Kemirgen Beyin Mikrovaskülatürünün Süper Çözünürlüklü Haritalanması için Ultrason Lokalizasyon Mikroskobu

Özet

Ultrason Lokalizasyon Mikroskobu (ULM), mikrovasküler sistemin in vivo görüntülenmesinde benzeri görülmemiş bir çözünürlük düzeyine izin veren yakın zamanda geliştirilmiş bir tekniktir. Bu çalışmada, klinik öncesi araştırmalar için tasarlanmış standartlaştırılmış bir fonksiyonel ultrason görüntüleme platformu kullanarak kemirgenlerde beyin mikrovaskülatürünün süper çözünürlüklü görüntülerinin nasıl elde edileceğini ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Özet

Ultrason Lokalizasyon Mikroskobu (ULM), geleneksel ultrasonun kırınım sınırını aşarak beynin mikrovasküler mimarisinin in vivo görselleştirilmesini sağlayan süper çözünürlüklü bir görüntüleme tekniğidir. ULM, intravenöz olarak enjekte edilen mikro kabarcıkları serebral damarlarda dolaşırken tespit edip izleyerek, 5-10 μm'ye kadar uzaysal ölçeklerde vasküler yoğunluk, akış hızı ve geri saçılan sinyal genliğinin yüksek çözünürlüklü haritalarını üretir. Bu protokol, özel bir fonksiyonel ultrason platformu kullanarak hayvan hazırlama, prob konumlandırma, görüntü elde etme, mikro kabarcık enjeksiyonu ve veri işleme dahil olmak üzere kemirgenlerde ULM görüntülemeyi gerçekleştirmek için eksiksiz bir iş akışı sunar. Fareler (transkraniyal) ve sıçanlar (kraniyal pencereli) için uyarlanmış iki hazırlama yöntemi açıklanır, ardından entegre bir beyin atlası kullanılarak prob hizalaması ve anatomik hedefleme için ayrıntılı talimatlar verilir. Alım sırasında, ultra hızlı ultrason dizileri, dinamik akış verilerini yakalamak için mikro kabarcıkların bolus enjeksiyonları ile senkronize edilir. Sonraki yeniden yapılandırma adımları, dağınıklık filtrelemeyi, görüntü enterpolasyonunu, mikro kabarcık tespitini, alt piksel lokalizasyonunu ve yörünge takibini içerir. Çıktılar, gemi doluluğunu yansıtan yoğunluk haritalarını, akış modellerini ve yönlülüğü ortaya çıkaran hız haritalarını ve yapısal yorumlama için ek kontrast sunan genlik haritalarını içerir. Temsili sonuçlar, tam koronal düzlemlerde başarılı edinimi gösterir ve düşük enjeksiyon kalitesi, hareket artefaktları ve kafatası kaynaklı sapma gibi yaygın tuzakları vurgular. Protokol hem kesitsel hem de boylamsal çalışmalarla uyumludur ve özellikle yaşlanma, felç, anevrizma ve nörodejeneratif hastalık modellerinde serebrovasküler değişiklikleri araştırmak için uygundur. Derinlik penetrasyonu, yüksek uzay-zamansal çözünürlük ve etiketsiz vasküler görüntülemeyi birleştiren ULM, klinik öncesi modellerde invazif olmayan beyin mikrosirkülasyon analizi için güçlü bir araç sunar.

Giriş

Beyin vücut kütlesinin sadece %2'sini oluşturmasına rağmen, nöronal aktiviteyi sürdürmek için oksijen ve glikozunun yaklaşık %20'sini tüketir¹. Bu yüksek metabolik talep, büyük arterler ve venlerden arteriyoller, venüller ve kılcal damarlar gibi mikrodamarlara kadar nörovasküler bağlantı² yoluyla düzenlenen karmaşık bir vasküler ağ tarafından karşılanır. Bu ince ayarlı sürecin bozulması, geniş bir nörolojik bozukluk yelpazesinde rol oynamaktadır. Örneğin nörovasküler ayrılma, Alzheimer, Parkinson, Huntington ve Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) gibi hastalıklarda erken bir patolojik özelliktir ve genellikle amiloid-beta ve tau patolojisi ^3,4,5,6 gibi nörodejenerasyonun klasik ayırt edici özelliklerinden önce gelir. Bu nedenle, beynin karmaşık doğasını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik süreçleri anlamaya yönelik artan ihtiyacı karşılamak için birincil endişe kaynağı olmuştur. Teknolojik gelişmeler, beyin fonksiyonlarını ve aktivitelerini hem doğrudan hem de dolaylı olarak artan hassasiyet, çözünürlük ve erişilebilirlikle araştırmak için benzersiz yetenekler sağlamıştır.

