Yöntem makalesi

Düşük Girişli Birincil Fare Kolanjiyositlerinde Kromatin Durum Geçişlerinin Profilini Çıkarmak için Multi-omik Teknikler

DOI:

10.3791/68606

⸱

3 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Oncology, Tianjin First Central Hospital, School of Medicine, Nankai University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 3Shenzhen Hospital, Southern Medical University, 4Tianjin Institute of Urology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin Medical University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazması, histon modifikasyonlarının profilini çıkarmak için düşük girdili ChIP-seq ve küçük miktarlarda birincil fare kolanjiyositlerinde kromatin erişilebilirliğini değerlendirmek için ATAC-seq için kapsamlı bir protokol sunmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polikistik karaciğer hastalığı (PLD), kolanjiyositlerden türetilen içi sıvı dolu kistlerin oluşumu ile karakterize, ilerleyici hastalığa ve hastaların yaşam kalitesinde belirgin azalmaya yol açan kalıtsal bir hastalıktır. PLD için mevcut tedaviler yetersizdir ve yeni terapötik stratejilere olan ihtiyacı vurgulamaktadır. PLD ilerlemesinde epigenetik düzenlemenin rolü, özellikle kromatin erişilebilirliği ve histon modifikasyonları yeterince araştırılmamıştır. ChIP-seq ve DNase-seq gibi geleneksel epigenetik profilleme teknikleri, primer kolanjiyositlerden elde edilmesi zor olan çok sayıda hücre gerektirir. Bunu ele almak için, düşük sayıda birincil kolanjiyosit için düşük girdili ChIP-seq ve ATAC-seq protokollerini optimize ettik. Bu yaklaşımlar, minimum hücre girdisi ile histon modifikasyonlarının ve kromatin erişilebilirliğinin analizine izin verir. Düşük girişli ChIP-seq, DNA parçalanması için mikrokokal nükleaz (MNaz) kullanırken, ATAC-seq, açık kromatin bölgelerini yakalamak için Tn5 transpozaz kullanır. Bu multi-omik teknikler, PLD ve diğer biliyer hastalıklarda kolanjiyosit kader geçişleri sırasında kromatin durum dinamikleri hakkında değerli bilgiler sağlar. Daha da önemlisi, optimize edilmiş protokoller, çeşitli hücresel bağlamlarda epigenetik mekanizmaların araştırılmasını sağlayarak, diğer düşük girdili birincil hücrelere güvenle uygulanabilir. Bu çalışma, kromatin durum değişikliklerini incelemek için sistematik bir yaklaşım sunarak PLD ve ilgili hastalıklar için epigenetik temelli terapötik stratejilerin geliştirilmesine katkıda bulunmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PLD, kolanjiositlerden köken alan çok sayıda içi sıvı dolu kistin gelişimi ile karakterize kalıtsal bir hastalıktır. Bu kistler giderek genişledikçe hastaların yaşam kalitesini ciddi şekilde etkilerler 1,2. PLD için mevcut tedavi stratejileri yetersizdir, sadece sınırlı faydalar sağlarken sıklıkla yüksek nüks oranlarına ve komplikasyonlara yol açmaktadır 3,4. Bu nedenle, PLD tedavisinde çözülmemiş klinik zorlukların üstesinden gelmek için daha güvenli ve daha etkili terapötik yaklaşımlara acil bir ihtiyaç vardır.

Normal koşullar altında, kolanjiyositler hareketsiz kalırken, PLD'de hastalığın ilerlemesinin önemli bir itici gücü olan aşırı proliferasyon sergilerler 5,6. Bu kistik geçişin altında yatan moleküler mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. Kromatin erişilebilirliği ve histon modifikasyonları dahil olmak üzere epigenetik düzenleme, hücre kaderi geçişlerinde hayati bir rol oynarken, 7,8, PLD ilerlemesindeki rolü yeterince çalışılmamıştır. Bununla birlikte, birçok epigenetik profilleme tekniği çok sayıda hücre gerektirir. Sonikasyon ile kromatin parçalanmasına dayanan geleneksel ChIP-seq'in yanı sıra DNase-seq ve MNase-seq gibi kromatin erişilebilirlik deneylerine dayanan geleneksel ChIP-seq, tipik olarak birincil kolanjiyositlerden elde edilebilecek sayıyı çok aşan 106'dan fazla hücre gerektirir.

