Yöntem makalesi

Kütle Spektrometrisi Temelli Laktilom ve Laktillenmiş Proteinlerin Doğrulaması

254 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68597

⸱

24 Nisan 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Cell Biology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Sherbrooke (CRCHUS), 3Institut de Recherche sur le Cancer de l'Université de Sherbrooke (IRCUS)

Bu makalede

Özet

Bu protokol, protein laktilasyonunu analiz etmek için özofagus skuamöz hücre karsinom hücre hatlarını örnek olarak kullanan bir yöntemi tanımlar. Süreç, hücre kültüründen adayların doğrulanmasına kadar protein laktilasyonunun analiz edilmesini içerir; laktilasyon tabanlı kütle spektrometrisi analizi ve immünopresipitasyonla doğrulama dahildir.

Özet

İlk olarak 2019 yılında tanımlanan laktilasyon, lizin kalıntıları üzerinde yeni bir translasyonel modifikasyon (PTM) olup, daha sonra birçok patoloji ve fizyolojik bağlamda ilgi çekici olduğu gösterilmiştir. İki izomer (L- ve D-laktilasyon) içerir ve hedef proteinlerin kompleks oluşumunu, hücresel lokalizasyonunu veya stabilitesini değiştirdiği bilinir. Bu protokol, hücre kültüründen potansiyel laktillenmiş hedeflerin doğrulanmasına kadar laktilasyonun analiz edilmesi için TE11 özofageal skuamoz hücre karsinom hücre hattı örnek olarak kullanılan bir yöntemi tanımlar. Aşağıdaki protokol, kütle spektrometrisi (MS) analizi için peptitlerin L-laktillisin (KL-LA)-spesifik immünopresipitasyonu (IP) yoluyla laktillenmiş proteinlerin tanımlanmasına dair ayrıntılar sağlayacaktır: (1) protein ekstraksiyonu, (2) protein indirgemesi, alkilasyon ve sindirim, (3) protein arıtması ve peptit konsantrasyonu, (4) KL-LA boncukları kullanılarak IP ve (5) KL-LA peptidleri konsantrasyonu. Bu adımların ardından, MS ham verilerinin analizleri yapılarak laktillenmiş bölgeler belirlenecek ve bu varsayılan laktillenmiş proteinlerin IP ile doğrulanması açıklanacaktır. Bu yöntemle 100 ila 500 arasında bir aralık peptid tanımlanabilir ve ilgi çekici laktile proteinler doğrulanabilir. Sonuç olarak, laktil proteinlerin incelenmesi, hem normal hem de hastalık koşullarında PTM kaynaklı hücre sinyalizasyonunu anlamamızı geliştirme potansiyeline sahiptir.

Giriş

Laktilasyon, glikolizden türetilen metabolitler kullanılarak lizin kalıntıları üzerinde yapılan post-translasyonel bir modifikasyon (PTM) olmasıdır. L-laktil-CoA ve laktoilglutation, sırasıyla 1,2 olan L-laktilasyon (KL-LA) ve D-laktilasyonun (KD-LA) substratlarıdır. L-laktilasyon, asetiltransferaz 3,4 gibi enzimleri içeren enzimatik bir süreçtir. Buna karşılık, D-laktilasyon, laktoilglutatyon ile lizin rekıntısı5 arasında nükleofil ikame yoluyla enzimatik olmayan bir süreçtir. Dinamik bir süreç olarak, HDAC1-3 gibi deasetilazlar,laktilasyonun 6'nın silgileri olarak rol oynamıştır. 2019'daki keşfindenbu yana, birçok patoloji ve fizyolojik bağlamda ilgi çekici olduğugösterilmiştir 2. Bu PTM, yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC)-tandem kütle spektrometrisi (MS/MS) analiziyle 72.021 Da kütle kayması gözlemlenerek histonlarda ilk keztanımlanmıştır. O zamandan beri, laktilasyon histonlar dışında diğer proteinlerde de tespit edilmiş olup, bağlam 7,8,9,10 bağlamına bağlı olarak modifiye edilmiş proteinlerin fonksiyonel çeşitliliğini, lokalizasyonunu veya stabilitesini etkilediği gösterilmiştir.

PTM'lerin genellikle düşükbollukta 11 olduğu ve dinamik, geçici birsürecin parçası olduğu göz önüne alındığında, araştırılan PTM'nin immünopresipitasyon (IP) ile zenginleştirilmesi gereklidir. Bunun ardından, MS, fosfoproteom veya ubiquitination profilleme11 gibi sindirilmiş peptitlerde PTM bağlantılı proteomları tanımlamak için sıkça kullanılır. Diğer PTM'ler, laktilom veya zenginleştirilmiş laktillenmiş peptidler gibi, MS tabanlı proteomikler yeni laktilasyon noktalarını tanımlamak için altın standart yöntemdir.

Bu protokol, MS tabanlı proteomik yoluyla KL-LA zenginleştirilmiş peptidlerin tanımlanmasını ve ardından laktillenmiş proteinlerin immünopresipitasyonla doğrulanmasını açıklar. Özofagus skuamöz hücreli karsinom (ESCC) hücre hatlarını örnek olarak kullanarak, laktillenmiş hedeflerin MS tabanlı tanımlanması ve ardından IP ile doğrulaması için laktillenmiş proteinlerin aşağı çekilmesini sağlayan bir protokolü açıklıyoruz.

Protokol

PTM'ler dinamik ve geçici bir süreç olduğundan, toplam laktilasyon seviyesinin optimal olduğu birleşme noktasını akış sitometrisi veya Western blotting ile anti-KL-LA antikoru kullanılarak önceden belirlemek önemlidir. Örneğin, laktilom ve IP deneyleri için ESCC hücre hatlarında %70-80 birleşme tercih edilir, çünkü toplam laktilasyon seviyesi en yüksek seviyededir. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hücre kültürü

  1. Daha önce belirtildiği gibi, gerekli birleşme noktasına ulaşana kadar 100 mm Petri kaplarında hücreler yetiştirin.
    NOT: Laktilomlar için 0,5-1 mg arasında protein veya IP için 2 mg'dan fazla protein elde edecek kadar hücre yetiştirin.
  2. Hücreleri 5 mL önceden soğutulan, 1x fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) ile durulayın.
  3. 500 μL önceden soğutulmuş PBS ekleyin ve hücreleri bir kazıyıcı ile hasat edin. 1 mL düşük bağlanan mikrotüpe aktarın.
  4. Santrifüj hücreleri oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 2.000 x g ile alın ve şeffaf süpernatantı atın. Hücre pelletleri -80 °C'de depolanabilir.

