileceğini ve sadelik için kriyofiksasyonla karşılaştırmak üzere sadece yaygın bir kimyasal fiksasyon olan PFA'nın seçildiğini unutmayın.

İnsan RPE1 (retinal pigment epitel hücreleri) mikrotübullar, mitokondriler ve çekirdekleri görselleştirmek için αβ-tubulin, ATP5a ve Hoechst için boyandı. Ayrıca, jeller genleşmeden önce floresan NHS-ester ile inkübe edildi; bu boya serbest amin gruplarıyla reaksiyona girerek tüm hücresel proteomu boyanıyordu. Kriyofiksasyonun kimyasal fiksasyona kıyasla çeşitli avantajlarını gözlemleyebildik, zaten^{gösterildiği gibi 23}. En dikkat çekici özellik, kriyofiksasyonun mitokondriyal ağı mükemmel şekilde korumasıydı; hem NHS-ester hem de ATP sentaz alt birimi alfa'ya (ATP5a) karşı spesifik antikorlar kullanılarak görülebilir (Şekil 3A,B). Ayrıca, ATP5a iç mitokondriyal membranda lokalize olduğundan, kriyofiksasyon kullanarak mitokondriyal kristaları çözebiliriz (Şekil 3B"). Buna karşılık, PFA fiksasyonu mitokondriyal ağın korunmasına izin vermedi ve bu nedenle mitokondriyal kristalar bu durumda görünür değildi (Şekil 3C"). Her iki durumda da mikrotubulları boyadık ve kriyofiksasyonun sitoplazmik veya astral mikrotubullar gibi daha iyi dinamik mikrotubulları koruduğunu gösterdik (Şekil 3B-E). Ancak, centriol ve silia gibi stabil mikrotübullar, 9 katlı mikrotubullardan oluşan membran olmayan organeller, kriyo-sabit hücrelere kıyasla PFA-sabit hücrelerde eşit derecede korunmuş, hatta daha iyi (Şekil 3B',C'). Kriyofiksasyonun, hücresel proteinlerin bütünlüğünü koruması nedeniyle, centriollar/silialar gibi çok yoğun yapılara daha az uygulanabilir olabileceğini belirtmek önemlidir. Bu gözlem, kimyasal fiksasyonun sitoplazmik proteinlerin yuyulmalarını tetiklediği nükleer gözenekler gibi sert yapılarda da yapılmıştır; bu da nükleer gözenek yapılarının daha iyi gözlemlenmesine olanak^{tanır 23,32}. Son olarak, kriyofiksasyonun kimyasal fiksasyonun çapraz bağlama etkisini de aştığını gösterebiliriz; bu da mitotik iğnelerde gösterildiği gibi, genleşme kapasitesini olumsuz etkilemiştir; çünkü mitotik iğneler kriyo-sabit durumda PFA'ya göre neredeyse 2 kat daha genişlemişti (Şekil 3D,E).

Trypanosoma brucei hücreleri, benzersiz mitokondriyi görselleştirmek için TDH³⁴ (Şekil 4A-D) ve endoplazmik retikulumu vurgulamak için BiP³⁵ (Şekil 4E,F) için boyanmıştır. Ayrıca, jeller floresan NHS-ester ile boyandı. İnsan hücrelerinde gözlemlendiği gibi, kriyofiksasyon ve genişleme birleşikleri, özellikle bu iki membran yapıyı genel hücresel yapıyı (Şekil 4B,E) PFA fiksasyonuna kıyasla daha iyi korur (Şekil 4C,D,F). T. brucei'nin mikrotubul sitoskeleti, insan hücrelerinden daha sert ve kararlıdır; bu nedenle, PFA ile kriyofiksasyon arasında anlamlı bir fark gözlemlenmedi. Ayrıca, U-ExM tekniğinin çözünürlük sınırı, bireysel mikrotubulları ayırt etmemizi engeller (gösterilmemiştir).