Doppler ultrason, kan akışını kullanarak beyin aktivitesinin fonksiyonel ölçümü için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır⁷. Özellikle, kırmızı kan hücrelerinin (RBC'ler) hareketini algılamak için tasarlanmış güç Doppler görüntüleme, tekrarlanan ultrasonik darbeleri kan damarlarına iletir ve hareketli RBC'ler⁸ tarafından geri saçılan ultrasonik yankıların genliğini kaydeder. Ultra hızlı ultrason görüntülemenin, özellikle de fonksiyonel ultrasonun (fUS) ortaya çıkışı, önceki sınırlamaların aşılmasında çok önemli bir nokta oldu. Gerçekten de, geleneksel ultrason dokuyu satır satır tarar - beynin mikro damar sistemine özgü yavaş kan akışları tespit edilemediğinden, uygulamasını ana serebral arterlerle sınırlayan sıralı bir yaklaşım⁹. Daha yeni fUS tekniği, saniyede binlerce kare elde etmek için çoklu düzlem dalga iletimi kullanır ve hem zamansal çözünürlüğü hem de sinyal-gürültü oranını (SNR) önemli ölçüde iyileştirir. En önemlisi, fUS, 1 mm/s kadar düşük hızlara sahip çok küçük damarlardaki hemodinamik değişikliklerin saptanmasını sağlar ve arteriyol seviyesine kadar beyin aktivitesinin gerçek zamanlı fonksiyonel görüntülenmesini destekler⁸.

Ultra hızlı Doppler yöntemleri mikrovasküler görüntülemeyi önemli ölçüde iyileştirmiş olsa da, ultrason^10'un kırınımla sınırlı çözünürlüğü ile hala sınırlıdırlar. fUS ile birlikte, ultrason lokalizasyon mikroskobu (ULM) bu engeli aşarak, kontrast maddelerden ve yüksek hassasiyetli lokalizasyon algoritmalarından yararlanarak mikrovasküler yapıların kılcal düzeyde görselleştirilmesini sağlar¹¹. Bu, vasküler morfoloji ve fonksiyon hakkında benzeri görülmemiş bilgiler sağlar. Daha spesifik olarak, ULM'de, yaklaşık 1-3 μm çapında, stabilize gaz dolu mikro kabarcıklardan yapılmış kontrast maddeler kan dolaşımına enjekte edilir. Bireysel nokta kaynakları olarak tespit edilebilen güçlü akustik saçılımcılar olarak işlev görürler. Mikro kabarcıkların ultrason dalga boyundan önemli ölçüde daha küçük olduğu göz önüne alındığında, sistemin nokta yayılma fonksiyonu (PSF) olarak görünecek şekilde uzamsal ve zamansal olarak izole edilebilirler. STORM ve PALM gibi optik süper çözünürlük tekniklerinden esinlenerek, bu mikro kabarcıkların alt piksel lokalizasyonu, konumlarını yüksek hassasiyetle^haritalayan ters evrişim yöntemleri kullanılarak elde edilir 10,12,13,14. Bu, vasküler yapıların, geleneksel ultra hızlı ultrason gücü Doppler görüntülemenin kırınım tarafından dayatılan sınırının çok ötesinde, 5-10 μm'lik bir uzamsal çözünürlükte çözülmesine izin verir.

ULM, kılcal ölçeğe kadar vasküler haritalama için güçlü ve etkili bir araçtır ve yüzeysel katmanlarla sınırlı birçok optik yöntemin sınırlamalarının üstesinden gelir. Canlı hayvanlarda mikrovasküler görüntüleme yapabilmesi, boylamsal ve farmakolojik çalışmalara olanak sağlaması, ULM'nin beyin fiksasyonu ve boyama gerektiren diğer tekniklere göre bir diğer önemli avantajıdır. Çıkarılan bilgiler statik vasküler haritaların ötesine geçerek kılcal seviyeye kadar kan akışının niceliksel tahminlerini sağlar ve böylece hem klinik öncesi hem de klinik uygulamalar için umut verici yollar açar. Tekrarlanabilirliği kolaylaştırmak için, klinik öncesi araştırmalar için tasarlanmış standartlaştırılmış bir fonksiyonel ultrason görüntüleme platformu kullanılarak uygulanan, kemirgenlerde ULM tabanlı beyin görüntüleme için tam bir iş akışı tanımlıyoruz.