2. Laktilom

NOT: Numune kontaminasyonunu önlemek için her zaman eldivenle çalışın. Her zaman filtrelenmiş uçlar, düşük bağlayıcı mikrotüpler ve MS kalitesinde su kullanın.
NOT: Biyolojik kopyalamalar (bizim deneyimimizde 3-5 tane) her zaman gerçekleştirilmelidir, böylece belirlenen modifikasyonlar tekrarlanabilir olur.

  1. Protein ekstraksiyonu
    NOT: Buz üzerinde çalışın.
    1. Laktilom lizis tamponunu hazırlayın (Tablo 1) ve kullanmadan önce 4 °C'de sakla. Kullanımdan hemen önce proteaz inhibitörleri ekleyin.
    2. Proteinleri uygun hacimde lizin tamponu kullanarak çıkarın.
    3. Buz üzerinde 12 döngü, 5 saniye darbe + 5 saniye aralıklı aralıkta, %20-25 yoğunlukta sonikasyon yapın.
    4. 16.000 x g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Proteinleri içeren şeffaf üst tüpü yeni düşük bağlanan bir mikrotübe aktarın.
    5. Üreticinin önerisine göre bir Bicinchoninic asit (BCA) kiti kullanarak proteinleri niceliklerini ölçebilirsiniz.
      NOT: BCA kiti maksimum 3 M urea ile uyumludur. Bu nedenle, örnekler buna göre seyreltilmelidir.
    6. 500 μg'den 1 mg proteine yeni düşük bağlanma mikrotüplerine aktarın. Her örnek için aynı miktarda protein kullanın. Tüm örneklerin hacmini laktilom lizis tamponu ile aynı nihai hacme tamamlayın.
  2. İndüksiyon, alkilasyon ve enzimatik sindirim
    1. Ditiothreitol ekleyin, son konsantrasyon 5 mM'ye ekleyin. 95 °C'de 2 dakika kuluçka yapın.
    2. RT'de 30 dakika kuluçka yapın.
    3. Kloroasetamidi 7,5 mM nihai konsantrasyona ekleyin. RT'de karanlıkta 20 dakika kuluçka yapın.
    4. Üre'yi 8 M'den 2 M'ye düşürmek için örnek hacminin (adım 2.1.6'dan itibaren) 3 katı 1 M (NH4)2CO3 ekleyin.
      NOT: Toplam hacim mikrotüplerin kapasitesini aşarsa, iki mikrotübe bölünün.
    5. Her 100 μg protein başına 1 μg MS sınıfı tripsin ekleyin. 30 °C'de gece boyunca kuluçka yapın. Numune arıtmasına devam edin.
  3. Arıtma ve peptit konsantrasyonu
    NOT: RT'de çalışıyorum.
    1. Numuneyi %0,2 nihai konsantrasyona trifluoroasetik asit (TFA) ekleyerek asitleştirin.
    2. MS sınıfı suda taze olarak şu çözeltiler hazırlanır: %0,1 TFA, %1 formik asit (FA) ve %1 FA/%50 asetonitril.
    3. Arındırmaya devam etmek için C18 100 mg kolonları kullanın.
      NOT: Bu sütunu kullanmak için iki pipet ucu kullanın: birini sütuna yükleyin ve diğerinin ucunu keserek sıvıyı kolondan dışarı çıkarın. Kolonun sürekli ıslak kaldığından emin olun. Her örnek için bir sütun kullanın.
    4. Kolonu 1 mL %100 asetonitrile doldurun, ıslatıcı çözelti ve dışarı atın. İki kez tekrarlayın.
    5. Kolonu dengeleyerek %0,1 TFA doldurup eşart edin. İki kez tekrarlayın.
    6. Sütunu asitlenmiş numuneden 1 mL ile doldurun. Numunenin 10 döngüsünü yük/çıkarma döngüsüyle devam edin. Eğer kalan bir örnek varsa tekrarlayın.
    7. Kolonu 1 mL %0,1 TFA doldurarak yıkayın ve eplasman çıkarın. İki kez tekrarlayın.
    8. Elyusiyon için, 750 μL %1 FA/%50 asetonitril kullanarak 10 yük/fırlatma döngüsü ile devam edin. Yeni düşük bağlanma mikrotüpünde toplayın. Ek olarak %1/%50 asetonitrile eklenerek toplam 1,5 mL saflaştırılmış peptid ile tekrarlayın.
      NOT: Mikrotüpü kapağın üzerinde değil, yan tarafında belirleyin, böylece kapağadaki delikler açarken örnekleri kirletmenizi önleyin.
    9. Mikrotüplerin kapağındaki 1 ila 3 delikleri buharlaştırma için bir iğneyle delin.
    10. Vakum konsantratörü kullanarak, örnekleri 60 °C'de gerektiği kadar konsantre edin (1,5 mL nihai hacimdeki örnekler için bu en az 4 saat sürebilir). Sonra, peptidlerin immünopresipitasyonuna geçin.
  4. KL-LA boncukları kullanılarak immünopresipitasyon
    1. Yıkama tamponu ve laktilom IP tamponunu hazırlayın (Tablo 2).
    2. Buz üzerinde, konsantre peptitlere 200 μL IP tamponu ekleyin, iyice karıştırarak çözünene kadar yukarı aşağı karıştırın. Bazı çökelticiler hâlâ görünür olabilir.
    3. Çökeltmeleri çıkarmak için 12.000 x g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
      NOT: Santrifüjlemeden sonra, örnek, örneğin bir spektrofotometre kullanılarak peptit konsantrasyonunu 205 nm'de niceleştirerek kontrol adımı olarak dozlanabilir.