Genel olarak, kriyofiksasyon, membranöz organellerin (mitokondriler, endoplazmik retikulum) ve dinamik sitoskelet elementlerinin (sitoplazmik veya astral mikrotubullar) korunması gibi klasik kimyasal fiksasyonun sınırlamalarını ele alır. Ayrıca, kriyofiksasyon proteinler arasında çapraz bağlantı oluşturmadığı için, özellikle sert ve yoğun yapılarda genleşme kapasitesini tam olarak korur.

Biyolojik örneklerin hücresel ultrayapısını korumak için kriyofiksasyon ve genişleme kalitesinin kontrolü gereklidir. Birçok hata kötü fiksasyona yol açabilir ve biyolojik örneklerde artefaktlar yaratabilir. Burada, en yaygın kriyo-fiksasyon dezavantajlarını ve kötü fiksasyonun sonuçlarını vurguluyoruz. Kriyofiksasyonla oluşan en belirgin artefakt, biyolojik örnek içinde çatlakların ortaya çıkmasıdır (Şekil 5A), bu da kriyo-elektron mikroskopisinde yaygındır. Bu çatlaklar, mitokondriler ve mikrotübullar için Şekil 5A'da gösterildiği gibi organellerin içsel ultra-yapısını değiştirmese de, bu çatlakların biyolojik öneminin yanlış yorumlanmasına yol açabilir ve dikkatli değerlendirilmesi gerekir. Manipülasyon sorunları ile bu çatlakların görünümü/bolluğu arasında özel bir korelasyon yoktur.

Zayıf fiksasyonun bir göstergesi, hücre sitoplazması içinde buz kristallerinin varlığını gösteren "baloncuk benzeri yapılar"ın ortaya çıkmasıdır. Bu yapılar özellikle NHS-ester boyamasında görünür (Şekil 5B). Genellikle bu özelliklere göre dalgalı şekilli mikrotübullar gibi sitoskelet elementlerinin sınırlı korunması (Şekil 5B) ve membranöz organellerin (mitokondriler, Şekil 5B'de) çok kötü korunması ile birlikte gelir. Bu özellikler, (i) uygunsuz etan hacmi ve/veya sıcaklık (protokolden 2.2.4-2.2.6 adımları), (ii) biyolojik numunenin kademeli olmayan ısıtılması (protokolden 2.3 ve 2.4. adımlar) ve (iii) dondurma yerine çözümde safsızlıkların bulunmasından (protokolden 2.2.1) kaynaklanabilir. %38 sodyum akrilatın kullanılabilir (renksiz ve saydam [1]) veya hafif sarı ve saydam [2]) veya genişleme için kullanılamaz (sarı/turuncu ve bulutlu [3]) yönünü vurgulayan sodyum akrilat çözeltilerinin temsil edici görüntüleri Şekil 5C'de gösterilmiştir.

