Bu protokol, uyanık farelerde omuriliğin ultrason stimülasyonu için özel olarak tasarlanmış bir ultrason dönüştürücü fiksasyon sistemini tanımlar. Yöntem, ultrason dönüştürücüsünün doğru konumlandırılmasını sağlamak için bir sabitleme sistemi kullanır ve aynı zamanda deney deneklerinin stimülasyon hassasiyetinden ödün vermeden serbestçe hareket etmesine izin verir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farelerde Omurilik Nöromodülasyonu için Ultrason Transdüserlerinin Fiksasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Fokuslu ultrason (FUS), omurilik nöral regülasyonu için önemli bir potansiyel gösteren yenilikçi bir non-invaziv nöromodülasyon teknolojisi olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, omurga boyunca stabil dönüştürücü fiksasyonunun elde edilmesi, dikkate değer teknik zorluklar sunar. Mevcut immobilizasyon yöntemleri genellikle uzun süreli hayvan anestezisi gerektirir veya yetersiz yapışma güvenilirliği gösterir. Bu kritik kısıtlamalar, hem operasyonel stabilite hem de fizyolojik uyumluluk sağlayan yeni bir fiksasyon paradigmasının geliştirilmesine yönelik acil ihtiyacın altını çizmektedir. Bu protokol, uyanık, serbestçe hareket eden farelerde omuriliğin uyarılması için yenilikçi bir ultrason dönüştürücü fiksasyon sistemi sunar. Vertebra kolonuna hassas ultrason dönüştürücü yerleşimi için güvenilir bir yöntem oluşturmak, nörostimülasyon deneyleri için anahtardır. Bu yöntem üç aşamayı entegre eder: T13 vertebral gövdesinin cerrahi olarak maruz bırakılması, düzlemsel bir temas arayüzü oluşturmak için spinöz işlemin hassas bir şekilde taşlanması ve protez taban malzemesi ve yapıştırıcı karışımı kullanılarak metal tabanın ve kolimatörün vertebral kolona güvenli bir şekilde yapıştırılması. Sınırsız hareket yoluyla doğal motor davranışlara izin verir ve seanslar arasında minimum uzamsal varyasyon ile stabil konumlandırma sağlar, bilinçli hayvan modellerinde ultrason aracılı omurilik girişimlerinin araştırılmasını kolaylaştırır. Özellikle omurga yaralanması onarımı, kan-omurilik bariyeri modülasyonu ve kronik ağrı mekanizmalarında davranışsal değerlendirmeler gerektiren çalışmalarla ilgilidir. Uyanık hayvan nöromodülasyon araştırmalarında kritik bir teknik zorluğu ele alan bu protokol, hareket kısıtlaması olmaksızın stabil bir dönüştürücü-omurga arayüzü sunarak daha doğru ve güvenilir deneysel sonuçların önünü açar.
Giriş
Omurilik, merkezi ve periferik sinir sistemleri arasındaki bilgileri entegre etmek için çok önemli bir merkezdir ve bu da onu ağrı sinyali iletimi, motor sinir ağı rekonstrüksiyonu ve nöroplastisite regülasyonu gibi alanlarda klinik araştırmalar için değerli kılar. Gelişmekte olan non-invaziv bir nöromodülasyon teknolojisi olan fokuslu ultrason (FUS), omurilik nöral regülasyonunun önemli bir aracı haline gelmiştir. Derin doku penetrasyonunun fiziksel özellikleri, milimetre düzeyinde uzamsal çözünürlük ve kontrol edilebilir enerji çıkış parametreleri ile uygulaması, temel nöro-mekanizma araştırmalarından çeşitli omurilik patolojik modellerinin klinik öncesi translasyon çalışmalarına kadar uzanır.