Bu el yazması, histon modifikasyonlarının profilini çıkarmak için düşük girişli ChIP-seq 9,10,11 ve düşük sayıda primer kolanjiyositte kromatin erişilebilirliğini değerlendirmek için ATAC-seq 11,12,13 için kapsamlı bir protokol sağlar. Düşük girdili ChIP-seq, DNA9'u parçalamak için MNase kullanırken, ATAC-seq, Tn5 transpozaz12 kullanarak açık kromatin bölgelerinden DNA fragmanlarını yakalar. Bu yaklaşımları kullanan multi-omik analiz, PLD ve diğer biliyer hastalıklarda kolanjiyosit kader geçişleri sırasında kromatin durum dinamikleri hakkında değerli bilgiler sunar ve böylece epigenetik hedefli tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ATAC-seq için çözeltilerin ve kolanjiyositlerin hazırlanması

  1. ATAC-seq deneyinden en az 1 gün önce, Tablo 1'de listelenen reaktifleri kullanarak ATAC Lizis Tamponunu hazırlayın.
    NOT: ATAC Lizis Tamponu karanlıkta 4 °C'de en az 1 ay saklanabilir.
  2. Yeni izole edilmiş primer kolanjiyositler14 için, izolasyondan hemen sonra bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve ATAC-seq deneyine devam edin.
    NOT: Hücre canlılığı üzerindeki etkiyi en aza indirmek için ne kadar erken olursa o kadar iyidir. Bununla birlikte, buz üzerinde tutulursa, 2 saat içinde ilerlemek genellikle bir sorun değildir.

2. ATAC-devamı

NOT: ATAC-seq için 100.000 kolanjiyosit kullanın. Numuneleri ve çözeltileri buz üzerinde tutun. ATAC-seq deneyi için tüm prosedür yaklaşık 2 gün sürer.

  1. 500 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  2. Süpernatanı atın, Proteaz İnhibitörü içeren 200 μL ATAC Lizis Tamponu ekleyin, karıştırmak için hafifçe pipetleyin ve 20 dakika buz üzerinde inkübe edin. İlk 10 dakika boyunca karıştırmak için hafifçe pipetleyin.
  3. 1.500 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  4. ATAC DNA Kütüphanesi Hazırlık Kitinden 3 μL Enzim Karışımı, ATAC DNA Kütüphanesi Hazırlık Kitinden 10 μL 5x Tampon ve 37 μL Nükleaz içermeyen suyu karıştırarak Transpozisyon Reaksiyon Tamponunu (50 μL) hazırlayın. İyice karıştırın.
  5. Süpernatanı dikkatlice atın, toplanan nükleer peleti buzun üzerine yerleştirin ve hemen 50 μL Transpozisyon Reaksiyon Tamponu ekleyin. Nazikçe yeniden süspanse edin ve 37 ° C'de 60 dakika inkübe edin, karıştırmak için her 10 dakikada bir tüpün altını hafifçe vurun.
    NOT: Hücrelerin kurumasını önlemek için süpernatanı atmadan önce Transpozisyon Reaksiyon Tamponunu hazırlayın.
  6. Üreticinin talimatlarına göre PCR Saflaştırma Kitini kullanarak DNA'yı saflaştırın.
    NOT: Kolanjiyosit izolasyon işleminden14 kalan Protein G boncukları bu adımda çıkarılabilir. DNA örnekleri uzun süreli koruma için -80 °C'de saklanabilir.
  7. Üreticinin talimatlarına göre ATAC DNA Kitaplığı Hazırlık Kitini kullanarak kitaplık yapımını gerçekleştirin.
    NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm numuneleri ve çözeltileri buz üzerinde saklayın. Prosedürler diğer kit markaları arasında farklılık gösterse de, hepsi protokolümüzle uyumludur.
    1. PCR Zenginleştirme: Aşağıdaki bileşenleri belirtilen sırayla karıştırarak PCR Zenginleştirme Karışımını (50 μL) bir PCR tüpünde hazırlayın: 10 μL DNA örneği (adım 2.6'dan itibaren), 14 μL Nükleaz içermeyen su, 10 μL 5x TAB, 5 μL PPM, 1 μL TAE, 5 μL P5 primeri ve 5 μL P7 primeri. Karıştırmak için hafifçe pipetleyin.
    2. Tüpü bir PCR cihazına aktarın ve aşağıdaki programı çalıştırın: (3 dakika için 72 °C) x 1 döngü, (30 saniye için 98 °C) x 1 döngü, (15 saniye boyunca 98 °C, 30 saniye için 60 °C, 3 dakika için 72 °C) x 15 döngü ve (5 dakika için 72 °C) x 1 döngü ve 4 °C'de tutun.
    3. Saflaştırma: DNA Clean boncuklarını kullanmadan önce 30 dakika oda sıcaklığına getirin, ardından iki aşamalı bir manyetik boncuk saflaştırması gerçekleştirin.
      1. İlk tur: PCR ürünlerine (adım 2.7.2'den itibaren) 30 μL DNA Temiz boncuk ekleyin, karıştırmak için hafifçe pipetleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. PCR tüpünü manyetik bir ayırıcı üzerine yerleştirin ve çözelti berraklaşana kadar bekleyin (~5 dakika). Süpernatanı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın ve DNA Temiz boncukları atın.
      2. İkinci tur: Toplanan süpernatanıma 7,5 μL DNA Temiz boncuk ekleyin (adım 2.7.3.1'den itibaren), karıştırmak için hafifçe pipetleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Tüpü manyetik bir ayırıcı üzerine yerleştirin ve çözelti berraklaşana kadar bekleyin (~ 5 dakika). Süpernatanı dikkatlice atın.
    4. Tüpü manyetik ayırıcı üzerinde tutun ve oda sıcaklığında 200 μL taze hazırlanmış% 80 etanol ile DNA Clean boncuklarını 2 x 30 saniye durulayın. Her durulamadan sonra süpernatanı dikkatlice atın. Tüp hala manyetik ayırıcı üzerindeyken, tüp kapağını açın ve boncukları 10 dakika havayla kurutun. Son olarak, DNA'yı elüte etmek için 22 μL Nükleaz içermeyen su ekleyin.
      NOT: DNA örnekleri uzun süreli koruma için -80 °C'de saklanabilir.
  8. Standart bir yeni nesil sıralayıcı kullanarak kitaplıkları sıralayın.
    NOT: En az 50 milyon çift uçlu okuma almanızı öneririz.