Şekil 1 Cryo-ExM iş akışı. (A) Canlı hücreler (insan hücreleri veya T. brucei) -180 °C'de sıvı etana daldırarak ve kuru buz üzerinde donmuş asetonda kuluçka ile inkübe edilir. Donma ikame, kuru buz üzerinde kuluçka yoluyla sıcaklığın -180 °C'den -80 °C'ye sürekli ve yavaş yükseltilmesiyle gerçekleştirilir; bu durum aseton sıvılaştırmasını tetikler (-96 °C), ardından -80 °C'den -20 °C'ye kuru buz olmadan kuluçka yoluyla yapılır. Rehidrasyon, etanolün ardışık banyoları ile hilal şeklinde damıtılmış su karışımı ve -20 °C'den oda sıcaklığına kadar sürekli bir artışla gerçekleştirilir. (B) Rehidratlanmış örnekler daha sonra aşağıdaki şekilde genleşmek üzere ilerler: Örnekler, 37 °C'de akrilamid karışımı formaldehit (AA/FA) içinde inkübe edilir; bu karışım proteinlerin akrilamid, bis-akrilamid ve sodyum akrilattan (AA/BIS/SA) oluşan şişebilir polimere sabitlenmesine olanak tanır; bu polimer jele genleşme özelliği kazandırır. Örnekler, protein-protein etkileşiminin destabilizasyonu ve hafif denatürasyon yapmak için 95 °C sıcaklıkta NaCl/SDS'de kuluçka yapılır. Bu adım, izotropik genleşme için gereklidir. Örnekler daha sonra düzenli birincil ve ikincil antikorlarla immünbonize edilir ve sonunda damıtılmış suda genişletilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Cryo-plunging ve genişleme kurulumu. (A) Kriyo-piston silahlı pozisyonda (üst panel) ve aşağı pozisyonda (alt panel). Ok, dalma hareketini etkinleştirmek için PUSH tuşunu gösterir. (B) Kriyo-daldırmaya hazır olan ve dewarın çevresindeki köpüğün yüksekliğiyle gösterilen kriyo-fiksasyon için uygun sıvı azot (_{N 2}) seviyesini gösteren kriyo-daldırma kurulumu. Çıkarılabilir örümcek yıldızlarla gösterilir. (C) Coverslip'in tutulmasından kriyo-dalmanın temel adımlarının (üst sol), kapak kapaklarının sıvı etan dewar'daki konumunun (alt sol) ve dondurma yerine geçme için toplama tüpünün (sağda) gösterilmesi gösterildi. (D) İnsan örneklerinde immünboyama için 'jel delme' yönteminin illüstrasyonu. Kaplama kaplı polimerize jel (1), belirli bir biyopsi punch (P) kullanılarak kesilir ve 0,4 cm çapında bir jel punch (2) oluşur; bu delici silikonlu plaka (sağ panellerde) boyanarak antikor miktarını azaltabilir. (E) İnsan ve T. brucei örneklerinde immünboyama için 'jel kesme' yönteminin illüstrasyonu. Polimerize ve denatüre jeller (1) 4 eşit parçaya (2) bölünür ve antikorlarla birlikte 12 kuyuyla bir plakada inkubasyon yapılmasına izin verilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. İnsan hücrelerinde kriyo-fiksasyon ve PFA-fiksasyonun karşılaştırılması. (A) αβ-tubulinler (sian), mitokondriyal ATP sintaza alt birimi 5a (ATP5a, sarı) ve NHS-ester (kırmızı/gri) için boyanmış kriyo-sabitlenmiş ve genişletilmiş RPE1 hücrelerinin dönen disk görüntüsü; hem membran bazlı organellerin hem de sitoskelet elementlerinin, centriollar ve kirpikler (ok uçları) dahil olmak üzere mükemmel korunduğunu gösterir. Ölçek çubuğu: 10 μm. (B, C) Kriyo-sabit (B) ve PFA-sabitli (C) RPE1 hücresinin dönen disk görüntüsü, αβ-tubulinler (siyanen), mitokondriyal ATP5a (sarı) ve Hoechst (magenta) için boyanmış, birincil silium (oklar, B', C') ve mitokondriler (B", C") vurgulanır. Kriyo- ve PFA-fiksasyonları sentriolleri ve birincil kirpikleri eşit şekilde korursa, kriyofiksasyon mitokondriyal yapı koruması açısından PFA'yı büyük ölçüde geçer (B", C"- kırmızı ok uçları, sadece kriyo-sabit koşullarda görülen mitokondriyal kristaları gösterir). Ölçek çubukları: sırasıyla 1, 1 ve 2,5 μm. (D,E) Kriyo-sabit (D) ve PFA-sabitli (E) mitotik RPE1 hücrelerinin sarı/gri boyanmış spinning disk görüntüsü, mitokondriyal ATP5a (magenta) ve Hoechst (BOP mavi) için boyanmış olup, kriyofiksasyonun mitotik mil (kırmızı ok uçları) daha iyi genişlemesini ve daha iyi mitotik mil mikrotubullarının korunmasını (kırmızı oklar) sağladığını göstermektedir. Mitotik mil uzunluğunun ölçümleri: sırasıyla kriyo-fiksasyon ve PFA-fiksasyon için 12 μm ve 7 μm. Ölçek çubukları: 10 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4. Trypanosoma brucei'de Cryo-fiksasyon ve PFA fiksasyonunun karşılaştırılması. (A, B) Mitokondriyal treonin dehidrojenaz (TDH, sarı) ve NHS-ester (kırmızı/gri) için boyanmış kriyo-sabitlenmiş ve genişletilmiş T. brucei prosiklik hücrelerinin konfokal görüntüleri; bu görüntüler, benzersiz mitokondriyi ve hücrenin genel mimarisini mükemmel şekilde korumayı göstermektedir. Ölçek çubukları: 5 μm. (C, D) PFA-sabit ve genişletilmiş T. brucei prosiklik hücrelerinin konfokal görüntüsü, TDH (sarı) ve NHS-ester (kırmızı/gri) için boyanmış. Mitokondriyal yapı koruması ve ağ karşılaştırıldığında, kriyofiksasyon PFA-fiksasyonundan daha iyi performans gösterir. Ölçek çubukları: 5 μm. (E, F) Endoplazmik retikulum belirteci BiP ve NHS-ester (gri) için boyanmış kriyo-fiksasyonun (E) ve PFA-sabitli (F) ve genişletilmiş T. brucei prosiklik hücrelerinin konfokal görüntüleri, kriyofiksasyonun endoplazmik retikulumun daha iyi genişlemesi ve korunmasına olanak sağladığını göstermektedir. Ölçek çubukları: 5 μm. Bu figürün daha büyük versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5. Kriyofiksasyon sorunları. (A,B) αβ-tubulinler (siyanen), mitokondriyal ATP sendaz alt birimi 5a (ATP5a, sarı) ve NHS-ester (kırmızı) için boyanmış kriyo-sabit ve genişletilmiş RPE1'in dönen disk görüntüleri; kriyofiksasyonun klasik etkilerini gösteriyor: çatlaklar (A, oklar) ve kabarcıklar (B, ok). Çatlaklar organellerin ultrayapılarını (A) etkilemese de, sitoplazmada (B) kabarcıkların varlığı kötü fiksasyonun göstergesidir ve subhücre organellerinin (mitokondriler ve mikrotubullar, insetler) korunmasını önemli ölçüde değiştirir. Ölçek çubukları: 5 μm ve 2 μm (insetler). (C) %38 sodyum akrilatın kullanılabilir yönünü (renksiz ve saydam (1) veya hafif sarı ve saydam (2) veya genişleme için kullanılamaz (sarı/turuncu ve bulutlu (3)) farklı sodyum akrilat çözeltilerini gösteren bir fotoğraf. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Çözüm depolama koşulları Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Antikor Listesi Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: İmmünboya Durumları Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu makalede, kriyofiksasyonu genişleme mikroskobu (Cryo-ExM) ile bütünleştiren ayrıntılı bir protokol sunuyoruz; bu protokol, kimyasal fiksasyonla ilişkili yapısal bozulma ve antijen kaybı gibi yaygın olarak ilişkilendirilen artefaktlardan kaçınırken hücrealtı bölmeleri görselleştirmek için sağlam bir yaklaşım sunuyor. Hücresel mimariyi neredeyse doğal bir durumda koruyarak, Cryo-ExM kapsamlı fiksasyon optimizasyonuna olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve daha doğru protein lokalizasyonu sağlar.