Araştırmalar, FUS'un omurilik nöral devrelerini iki şekilde düzenleyebileceğini gösteriyor: ya inhibe ederek ya da termal ve mekanik etkiler yoluyla aktive ederek. Aynı zamanda 1,2,3 dokuları için zamansal geri dönüşümlülüğü ve güvenliği ile karakterizedir. Omurilik yaralanması modellerinin çalışmasında, FUS, inflamatuar yanıtları modüle ederek ve nöral onarımı teşvik ederek sıçanların motor yeteneğini geliştirmiştir 4,5,6. Ayrıca, FUS'un kan-omurilik bariyerini açtığı ve mikro kabarcık aracılı kavitasyon etkisi yoluyla yerel ilaç dağıtım verimliliğini artırdığı gösterilmiştir 7,8. Nöropatik ağrı alanında, Liao ve ark. FUS'un KCC2 ekspresyonunu düzenleyerek ve CaMKIV KCC2 yolu9'u inhibe ederek sıçanlarda nöropatik ağrı belirtilerini etkili bir şekilde hafiflettiğini doğrulamıştır. Song ve ark. lomber omuriliğe uygulanan düşük yoğunluklu tsFUS'un bir sıçan kronik daralma yaralanması modelinde mekanik allodiniyi önemli ölçüde azalttığını ve mikroglial aktivasyonu baskıladığını göstermiştir10. FUS ile hassas omurilik modülasyonunun elde edilmesi, ultrason enerji dağıtım sisteminin uzamsal stabilitesine bağlıdır. Mevcut fiksasyon stratejileri temel olarak iki kategoriye ayrılmaktadır: 1) Rijit fiksasyon yöntemi: Stereotaktik bir çerçeve kullanarak hassas konumlandırma sağlar, ancak deney deneklerinin nöral aktivitesini baskılayan ve davranışsal değerlendirmelerin geçerliliğini etkileyen sürekli anestezi gerektirir 1,2,3,4,10; 2) Esnek fiksasyon yöntemi: Elastik bir kemer cihazı kullanılarak bilinçli denekler üzerinde araştırma yapılmasına olanak sağlar, ancak omurganın büyük hareket kabiliyeti nedeniyle yer değiştirme hataları ve dönüştürücü dekolmanıvardır 6,8,9. Ek olarak, vertebral kolonun laminasının geometrik heterojenliği, ultrason enerjisinde önemli bir azalmaya yol açarak nöral modülasyonun 7,8 verimliliğini azaltır.
Bu çalışma, bilinçli, serbestçe hareket eden farelerde omurilik nöral modülasyon araştırmaları için yenilikçi bir şekilde implante edilebilir bir odaklanmış ultrason dönüştürücü fiksasyon şeması önermektedir. Bu protokol, metal tabanı, kolimatörü ve vertebral sütunu entegre etmek için minimal invaziv bir cerrahi yaklaşım kullanır, ultrason dönüştürücüsünün tekrar tekrar takılmasını destekler, ultrason hedefinin tutarlılığını sağlar ve lamina boyunca ultrason enerji zayıflamasını kabul edilebilir bir aralıkta tutar. Geliştirilen metodoloji, mevcut yaklaşımların kritik sınırlamalarını ele almakta ve böylece uyanık, davranan hayvanlarda daha güvenilir ve tekrarlanabilir omurilik nöromodülasyon deneylerini mümkün kılmaktadır. Anahtar parametreler arasında T13'te 2,5 cm'lik bir orta hat kesisi, paslanmaz çelik metal taban fiksasyonu ve protez taban malzemesinin siyanoakrilat yapıştırıcıya 3:1 hacim oranı bulunur. Sınırlamalar arasında orta derecede cerrahi invazivlik ve kemik yüzeyi hazırlığında operatöre bağlı hassasiyet yer alır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmada açıklanan tüm hayvan prosedürleri, Shenzhen İleri Teknoloji Enstitüleri Hayvan Deneyleri Kurumsal Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (sertifika numarası: SIAT-IACUC-200721-YGS-NLL-A1313). Tüm deneylerde erkek C57BL / 6J fareleri (8 haftalık) kullanıldı. Fareler ameliyat sırasında 18-22 g ağırlığındaydı.
