Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Entomopatojenik Mantarların Virülans Taraması için Biber Thrips (Scirtothrips dorsalis Hood) Yetiştirme Sisteminin Kurulması

1.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68600

⸱

18 Temmuz 2025

 ,  ,  , 
1Master Program in Plant Medicine and Good Agricultural Practice, National Chung Hsing University, 2Department of Entomology, National Chung Hsing University, 3Applied Zoology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, 4International Doctoral Program in Agriculture, National Chung Hsing University

Bu makalede

Özet

Agar içeren cam kaplarda modifiye edilmiş bir müstakil yaprak yöntemi kullanılarak biber tripslerinin toplu olarak yetiştirilmesi için müstakil yapraklı bir biyotahlil protokolü oluşturulmuştur, bu da yüksek sağkalım ve senkronize gelişme sağlar. Bu sistem, entomopatojenik mantar virülansının 2. instar larvalarına karşı verimli bir şekilde taranmasını sağlar ve laboratuvar, sera ve tarla değerlendirmeleri için güvenilir bir trips kaynağı sağlar.

Özet

Biber tripsi (Scirtothrips dorsalis Hood), Tayvan'da süs ve gıda bitkilerinin ekonomik açıdan önemli bir zararlısıdır. Entomopatojenik mantarlar (EPF), tripsleri yönetmek için çevre dostu bir biyolojik kontrol ajanı olarak çalışmaktadır. Saha uygulamasından önce laboratuvar koşullarında EPF izolatlarının biber tripslerine karşı virülansının taranması çok önemlidir. Bununla birlikte, biber tripslerinin yetiştirme yöntemine ilişkin sınırlı veri, büyük ölçekli laboratuvar taraması için zorluklar doğurmaktadır. Bu sorunu çözmek için, S. dorsalis'in seri üretimi için modifiye edilmiş bir laboratuvar yetiştirme yöntemi geliştirdik.

Yöntem, EPF'yi biber tripslerine karşı değerlendirmek için uygun olan agar içeren bir cam kap kullanan müstakil yapraklı bir yetiştirme sistemi kullanır. Bu optimize edilmiş müstakil yapraklı biyo-tahlil sistemi, EPF'nin biber tripslerine karşı etkinliğini değerlendirmek için uygundur. Sistem, virülans taraması için aynı gelişim aşamasında çok sayıda trips üretme kapasitesine sahiptir. Teste göre sonuç, Cordyceps cateniannulata (Cc-NCHU-213) izolatının, aşılamadan 7 gün sonra (d.p.i.) biber tripsinin 2. instar larvalarına karşı en yüksek virülansı (%53.6) gösterdiğini gösterdi. Ayrıca, agar gömülü yaprak diskleri 7 günden fazla bir süre taze kaldı ve gözlem süresi boyunca tripslerin hayatta kalmasına izin verdi (kontrol tedavisinin %90 hayatta kalma oranı), bu da yetiştirme sisteminin stabilitesini gösteriyor. Bu protokol, seri üretim için ve EPF izolatlarının biber tripslerine karşı virülansını değerlendirmek için ve diğer tripsler için faydalı olabilecek ve tarladaki tripsleri kontrol etmek için potansiyel EPF izolatlarının taranmasını sağlayan istikrarlı bir yetiştirme sistemini göstermektedir.

Giriş

Biber tripsi (Scirtothrips dorsalis Hood; Thysanoptera: Thripidae), sebzeler, süs ve meyve bitkileri de dahil olmak üzere 40 farklı bitki ailesinde 100'den fazla bitki türünü istila eden polifag bir zararlıdır1. Tropikal ve subtropikal Asya-Güneydoğu Asya, Hindistan, Japonya ve Tayvan'a özgüdür2. Bildiğimiz kadarıyla, biber tripsi, Tayvan'da mango, çay, yaban mersini ve nilüfer dahil olmak üzere tarım ve süs bitkilerinin zararlısıdır. Son yirmi yılda, biber thrips, artan küreselleşme ve açık tarımsal ticaret nedeniyle birçok ülkede önemli bir ekonomik zararlı haline geldi. Ek olarak, yüksek üreme potansiyeli ve yeni istila edilen alanlara uyum sağlama yeteneği, bu haşerenin yayılmasına katkıda bulunmuştur 1,3.