Protokol genellikle basit olsa da, başarılı sonuçlar için birkaç kritik adım özel dikkat gerektirir. Kriyo-daldırma adımı özellikle hassastır; çünkü hem belirli malzemeler (bkz. Malzemeler Tablosu) hem de özellikle sıvı etan dolgusu kullanırken bir beceri seviyesi gerektirir; bu da potansiyel bir tuzak oluşturur. Kriyofiksasyon teknikleri hakkında önceden bilgi edinmek avantajlıdır; Bu yöntemi ilk uygularken bir kriyo-EM uzmanı veya elektron mikroskopi tesis yöneticisine danışmanızı öneririz. Genişleme aşamasında, denatürasyon koşullarına sıkı sıkıya uyulmak önemlidir; çünkü sapmalar hem örnek korunmasını hem de genleşme verimliliğini tehlikeye atabilir. Son olarak, tüm reaktifler için uygun depolama koşullarını korumak ( bkz. Tablo 1), tekrarlanabilirlik ve tutarlı görüntüleme kalitesi için kritik öneme sahiptir.

Bu makale, Cryo-ExM protokolünün birkaç temel avantajını vurgulamaktadır. Özellikle, kriyofiksasyon çözünür proteinlerin kaybını en aza indirir (bu, geleneksel fiksasyon yöntemlerinin yaygın bir sınırlamasıdır) ve membran bütünlüğünü daha iyi korur ve böylece hücresel görüntülemenin isayetini artırır. Bu tekniğin en büyük gücü standart geniş alan ve konfokal mikroskoplarla uyumluluğudur. Özel ve genellikle pahalı ekipman gerektiren birçok süper çözünürlüklü yöntemin aksine, ExM geleneksel floresan mikroskopları kullanılarak uygulanabilir. ExM'in bir diğer önemli avantajı ise çok yönlülüğüdür. Bu teknik, bireysel hücrelerden karmaşık dokulara kadar çok çeşitli biyolojik örneklerde başarıyla uygulanmış ve çeşitli araştırma alanlarında geniş uygulanabilirliğini göstermiştir. Bu makale, bu protokolün iki çok farklı model sistemiyle uyumluluğunu özellikle vurgular: T. brucei ve insan hücreleri, ancak daha büyük veya daha karmaşık bir örnek için yüksek basınçlı dondurma gerektireceğini belirtmek gerekir çünkü manuel daldırma tüm örneği korumak için yeterli^{değildir 24,25,30}. Genişleme mikroskobi, daha önce çözülmesi zor veya imkansız olan nano ölçekli hücresel yapıların görselleştirilmesini devrim niteliğinde değiştirdi ve hücre biyolojisi, gelişim biyolojisi ve sinirbilim gibi alanlarda atılımlar yapılmasını^sağladı. Özellikle, bu yöntem geleneksel ışık mikroskopisinin sıklıkla eksik kaldığı parazitolojide dönüştürücü olmuştur. Birçok parazit için ultrastruktur genleşme mikroskopisi (U-ExM), apikoplast, konoid ve sitoskelet elemanlar gibi karmaşık organellerin eşi benzeri görülmemiş netlikle yüksek çözünürlüklü görüntülemesini mümkün kılan bir oyun değiştirici^{olduğunu kanıtlamıştır 6,37,38}. Bu gelişmeler, U-ExM'in daha önce erişilemeyen yapısal detayları ortaya çıkarma gücünü gösteriyor; hücre biyolojisi, sinirbilim ve parazit biyolojisinde yeni keşif yolları açıyor ve potansiyel terapötik hedeflerin aramasına yardımcı oluyor. Ayrıca, ExM, yaygın olarak kullanılan immünoflüoresans antikorlarla uyumludur ve bu da mevcut iş akışlarına entegrasyonunu kolaylaştırır. Çoğu durumda, floresan mikroskopisi veya western blotting için rutin olarak kullanılan antikorlar, genişletilmiş örneklerde etkili performans gösterir ve özel reaktiflere ihtiyaç ortadan kalkar. Bu erişilebilirlik, Cryo-ExM'i birçok biyolojik araştırma laboratuvarı için cazip bir seçenek haline getirir; gelişmiş görüntüleme sistemlerine özgü maliyet veya karmaşıklık olmadan yüksek çözünürlüklü görüntüleme sunar.