3. Düşük girdili ChIP-seq için çözeltilerin ve kolanjiyositlerin hazırlanması

  1. Düşük girişli ChIP-seq deneyinden en az 1 gün önce, Tablo 2, Tablo 3, Tablo 4 ve Tablo 5'te listelenen reaktifleri kullanarak ChIP Lizis Tamponu, ChIP MNaz Tamponu, ChIP Durdurma Tamponu, ChIP 2x RIPA Tamponu, ChIP RIPA Tamponu ve ChIP LiCl Tamponunu hazırlayın.
    NOT: Yukarıdaki solüsyonlar en az 1 ay boyunca 4 °C'de saklanabilir.
  2. Yeni izole edilmiş primer kolanjiyositler14 için, izolasyondan hemen sonra bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve düşük girişli ChIP-seq deneyine devam edin.
    NOT: Hücre canlılığı üzerindeki etkiyi en aza indirmek için ne kadar erken olursa o kadar iyidir. Bununla birlikte, buz üzerinde tutulursa, 2 saat içinde ilerlemek genellikle bir sorun değildir.

4. Düşük girdili ChIP-seq'in 1. günü: Hücre lizisi, MNaz sindirimi ve Antikor inkübasyonu

NOT: Düşük girişli ChIP-seq deneyi için tüm prosedür yaklaşık 3 gün sürer.