Biber tripsi öncelikle genç yapraklar, sürgünler, çiçek yaprakları ve olgunlaşmamış meyvelerle beslenir, bu da nekroza ve dokuların ölümüne yol açar3. Ayrıca, yer fıstığı tomurcuğu nekroz virüsü (GBNV), yer fıstığı klorotik fan lekesi virüsü (GCFSV), yer fıstığı sarı nokta virüsü (GYSV)4 ve tütün çizgisi virüsü (TSV)5 dahil olmak üzere çeşitli bitki hastalıkları için bir vektör görevi görürler. Sonuç olarak, biber tripsi ile besleme, etkilenen mahsullerin verimini ve değerini önemli ölçüde azaltabilir. Biber tripslerinin başarılı yönetimi, kültürel, biyolojik ve kimyasal kontrol stratejilerini kullanan entegre bir haşere yönetim planına dayanır1. Tayvan'da, organik çiftçiler genellikle dar aralıklı yağ ve neem yağı gibi kimyasal olmayan malzemeleri veya yırtıcı akarların ve küçük korsan böceklerinin kullanımı da dahil olmak üzere biyolojik kontrol yöntemlerini (kişisel gözlemle) kullanırlar. Bununla birlikte, çiftçilerden gelen geri bildirimlere dayanarak, bu yağların çiçek ve meyve verme mevsimi boyunca uygulanması tozlaşmayı engelleyebilir ve polenlere zarar verebilir, bu da verimde ve ekonomik değerde bir azalmaya yol açabilir. Bu nedenle, biber tripsi için etkili alternatif kontrol önlemleri geliştirmek organik çiftçiler için çok önemlidir.

Entomopatojenik mantarlar (EPF), etkili ve sürdürülebilir bir haşere yönetimi tekniği olduğu gösterilen bir böcek öldürücü mantar grubudur 6,7,8. Birkaç çalışma, EPF'nin biber tripslerine karşı etkinliğini göstermiştir. Ticari EPF'ler, Beauveria bassiana GHA (BotaniGard_ES) ve Metarhizium brunneum F52 (Met-52 EC), gül bitkileri 9,10 üzerinde biber tripslerinin önemli ölçüde kontrolünü sergilemiştir. Biber bitkilerindeki biber thrips popülasyonları da Cordyceps javanica (= Isaria fumosorosea) ile azaltılabilir11. Lecanicillium lecanii ve Purpureocillium lilacinum gibi diğer EPF'ler, biber bitkisi ve çay da dahil olmak üzere farklı mahsullerde biber tripslerine karşı test edilmiştir ve bu zararlıyı kontrol etmede etkili olmuştur12,13.

Seralarda veya tarlada trips kontrolü için EPF'lerin etkinliğini araştıran önceki bazı çalışmalar, en etkili EPF türleri/suşları için ilk tarama yapılmadan gerçekleştirilmiş ve bu da etkinliklerini sınırlamıştır. EPF'lerin dikkatli bir şekilde taranması, haşere yönetimini büyük ölçüde artırabilir. Birçok çalışma, kafesler içindeki bozulmamış bitkiler üzerinde biyo-tahliller için trips yetiştirmiştir11,14. Bozulmamış bir bitki yetiştirme sistemi, tripsler için daha doğal bir ortam sunarken, tripsler her aşamada farklı davranışlar sergilediğinden, farklı gelişim aşamalarını yönetmede zorluklar ortaya çıkarır. Bu değişkenlik, belirli deneysel amaçlar için hedeflenen aşamaların seçimini zorlaştırabilir. Ayrıca, bozulmamış bitki yetiştirme sistemi içindeki toprak koşulları, biber tripslerinin pupa ve eklosiyonunu etkileyebilir, böylece sonraki biyolojik tahliller15 için mevcut birey sayısını azaltabilir ve daha sonraki biyo-tahliller için kaynakları sınırlayabilir. Ek olarak, tüm bitki yetiştirme sistemleri, stresli bitkiler tripslerin davranışını değiştirebileceğinden ve daha fazla zaman alıcı ve kaynak yoğun olabileceğinden, bitkiler için daha fazla alan ve sürekli bakım gerektirir. Laboratuvar biyotahlil deneyleri için canlı olmayan bitki materyaline (örneğin, müstakil bitki dokusu veya yapay diyetler) dayalı trips yetiştirme sistemleri hakkında çok az rapor vardır, ancak bu yöntemlerin ayrıntıları genellikle belirsizdir veya ihmal edilmiştir12,16.

Bu çalışma, laboratuvar koşullarında basit, uygun maliyetli ve sürdürülebilir bir biber thrips yetiştirme sistemi geliştirmeyi amaçlamıştır. Bu protokolde, bir yaprak diski yetiştirme yöntemi7 , toplu yetiştirme tripsleri için daha verimli ve kontrollü bir yaklaşım sunacak şekilde modifiye edildi ve çevresel koşullar üzerinde sıkı bir kontrol yoluyla biyoanalizler için gelişim aşamalarının hassas bir şekilde seçilmesine izin verildi. Ek olarak, entomopatojenik mantar (EPF) izolatlarının virülansını değerlendirmek için kararlı ve tekrarlanabilir bir biyo-tahlil sistemi geliştirilmiştir %50 öldürücü süre (LT50) ve %50 medyan öldürücü konsantrasyon (LC50), belirli bir dozaj altında tahmini süreye atıfta bulunur ve biber tripsinin %50 mortalitesine neden olmak için gereken mantar süspansiyonu konsantrasyonu, sırasıyla. Bu yöntemin uygulanmasıyla, sahada toplanan tripsler doğru bir şekilde tanımlanabilir ve daha kolay ve daha tekrarlanabilir metodoloji kullanılarak farklı mantar izolatlarının etkinliğini test etmek için tripslerin stabil laboratuvar kolonileri korunabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Deneysel akış şemasının tamamı Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Biber thrips tarla toplama ve koloni bakımı