    4. KL-LA agaroz ile konjuge edilmiş boncukları 200 μL buz gibi soğuk 1x PBS ile 3 kez yıkayın; 2.000 x g sıcaklıkta 4 °C'de 1 dakika boyunca santrifüj yapın ve her yıkamadan sonra şeffaf üst yüzeyi çıkarın.
      NOT: Bu protokolün başında 1 mg protein için, daha önce kolay kullanım için 0.5 mL düşük bağlanma tüplerinde alkotte edilmiş 20 μL KL-LA agaroz konjugasyonlu boncuk kullanın.
    5. Yeniden süspansiyon edilen peptitleri içeren şeffaf süpernatantı önceden yıkanmış boncukları içeren 0,5 mL mikrotüpe aktarın. Sızıntıyı önlemek için tüpleri parafin filmiyle kapatın.
    6. Gece boyunca 4 °C'de nazikçe uçtan uca dönerek kuluçka yapın.
      NOT: 2.4.7-2.4.12 adımlarının tamamı 4 °C'de gerçekleştirilir.
    7. Boncukları 2.000 x g hassasiyetinde santrifüjle 1 dakika boyunca pellet edin. Şeffaf üst yüzeyi atın.
    8. 200 μL laktilom IP tamponu ekleyin ve tüpü ters çevirerek 15 saniye boyunca yıkayın. 2.000 x g hassasiyetinde 30 saniye santrifüj yapın ve şeffaf süpernatantı atın.
    9. 2.4.8 adımını bir kez tekrarlayın.
    10. 200 μL yıkama tamponu ekleyin ve tüpü ters çevirerek 15 saniye boyunca yıkayın. 2.000 x g ile 30 saniye santrifüj yapın ve şeffaf üst yüzeyi atın.
    11. 2.4.10 adımını iki kez tekrarlayın.
    12. 200 μL MS kalitesinde su ekleyin ve tüpü ters çevirerek 30 saniye boyunca yıkayın. 2.000 x g sıcaklıkta 1 dakika santrifüj yapın ve şeffaf süpernatantı atın.
      NOT: Laktilom protokolünün kalan adımları RT'de gerçekleştirilir.
    13. Bağlı peptitleri 100 μL elusyon tamponu (%0,1 taze hazırlanmış TFA) ile 1 dakika boyunca nazikçe uçtan uca dönerek RT pozisyonunda elütleyin. 2.000 x g ile 2 dakika boyunca santrifüj yapın.
    14. 2.4.13 adımını iki kez daha tekrarlayın ve elutları birleştirin. Örneklerin arıtmasına devam edin.
  5. KL-LA peptitlerinin konsantrasyonu ve saflaştırılması
    1. MS sınıfı taze suda şu çözeltileri hazırlayın: %0,1 TFA, %1 FA ve %1 FA/%50 asetonitrile.
      NOT: Arıtmaya başlamadan hemen önce, doğru miktarda çözeltiyi 1,5 mL mikrotüplerde hazırlayın (adım 2.5.3: %100 asetonitril 300 μL, 2.5.4. adım: %0.1 TFA 300 μL, 2.5.6. adım: %0,1 TFA 300 μL ve %1 FA/%50 %300 μL.
    2. Temizlemeye devam etmek için 100 μL C18 uçları kullanın.
      NOT: 100 μL C18 uçları, geleneksel pipet uçlarıyla aynı şekilde kullanılır. Başparmağı açık tutun ve kolonun ıslak kalması ve hava girmesini önlemek için adımlar arasında pistonu asla bırakmayın.
    3. 100 μL %100 asetonitrile olan ıslatıcı çözeltiyi aspire edin ve tüm sıvıyı dışarı atmadan dikkatlice dağıtın. İki kez tekrarlayın.
    4. Kolonu %0,1 TFA içeren 100 μL aspirasyon ile dengeleyin ve dikkatlice dağıtın. İki kez tekrarlayın.
    5. Sütunu 100 μL KL-LA peptid örneğiyle doldurun. Yeni düşük bağlanma mikrotüpte 10 yük/fırlatma döngüsü devam edin. Eğer kalan bir örnek varsa tekrarlayın.
    6. Kolonu 100 μL %0,1 TFA aspirasyonla yıkayın ve dağıtın. İki kez tekrarlayın.
    7. Yeni düşük bağlanma mikrotüpte 100 μL %1 FA/%50 asetonitril kullanarak elülasyon için 10 yük/fırlatma döngüsü devam edin. İki kez tekrarlayın ve elüatları birleştirin.
      NOT: Peptitlerin C18 ucuna bağlanması, ucun bir seferde 100 μL aspirasyon yapmasını engelleyebilir. Bu adımı, 2.5.7. adımda mikrotüpte sıvı kalana kadar (300 μL) tekrarlayın.
    8. Mikrotüplerin kapağındaki 1 ila 3 delikleri buharlaştırma için bir iğneyle delin.
      NOT: Delikleri delerken örneklerin kirlenmesini önlemek için mikrotüpleri kapakta değil, tüpün yan tarafında belirleyin.
    9. Vakum konsantratör kullanarak, örnekleri sıvının buharlaşması için gereken süre boyunca 60 °C'de konsantre edin (toplam 300 μL hacmde en az 2 saat sürebilir).
    10. Konsantre peptitleri %1 FA olan 30 μL içinde yeniden süspansiyona alın.
    11. Kütle spektrometrisi platformunuzun yönergelerini takip ederek, peptitleri 205 nm'de bir spektrofotometreyle nicelikten ölçerek konsantrasyonlarını belirleyin.
    12. Cam şişeye aktarın ve MS analizine kadar 4 °C'de kalın.