  1. Kolanjiyositleri tüp başına 100.000 hücreye bölün ve numuneleri ve çözeltileri buz üzerinde tutun.
    NOT: Birden fazla histon modifikasyonu için düşük girişli bir ChIP-seq deneyi gerçekleştiriliyorsa, histon modifikasyon antikorunu eklemeden önce hacmi orantılı olarak büyütmek kabul edilebilir. Aşağıdaki adımlardaki reaktif hacimleri, 1 × 105 hücre içeren bir tüpe dayanmaktadır.
  2. 2.000 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  3. Süpernatanı atın, Proteaz İnhibitörü içeren 19 μL ChIP Lizis Tamponu ekleyin, karıştırmak için hafifçe pipetleyin ve 10 dakika buz üzerinde inkübe edin. Baloncuk oluşturmaktan kaçının.
  4. 19 μL ChIP MNase Tamponu ekleyin ve karıştırmak için hafifçe pipetleyin.
  5. 2 μL MNase (0,01 U/μL) ekleyin ve karıştırmak için hafifçe pipetleyin. 37 °C'de 5 dakika inkübe edin.
    NOT: Kuluçka süresi kritiktir. MNaz'ın son konsantrasyonu 0.0005 U / μL'dir. Optimal MNaz konsantrasyonu, hücre tipine ve sayısına göre belirlenebilir.
  6. Numuneyi hemen buzun üzerine yerleştirin, sindirimi sonlandırmak için 5 μL ChIP STOP Tamponu ekleyin ve karıştırmak için hafifçe pipetleyin.
  7. Proteaz İnhibitörü içeren 45 μL ChIP 2x RIPA Tamponu ekleyin, karıştırmak için hafifçe pipetleyin ve 10 dakika buz üzerinde daha fazla inkübe edin.
  8. 20.000 × g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı yavaşça yeni bir tüpe aktarın.
    NOT: Kolanjiyosit izolasyon işleminden14 kalan Protein G boncukları bu adımda çıkarılabilir.
  9. 40 μL ChIP RIPA tamponu ekleyin.
  10. İmmünopresipitasyon (IP) numuneleri için, numune başına 1 μg antikor ekleyin ve süspansiyonu gece boyunca 4 ° C'de bir döndürücü (20 rpm) üzerinde inkübe edin.
  11. Giriş numuneleri için herhangi bir antikor eklemeyin ve süspansiyonu gece boyunca 4 ° C'de bir döndürücü (20 rpm) üzerinde inkübe edin.

5. Düşük girdili ChIP-seq'in 2. günü: İmmünopresipitasyon, Yıkama ve Elüsyon

NOT: IP örnekleri için 5.1-5.7 adımlarını izleyin. Giriş örnekleri için 5.8-5.12 adımlarını izleyin.

  1. Protein G boncuklarını 1 mL buz gibi soğuk ChIP RIPA Tamponu ile önceden yıkayın.
  2. Numunelere 400 μg Protein G boncukları ekleyin ve 2 saat boyunca 4 ° C'de rotasyonla (20 rpm) inkübe edin.
  3. Boncukları 150 μL buz gibi soğuk ChIP RIPA Tamponu ile 5 x 5 dakika boyunca bir döndürücüde (20 rpm) 4 °C'de 5 dakika yıkayın. Manyetik bir ayırıcı kullanarak süpernatanı çıkarın.
  4. Boncukları 150 μL buz gibi soğuk ChIP LiCl Tampon ile bir döndürücüde (20 rpm) 4 °C'de 5 dakika yıkayın. Manyetik bir ayırıcı kullanarak süpernatanı çıkarın.
  5. Boncukları yeniden süspanse etmek için 30 μL ChIP Elüsyon Tamponu (29 μL Nükleaz içermeyen su ve 1 μL Proteinaz K) ekleyin ve 900 dakika boyunca 55 ° C'de 900 rpm'de çalkalayın. Boncukları askıda tutmak için tüpü periyodik olarak hafifçe vurun.
  6. Süpernatanı manyetik bir ayırıcı kullanarak toplayın ve yavaşça yeni bir tüpe aktarın. Proteinaz K'yi inaktive etmek için 72 ° C'de 40 dakika inkübe edin.
  7. Bir florometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün.
    NOT: DNA örnekleri uzun süreli koruma için -80 °C'de saklanabilir.
  8. Giriş numuneleri için 1 μL Proteinaz K ekleyin ve 900 rpm'de 55 °C'de 90 dakika çalkalayın.
  9. Fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanarak DNA'yı saflaştırın. 130 μL DNA Ekstraksiyon Reaktifi ekleyin ve çözelti pembeye dönene kadar kuvvetlice girdaplayın. 20.000 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  10. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın, 130 μL buz gibi soğuk izopropanol ekleyin ve ardından 1 μL glikojen ve 6.5 μL 3M NaAc ekleyin. 20.000 × g'da 15 dakika santrifüjleyin.
  11. Süpernatanı atın, 1 mL% 70 etanol ile bir kez yıkayın ve 20.000 × g'da 15 dakika santrifüjleyin. Peleti kurutun ve 30 μL Nükleaz içermeyen suda tekrar süspanse edin.
  12. Bir florometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün.
    NOT: DNA örnekleri uzun süreli koruma için -80 °C'de saklanabilir.