  1. Biber thrips koleksiyonu
    1. Etkilenen bir yaban mersini çiftliğinde yaban mersini bitkilerinde biber tripsi istilası için yaprakların her iki tarafını ve çiçeklerin içinde görsel olarak inceleyin.
    2. Her numunenin ayrıntılarını kaydedin (örneğin, bitkinin bir kısmı ve istilanın ciddiyeti) ve mineral yağ ve doğal düşmanların uygulanması da dahil olmak üzere geleneksel tarım veya organik tarım gibi üretim uygulamalarını çiftçilerle onaylayın.
    3. Biber tripsi istilasına uğramış yaprakları ve çiçekleri kesin ve bunları plastik fermuarlı torbaya (Malzeme Tablosu) aktarın, ardından tırtılları canlı tutmak için fermuarlı torbayı içinde biraz hava olacak şekilde kapatın. Numuneyi 3 saat içinde laboratuvara getirin.
      NOT: Tarla toplama süresi 3 saatten fazla olduğunda numuneyi bir soğutucuya koyun.
    4. Bir cam yetiştirme kabı hazırlayın (35 mm yüksekliğinde, 45 mm iç çapında), cam yetiştirme kabının dibine üç kat dairesel kağıt havlu (çap 40 mm) yerleştirin ve ardından 8-10 damla (400-500 μL) filtrelenmiş su ekleyin (Şekil 1 ve Malzeme Tablosu).
    5. Mango tarlalarından genç, kırmızı bir mango yaprağı toplayın (Şekil 1). Cam yetiştirme kabını hazırlamadan önce yaprağı yıkayın ve optik mikroskop altında (Malzeme Tablosu) böcek yumurtaları veya diğer böcek kontaminasyonu olup olmadığını kontrol edin. Mango yaprağını deri bir kesici (Malzeme Tablosu) ile dairesel bir disk (40 mm) şeklinde kesin ve ıslak kağıt havlu üzerine yerleştirin.
      NOT: Mango yaprakları, tripsleri beslemek için yalnızca mevsimsel olarak yetişen genç yaban mersini yapraklarından daha istikrarlı kaynaklardır.
    6. Biber tripslerini 10x büyütmede optik mikroskop altında gözlemleyin ve 10 yetişkin tripsi (beş erkek ve beş dişi) ince bir boyama fırçası (Malzeme Tablosu) kullanarak cam yetiştirme kabına aktarın.
    7. Her bir cam yetiştirme kabını iki kat parafilm (Malzeme Tablosu) ile kapatın ve havalandırma için # 00 böcek pimi kullanarak yaklaşık 40 küçük delik açın (Malzeme Tablosu).
    8. Cam yetiştirme kabını 25 ± 1 °C'de, ~%70 bağıl nemde ve ışık:koyu (L:D) = 12 saat: 12 saat (Malzeme Tablosu) fotoperiyodu ile bir inkübatörde tutun.
    9. Yetişkinleri 48 saat sonra bir boya fırçası kullanarak çıkarın.
      NOT: Gözlemlerimize göre, dişi tripsler cam yetiştirme kabına aktarıldıktan ~ 2 gün sonra yumurta bırakacaktır.
    10. Yumurtlamayı daha fazla doğrulamak için yumurtalı yaprak dokularını stereomikroskop altında gözlemleyin (Şekil 1 ve Malzeme Tablosu). Yumurtalı yaprağın üzerine taze bir mango yaprağı diski yerleştirin ve nemi korumak için kağıt havlunun üzerine 8-10 damla filtrelenmiş su ekleyin.
  2. Biber thrips popülasyonunun bakımı
    NOT: Yumurtalar ~ 5-7 gün sonra 1st instar larvalarına çatlar.
    1. 1adet instar larvası içeren yaprağı doğrudan yeni bir cam yetiştirme kabına aktarın.
      NOT: Bir boya fırçası kullanarak, mango yapraklarındaki çürümüş ve beklenmedik mantar büyümesinden kaynaklanan kontaminasyonu önleyerek 1. instar larvalarını nazikçe yeni bir cam yetiştirme kabına aktarın. Gözlemlerimize göre, yetişkin bir dişi günde ortalama 6 yumurta bırakır.
    2. Biber tripslerini her gün gözlemleyin. Kağıt havluya her 4 günde bir 8-10 damla filtrelenmiş su ekleyin. Eski yaprak kurumadan önce her 4 günde bir kabın içine taze bir mango yaprağı diski ekleyin.
      NOT: 1. instar larvaları, sıcaklık ve nem gibi çevresel faktörlere bağlı olarak ~ 7-10 gün içinde yetişkinlere çıkar.
    3. Biber tripsi popülasyonunu, tripsler yetişkin hale gelene kadar günlük olarak gözlemleyin ve uzun süreli popülasyon bakımı için adım 1.1.4'teki adımları tekrarlayın.
  3. Biber tripslerinin toplu olarak yetiştirilmesi
    1. Korunan popülasyondan dişi yetişkinleri toplayın ve yukarıdaki adımlara göre bir cam yetiştirme kabı hazırlayın.
    2. 10 dişi yetişkini kabın içine aktarın ve yumurtalı bir yaprak elde etmek için 1.1.4 ila 1.1.10 arasındaki adımları izleyin.
      NOT: Yetişkin bir dişi günde ortalama 6 yumurta bırakır.
    3. ~ 120 1st instar larvalarını bir boya fırçası kullanarak yeni bir cam yetiştirme kabına nazikçe aktarın.
    4. Biber tripslerini her gün gözlemleyin. Her 4 günde bir kağıt havlu üzerine 8-10 damla filtrelenmiş su ekleyin. Eski yaprak kurumadan önce her 4 günde bir kabın içine taze bir mango yaprağı diski ekleyin.
    5. Yumurtalar bırakıldıktan 5-7 gün sonra 1adet instar larvası toplayın; 7-10 gün sonra 2adet instar larvası toplayın; biyo-tahlil için ~ 14 gün sonra yetişkinleri toplayın (Şekil 2).
      NOT: Daha fazla deney için biber tripslerinin farklı aşamalarını ayırt etmek için morfolojiyi gözlemleyin (Şekil 2).