1. Anestezi indüksiyonu ve idamesi (5 ± 1 dk)
- Anestezi devresini 5 dakika önceden şarj edin.
- İndüksiyon odasını, 2 L/dk'lık bir akış hızında medikal havada %4 izofluran verecek şekilde ayarlayın.
- Doğrultma refleksi kaybolduktan sonra yüz maskesi ventilasyonuna geçin.
- Buharlaştırıcıyı% 1.5-2 izofluran konsantrasyonunu koruyacak şekilde ayarlayın.
- Anestezi boyunca hedef aralığı 36-38 °C olan 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma battaniyesi kullanarak fare vücut ısısını koruyun.
- Terramisin oftalmik merhem uygulayın.
2. Konumlandırma (1 ± 1 dk)
- Fare için ayarlanabilir bir stereotaktik adaptör kullanın.
- Omurga fizyolojik eğriliğini korumak için fareyi omurga hizalaması ile yüzüstü konumlandırın.
- Kulak çubuklarını kullanarak farenin başını sabitleyin.
- Uzuvları simetrik olarak konumlandırın.
3. Cerrahi alan hazırlığı (1 ± 1 dk)
- Ameliyat bölgesindeki tüyleri almak için elektrikli bir kesme makinesi (bıçak aralığı 0,1 mm) kullanın.
- Epilasyon alanının yaklaşık 3 cm × 1 cm olmasına dikkat edin.
- Saç büyümesinin tersi yönde üç geçiş kırpma işlemi gerçekleştirin.
4. İnsizyon ve yaklaşım (2 ± 1 dk)
- Alanı 3 kez (30 s aralıklarla) iyodofor ile silin.
- Son kaburgayı (farelerde T13 omuruna bağlı) palpe edin ve şu şekilde kullanın:
Birincil dönüm noktası. boyunca T13 vertebral seviyesinde 2,5 cm'lik bir kesi oluşturun
bir neşter kullanarak dorsal orta hat. - Deri altı fasyayı sırayla inceleyin.
- Paraspinal kasları anatomik düzlemler boyunca açığa çıkarın.
5. Paraspinal kas diseksiyonu (5 ± 1 dk)
- Paraspinal kasların ve vertebral yapıların en iyi şekilde görselleştirilmesi için cerrahi mikroskop büyütmesini 5x'e ayarlayın.
- Mikro makas kullanarak paraspinal kasların keskin diseksiyonunu yapın.
- Ventral kas tabakalarını korurken dorsal ve lateral paraspinal kasları tamamen rezeke edin.
- Emilebilir hemostatik gazlı bez ile kanamayı yönetin.
6. Metal taban montajı (1 ± 1 dakika)
- Sabitleme çubuğunu (plastik) stereotaktik adaptöre monte edin.
- Özel metal tabanı (paslanmaz çelik, 0.28 g) çubuğun distal ucuna monte edin (Şekil 1A).
- Özel metal tabanı T13 spinal enine süreçlerde iki taraflı olarak konumlandırın.
- Kaplin kararlılığını doğrulayın.
7. Kemik ara yüz hazırlığı (2 ± 1 dk)
- Cerrahi mikroskop altında lamina ve spinöz süreçlerden kalan kas dokusunu çıkarın.
- Steril pamuk rehin sıkıştırması ile tam hemostaz elde edin.
- Sürekli tuzlu sulama ile hassas bir kemik matkabı kullanarak düzlemsel bir temas yüzeyi oluşturun. Isı oluşumunu en aza indirmek için matkabı 5.000-10.000 rpm hızında çalıştırın. Delme sırasında bir göz siperi ve maske takın.
- Tuzlu suyla nemlendirilmiş pamuklu çubuklarla kemik tozunu alın.