Protokol

Bu çalışmada açıklanan tüm prosedürler, 22 Eylül 2010 tarihli Avrupa Topluluğu Konseyi Direktifine (010/63/UE) uygun olarak yürütülmüş ve yerel etik kurul tarafından onaylanmıştır (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale number 59, 'Paris Centre et Sud', proje #2020-16). Deneyler, ticari kaynaklı yetişkin erkek C57BL/6 Rj fareleri (2 aylık, 20-30 g) ve Sprague-Dawley Rj:Han sıçanları (200-300 g) üzerinde gerçekleştirildi. Hayvanlar, 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü altında, 22 °C sabit sıcaklıkta ve ad libitum sağlanan yiyecek ve su ile kafes başına dörtlü gruplar halinde barındırıldı. Deneylerin başlamasından önce, tüm hayvanlar barınma koşullarına en az bir haftalık bir alışma sürecinden geçti. Kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hayvan hazırlama

1. Farelerde anestezi ve hayvan preparasyonu
   1. Fareyi izofluran indüksiyon odasına yerleştirin ve %2 izofluranı hava (0,075 L/dak) ve oksijen (0,175 L/dak veya tıbbi hava) ile uygulayın.
   2. 5 dakikalık anestezi indüksiyonundan sonra, hayvanı vücut ısısını korumak için 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirilen stereotaksik çerçeveye aktarın ve aynı konsantrasyon ve akış hızında bir maske aracılığıyla sürekli İzofluran iletimini sağlayın.
   3. Sert ancak zarar vermeyen bir basınç kullanarak ayak parmağı veya kuyruk sıkışmasına yanıt olarak reflekslerin yokluğunu kontrol ederek yeterli anestezi derinliğini doğrulayın. Bir refleks varsa, izofluran konsantrasyonunu biraz artırın. Devam etmeden önce yeniden değerlendirin.
   4. Katarakt oluşumunu önlemek için göz merhemi sürün.
   5. Bir düzeltici kullanarak farenin kafasını tıraş edin. Tüy dökücü krem sürün, 1-1,5 dakika bekletin, ardından ılık suyla durulayın ve gazlı bezle kurulayın. Tüm tüyler alınana kadar gerektiği kadar tekrarlayın. Tüy dökücü kremi uzun süre bırakmaktan kaçının, çünkü ciltte kimyasal hasara neden olabilir.
   6. Akustik bağlantıyı sağlamak için kafaya santrifüjlenmiş ultrason jeli (kabarcıksız, gazı alınmış) uygulayın.
2. Sıçanlarda anestezi ve hayvan preparasyonu
   1. Sıçanı tarttıktan sonra, 1 mL'lik bir şırınga kullanarak ketamin (75 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonunu uygulayın. Başın üstündeki kürkü tıraş edin ve cildi iyot solüsyonuyla temizleyin.
      NOT: Ketamin birçok ülkede yüksek düzeyde düzenlemeye tabi bir maddedir ve tedarik ve kullanım için özel izin gerektirebilir. Cerrahi düzeyde anestezi elde etmek için alternatif anestezik rejimler kullanılabilir.
   2. Hayvanı, vücut ısısını korumak için 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirilmiş stereotaksik bir aparatın üzerine yerleştirin. Kurumayı ve katarakt oluşumunu önlemek için gözlere bol miktarda oftalmik merhem sürün.
   3. İntraoperatif analjezi için 1 mL'lik bir şırınga kullanarak deri altına meloksikam (2 mg/kg) enjekte edin.
   4. Sert ancak zarar vermeyen bir basınç kullanarak ayak parmağı sıkışmasına veya kuyruk sıkışmasına yanıt olarak reflekslerin olmadığını kontrol ederek yeterli anestezi derinliğini doğrulayın. Bir refleks varsa, ilk anestezik dozunun dörtte birine eşit ek bir doz uygulayın. Anestezi derinliğini yeniden değerlendirmeden önce yaklaşık 5 dakika bekleyin. Yalnızca cerrahi anestezi düzlemi onaylandıktan sonra devam edin ve her 20-30 dakikada bir yeniden değerlendirin.
   5. Bir neşter kullanarak sagital sütür boyunca uzunlamasına bir kesi yapın ve kesiğin kafatasına bağlı deri ve bağ dokularını içerecek kadar derin olduğundan emin olun.
   6. Fizyolojik salin kullanarak ameliyat boyunca çevre dokuları iyice nemlendirin.
   7. Döner bir matkap kullanarak, kafatasının yüzey katmanını işaretleyerek kafatası penceresinin ana hatlarını hafifçe çizin. Beyne optimum erişim için, kafatası boyutuna bağlı olarak pencere yan boyutta yaklaşık 14 mm ve ön-arka boyutta en az 2 mm olmalıdır.
   8. Kemik direnci kalmayana kadar anahat boyunca frezelemeye devam edin. Delme sırasında, kemiği soğutmak ve termal hasarı en aza indirmek için periyodik olarak birkaç damla fizyolojik salin uygulayın. İnce, yuvarlak kenarlı bir spatula, boşluğa kuvvet uygulamadan kolayca yerleştirilmelidir.
   9. Kısa, tek yönlü raybalama vuruşları kullanarak, direnç zar zor algılanana kadar kemiğin son katmanını inceltin.
   10. Kraniyal pencerenin yan kenarına kenarları yuvarlatılmış ince, hafif kavisli bir spatula yerleştirin.
   11. Spatulayı yavaşça merkeze doğru hareket ettirin, kemiği meninkslerden nazikçe ayırın. Herhangi bir direnç hissedilmediğinde, ayrılan kemik parçasını kaldırın ve tamamen çıkarın.
   12. Duranın üzerine santrifüjlenmiş ultrason jeli uygulayın. Deney düzeneğinin bir açıklaması Şekil 1'de gösterilmektedir.