3. Yüksek Lisans analizi ve biyoinformatik

NOT: Örnekler, Sherbrooke Üniversitesi Proteomik Çekirdek Tesisi'nde bir kütle spektrometresi (MS) kullanılarak analiz edildi (Paralel Birikim-Seri Parçalanma (DDA-PASEF) modunda Veriye Bağımlı Toplama ile çalışmaktadır).

  1. Kütle spektrometrisi
    1. Her örnek için, yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) sistemine 375 ng peptid enjekte edilir.
    2. Peptitleri tuzak kolonuna 4 μL/dakika sabit akış hızıyla yükleyin.
    3. Analitik C18 kolonundaki peptitleri, %0,1 FA'da %5%-37 asetonitril oranında 2 saatlik gradyanı ile 400 nL/dakika akış hızında ayırın.
    4. Elektrosprey iyonizasyonu aşağıdaki ayarlarla gerçekleştirin: Kapiler voltaj: 1500 V, Kuru gaz: 3.0 L/d, Kuru sıcaklık: 180 °C, TIMS-in basıncı: 2.6 mBar.
    5. DDA oto-MS/MS modunu kullanarak 100-1700 m/z aralığında kütle spektrumlarını elde edin.
      NOT: Alet, 0'dan 5+ kadar yük durumlarını tespit edecek şekilde ayarlanmıştır. Çift Hapsedilmiş İyon Hareketlilik Spektrometrisi (TIMS) konfigürasyonu kullanılır; rampa süresi 100 ms ve her alım döngüsü başına 10 Paralel Birikim-Seri Parçalanma (PASEF) taraması yapılır; bu da 1,17 saniyelik bir görev döngüsü sağlar. Dinamik dışlama 0,4 dakika olarak ayarlanmıştır.
    6. Çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) enerjisi ile 20-59 eV arasında doğrusal olarak 0.6-1.6 Vs/cm² iyon hareketlilik aralığında artırılmış bir parçalanma gerçekleştirin.
      NOT: Hedef yoğunluk 20.000 olarak belirlenmiş ve yoğunluk eşiği 2.500'dür. Standart bir filtre poligonu, m/z-ion hareketlilik düzlemindeki +2, +3 ve +4 yüklü peptitler için diyagonal tarama çizgisi boyunca öncülleri önceliklendirmek için uygulanır.
  2. Veri ön işleme: MaxQuant analizi
    NOT: Sonraki adımlar, laktillenmiş peptitleri tanımlamak için MaxQuant v.2.6.713 yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir.
    1. Sağ üst bölümde Yapılandırma sekmesine tıklayın ve laktilasyonun bir değişiklik olarak eklendiğini doğrulayın.
    2. Eğer yoksa, Unimod.orgveritabanını 14 kullanın. Konuk olarak giriş yapın ve laktilasyon (erişim #2114) arasın.
    3. Ekle butonuna tıklayın. İsim'e Laktilasyon (K) yazın, Unimod'da yazılmış şekilde Değiştir butonuna tıklayarak kompozisyonu girin.
    4. Elde edilen monoizotopik kütlesi doğrulayın. OK tuşuna tıklayın.
    5. Ekranın sol üst köşesinde, mavi renkte, Değişiklikleri Kaydet butonuna tıklayın.
    6. Sol üst bölümde Ham veri üzerine tıklayın. Ham veri dosyalarını yükleyin ve kesirler yok butonu ile otomatik olarak adlandırın.
    7. Bilgisayarda erişilebilen çekirdek sayısına göre sol alt köşedeki iş parçacığı sayısını ayarlayın.
    8. Grup özel sekmesinde, mavi renginde Modifikasyonlar'a tıklayın.
    9. Laktilasyonu Değişken modifikasyonlarına ekleyin; ok butonuna tıklayarak sağdaki kareye ekleyin.
    10. Etiketsiz niceleme seçeneğine tıklayın. LFQ girin ve normalizasyon türünü sıfır olarak değiştirin.
    11. Sindirim üzerine tıklayın. Sağdaki karaya Tripsin/P'nin eklendiğinden emin olun.
    12. Laktilasyonun tripsin sindirimini etkileyebileceği için eksik kesilen dekolteleri 4'e çıkarın.
    13. Enstruman'a tıklayın. Ana arama peptid toleransını 20'ye değiştirin, laktilasyonun yaygın bir PTM olmadığını göz önünde bulundurarak.
    14. Sol üst bölümde Global parametrelere tıklayın. Karşılık gelen türler için daha önce Uniprot veya Ensembl'dan indirilmiş bir Fasta dosyası ekleyin.
    15. Fasta dosyasının doğru okunabildiğinden emin olmak için Tanımlayıcı kuralı ve Test üzerine tıklayın.
    16. Mavi renkte Protein niceliklendirme üzerine tıklayın. Sağdaki karaya Laktilasyonu ekleyin.
    17. Mavi Tanımlama seçeneğine tıklayın. FDR'yi 0.05'e değiştirin. İkinci peptitlerin ve koşular arasındaki eşleşmenin işaretlendiğinden emin olun.
    18. Mavi renkte Etiketsiz nicelik üzerine tıklayın. iBAQ ve Top3 kutularını kontrol edin.
    19. Sağ üst bölümde Performans'a tıklayın.
    20. Alt bölümde, mavi ile başlat'a tıklayın.
  3. Laktillenmiş proteinlerin tanımlanması
    NOT: MaxQuant çalıştırmasının sonunda, aşağıdaki gibi birden fazla çıktı dosyası elde edilir:
    • Laktilasyon (K)Sites: ilgi çekici birincil dosya - kesin bir peptid dizisinde laktillenmiş lizin kalıntıları hakkında siteye özgü bilgiler içerir (protein tanımlandı, laktilasyonun sırada lokalizasyonu, yoğunluklar, güven seviyesi).
    • Laktilasyon parametreleri: MaxQuant analizi sırasında kullanılan tüm ayarlar ve eşikler hakkında bilgi içerir.
    • Laktilasyon peptitleri: modifiye ve değiştirilmemiş tanımlanmış peptidler.
    • Laktilasyon protein grupları: tanımlanmış protein grupları ve bunların tespit edilen laktilasyonla bağlantısı.
    Bu dosyaların kullanımı araştırma sorusuna bağlı olacaktır. Bir sonraki adım, laktillenmiş bir sitenin nasıl tanımlanacağını açıklar.
    1. Excel'de Laktylasyon (K)Sites dosyasını açın.
    2. Orijinal veriyi korumak için alt Laktilasyon (K)Noktaları sekmesini çoğaltın.
    3. A'dan Z'ye Ters ve Potansiyel Kirletici sütunlarını sıralayın. Bazı satırlarda değer varsa, o satırları silin.
    4. Bu yeni sekmede sadece gerekli sütunları tutun, örneğin: (1) Protein: UniProt14 Birincil erişim numarası, (2) Proteinler içindeki konumlar: Laktilasyonun tahmin edilen konumu, daha sonra açıklandığı gibi doğrulamak önemli, (3) Protein isimleri, (4) Gen isimleri, (5) Laktilasyon sayısı (ilgili peptidde tespit edilen K), (6) Laktilasyon (K) olasılıkları (laktilasyon pozisyonunda 1 olasılığı), (7) Yoğunluk (İlgili peptide ait tüm bireysel yoğunlukların toplamı).
    5. Protein isimleri veya Gen adları gibi eksik değerleri tamamla.
    6. ''Proteinler'' sütununda sadece ilk erişim numarasını tutun. Elde edilen tablo, tespit edilen tüm laktillenmiş peptitleri ve bu peptidin bulunabileceği en olası proteini temsil eder.
      NOT: Laktilasyon bol miktarda bir PTM olmadığından, 100 ila 500 arasında peptidin laktillenmiş olarak tanımlanması beklenmektedir. Tespit edilen peptitler bir çoğaltmadan diğerine farklılık gösterdiğinden, en az 2 biyolojik çoğaltmada tespit edilmiş eşik belirlemek mümkündür.
    7. Değiştirilmiş kalıntının konumunu doğrulamak için, NIH15'ten BLAST veya UniProt16'dan Align gibi bir hizalama web aracı kullanın; bu araçta ''Laktilasyon (K) Olasılıkları'' sütunundaki peptid dizisi (olası herhangi bir olasılığı silin) ve UniProtveritabanı 17'den protein dizisi kullanılır.
      NOT: Tek bir protein dizisinde birden fazla laktilasyon bölgesi tespit edilebildiğinden, bu siteler aynı anda hizalanabilir. Bu ayrıca, protein dizisinde farklı peptitlerde bulunan ancak aynı konumda olabilecek çoğaltılmış siteleri de tespit etmeye yardımcı olacaktır.
    8. Veri analizi araştırma sorusuna bağlı olacaktır, ancak herhangi bir istatistiksel veri analizi yapmadan önce normalizasyon, merkezleme, ölçeklendirme ve log dönüşümü adımlarını dikkate almakgereklidir 18.
    9. MS analiziyle tanımlanan laktillenmiş proteinleri doğrulamak için immünopresipitasyon protokolüne devam edin.