6. Düşük girdili ChIP-seq'in 3. günü: Kütüphane inşası ve Sıralama

  1. Üreticinin talimatlarına göre bir ChIP DNA Kitaplığı Hazırlık Kiti kullanarak kitaplık yapımını gerçekleştirin.
    NOT: Adımlar Sonlandırma Hazırlığı, Adaptör Ligasyonu ve Kitaplık Amplifikasyonunu içerir. Kitaplık yapımı için 5 ng ChIP numunesi (Giriş ve IP numuneleri) pipetleyin. Aksi belirtilmedikçe tüm numuneleri ve çözeltileri buz üzerinde saklayın. Prosedürler diğer kit markaları arasında farklılık gösterse de, hepsi protokolümüzle uyumludur.
  2. Son Hazırlık: Son Hazırlama Reaksiyon Tamponunu (65 μL) 5 ng DNA örneğini (adım 5.6 veya adım 5.11'den), 15 μL Son Hazırlık Karışımı 4, 6.5 μL Tris EDTA ve Nükleaz içermeyen suyu 65 μL'lik bir nihai hacme karıştırarak bir PCR tüpünde hazırlayın. Karıştırmak için hafifçe pipetleyin. Tüpü bir PCR cihazına aktarın ve aşağıdaki programı çalıştırın: 20 °C 15 dakika, 65 °C 15 dakika ve 4 °C'de tutun (Sıcak Kapak: 105 °C).
  3. Adaptör Ligasyonu: DNA Adaptör S'yi 1:100 oranında seyreltin. 65 μL Son Hazırlama Ürünleri (adım 6.2'den itibaren), 25 μL Hızlı Ligasyon tamponu 2, 5 μL Hızlı DNA ligaz ve 5 μL seyreltilmiş DNA Adaptör S'yi karıştırarak Adaptör Ligasyon Reaksiyon Tamponunu (100 μL) bir PCR tüpünde hazırlayın. Tüpü bir PCR cihazına aktarın ve aşağıdaki programı çalıştırın: 20 °C'de 15 dakika, ardından 4 °C'de tutun (Sıcak Kapak: 105 °C).
  4. Arıtma:
    1. Kullanmadan önce DNA Clean boncuklarını 30 dakika oda sıcaklığına getirin. Adaptör Ligasyonu ürünlerine 60 μL DNA Temiz boncuk ekleyin (adım 6.3'ten itibaren). Karıştırmak için hafifçe pipetleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    2. PCR tüpünü manyetik bir ayırıcı üzerine yerleştirin ve çözelti berraklaşana kadar bekleyin (~5 dakika). Süpernatanı dikkatlice atın.
    3. Tüpü manyetik ayırıcı üzerinde tutun. DNA Clean boncuklarını oda sıcaklığında 200 μL taze hazırlanmış% 80 etanol ile 2 x 30 saniye durulayın. Her durulamadan sonra süpernatanı dikkatlice atın.
    4. Tüp hala manyetik ayırıcı üzerindeyken, tüp kapağını açın ve boncukları 5 dakika havayla kurutun. Son olarak, DNA'yı elüte etmek için 22.5 μL 10 mM Tris-HCL (PH 8.0) ekleyin.
  5. Kütüphane Amplifikasyonu: 20 μL Saflaştırma ürünü (adım 6.4'ten itibaren), 2.5 μL i5 PCR Primer, 2.5 μL i7 PCR Primer ve 25 μL Amplifikasyon Karışımını karıştırarak bir PCR tüpünde Kütüphane Amplifikasyon Reaksiyon Tamponunu (50 μL) hazırlayın. Karıştırmak için hafifçe pipetleyin. Tüpü bir PCR cihazına aktarın ve aşağıdaki programı çalıştırın: (3 dakika boyunca 95 °C) x 1 döngü, (20 saniye boyunca 98 °C, 15 saniye için 60 °C, 30 saniye için 72 °C) x 18 döngü, (5 dakika için 72 °C) x 1 döngü ve 4 °C'de tutun.
  6. Saflaştırma: DNA Clean boncuklarını kullanmadan önce 30 dakika oda sıcaklığına getirin, ardından iki aşamalı bir manyetik boncuk saflaştırması gerçekleştirin.
    1. İlk tur: Kütüphane Amplifikasyon ürünlerine 30 μL DNA Temiz boncuk ekleyin (adım 6.5'ten itibaren). Karıştırmak için hafifçe pipetleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. PCR tüpünü manyetik bir ayırıcı üzerine yerleştirin ve çözelti berraklaşana kadar bekleyin (~5 dakika). Süpernatanı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın ve DNA Temiz boncukları atın.
    2. İkinci tur: Toplanan süpernatanıma 7,5 μL DNA Temiz boncuk ekleyin. Karıştırmak için hafifçe pipetleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Tüpü manyetik bir ayırıcı üzerine yerleştirin ve çözelti berraklaşana kadar bekleyin (~ 5 dakika). Süpernatanı dikkatlice atın. Tüpü manyetik ayırıcı üzerinde tutun. DNA Clean boncuklarını oda sıcaklığında 200 μL taze hazırlanmış% 80 etanol ile 2 x 30 saniye durulayın. Her durulamadan sonra süpernatanı dikkatlice atın. Tüp hala manyetik ayırıcı üzerindeyken, tüp kapağını açın ve boncukları 10 dakika havayla kurutun. Son olarak, DNA'yı elüte etmek için 22.5 μL 10 mM Tris-HCl (PH 8.0) ekleyin.
      NOT: DNA örnekleri uzun süreli koruma için -80 °C'de saklanabilir.
  7. Kitaplıkları standart bir yeni nesil sıralayıcıda sıralayın.
    NOT: En az 10-20 milyon çift uçlu okuma almanızı öneririz.