Şekil 1: Kemirgenlerde ULM beyin görüntüleme için deney düzeneğinin şeması. Görüntüleme sistemi, motorlu bir konumlandırma aşamasına monte edilmiş yüksek frekanslı bir proba bağlı bir ultrason toplama ünitesinden oluşur. Hem fareler hem de sıçanlar stereotaksik çerçevelerde gösterilir: fare, transkraniyal görüntüleme için traş edilmiş bir kafa derisine sahipken, sıçan cerrahi olarak hazırlanmış bir kraniyal pencereden görüntülemeye tabi tutulur. Her iki türde de kontrast madde enjeksiyonu için kuyruk ven kateteri yerleştirilir. Bu kurulum, mikro kabarcık enjeksiyonu sırasında yüksek çözünürlüklü fonksiyonel ultrason verilerinin istikrarlı bir şekilde elde edilmesini sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Kuyruk ven kateterizasyonu
   1. 8" borulu 18 G × 1/2" iğneye bağlı 27 G × 1/2" kanatlı infüzyon seti kullanın. Ölü hacmi en aza indirmek için mümkünse boruyu kısaltın.
   2. Yanal kuyruk damarlarını ortaya çıkarmak için hayvanın kuyruğunu yavaşça 90 derece çevirin (bkz. Şekil 2). Kateterizasyon sırasında stabiliteyi sağlamak ve gereksiz hareketi önlemek için kuyruğu bant kullanarak yerine sabitleyin.
   3. Distal uçtan (kuyruğun ucu) başlayıp tabana doğru hareket ederek kuyruk damarını tanımlayın. Bu adımı kolaylaştırmak için, vazodilatasyonu teşvik etmek ve damar görünürlüğünü artırmak için kuyruk ılık suyla ısıtılabilir.
   4. Bir parmağınızı kullanarak kuyruğun tabanına hafif bir baskı uygulayın ve enjeksiyon bölgesine doğru (yani kan akış yönünün tersine) kaydırın. Bu manevra venöz dönüşü geçici olarak engelleyerek kaudal venlerin şişmesine ve daha belirgin hale gelmesine neden olarak kateter yerleştirilmesini kolaylaştırır.
   5. Kanatlı infüzyon setinin 27 G × 1/2" iğnesini damara paralel olarak yerleştirin ve eğimin yukarı baktığından emin olun.
   6. Doğru iğne yerleşimini onaylayan kan geri dönüşünün varlığı için boruyu gözlemleyin.
      NOT: Sonraki enjeksiyonlar sırasında daha önceki deliklerden sızıntıyı önlemek için kateterizasyona distal kuyruk ucundan başlayın. Kuyruk ven kateterizasyonu zor veya başarısız olursa, alternatif santral yollar düşünülebilir. Bunlara retro-orbital sinüs, juguler ven veya safen ven dahildir.