2. Biber tripslerinin moleküler tanımlanması

NOT: Tarladan toplanan tripsler, biber tripsi17,18 için yaygın olarak kullanılan bir belirteç olan mitokondriyal sitokrom oksidaz I (COI) geninin bir parçası kullanılarak moleküler tanımlama yoluyla tür düzeyine kadar tanımlanmalıdır.

  1. Biber thrips genomik DNA'sının ekstraksiyonu
    1. 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde (Malzeme Tablosu) bir yetişkin biber tripsi toplayın.
    2. Biber tripslerini bir pelet havaneli kullanarak homojenize edin, ardından üreticinin protokolüne göre ticari kiti kullanarak genomik DNA'yı izole edin (Malzeme Tablosu).
  2. PCR amplifikasyonu ve DNA dizilimi
    1. Kısmi mitokondriyal COI genini amplifiye eden bir COI primer çifti, ileri primer LCO 1490 ve ters primer HCO 2198 ile PCR Master Mix (2x) kullanarak beklenen biber tripleri DNA fragmanını amplifiye edin (Malzeme Tablosu).
      1. 2 μL thrip genomik DNA şablonu, 1 μL ileri ve geri primer, 10 μL 2x PCR Master Mix ve 6 μL ddH2Oiçeren 20 μL'lik bir PCR karışımı hazırlayın (Malzeme Tablosu).
      2. PCR'yi aşağıdaki döngü koşullarında bir Termal Döngüleyici ile gerçekleştirin: 94 dakika boyunca 2 °C'de ilk denatürasyon, 35 döngü boyunca 94 °C boyunca 30 s, 52 dakika boyunca 1 °C, 72 dakika boyunca 1 °C, ardından 72 dakika boyunca 10 °C'lik son uzatma (Malzeme Tablosu).
    2. Amplifikasyonun sonucunu doğrulamak için %1'lik bir agaroz jel içinde elektroforez ile PCR amplikonunu kontrol edin (Şekil 3).
    3. Hedef bandı çıkarın (Beklenen amplikon boyutu 658 bp idi) ve üreticinin protokolüne göre bir Jel/PCR saflaştırma kiti kullanarak biber tripslerinin COI PCR amplikonunu saflaştırın. Saflaştırılmış ürünü ticari bir sıralama hizmeti aracılığıyla sıralama için gönderin. (Malzeme Tablosu).
  3. Dizi analizi
    1. Referans verilen yazılımı (Malzeme Tablosu) kullanarak dizi kalitesini değerlendirin.
    2. FASTA veya TXT dosyasını açın ve istenmeyen dizileri silerek hem 5' hem de 3' uçlarda düşük kaliteli tabanları manuel olarak kırpın.
    3. Tür kimliğini doğrulamak için varsayılan parametreleri kullanarak NCBI veritabanında (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) bir BLAST araması yapın.

3. Entomopatojenik mantarların hazırlanması

NOT: Bu çalışmada kullanılan EPF izolatları Tablo 1'de listelenmiştir.