4. İmmünopresipitasyon (IP)

  1. Protein ekstraksiyonu
    NOT: Buz üzerinde çalışın.
    1. IP lizi/yıkama tamponunu (Tablo 3) hazırlayın ve kullanmadan önce 4 °C'de saklayın. Proteaz inhibitörlerini hemen kullanmadan önce ekleyin.
      NOT: Numune hazırlığı için, -80 °C'de korunmuş bir hücre peleti kullanılabilir. Yeni hücrelerle çalışırsanız, 4.1.2 ve 4.1.3 adımlarını takip edin. Aksi takdirde, hücre pelletini 4.1.2. adımda belirtilen aynı IP lizisi/yıkama tamponu hacminde tekrar askıya alın ve 4.1.4 adımına devam edin.
    2. 1 mL IP lüz/yıkama tamponu ekleyin ve hücreleri 4 °C'de 10 dakika kuluçka edin.
    3. Hücreleri bir kazıyıcı kullanarak toplayın ve lizisi 1,5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın.
    4. 4 °C'de 30 dakika boyunca nazikçe uçtan uca döndürerek kuluçka yapın.
    5. 16.000 x g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
    6. Şeffaf süpernatantı yeni bir 1.5 mL mikrotübe aktarın.
    7. Üreticinin protokolüne göre bir BCA kitiyle proteini nicelikle ölçebilirsiniz.
  2. Boncukların önceden temizlenmesi ve KL-LA antikor kuluçkası
    NOT: Buz üzerinde çalışın. Her deneysel durum için, bir kontrol IP tüpü (KL-LA antikoruyla aynı türden IgG) ve KL-LA IP için bir tüp hazırlayın.
    1. 1 mg protein yeni bir 1.5 mL mikrotübe aktarın. Tüm örnekleri IP lizisi/yıkama tamponu kullanarak aynı son hacme tamamlayın.
      NOT: Bu protokol manyetik boncuklar veya agaroz boncuklar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Aşağıdaki adımlar için manyetik boncuklar kullanılmıştır.
    2. Gerekli boncuk hacmini yeni bir 1.5 mL mikrotüpe aktarın.
    3. Boncukları önceden yıkamak için, boncukları 30 saniye veya çözelti berrak olana kadar mıknatıslaştırın. Berrak üst tamponu atın. Boncukları 500 μL IP lizisi/yıkama tamponu ile 3 kez yıkayın. Her yıkamadan sonra şeffaf süpernatantı atın. İlk alınan boncukların hacmiyle aynı hacimde IP tamponu ekleyin.
    4. Protein örneklerini, önceden yıkanmış boncuklardan 10-15 μL ile 4 °C'de nazikçe uçtan uca döndürerek 20 dakika boyunca kuluçka yapın.
      NOT: 1 mg protein için 10-15 μL manyetik boncuk kullanın. Bu adım, immünopresipitasyon protokolü sırasında boncuklara spesifik olmayan protein bağlanmasını en aza indirir.
    5. Boncukları 30 saniye veya çözelti berrak olana kadar mıknatısla yapın. Berrak süpernatantı yeni bir 1,5 mL mikrotübe aktarın.
    6. Bir tüpte 1,5 μL anti-KL-LAantikoru ve diğer tüpte karşılık gelen miktarda IgG ekleyin.
      NOT: Bu protokolün başında 1 mg protein için 1,5 μg antikor kullanın.
    7. Örnekleri gece boyunca 4 °C'de nazikçe uçtan uca dönerek kuluçka edin.
  3. KL-LA immunoprecipitasyonu
    NOT: Buz üzerinde çalışın.
    1. IP lizi/yıkama tamponunu (Tablo 3) hazırlayın ve kullanmadan önce 4 °C'de saklayın. Proteaz inhibitörlerini hemen kullanmadan önce ekleyin.
    2. Boncukları 4.2.3. adımda tarif edildiği gibi önceden yıkayın.
      NOT: Bu protokolün başında 1 mg protein için 40 μL manyetik boncuk kullanın.
    3. Örnekleri 40 μL önceden yıkanmış manyetik boncuklarla 4 °C'de nazikçe uçtan uca dönerek 4 °C'de kuluçka edin.
    4. Boncukları 30 saniye veya çözelti berrak olana kadar mıknatıslaştırın. İlk berrak üst yüzeyi toplayın. Boncukları 500 μL IP analiz/yıkama tamponu ile 3 kez yıkayın. Her yıkamadan sonra şeffaf üst yüzeyi çıkarın.
      NOT: İlk üst yüzey ölçebilen western blotting (WB) için nicel olarak kullanılabilir. İmmünopresipitasyonun etkinliğini değerlendirmek için faydalıdır.
    5. Boncukları 20 μL 2x Laemmli ve %5 β-merkaptoetanol tamponu ile yeniden askıya alın.
    6. SDS-PAGE jeline yüklenmeden önce 95 °C'de 5 dakika kuluçka yapın. Alternatif olarak, denatüre edilmiş örnekler -20 °C'de birkaç hafta boyunca saklanabilir.
  4. WB tespiti
    1. IP tüplerini manyetik standa 30 saniye boyunca yerleştirin, sonra örneği toplayıp SDS-PAGE jeline yükleyin.
    2. İlgilenen proteine karşı bir antikor ve/veyaanti-K L-La antikoru kullanarak %5 sığır serum albümininde (BSA) laktillenmiş proteinlerin aşağı çekilmesini doğrulamak için WB işlemi yapıldı. İkincil antikorlar %5 BSA'da 1:5000 derecesinde seyreltildi.
    3. Bantları HRP tabanlı kemilyüminesans tespiti ile tespit edin.

Sonuçlar

Örneğin, özofagus skuamöz hücre karsinomi TE11 hücre hattı %80 birleşmeye ulaşana kadar kültürlendi. Şekil 1'de gösterilen iş akışı ve bu protokolde açıklanan MaxQuant analizi izlendikten sonra laktilom belirlendi. Bu hücrelerde, aynı protein üzerinde birden fazla bölge tespit edildiği için 82 benzersiz proteini temsil eden 137 potansiyel laktil peptid tespit edildi (Şekil 2A). Bunun benzersiz peptitleri hesaba katmadığını unutmayın. Bu deneylerde özofagus skuamöz hücre karsinomi hücre hatlarında 100 ila 500 arasında tanımlanan peptid sayısı beklenmektedir.