Avantajlarına rağmen, ExM'in bazı sınırlamaları vardır. Büyük bir dezavantaj, özellikle sınırlı sayıda bulunan ev yapımı antikorlar için maliyetli veya sorunlu olabilecek yoğun antikor tüketimidir. İşte bu protokol stratejisini immünboyama için kullanılan antikor hacmini azaltmak amacıyla öneriyoruz (Şekil 2D,E). Genişleme süreci ayrıca numunenin kalınlığını artırır; bu da standart mikroskop hedeflerinin çalışma mesafesi sınırlamaları nedeniyle daha derin yapıların görselleştirilme yeteneğini etkileyebilir. Bu sınırlama, daha büyük ve kalın örnekler incelendiğinde özellikle zor olabilir; çünkü daha derin bölgeler geleneksel mikroskoplarla etkili şekilde görüntülenemeyebilir. Ayrıca, doku genişlemesi bazen mekanik bozulmalara yol açabilir ve doğru mekansal temsilleri sağlamak için dikkatli doğrulama ve düzeltme adımları gerektirir. Son olarak, klasik ExM kesinlikle örnek fiksasyonuna bağlıdır; bu da biyolojik örneklerden veya subhücre yapısına göre gözlem yapılabilir. Centrioller ve silialar önceden fiksasyon olmadan genişlenebilecek kadar stabil olsa da, hücresel organeller farklı türde kimyasal fiksasyon (PFA, metanol, glutaraldehit) gerektirir; bu da artefaktlar oluşturabilir ve birkaç hücresel yapının birlikte gözlemlenmesini engelleyebilir. Son olarak, ExM, Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopisi (SIM)³⁹, Uyarılı Emisyon Azalma Mikroskopisi (STED⁾⁴⁰, Doğrudan Stokastik Optik Yeniden Yapılandırma Mikroskopisi (dSTORM⁾⁴¹ ve daha yakın zamanda ışık tabakası^{mikroskopisi 42} gibi çeşitli süper çözünürlüklü görüntüleme yöntemleriyle uyumlu olduğundan, bu çalışmada tanımlanan yaklaşım, hücresel yapıları yüksek hassasiyetle incelemek için çok yönlü bir araç sağlar. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, kriyofiksasyonu yinelemeli genleşme^{mikroskopisi 32} ile birleştirerek, hücrenin doğal durumunu mümkün olduğunca koruyarak çözünürlük sınırlarını daha da zorladı.

Bu gelişmiş görüntüleme tekniklerinin hücreleri doğal hallerinde yakalamasını mümkün kılarak, Cryo-ExM gelecekte karmaşık hücresel süreçlerin görülmemiş netlikle çalışmalarına yol açıyor. Bu yaklaşım ayrıca korelasyon ışık ve elektron mikroskopisi (CLEM) için yeni olanaklar açarak çoklu modal görüntüleme potansiyelini daha da artırır.