  1. Mantar kaynak kitaplığından mantar izolatlarının geri kazanımı
    1. Korunmuş mantar conidia stoğunu (% 30 gliserin içinde süspanse edilmiş conidia) -80 ° C'lik bir dondurucudan çözün.
    2. Conidia süspansiyonunun yaklaşık 10 μL'sini aktarın ve laminer akış başlığında bir hücre yayıcı kullanarak 5,5 cm 1/4 Sabouraud dekstroz agar (SDA) plakasına eşit şekilde yayın. Ortam, 0.75 g Sabouraud dekstroz suyu ve 1.5 g agarın 100 mL çift damıtılmış su (ddH2O) içinde karıştırılmasıyla hazırlanır (Malzeme Tablosu).
    3. Petri kabını parafilm (Malzeme Tablosu) ile kapatın ve plakayı 10-14 gün boyunca 25 ° C'de karanlık inkübatöre aktarın.
    4. Aktif olarak büyüyen mantar miselyumunu taze bir 1/4 Sabouraud dekstroz agar (SDA) plakasına çizerek alt kültürleyin. Hasattan önce konidiyal gelişime izin vermek için mantarları 25 ° C'de 10-14 gün karanlıkta kuluçkaya yatırın.
      NOT: Sonraki biyo-tahliller için yaklaşık 10 günlük mantar kültürleri kullanın. 14 günden daha eski kültürler, konidiyal canlılıktaki potansiyel azalmalar nedeniyle virülans testi için önerilmez.
  2. Conidia süspansiyonunun hazırlanması
    1. 1/4 SDA'da 10-14 günlük bir mantar kültürünün yüzeyine 2-3 mL %0.03 Tween 80 ekleyin. Conidia'yı steril bir halka (Malzeme Tablosu) kullanarak nazikçe kazıyın.
    2. Mantar süspansiyonunu 15 mL'lik temiz bir santrifüj tüpüne aktarın.
    3. Süspansiyonu maksimum hızda girdaplayarak homojenize edin ve hif kalıntılarını gidermek ve saf bir conidia süspansiyonu elde etmek için filtre kağıdından süzün.
    4. Işık mikroskobu altında conidia sayısını kontrol etmek için bir hemositometre (Malzeme Tablosu) kullanın ve süspansiyonu 108 conidia / mL'ye seyreltin.
    5. Konidiyal süspansiyonu, sonraki biyo-tahlil uygulaması için UV ışığı ile sterilize edilmiş bir mikro püskürtücüye aktarın.
      NOT: Yerleşmeyi önlemek için her transferden önce konidiyal süspansiyonun iyice girdaplandığından emin olun. Kullanmadan önce, mikro püskürtücüyü laminer akış başlığı içinde 30 dakika boyunca ultraviyole radyasyona maruz bırakarak sterilize edin.

4. Biber tripslerine karşı virülans taraması

  1. 2adet instar larvanın hazırlanması
    1. Aşağıdaki deney için 1.3.1-1.3.5 adımlarını izleyerek 2. instar larvalarını toplayın.
      NOT: 2. instar larvalarını sarı gövde renkleri ve geniş karınları ile ilk instar larvalarına göre ayırt ediniz (Şekil 2).
  2. Aşılama kabının hazırlanması
    NOT: Biber thrips'in hedef mahsulüne göre yaprak türlerini seçin. Bu çalışmada, istila edilmiş yaban mersini 'Biloxi' (V. corymbosum L. × V. darrowii Kampı) yapraklarından biber tripsi toplanmıştır. Bu nedenle, EPF'nin biber tripslerine karşı biyolojik tahlili yaban mersini yaprakları üzerinde gerçekleştirilecektir.
    1. Bir yaban mersini çiftliğinden genç yaban mersini yapraklarını toplayın ve yüzey tozunu ve varsa diğer eklembacaklıları temizlemek için yaban mersini yapraklarını yıkayın.
    2. Yaprakları havayla kurutun veya suyu silmek için kağıt havlu kullanın; Ardından, yaban mersini yapraklarının yüzeyinde stereomikroskop altında başka eklembacaklılar veya yumurtalar olup olmadığını kontrol edin. Varsa eklembacaklıları çıkarın.
    3. Deri kesici (Malzeme Tablosu) kullanarak 2,8 cm çapında bir yaprak diski kesin, yaprağı %1 çamaşır suyu (Sodyum hipoklorit çözeltisi) kullanarak dezenfekte edin ve yapraklardaki ağartıcı kalıntılarını gidermek için 2 adet sterilize su ile durulayın.
      NOT: Yaprak diskin su agarına düzgün bir şekilde gömülebilmesini sağlamak için agar katılaşmasından önce yaprak diskini hazırlayın.
    4. Sterilizasyon için% 2.5'lik bir su agar çözeltisi (100 mL ddH2O başına 2.5 g agar) otoklavlayın.
    5. Agar katılaşmadan önce laminer akış davlumbazının içindeki küçük cam kaplara (35 mm yüksekliğinde, 30 mm iç çapında) 3 mL %2,5 su agar dökün. Agarın yarı katı hale gelene kadar yaklaşık 40 °C'ye soğumasına izin verin.
    6. Yaprak diskini (adaksiyal tarafı yukarı bakacak şekilde) agar yüzeyine nazikçe yerleştirin ve agar yüzeyinin üzerine minimum maruz kalacak şekilde hafifçe gömün. Su agar tamamen katılaştığında, cam kaplar biyolojik tahlil için hazırdır.
  3. EPF aşılama ve gözlem
    1. Uygulamadan önce, konik süspansiyonu iyice girdaplayın. Bir mikro püskürtücü kullanarak, cam kabın içinde yaklaşık 10 cm'lik bir mesafeden her bir yaprak diskinin yüzeyine 0,1 mL süspansiyonu (adım 3.2.4'te hazırlanmıştır) eşit şekilde uygulayın.
      NOT: Deneyden önce püskürtme alanlarını test edin. Püskürtmenin tüm yaprak diskini ince bir tabaka ile eşit şekilde kapladığından emin olun. Yaprak üzerinde durgun suya damlacıklar birikirse, aşırı ıslanmayı önlemek için aşılama hacmini azaltın.
    2. Yaprak üzerindeki conidia süspansiyonunu steril koşullar altında (örn. laminer akış başlığında) 30 dakika havayla kurutun.
    3. 2. instar larvalarından 10'unu ince bir boya fırçası kullanarak her bir kaba aktarın ve her bir cam yetiştirme kabını iki kat parafilm ile kapatın.
    4. Havalandırma için # 00 böcek pimi (Malzeme Tablosu) kullanarak ~ 30 küçük delik açın.
    5. Kabı 25 ± °C'de ~%70 bağıl nem ve L:D = 12 saat: 12 saat fotoperiyodu olan inkübatörde aşılayın.
    6. Biber tripslerinin mortalitesini 7 gün boyunca günde 10x büyütmede stereomikroskop altında gözlemleyin ve kaydedin.
    7. EPF enfeksiyonunu doğrulamak için mikoz gözlemi için ölü larvaları cam kabın içinde tutun.