7. ATAC-seq ve Düşük girdili ChIP-seq veri analizi

  1. Analizin sanal ortamda hazırlanması (miniconda)
    1. Aşağıdaki komutları kullanarak Miniconda3'ü web sitesinden indirin ve Miniconda'nın kurulum talimatlarını izleyin.
      wget https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
      bash Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
    2. Hem ATAC-seq hem de ChIP-seq analiz hattı için sanal bir ortam oluşturun.
      conda create -n NGSpipeline
      conda NGSpipeline'ı etkinleştirin
      Conda install bioconda::fastqc bioconda::multiqc bioconda::trim-galore bioconda::bowtie2 bioconda::samtools bioconda::macs2 bioconda::d eeptools bioconda::p icard bioconda::igv
    3. Referans genom dizi dosyasını indirin ve papyon2 hizalaması için bir hizalama indeksi oluşturun.
      wget https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_mouse/release_M25/GRCm38.p6.genome.fa.gz
      gunzip GRCm38.p6.genome.fa.gz
      papyon2-yapı-s GRCm38.p6.genome.fa GRCm38_bowtie2_index
  2. FastQC ile ATAC-seq okumalarının ve ChIP-seq okumalarının kalite kontrolünü gerçekleştirin ve sıralama sonuçlarının GC yanlılığını ve aşağı akış analizi için yeterli kitaplık karmaşıklığını sağlamak için MultiQC kullanarak kalite kontrol raporunu özetleyin. Önemli farklı kalite kontrol sonuçları ile dizi kitaplığını atın.
    fastqc -o <çıktı dizini> ......
    multiqc     <çıkış dizini>
  3. Trim bolore kullanarak trim sıralama adaptörünü kırpın.
    trim_galore -q 20 --phred33 --stringency 3 --length 25 -e 0.1 --paired -j -o
  4. Varsayılan parametreleri kullanarak kırpılmış okumaları Bowtie2 ile mm10 referans genom düzeneğine eşleyin ve ATAC-seq parçasının geniş uzunluk dağılımı nedeniyle ATAC-seq için ekleme parametrelerini (--very-sensitive -X 2000) bowtie2'ye geçirin.
    1. ATAC-seq için:
      bowtie2 -p --çok hassas -X 2000 -x -1 < 4.2'den temizlenmiş fastq dosyası okuma 1> -2 < 4.2'den temizlenmiş fastq dosyası okuma 2> | samtools görünümü -S -O BAM -@ -o <çıktı BAM dosyası>
    2. ChIP-seq için:
      papyon2 -p -x -1 < temizlenmiş fastq dosyası 4.2'den okundu 1> -2 < temizlenmiş fastq dosyası 4.2'den okundu 2> | samtools görünümü -S -O BAM -@ -o <çıktı BAM dosyası>
  5. Düşük hizalama skoru (q30) ile okumaları ve mitokondri genomu ve standart olmayan kromozomla hizalanmış okumaları çıkarın.
    samtools görünümü -bh -q 30 -f 2 | samtools görünümü -h | grep -v 'chrM' | grep -v 'rastgele' | grep -v 'chrUn' | samtools sıralama -l 9 -O BAM -o <çıktı filtrelenmiş BAM dosyası>
  6. PCR yinelenen okumalarını kaldırmak için Picard MarkDuplicates komutunu kullanın.
    picard MarkDuplicates I= O=<çıktı çoğaltma bam dosyasını kaldır> M=<çoğaltma raporu dosyasını kaldır> REMOVE_DUPLICATES=true
  7. -f BAMPE -g mm -B -q 2 parametresi ile MACS0.01 çağrı zirvesi komutunu kullanarak tepe noktasını arayın.
    macs2 callpeak -f BAMPE -t <çoğaltmayı kaldır bam dosyası > -g mm -n <çıktı öneki> -B -q 0.01
  8. Deeptools BamCoverage komutunu kullanarak BigWig dosyaları oluşturun.
    Samtools dizini <çoğaltma BAM dosyasını kaldır> -@ 4
    bamCoverage -b     <çoğaltmayı kaldır bam dosyası> -o <çıktı BigWig dosyası> -bs 50 -p --effectiveGenomeSize2652783500--normalizeRPGC -e -ignoreDuplicates kullanarak
  9. macs2'den narrowPeak dosyasını ve Deeptools BamCoverage'dan BigWig dosyalarını görüntülemek için IGV genom tarayıcısını kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birincil kolanjiyositlerin kromatin manzarasını oluşturmak için, düşük sayıda (~ 100.000) birincil kolanjiyosit için düşük girdili ChIP-seq ve ATAC-seq protokollerini optimize ettik. Primer kolanjiyositler için agaroz jel elektroforezi sonuçları, 1 × 105 primer kolanjiyosit için, 5 dakika boyunca 37 ° C'de 0.02 U MNaz'ın, optimal konsantrasyon olarak tanımlanan mononükleozom üretimi ile sonuçlandığını göstermiştir (Şekil 1).