8. Sabitleme sistemi sızdırmazlığı (3 ± 1 dakika)
- Protez taban malzemelerini ve siyanoakrilat yapıştırıcıyı (502 tutkal) 3:1 hacim oranında karıştırın. Cilt/göz temasını önlemek için nitril eldiven ve koruyucu gözlük kullanın.
- Ultrasonik kolimatörü (plastik, 0.6 g, Şekil 1B) ve metal tabanı yapışkan karışımı kullanarak vertebral kolona takın (Şekil 1C).
- Yapışkan karışımın kontrollü ortam koşullarında (24 ± 1 °C, %40-60 bağıl nem) kürlenmesine izin verin. Tam katılaşmanın görsel olarak onaylanmasına kadar (yüzey parlaklığı kaybı ve sert bir arayüz oluşumu) statik konumlandırmayı 60 saniye boyunca koruyun.
- Metal tabanı plastik sabitleme çubuğundan ayırın.
- Sabitleme stabilitesi doğrulaması: Yatay düzlemde metal tabana hafif bir dönme kuvveti uygulayın. Herhangi bir yer değiştirme için 5x büyütme altında kolimatör-omur arayüzünü gözlemleyin (<0,1 mm tolerans). Hareket toleransı aşarsa, yapışkan karışımı yeniden uygulayın (adım 8.2) ve kürlemeyi tekrarlayın (adım 8.3).
9. Yara kapatma (1 ± 1 dk)
- Metal tabanı tam olarak kaplamak için yara kenarlarını hizalayın.
- 4-0 ipek dikişlerle kesintili dikiş atın.
- Kesiği iyodofor ile silin.
- Kolimatörün laminer maruz kalma bölgesindeki artık kan/kemik kalıntılarını temizleyin ve sızdırmazlık ve hemostaz için steril pamukla paketleyin.
10. Ameliyat sonrası yönetim
- Termoregülasyon: Ambulasyonun tamamen iyileşmesine kadar (tipik olarak anesteziden 2-3 saat sonra) fareyi bir ısınma battaniyesi (37 ° C) üzerinde tutun.
- Ameliyat sonrası antibiyotik profilaksisi: Ameliyattan hemen sonra sırt boyun bölgesine deri altı enjeksiyon yoluyla sefazolin sodyum (50 mg / kg,% 0.9 salin içinde 50 mg / mL konsantrasyona çözülmüş) uygulayın.
- Yara hijyenini koruyun. İlk 3 gün boyunca günde bir kez tuzlu suyla nemlendirilmiş bir pamuklu çubuk kullanarak yarayı temizleyin ve cerrahi bölgeyi enfeksiyon, ayrışma veya iltihaplanma belirtileri açısından günlük olarak inceleyin.
- Ameliyat sonrası analjezi: Ameliyat sonrası 3 gün boyunca her 12 saatte bir carprofen (deri altından 5 mg / kg) uygulayın11.
NOT: Şekil 1D , iyileşme sonrası canlı bir fareye implante edilen fiksasyon sistemini göstermektedir.
11. Tehlikeli atık bertarafı
- Lisanslı bir tıbbi atık bertaraf tesisine transfer edilmek üzere "Biyolojik Tehlike" sembolleriyle etiketlenmiş sızdırmaz biyolojik tehlike torbalarında kemik tozu ve kanla kontamine olmuş malzemeleri toplayın.
- Kürlenmemiş protez taban malzemesini ve 502 tutkal kalıntılarını "Kimyasal Atık" etiketli sızdırmaz kimyasallara dayanıklı kaplara koyun ve bunları kimyasal atık yönetimi protokolleri aracılığıyla bertaraf edilmek üzere belirlenmiş havalandırmalı bir dolapta saklayın.
- İğneleri, neşter bıçaklarını ve kemik matkaplarını "Biyolojik Tehlike" etiketleriyle işaretlenmiş delinmeye dayanıklı kesici alet kaplarına atın.