5. Seçilen EPF izolatlarının biyo-tahlili

NOT: Biber tripslerine karşı doza bağlı bir biyo-tahlil için ya en öldürücü EPF izolatı ya da yüksek virülanslı birkaç izolat seçilebilir. Doz ve patojenite arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için 106 ila 108 conidia / mL arasında değişen üç farklı konidiyal konsantrasyon kullanıldı.

  1. Conidia süspansiyonunun hazırlanması
    1. Adım 3.1'i izleyerek seçilen EPF izolatını kurtarın.
    2. Adım 3.2'de açıklandığı gibi üç konsantrasyonda conidia süspansiyonu (106, 107 ve 108 conidia/mL) hazırlayın.
  2. 2adet instar larvanın hazırlanması
    1. Yeni çıkan yetişkinleri elde etmek için adım 4.1'i takip ederek ikinci instar larvalarını toplayın.
  3. Aşılama kabının hazırlanması
    1. Adım 4.2'yi izleyin. su agarına gömülü yaban mersini yaprağı diskleri içeren aşılama kabını hazırlamak için.
  4. EPF aşılama ve gözlem
    1. EPF aşılamasını, adım 4.3'te açıklandığı gibi üç konsantrasyonda conidia süspansiyonu ile gerçekleştirin.

6. İstatistiksel analiz

  1. Mortalitenin hesaplanması
    1. Mantar tedavileri arasındaki farklılıkları değerlendirmek için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) yapmadan önce her bir mantar türünün mortalite verilerini Arcsin dönüşümü ile dönüştürün (anlamlılık düzeyi p < 0.05 olarak belirlenmiştir).
    2. Tukey'in Dürüst Anlamlı Fark (HSD) testini kullanarak tedavi araçlarının post hoc karşılaştırmalarını yapın.
  2. Ortalama öldürücü sürenin (LT50) ve ortanca öldürücü konsantrasyonun (LC50) hesaplanması
    1. Probit regresyon analizini kullanarak medyan öldürücü süre (LT50) ve medyan öldürücü konsantrasyon (LC50) değerlerini hesaplayın.
    2. "Toplam", "yanıt" ve "süre" (LT50 için) veya "konsantrasyon" (LC50 için) adlı değişkenleri yazılım arayüzünde gözlemlenen verilerle oluşturun ve doldurun.
      NOT: Gözlem süresi içinde kümülatif mortalite %50'yi aşmazsa, LT50 ve/veya LC50 değerleri güvenilir bir şekilde tahmin edilemez.
    3. Analiz | Regresyon | Önermek. "Toplam"ı test edilen toplam böcek sayısı, "yanıt"ı ölü böcek sayısı ve "süre" veya "konsantrasyon"u ortak değişken olarak ayarlayın. Seçenekler tuşuna basarak ve Heterojenlik faktörünün kullanımı için Anlamlılık düzeyini 0,05 olarak ayarlayarak heterojenlik faktörünün anlamlılık düzeyini 0,05 olarak ayarlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmada sunulan deneysel akış şeması, tarla toplamasından EPF izolatlarının virülansının taranmasına kadar biber tripslerinin stabil yetiştirme sisteminin kurulabileceğini göstermiştir (Şekil 1). Morfolojik gözlem, biber tripslerini diğer çiçek tripsilerinden ayırt edebilse de, PCR amplikon boyutu ve COI dizilimi dahil olmak üzere kısmi COI dizisinin moleküler bir belirteç olarak kullanılması, sahada toplanan tripslerin biber tripsi olarak tanımlanmasını...