ATAC-seq ve H3K9ac/H...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kistik kolanjiyositlerin durum geçişinin altında yatan kromatin durum dinamiklerini sistematik ve kapsamlı bir şekilde haritalamak için, sınırlı sayıda primer kolanjiyosit için düşük girdili ChIP-seq ve ATAC-seq'i başarıyla optimize ettik. Bu çalışma primer kolanjiyositlere odaklanmış olsa da, protokolün sınırlı kullanılabilirliğe sahip diğer yüksek canlılığa sahip primer hücrelere de uygulanabileceğinden eminiz. Benzer şekilde, bu çalışma yalnızca H3K9ac ve H3K9me3'ün ChIP-seq analiz so...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (82402166'den RJ'ye) alınan hibelerle desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.5 M EDTASolarbioE1170
1 M Tris-HCl (pH = 7.5)SolarbioT1140
1 M Tris-HCl (pH = 8.0)SolarbioT1150
3 M NaAcBeyotimeST342
8 M LiClSigmaL7026
Agaroz jelBiosharpBS081
ATAC DNA Kütüphanesi Hazırlık KitiVazymeTD501
CaCl2Sangon BiotechA5013301 M stok
ChIP DNA Kütüphanesi Hazırlık KitiVazymeND607
DNA Temiz boncuklarVazymeN411
DNA Ekstraksiyon ReaktifiSolarbioP1012
EGTASolarbioE8050100 mM (pH = 8) stok
FlorometreInvitrogenQ33226
GlikojenThermo ScientificR0561
HemositometreQIUJINGXB. K.25.
Igepal CA-630SigmaI8896%10 stok
Manyetik ayırıcıPromegaZ5342
MgCl2Sangon BiotechA1002881.5 M stok
MNaseSigmaN37550.01 U/&mikro; L stok
NaClSangon BiotechA6104765 M stok
NP40SolarbioN8030
Nükleaz içermeyen suYaşam TeknolojileriAM9937
PCR cihazıUygulamalı Biyosistemler4484073
PCR Saflaştırma KitiQIAGEN28106
Proteaz İnhibitörüRoche
Protein G boncuklarıInvitrogen10004D
Proteinaz KTransGenGE201-01
DöndürücüKylin-BellQB-528
SDSSolarbioS801010 & nbsp stok
Sodyum deoksikolatSigmaS1827
Termomikser konforuEppendorf5355
Triton X-100SolarbioT8200
Tween-20SolarbioT8220
SoftwareCitation (PMID)/Company<strong>VersionWebsite
Bowtie2223882862.3.5.1https://github.com/BenLangmead/bowtie2
Deeptools270799753.4.3https://deeptools.readthedocs.io/en/latest/
FastQC0.12.1https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
IGV212210952.12.3https://igv.org/
MACS2187989822.2.7.1https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_peak_calling_macs.html
MinicondaAnaconda4.7.12.1https://www.anaconda.com/
MultiQC273124111.23https://seqera.io/multiqc/
Picard2.27.5https://broadinstitute.github.io/picard/
samtools335908611.6https://www.htslib.org/
Donanım Genişliği0.6.6https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/
04693132001%