Tanımlanan laktillenmiş proteinler, literatürde laktillenmiş proteinlerde zenginleştiği olarak tanımlanan kromatin yeniden modellenmesi veya kromatin montajı gibi çeşitli biyolojik süreçlerle ilişkilidir (Şekil 2B). İlk tanımlanan laktillenmiş proteinlerden bazıları histonlardı ve bunlar da bu verilerde bulunabilir, örneğin Histon H1.2 (Tablo 4). Laktilasyon, aynı proteinden birkaç farklı lizin kalıntısında tanımlanabilir. Örneğin, Histon H1.2'de iki laktilasyon yeri tespit edilmiştir: lizin (K) 168 (muhtemelen) ve 191. İlk peptidde (Tablo 4, satır 2), K168 kalıntısının 1 üzerinde 0.733 ile laktillenmiş olma olasılığının daha yüksek olduğu gözlemlenmiştir; K169 ise sadece 0.267 olmaktadır. HNRNPA1, doğru modifiye kalıntıyı belirlemek için hizalanması gereken iyi bir peptid örneğidir.

Laktilom sonuçlarına (Tablo 4) dayanarak HNRNPA1 laktilasyonunu doğrulamak için, bu post-translasyonel modifikasyonu hedefleyen bir IP testi gerçekleştirildi. İlk olarak, hangi boncuk tipinin anti-KL-LAantikorla optimal etkileşim gösterdiğini belirlemek için G boncukları ve A/G boncukları karşılaştırıldı. KL-LA antikoru ile IP yapıldıktan ve ardından KL-LA'ya karşı WB uygulandıktan sonra, her iki boncuk tipinde de girdiye kıyasla KL-LA proteinlerinin görünür bir zenginleşmesi gözlemlendi (Şekil 3). Bu sonuçlar, laktillenmiş proteinlerin zenginleştirilmesinde protokolün verimliliğini ve sağlamlığını göstermektedir. Test edilen iki boncuk tipi arasında belirgin bir fark gözlemlenmedi. MS tarafından tanımlanan hedefleri doğrulamak için spesifik IP'ler doğrulanabilir. Örneğin, MS (Tablo 4) tarafından tanımlanan HNRNPA1'nin laktilasyonu kalibre edildi. KL-LA IP ve HNRNPA1 WB'den sonra HNRNPA1'ye karşılık gelen belirli bir bant tespit edildi; bu da HNRNPA1'nin laktilasyonla değiştirildiğini gösterir (Şekil 4). Hem G hem de A/G boncukları hedef proteini başarılı bir şekilde immünopresipit etmişken, A/G boncuklarında daha yoğun bir HNRNPA1 sinyali gözlemlenmiştir; bu da artan afinite veya iyileşme işareti verir.

figure-results-1
Şekil 1: Laktilom analizi için iş akışının genel özeti. Kısaltmalar: IP = İmmünopresipitasyon; KL-LA = L-laktillizin; LC-MS/MS = sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: TE11 hücrelerinin laktilomu için elde edilen bazı proteinler için temsil eden sonuçlar. (A) Tanımlanan toplam protein ve peptit sayısı. Aynı protein üzerinde birden fazla laktilasyon noktası tanımlanabilir. (B) TE11 hücrelerinde STRING veritabanı kullanılarak elde edilen laktillenmiş proteinler için zenginleştirilen ilk 5 biyolojik süreç. P-değeri, Benjamini-Hochberg kullanılarak çoklu testler için düzeltildi. Her çubuktaki sayı, bu Gen Ontolojisi'ndeki (GO) toplam protein sayısından laktillenmiş olarak tanımlanan ağdaki protein sayısını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: G veya A/G boncukları kullanılarak KL-LA'nın immünopresipitasyonu ve TE11 hücrelerinde Pan-KL-LA'nın WB tespiti. Pan-KL-LA tespiti, bu PTM'nin immünüspresipitasyonunun etkinliğini ve özelliğini doğrulamak için kritik bir kontrol görevi görür. Bu deney, IP'nin KL-LA modifikasyonunu barındıran proteinleri başarıyla zenginleştirmesini sağlar. (*), IP'de açıkça gözlemlendiği gibi antikorun ağır ve hafif zincirlerini gösterir: IgG şeritleri (kontrol IP) (N = 3). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: G veya A/G boncukları kullanılarak KL-LA'NIN immünopresipitasyonu ve WB tarafından HNRNPA1 tespiti. WB tarafından G veya A/G boncukları kullanılarakK L-LA-spesifik immünopresipitasyonlarda HNRNPA1 tespit edilmesi, TE11 hücrelerinde laktilasyonu doğrulamaktadır (N = 3). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

ÇözümSon yoğunlaşma
Urea8 M
Amonyum bikarbonat1 M
HEPES20 mM

Tablo 1: Laktilom lizis tamponu. MS kalitesinde suda hazırlanıyor ve pH 8'e ayarlanıyor.

Çözüm - Laktilom yıkama tamponuSon yoğunlaşma
NaCl100 mM
EDTA1 mM
Tris-HÇL20 mM
Lactylome IP buffer için addSon yoğunlaşma
NP-400.5%

Tablo 2: Laktilom yıkama tamponu ve IP tamponu. MS kalitesinde suda hazırlanır ve her iki çözelti için pH 8'e ayarlanır.

ÇözümSon yoğunlaşma
Sodyum klorür100 mM
Sodyum florür50 mM
Tris-HCl (pH 7.5)50 mM
β-gliserofosfat40 mM
EDTA (pH 8)5 mM
Gliserol5%
Triton X-1001%
Taze ekleyin:
Proteaz İnhibitörü Kokteyli 100X1X
PMSF1 mM
Ortovanadat0.2 mM

Tablo 3: IP lizisi/yıkama tamponu. Denaturantlardan arınmış olmalıdır, çünkü proteinler üzerindeki PTM'lerin varlığını istikrarsızlaştırabilir.

Proteinler içindeki konumlarProteinProtein isimleriGen isimleriLaktilasyon sayısı (K)Laktilasyon (K) olasılıklarıYoğunluk
168P16403Histon H1.2HIST1H1C1KPAAATVTK(0.733)K(0.267)1.98E+04
191P16403Histon H1.2HIST1H1C1SAAK(1)AVKPK6.91E+04
51A8K2U0Alfa-2-makroglobulin benzeri protein 1A2ML11VCLDLSPGYSDVK(1)3.18E+04
5; 5; 5C9JMM0Kromobox protein homologu 3CBX31ASNK(1)TTLQK1.21E+05
10; 10; 10C9JMM0Kromobox protein homologu 3CBX31TTLQK(0.828)MGK(0.172)2.49E+05
112; 141O76095-2Protein JTBJTB2K(0.858)ALEK(0.18)VRK(0.962)1.47E+04
350; 298; 298; 297; 285; 245;
253; 169; 48; 100; 95; 93; 79;
23; 93; 92; 79; 28; 74; 50; 73;
51; 57; 56; 48; 61; 66; 66; 73		P09651Heterojen nükleer ribonükleoprotein A1HNRNPA11SSGPYGGGGQYFAK(1)PR6.13E+04

Tablo 4: TE11 özofagus skuamöz hücre karsinom hücre hattı için elde edilen laktillenmiş peptitler için temsil edilen sonuçlar. Bu tablo, MaxQuant analizi sonrası elde edilmiştir.