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Biber thrips, mısır, yer fıstığı, biber, soya fasulyesi, çilek, tatlı patates ve domates gibi ekonomik açıdan önemli çok sayıda ürünü etkileyen küresel olarak önemli bir zararlıdır 1,11,19. Mevcut kontrol stratejileri, doğal düşmanların, nematodların ve EPF'lerin kullanımı dahil olmak üzere kültürel uygulamaları, biyolojik kontrol ajanlarını ve kimyasal tedavileri içeren entegre yaklaşımlara day...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, bu çalışmada herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yaban mersini bitkilerini sağlayan Humi yaban mersini çiftliğinden (Wufeng Dist., Taichung Şehri) Bay Lin, Huanf-Jen'e özel teşekkürlerimizi sunarız. Bu araştırma Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi (NSTC) tarafından 113-2313-B-005 -024 -MY3 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
#00 böcek iğnesiEntosphinx DMM0220İngiltere'de üretilmiştir
1,5 mL santrifüj tüpüCorning kurulduMCT-175-CABD'de üretilmiştir
10 μ L Aşılama DöngüsüNEST Bilimsel718201ABD'de üretilmiştir
100 bp DNA Merdiveni IIIGeneaidDL007 SerisiTayvan'da üretilmiştir.
2x SuperRed PCR Ana KarışımıBiyolojik aletlerTE-SR01Tayvan'da üretilmiştir
6 cm Petri kabıAlfa Artı Bilimsel16021Tayvan'da üretilmiştir
AgarBioman BilimselAGR001.1Mikrobiyoloji notu
AgarozBioman BilimselPB1200 SerisiTayvan'da üretilmiştir
BioGreen Güvenli DNA Jel TamponuBioman BilimselSDB001TTayvan'da üretilmiştir
Kolay DNA Yüksek Hızlı Ekstraksiyon Doku KitiFisher BiotecET-100 Serisihttps://www.fisherbiotec.com.au/wp-content/uploads/2021/11/FB-EDNA-DNA-Kits-flyer-11Nov21.pdf (Avustralya'da üretilmiştir)
İleri astar: LCO 1490Genomik PO-PR220919G6Sıra: 5'-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3'
GenepHlow Jel/PCR KitiGeneaidDFH300 Serisihttp://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
Cam Yetiştirme Konteyneri Sunshine Laboratuvar Ekipmanları şirketiBoyut: 35 mm yükseklik, 45 mm iç çap. Herhangi bir benzer boyuttaki plastik veya cam bardakla değiştirilebilir.
HemositometrePaul Marienfeld'in fotoğrafı.640030Almanya'da üretilmiştir
kuvözMerhabaF740 SerisiTayvan'da üretilmiştir
deri kesiciGerçek El Yapımı Atölyesihttps://shopee.tw/jj891004? categoryId=100636& entryPoint=ShopByPDP& itemId=16023929406
MiniAmp Termal DöngüleyiciThermo Fisher BilimselA37834ABD'de üretilmiştir
optik mikroskop Nikon  Ci-LJaponya'da üretilmiştir
Boyama fırçasıTian Cheng fırça şirketi47166084003520 veya 1 boyutunda yuvarlak fırçaya eşdeğer ince uçlu suluboya fırçası ile değiştirilebilir.
kağıt havluMayıs çiçeğiBLS007-8Tayvan'da üretilmiştir
Parafilm MBemisPM-996ABD'de üretilmiştir
Pelet havaneliBioman BilimselGT100R SerisiTayvan'da üretilmiştir
Ters astar: HCO 2198Genomik PO-PR220919G6Sıra: 5'-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3'
Sabouraud Dekstroz SuyuHiMedyaMH033-500GHindistan'da üretilmiştir
stereomikroskopSoptopSZN71 SerisiTayvan'da üretilmiştir
TAE tamponu 50XBioman BilimselTAE501000Tayvan'da üretilmiştir
Ara 80PanReac Uygulama Kimyası142050.1661Tayvan'da üretilmiştir
fermuarlı çantaWenchen Plastik Şirketi1809000061Boyut: 12 cm genişliğinde ve 17 santimetre uzunluğundadır. (Tayvan'da üretilmiştir)