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perugorria, M. J., et al. Polycystic liver diseases: Advanced insights into the molecular mechanisms. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (12), 750-761 (2014).
  2. Olaizola, P., et al. Genetics, pathobiology and therapeutic opportunities of polycystic liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 19 (9), 585-604 (2022).
  3. Masyuk, T. V., Masyuk, A. I., Larusso, N. F. Polycystic liver disease: Advances in understanding and treatment. Annu Rev Pathol. 17, 251-269 (2022).
  4. Masyuk, T. V., Masyuk, A. I., Larusso, N. F. Therapeutic targets in polycystic liver disease. Curr Drug Targets. 18 (8), 950-957 (2017).
  5. Caballero-Camino, F. J., et al. Synthetic conjugates of ursodeoxycholic acid inhibit cystogenesis in experimental models of polycystic liver disease. Hepatology. 73 (1), 186-203 (2021).
  6. Masyuk, A. I., Masyuk, T. V., Trussoni, C. E., Pirius, N. E., Larusso, N. F. Autophagy promotes hepatic cystogenesis in polycystic liver disease by depletion of cholangiocyte ciliogenic proteins. Hepatology. 75 (5), 1110-1122 (2022).
  7. Meng, Y., et al. Epigenetic programming defines haematopoietic stem cell fate restriction. Nat Cell Biol. 25 (6), 812-822 (2023).
  8. Perino, M., Veenstra, G. J. Chromatin control of developmental dynamics and plasticity. Dev Cell. 38 (6), 610-620 (2016).
  9. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification h3k4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  10. Brind'amour, J., et al. An ultra-low-input native chip-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033(2015).
  11. Liu, Z., Zhang, L., Chen, Y. Epigenomic, cistromic, and transcriptomic profiling of primary kidney tubular cells. J Biol Methods. 11 (2), e99010015(2024).
  12. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  13. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by atac-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  14. Ji, R., Qing, B., Chen, J., Zhao, Z., Zhang, L. Isolation and culture of primary cholangiocytes from mice with polycystic liver disease using a two-step digestion method. J Vis Exp. (219), e68202(2025).
  15. Spirli, C., et al. Cyclic amp/pka-dependent paradoxical activation of raf/mek/erk signaling in polycystin-2 defective mice treated with sorafenib. Hepatology. 56 (6), 2363-2374 (2012).
  16. Lin, T. C. Runx1 and cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (3), 188715(2022).
  17. Spirli, C., et al. Mammalian target of rapamycin regulates vascular endothelial growth factor-dependent liver cyst growth in polycystin-2-defective mice. Hepatology. 51 (5), 1778-1788 (2010).
  18. Ji, R., et al. Multi-omics profiling of cholangiocytes reveals sex-specific chromatin state dynamics during hepatic cystogenesis in polycystic liver disease. J Hepatol. 78 (4), 754-769 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Multi omics TechniquesChromatin StateLow input ChIP seqATAC seq ProtocolChromatin AccessibilityHistone ModificationsPrimary CholangiocytesEpigenetic ProfilingMicrococcal NucleaseTn5 Transposase
Video yakında

İlgili makaleler