Tartışma

Bu protokol, MS'de KL-LA modifiye proteinlerin immünopresipitasyonunun yeni laktillenmiş proteinleri ve laktilasyon noktalarını keşfetmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar. Bu laktilom protokolü konjuge boncuklar kullanılarak yapılır, ancak araştırma sorusuna göre KL-LA antikor veya hatta KD-LA antikoru kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Eğer bir antikor yerine konjuge boncuklar kullanılırsa, poliklonal antikor seçilmek daha sıkı komplekslerin oluşumunu kolaylaştırır çünkü birden fazla epitopa bağlanabilir; ancak bu yaklaşım değişkenlik getirebilir. Konjuge boncukların kullanımının bir avantajı, antikorun katı destekten salınmasını engellemesidir ve bu da MS örneklerini kirletebilir. Ayrıca, konjuge olmayan bir antikor kullanmaktan daha zaman tasarrufludur.

Ayrıca, bu tür analizlerde tanımlanan peptidlerin miktarının birden fazla faktör tarafındanetkilenebileceğini belirtmek önemlidir 1. Birincisi, antikor özgüllüğü doğru proteinin yakalanmasını sağlamada kritik bir rol oynar. Agaroz boncuklarıyla önceden temizleme adımı eklemek, spesifik olmayan etkileşimleri ortadan kaldırmanın bir yolu olabilir. Öte yandan, laktilasyonun tripsin sindirimini etkileyip etkilemediği bilinmemektedir; çünkü arginin kalıntısının c-terminal tarafındaki peptitleri parçalar, ancak en önemlisi lizin kalıntısıdır. Eğer durum buysa, potansiyel olarak peptid kapsayışının azalmasına yol açabilir. Bu nedenle, proteazlar için başka seçenekler de değerlendirilebilir. Bu protokolde, ''Max. kaçırılmış bölünmeler'' parametresi bu sınırlamayı dikkate almak için artırılmıştır. Son olarak, örneğin örneklerin deriden keratinlerle kontaminlenmesini önlemek için eldiven kullanımı veya PTM değişimi dinamik ve bazen hızlı bir süreç olduğu için modifikasyon kararlılığı gibi örnek hazırlama ve işleme de göz önündebulundurulmalıdır.

Daha geniş MS yaklaşımının aksine, laktilasyon gibi düşük bolluklu PTM'nin düşük tespit edilmesine yol açarken, MS tabanlı proteomiklerle zenginleştirilmişK L-LA peptitlerinin tanımlanması, yeni karakterize edilen laktilasyon ve laktillenmişproteinlerin 19 tanımlanması gibi ayrıntılı PTM sitesi analizini mümkün kılar. Western blot, hücrelerde bulunan genel laktilasyon desenine dair bilgi sağlayabilir, ancak protein-spesifik laktilasyon hakkında bilgi vermez. Bu nedenle, IP, MS tespit edilenPTM 20'yi doğrulamak için yaygın kullanılan yaklaşımdır. Yakınlık ligasyon testi (PLA), proteomik21 tarafından belirlenen potansiyel hedeflerin laktilasyonunu doğrulamak için kullanılabilecek başka bir tekniktir. Bu teknik, değiştirilmiş proteinlerin lokalizasyonunu da gösterebilir, ancak daha düşük spesifikliğe sahiptir. Laktilasyona özgü IP yaklaşımı geniş bir PTM taraması için uygundur, ancak araştırma sorusuna bağlı olarak proteine özgü IP yapmak ilginç olabilir.

Toplam protein ekstraktındaki belirli laktillenmiş proteinin oranını nicelleştirirken, tek başına IP yapmak yeterli değildir. KL-LA boncukları kullanılarak IP, laktillenmiş proteinlerin yakalanmasına olanak tanırken, laktilasyonun oranını doğru şekilde ölçemez, çünkü bu sadece hedef proteinleri zenginleştirmekle sınırlıdır. Bu nedenle, laktilasyonun hassas nicel ölçümüne olanak tanıyan daha ayrıntılı bir analiz sunan kütle spektrometrisi gereklidir. Böylece, potansiyel olarak laktillenmiş bir proteinin antikoru kullanılarak IP yapılması ve ardından kütle spektrometrisi analizi, toplam protein örneğindeki laktillenmiş proteinlerin yüzdesini belirleyebilirken, IP uygulama, MS tarafından laktillenmiş olarak tanımlanan proteinlerin laktilasyonunu doğrulamak için etkili bir yaklaşımdır.

Konjuge olmayan antikorlar kullanan bir IP'de, laktillenmiş proteinlerin optimal yakalanmasını sağlamak için boncuk-antikor oranının optimize edilmesi şarttır. Gerçekten de, bu iki bileşen arasındaki denge IP'nin özgüllüğünü ve verimliliğini doğrudan etkiler. Aşırı antikor, özgün olmayan bağlanmaya yol açabilir, bu da arka plan gürültüsünü artırır ve genel tespit doğruluğunu azaltır. Buna karşılık, aksi durum verimsiz hedef protein zenginleşmesine yol açabilir, bu da zayıf sinyallere ve hassasiyetin azalmasına yol açabilir. Bu teknik hususlar, laktillenmiş proteinlerin araştırılmasında güvenilir ve kesin sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir.

Sonuç olarak, bu protokol, homeostaz deregülasyonundan sonra laktilasyon profillerindeki değişiklikleri, örneğin kanser 8,10 gibi değişiklikleri izlemek için kullanılabilir; bu değişiklikler ilaçla ilgili yanıtı etkileyebilir. Bu yöntemle biyobelirteçlerin tanımlanması bile mümkün olabilir. Birden fazla hücre hattı, doku tipi ve hatta hasta biyopsileri için uygulanabilir olan bu teknik, hastalık veya normal durumlarda PTM kaynaklı hücre sinyalinin anlaşılmasını derinleştirme potansiyeline sahiptir.

Açıklamalar

Açıklanacak bir çıkar çatışması yok.