Kaynaklar

  1. Kumar, V., Kakkar, G., McKenzie, C. L., Seal, D. R., Osborne, L. S. Weed and pest control-conventional and new challenges. , 53-77 (2013).
  2. Hoddle, M. Scirtothrips dorsalis (chilli thrips). CABI Compendium. , Wallingford, CT, USA. (2022).
  3. Liburd, O. E., Panthi, B. R., Phillips, D. A. Chilli thrips on blueberries in Florida: ENY2053/IN1298. EDIS. 2020 (6), (2020).
  4. Gopal, K., Krishna Reddy, M., Reddy, M., Muniyappa, V. Transmission of peanut yellow spot virus (PYSV) by thrips, Scirtothrips dorsalis Hood in groundnut. Arch Phytopathol Plant Prot. 43 (5), 421-429 (2010).
  5. Prasada Rao, R., et al. The host range of tobacco streak virus in India and transmission by thrips. Ann Appl Biol. 142 (3), 365-368 (2003).
  6. Chang, J. C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Front Sustain Food Syst. 5, 596316(2021).
  7. Yang, C. J., Nai, Y. S. Assessment of aphidicidal effect of entomopathogenic fungi against mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.). J Vis Exp. (197), e65312(2023).
  8. Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. J Vis Exp. (175), e62882(2021).
  9. Aristizábal, L., Chen, Y., Cherry, R., Cave, R., Arthurs, S. Efficacy of biorational insecticides against chilli thrips, Scirtothrips dorsalis (Thysanoptera: Thripidae), infesting roses under nursery conditions. J Appl Entomol. 141 (4), 274-284 (2017).
  10. Francis, J. R., Manchegowda, H. K. Molecular phylogenetic identification of Metarhizium and Beauveria and their bio-efficacy against chilli thrips, Scirtothrips dorsalis. Int J Trop Insect Sci. 43 (3), 909-918 (2023).
  11. Arthurs, S. P., Aristizábal, L. F., Avery, P. B. Evaluation of entomopathogenic fungi against chilli thrips, Scirtothrips dorsalis. J Insect Sci. 13 (1), 31(2013).
  12. Subramaniam, M. S. R., Babu, A., Deka, B. Lecanicillium lecanii (Zimmermann) Zare & Gams as an efficient biocontrol agent of tea thrips, Scirtothrips bispinosus Bagnall (Thysanoptera: Thripidae). Egypt J Biol Pest Control. 31, 1-14 (2021).
  13. Panyasiri, C., et al. Control efficacy of Purpureocillium lilacinum against chilli thrips (Scirtothrips dorsalis) on chili plant. Insects. 13 (8), 684(2022).
  14. Perera, M., Senanayake, N., Dissanayake, D. Evaluation of Amblyseius swirskii (predatory mite) and Orius laevigatus as biological control agents of chilli thrips (Scirtothrips dorsalis). Ceylon J Sci. 50 (4), 541(2021).
  15. Han, D., et al. Effect of pupation environment on pupal development and eclosion of chilli thrips (Thysanoptera: Thripidae). Environ Entomol. 54 (1), 223-230 (2025).
  16. Tatara, A. Effect of temperature and host plant on the development, fertility and longevity of Scirtothrips dorsalis Hood (Thysanoptera: Thripidae). Appl Entomol Zool. 29 (1), 31-37 (1994).
  17. Kumar, V., Seal, D. R., Osborne, L. S., McKenzie, C. L. Coupling scanning electron microscopy with DNA barcoding: a novel approach for thrips identification. Appl Entomol Zool. 49, 403-409 (2014).
  18. Silva, R., et al. Seasonal abundance of cotton thrips (Thysanoptera: Thripidae) across crop and non-crop vegetation in an Australian cotton-producing region. Agric Ecosyst Environ. 256, 226-238 (2018).
  19. Venette, R., Davis, E. Chilli thrips/yellow thrips, Scirtothrips dorsalis Hood (Thysanoptera: Thripidae) mini pest risk assessment. , Univ Minnesota Tech Bull. (2004).
  20. Mandi, N., Senapati, A. Integration of chemical, botanical and microbial insecticides for control of thrips, Scirtothrips dorsalis Hood infesting chilli. J Plant Prot Sci. 1 (1), 92-95 (2009).
  21. Samota, R., Jat, B., Choudhary, M. D. Efficacy of newer insecticides and biopesticides against thrips, Scirtothrips dorsalis Hood in chilli. J Pharmacogn Phytochem. 6 (4), 1458-1462 (2017).
  22. Panthi, B. R., Renkema, J. M., Lahiri, S., Liburd, O. E. The short-range movement of Scirtothrips dorsalis (Thysanoptera: Thripidae) and rate of spread of feeding injury among strawberry plants. Environ Entomol. 50 (1), 12-18 (2021).
  23. Priyanka, T., et al. Biology and morphometrics of Thrips parvispinus (Karny) (Thysanoptera: Thripidae) on chilli, Capsicum annuum L. Pest Manag Hortic Ecosyst. 30 (1), 85-92 (2024).
  24. Hemalatha, S., Ramaraju, K., Jeyarani, S. Evaluation of entomopathogenic fungi and delivery methods for management of thrips in chillies. Int J Veg Sci. 23 (3), 246-259 (2017).
  25. Xu, X. M., Guerin, L., Robinson, J. Effects of temperature and relative humidity on conidial germination and viability, colonization and sporulation of Monilinia fructigena. Plant Pathol. 50 (5), 561-568 (2001).
  26. Lee, S. J., et al. Transcriptional response of bean bug (Riptortus pedestris) upon infection with entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana JEF-007. Pest Manag Sci. 75 (2), 333-345 (2019).
  27. Yang, Y. -T., et al. Up-regulation of carbon metabolism-related glyoxylate cycle and toxin production in Beauveria bassiana JEF-007 during infection of bean bug, Riptortus pedestris (Hemiptera: Alydidae). Fungal Biol. 120 (10), 1236-1248 (2016).
  28. Qayyum, M. A., et al. Entomopathogenic fungi: prospects and challenges. Entomopathogenic Fungi: Prospects and Challenges. , 57-79 (2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ayr k Yaprak BiyoanaliziK tle retimiBiyolojik M cadeleLaboratuvar Ortam nda Yeti tirmeFungal zolatlar
Entomopatojenik Mantarların Virülans Taraması için Biber Thrips (Scirtothrips dorsalis Hood) Yetiştirme Sisteminin Kurulması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.