Sonuç olarak, ExM, çeşitli biyolojik örneklerde geniş uygulanabilirliğe sahip güçlü bir süper çözünürlüklü görüntüleme aracıdır. Standart mikroskoplarla uyumluluğu, örnek tiplerindeki çok yönlülüğü ve nispeten basit uygulaması, birçok laboratuvar için cazip bir tercih haline getirir. Teknikteki ilerlemelerle birlikte, çözünürlük, antikor kullanımı ve örnek işlemede daha fazla iyileşme bekliyoruz; bu da yeteneklerini artıracak ve biyolojik uygulamalar için daha erişilebilir hale getirecek. Özellikle Cryo-ExM, hücresel yapıları olağanüstü detaylarla incelemeye olanak tanıyan ve doğal bütünlüklerini koruyan umut verici bir ilerleme olarak öne çıkıyor ve nihayetinde modern mikroskopinin sınırlarını zorlamaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
5ml tüp metalik tutucu	Dominique Dutscher	QB-E5	Dondurma yerine geçme adımı
620 Manuel Kriyo-Piston	RHOST	https://rhost-em.com/	Kriyofiksasyon adımı
Aseton %99,8 AcroSeal	Acros Organics	kedi. No. 67-64-1 	Dondurma yerine geçme adımı
Akrilamid, %40 (AA)	Sigma-Aldrich	A4058	Genişletme prosedürü  (çaplama)
Akrilik asit	Sigma-Aldrich	8.00181	Genişleme prosedürü (polimer)
Amonyum persülfat (APS)	Thermo Fisher	17874	Genişleme prosedürü (polimer)
Biyopsi punchu	Dominique Dutscher	PUK-40	Denaturasyondan önce jelin kesilmesi için gereklidir
BSA	Sigma-Aldrich	P1379	İmmünboyama
Hücre odası Attofluor	Invitrogen	A7816	Görüntüleme odası, görüntüleme için 24mm kapak kapaklarına uyarlanmış
Hücre odası	Hayat Tasarlama Hizmeti	10900	Görüntüleme odası, görüntüleme için 18mm örtülü kapaklara uyarlanmış
Kapak kaymaları 12 mm	Dominique Dutscher	100040	Büyüyen hücreler / T.brucei'nin bağlanması
Kapak kaymaları 24 mm	Dominique Dutscher	900547	Görüntüleme
Kapak kaymaları 18mm	VWR	631-0153	Görüntüleme
Ethane gaz	Linde Gaz	88888DE	Kryofiksasyon için gerekli
Formaldehit 36.5– %38 (FA)	Sigma-Aldrich	F8775	Genişletme prosedürü  (çaplama)
Glutaraldhehyde %25 (GA)	Sigma-Aldrich	G5882	Dondurma yerine geçme adımı
Gliserol	Euromedex	EU3550	Uzun vadeli jel depolama
Sıvı azot ve nbsp;	Linde Gaz	2200975	Kriyofiksasyon (sistemi soğutma) için gereklidir
Microtube clear-lock 5 ml	Dominique Dutscher	390932A	Dondurma ikamesi için gerekli
İğne 18G	Dominique Dutscher	050123B	Aseton toplamak için gerekli
N,N-metilbisakrilamid %2 (BIS)	Sigma-Aldrich	M1533, SIGMA	Genişleme prosedürü (polimer)
Paraformaldehit %16 (PFA)	EMS	kedi. No. 15710	Dondurma yerine geçme adımı
Poli-D-Lisin	Sigma-Aldrich	P1024	Örnek / görüntüleme ve görüntüleme için kaplama kapak kağıtları;
Poli-L-Lizin	Sigma-Aldrich	P1274	Örnek / görüntüleme ve görüntüleme için kaplama kapak kağıtları;
Basınç reduicer	Linde Gaz	CPLH0SJ-LIN224	Etan dağıtıcısına (kriyo-fiksasyon) olanak tanıyan basınç dağıdıcı
Seringe terumo 10 ml	Dominique Dutscher	50132	Aseton toplamak için gerekli
Silikon Elastomer kiti	Dow	4001834	Silyonlu kuyulu plakaların hazırlanması için kit (immünboyama) ve nbsp;
Sodyum Akrilat %97-99 (SA)	Sigma-Aldrich	408220	Genişleme prosedürü (polimer)
AK Scientific	R624	Genişleme prosedürü (polimer)
Sodyum dodesil sülfat	Euromedex	EU0660	Genişleme prosedürü (denatürasyon)
Tetrametilendiamin (TEMED)	Thermo Fisher	17919	Genişleme prosedürü (polimer)
Tubings	Termo Bilimsel	8060-0060	Etan dağıtımı (kriyofiksasyon) için tüpler
Tween-20	Euromedex	1005-7	İmmünboyama
Dumont cımbızları n° 5	FineScienceTools	11255-20	Coverslips 'nin manipülasyonu;