Teşekkürler

Bilimsel tartışmalar için Giroux Laboratuvarı'nın tüm üyelerine içtenlikle teşekkür ediyoruz. Université de Sherbrooke Tıp ve Sağlık Bilimleri Fakültesi'nin Proteomik ve Kütle Spektrometrisi platformuna hizmet ve rehberlik sağladıkları için minnettarız. VG, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (RJPIN-2019-06185) ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (178171) tarafından desteklenmektedir. VG, Gastrointestinal Kök Hücre Biyolojisi alanında Kanada Araştırma Kürsüsü Kademe 2 (Kademe 2) sahibidir. MH, Centre de Recherche en Inflammation et Oncologie Digestive de l'Université de Sherbrooke, Université de Sherbrooke-Fondation De Sève, CRCHUS, TRaIning A New Generation of researchers in Gastroenterology and LivEr (TRIANGLE) programı ve FRQ'dan burslar almıştır. FMB, FRQS Liyakat Araştırma Akademisyenidir (366044). VG ve FMB, FRQS tarafından finanse edilen "Centre de Recherche du CHUS" üyeleridir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 uL Zip Tip C18 Pierce87784
Acclaim PepMap100 C18Dionex Şirketi1649460,3mm kimlik x 5mm
Asetonitril (MS derecesi)FisherA955-4
Amonyum bikarbonatSigma-AldrichA6141-500
Anti-HNRNPA1 monoklonal antikorNovus Biologicals NB100-672
Anti-L-Laktilizin (KL-La) monoklonal antikorPTM-BioPTM1401RM
Anti-fare IgG, HRP ile bağlantılı antikorCST7076S
Anti-tavşan IgG, HRP ile bağlantılı antikorCST7074S
Azure 280BiyosistemlerAZI280-01
BCA formuThermo Fisher ScientificP123227
Bovin Serum Albümini (BSA)Wisent800-095-EG
Captive Spray nanoESI kaynağıBruker Daltonics
KloroasetamideSigma-AldrichC0267
Clarity Max Western ECL SubstratıBio-Rad1705062
Ditiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861
Dynabeads Protein G boncukları İmmunoprecipitasyon içinThermo Fisher Scientific10004D
EDTASigma-AldrichE9884
Formik asit (FA; Yüksek lisans derecesi)Thermo Fisher ScientificA117-50
GliserolFisher ScientificBP229-1
HEPES (1M)Wisent330-050-EL
Hypersep C18 100mg kolonFisher60108-302
KL-LA agaroz konjuge boncuklarPTM-BioPTM-1404
Laemmli 2X (SDS, Bromofenol)Wisent, J.T. Baker800-100-CG, D293-01
Düşük bağlayıcı mikrotüp 0.5 mLSarstedt72.704.600
Düşük bağlayıcı mikrotüp 1.5 mLThermo Fisher ScientificP190410
Mikrotüp 1.7 mLAxygenMCT-175-C
NanoElute HPLC sistemiBruker Daltonics1,9 um parçacık boyutu, 75 um kimlik x 25cm
Normal Tavşan IgG poliklonal antikorMillipore Sigma12-370
PepSepBruker Daltonics1811112
Fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS)Wisent311-425-CL
PMSFThermo Fisher Scientific36978
Proteaz inhibitörü kokteyli (PIC)Sigma-AldrichP8340-5
Sera-Mag Speedbeads Protein A/G Manyetik ParçacıklarıThermo Fisher Scientific09-981-920
Sodyum klorürSigma-AldrichS9888-500
Sodyum florürSigma-AldrichS1504
Sodyum ortovanadatSigma-AldrichS6508
TimsTOF pro kütle spektrometresi Bruker Daltonics
Trifluoroasetik asit (TFA)Thermo Fisher ScientificA116-50
Tris-HÇLWisent600-125-IK
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Tripsin (MS derecesi)Pierce90058
UreaThermo Fisher ScientificU15-500
Vakcufuge plusEppendorf22820168
Su (MS derecesi)VWR10803-890A
β-gliserofosfatSigma-AldrichG5422
β-merkaptoetanolSigma-AldrichM3148

Kaynaklar

  1. Li, H., Sun, L., Gao, P., Hu, H. Lactylation in cancer: Current understanding and challenges. Cancer Cell. 42 (11), 1803-1807 (2024).
  2. Lu, Z., et al. Lactylation: The emerging frontier in post-translational modification. Front Genet. 15, 1423213(2024).
  3. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  4. Niu, Z., et al. HBO1 catalyzes lysine lactylation and mediates histone H3K9la to regulate gene transcription. Nat. Commun. 15 (1), 3561(2024).
  5. Zhao, Q., et al. Non-enzymatic lysine D-lactylation induced by glyoxalase II substrate SLG dampens inflammatory immune responses. Cell Res. 35 (2), 97-116 (2025).
  6. Moreno-Yruela, C., et al. Class I histone deacetylases (HDAC1-3) are histone lysine delactylases. Sci Adv. 8 (3), eabi6696(2022).
  7. Yang, W., et al. Hypoxic in vitro culture reduces histone lactylation and impairs pre-implantation embryonic development in mice. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 57(2021).
  8. Yang, Z., et al. Lactylome analysis suggests lactylation-dependent mechanisms of metabolic adaptation in hepatocellular carcinoma. Nat. Metab. 5 (1), 61-79 (2023).
  9. Zhang, N., et al. Protein lactylation critically regulates energy metabolism in the protozoan parasite Trypanosoma brucei. Front Cell Dev Biol. 9, 719720(2021).
  10. Yu, J., et al. Histone lactylation drives oncogenesis by facilitating m(6)A reader protein YTHDF2 expression in ocular melanoma. Genome Biol. 22 (1), 85(2021).
  11. Kim, M. -S., Zhong, J., Pandley, A. Common errors in mass spectrometry-based analysis of post-translational modifications. Proteomics. 16 (5), 700-714 (2016).
  12. Conradi, C., Shiu, A. Dynamics of post-translational modification systems: Recent progress and future directions. Biophys J. 114 (3), 507-515 (2018).
  13. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  14. Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Unimod: Protein modifications for mass spectrometry. Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).
  15. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  16. Zaru, R., Orchard, S. UniProt Consortium. UniProt Tools: BLAST, Align, Peptide Search, and ID Mapping. Curr Protoc. 3 (3), e697(2023).
  17. UniProt Consortium. UniProt: The universal protein knowledgebase in 2025. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D609-D617 (2025).
  18. Sun, J., Xia, Y. Pretreating and normalizing metabolomics data for statistical analysis. Genes Dis. 11 (3), 100979(2023).
  19. Yang, Y., Qiao, L. Data-independent acquisition proteomics methods for analyzing post-translational modifications. Proteomics. 23 (7-8), e2200046(2023).
  20. Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein post-translational modifications. ACS Chem Biol. 10 (1), 63-71 (2015).
  21. Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Proximity ligation assay allows the detection, localization, and quantification of protein arginine methylation in fixed tissue. J Vis Exp. (185), e64294(2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Protein LaktilasyonuPost Translasyonel Modifikasyonmm nopresipitasyon PeptitleriProtein EkstraksiyonuProtein Sindirimizofageal Karsinom H creleriLizin ModifikasyonuH cre Sinyalizasyonu

İlgili makaleler