12. Güvenlik uyarıları
- Protez bazlı malzemeleri tutarken, nitril eldiven ve koruyucu gözlük takarak doğrudan cilt temasından kaçının ve uçucu monomerlerin solunmasını en aza indirmek için iyi havalandırılan bir çeker ocakta karıştırma ve sertleştirme işlemi gerçekleştirin.
- Artık malzemeyi kurumsal yönergelere göre kimyasal atık olarak atın. 502 Siyanoakrilat yapıştırıcılar için, cilt veya göz temasını önleyin ve maruz kalma meydana gelirse derhal 15 dakika su ile yıkayın ve tıbbi yardım alın. Havalandırılan alanlarda kullanın, serin ve kuru yerlerde tutuşturucu kaynaklardan uzakta saklayın ve pamuklu veya yünlü kumaşlarla temasından kaçının.
- Hassas matkaplar kullanırken, el aletini sabitleyin, yüz siperi ve cerrahi maske takın ve termal yaralanmayı önlemek için delme alanını tuzlu suyla yıkayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Açık alan testi
Açık alan testi, ameliyatı takiben farelerde potansiyel davranış değişikliklerini değerlendirmek için tasarlanmıştır (Şekil 2A). Fareler için yeterli aktivite alanı sağlarken, nispeten tutarlı çevresel koşulları korumak ve dış müdahaleyi en aza indirmek için 40 cm × 40 cm'lik standart bir açık alan odası kullanıldı. Deney iki aşamadan oluşuyordu: ameliyat öncesi ve ameliyat sonrası 7 gün. Her aşamada, farelerin davranışlarını belgelemek için 10 dakikalık b...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışma, uyanık, serbest davranan farelerde omuriliğin hassas ultrason nöromodülasyonunu kolaylaştıran yeni bir vertebral eşleşme protokolü sunmaktadır. Konvansiyonel fiksasyon yaklaşımlarının aksine, bu metodoloji konvansiyonel fiksasyon yaklaşımlarının sınırlamalarının üstesinden gelir. Sürekli anestezi gerektiren katı stereotaktik çerçevelerin (nöral aktiviteyi baskılayan ve davranışsal değerlendirmelerikarmaşıklaştıran 10) ve omurga hareketinden
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma kısmen, Grant HKUSZH202207003 kapsamında Hong Kong Üniversitesi-Shenzhen Hastanesi'nin Üst Düzey Yetenek Bilimsel Araştırma Başlangıç Projesi tarafından desteklenmiştir. Protokol optimizasyonu ve hayvan bakımı konusundaki yardımları için tüm laboratuvar üyelerine ve kurumsal destekleri için Shenzhen İleri Teknoloji Enstitüsü, Çin Bilimler Akademisi'ne (SIAT) içtenlikle teşekkür ederiz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anestezi İndüksiyon Odası | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| Siyanoakrilat Yapıştırıcı (502 Tutkal) | Pekin Kimya İşleri | https://item.taobao.com/item.htm? detail_redpacket_pop=doğru& kimlik=736 869038961& ltk2=1752156592779 mdbp47qqp4vyv57mq156e& ns=1& fiyatTId=214780251752156543206 3926e1996& query=502%E8%83% B6%E6%B0%B4%20%E5%8C%97 %E4%BA%AC%E5%8C%96%E5% B7%A5%E5%8E%82& skuId=52584 34238219 | |
| Protez kaide malzemeleri | Yeni Yüzyıl Diş | https://www.sncdental.com/product-item-11.html | |
| Sabitleme çubuğu | Töre | ||
| İzofluran | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| Metal taban | Töre | ||
| Mikroenstrüman | Shenzhen Zongshi Bilimsel Aletler Co, Ltd | ||
| Hassas matkap | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| Küçük Hayvan Çok Kanallı Anestezi Sistemi | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia/data_66.html | |
| Fareler ve genç sıçanlar için stereotaktik adaptör | Changsha Mayue | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =doğru& kimlik=651346369142& ltk2=1752 157416717wlsrozz5uroehtbq5ycim4 & ns=1& priceTId=214781ce1752157 3520498589e101a& query=%E8%84 %91%E7%AB%8B%E4%BD%93%E5%AE% 9A%E4%BD%8D%E4%BB%AA%20% E9%95%BF%E6%B2%99%E8%BF% 88%E8%B6%8A& skuId=4891677573 207& spm=a21n57.1.hoverItem.14& utparam=%7B%22aplus_abtest% 22%3A%22a478799868a3178d0dd 433b763909e16%22%7D& xxc= taobaoArama | |
| Cerrahi mikroskop | Shenzhen Zongshi Bilimsel Aletler Co, Ltd | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| Cerrahi dikiş (Prolen) | Ethicon (Johnson & Johnson) | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =doğru& kimlik=774292384846& ltk2= 1752157506907c0321finubb5 rpkub6av6n& ns=1& priceTId= 214781ce1752157493734800 4e101a& sorgu=%E5%BC%B A%E7%94%9F%E7%BC%9D %E7%BA%BF& skuId=594224 1331046& spm=a21n57.1.hoverI | |
| Terramisin Oftalmik Merhem | Pfizer | https://theterramycin.com/terramycin-ophthalmic-ointment/ | |
| Ultrasonik kolimatör | Töre |
Kaynaklar
- Song, W., et al. Transspinal focused ultrasound suppresses spinal reflexes in healthy rats. Neuromodulation. 27 (4), 614-624 (2024).
- Tsehay, Y., et al. Low-intensity pulsed ultrasound neuromodulation of a rodent's spinal cord suppresses motor evoked potentials. IEEE Trans Biomed Eng. 70 (7), 1992-2001 (2023).
- Kim, E., Kum, J., Kim, H. Trans-spinal focused ultrasound stimulation selectively modulates descending motor pathway. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 30, 314-320 (2022).
- Hong, Y. -R., et al. Ultrasound stimulation improves inflammatory resolution, neuroprotection, and functional recovery after spinal cord injury. Sci Rep. 12 (1), 3636(2022).
- Hwang, B. Y., et al. Ultrasound in traumatic spinal cord injury: A wide-open field. Neurosurgery. 89 (3), 372-382 (2021).
- Liao, Y. -H., et al. Low-intensity focused ultrasound alleviates spasticity and increases expression of the neuronal K-Cl cotransporter in the l4-l5 sections of rats following spinal cord injury. Front Cell Neurosci. 16, 882127(2022).
- Payne, A. H., et al. Magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound to increase localized blood-spinal cord barrier permeability. Neural Regen Res. 12 (12), 2045-2049 (2017).
- Fletcher, S. -M. P., Choi, M., Ogrodnik, N., O'Reilly, M. A. A porcine model of transvertebral ultrasound and microbubble-mediated blood-spinal cord barrier opening. Theranostics. 10 (17), 7758-7774 (2020).
- Liao, Y. -H., Wang, B., Chen, M. -X., Liu, Y., Ao, L. -J. Lifu alleviates neuropathic pain by improvingthe kcc2 expression and inhibiting the camkiv-kcc2 pathway in the l4-l5 section of the spinal cord. Neural Plast. 2021, 6659668(2021).
- Song, W., Giannotti, A., Bekiaridou, A., Bloom, O., Zanos, S. Low intensity trans-spinal focused ultrasound reduces mechanical sensitivity and suppresses spinal microglia activation in rats with chronic constriction injury. Bioelectron Med. 11 (1), 8(2025).
- Glasenapp, A., Bankstahl, J. P., Bähre, H., Glage, S., Bankstahl, M. Subcutaneous and orally self-administered high-dose carprofen shows favorable pharmacokinetic and tolerability profiles in male and female C57bl/6j mice. Front Vet Sci. 11, 1430726(2024).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