Şekil 2: Kateterizasyon için vasküler işaretleri gösteren kemirgen kuyruğunun kesitsel anatomisi. Ana kan damarlarının göreceli konumlarını gösteren, distal kemirgen kuyruğu boyunca enine bir kesitin şematik çizimi. Orta hattın yakınında iki arter bulunur: üst (dorsal) bölgede bulunan dorsal kaudal arter ve kuyruk kesitinin alt (ventral) kısmında yer alan ventral kaudal arter. Bu arterler tipik olarak intravenöz prosedürler sırasında kaçınılır. Arterleri yanal olarak çevreleyen kaudal damarlar, her iki tarafta simetrik olarak uzanır ve derinin hemen altında yer alır, bu da onları kateterizasyon veya mikro kabarcık enjeksiyonu için tercih edilen erişim yerleri haline getirir. Bu anatomik genel bakış, özellikle vazodilatasyonu teşvik etmek için ısınma ile arttırıldığında, damarların kesin lokalizasyonuna yardımcı olur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. IcoScan yazılımını kullanarak prob konumlandırma
   1. Edinme platformunda, fUS satın alma yazılımını başlatın (örneğin, Iconeus One için IcoScan) ve bir deneme oturumu oluşturun. Ultrason probu konumunu ayarlayın.
      NOT: Probu hayvanın başının yaklaşık 1 mm yukarısına yerleştirin. Herhangi bir görüntüleme dizisine başlamadan önce probun ultrason jeli ile temas halinde olduğundan emin olun.
   2. Canlı Görüntü alımını başlatın ve gerçek zamanlı serebral kan hacmi (CBV) görüntülemeyi kullanarak prob konumunu gerektiği gibi ayarlayın. Beyin görüntüye odaklanmalıdır. Görselleştirme kalitesini artırmak için kontrast ve sıkıştırma gibi görüntüleme parametrelerini optimize edin.
   3. Açılış Angio3D edinme yazılımındaki menü. Tarama parametrelerini (İlk Dilim, Son Dilim ve Adım Boyutu) ayarlayarak beynin tamamını kapsadıklarından emin olun. Satın alma işlemini başlatın.
      NOT: Tarama parametrelerini ayarlarken, taramanın beynin arka kısmını, yani tüm arka arterleri kapsadığından emin olun.
   4. Edinme yazılımını açık tutun ve veri analizi ve görselleştirme için IcoStudio yazılımını başlatın. Angio3D taramasını yükleyin.
   5. Beyin Kaydı paneline gidin ve tam otomatik veya manuel kayıt modunu kullanarak taramayı Allen Mouse Ortak Koordinat Çerçevesine kaydedin.
   6. Kaydı .bps dosyası olarak kaydedin.
   7. Ardından, Beyin Navigasyonu menüsüne gidin. Atlas Manager panelinde, Allen Mouse Beyin Atlası'na göz atmak için Üst/Alt ağaç gezginini kullanın. 3'lü görünüm panelinde taramanın üzerine bindirilecek olan hedeflenen anatomik bölgeleri seçin.
   8. İlgilendiğiniz bölgelerle çakışan bir görüntüleme düzlemi seçin. Hedeflenen görüntüleme dilimini tanımlamak için koronal görünümde iki işaretçiyi manuel olarak ayarlayın.
   9. Seçilen düzlemi görüntülemek için prob konumuna karşılık gelen motor koordinatlarını çıkarmak için Beyin Konumlandırma Sistemine (BPS) tıklayın. Angio3D taramasından hesaplanan görüntü önizlemesini kontrol edin ve BPS Koordinatlarını Kopyala'ya tıklayın.
   10. IcoScan yazılımına geçin ve Prob Konumlandırma panelini açın. BPS Koordinatlarını Gir'e tıklayın ve adım 1.4.9'da çıkarılan değerleri yapıştırın. Prob otomatik olarak hareket edecek ve seçilen görüntüleme düzlemiyle hizalanacaktır.
   11. Mevcut görüntüleme düzleminin adım 1.4.8'de tahmin edilen düzlemle eşleştiğini doğrulamak için bir Canlı Görüntü alımı gerçekleştirin.
       NOT: Aynı uzamsal işaretleyicileri kaydederek ve yeniden kullanarak, görüntüleme düzlemi oturumlar arasında tutarlı bir şekilde yeniden tanımlanabilir ve uzunlamasına çalışmalar için probun doğru şekilde yeniden konumlandırılmasını sağlar.

2. ULM'nin satın alınması

1. Mikro kabarcıkların hazırlanması
   NOT: Piyasada bulunan çeşitli ultrason kontrast maddeleri kullanılabilir. Ancak gaz bileşimi, kabarcık konsantrasyonu, çapı ve stabilitesi kullanılan ürüne bağlı olarak değişiklik gösterebilir. Lütfen üreticinin hazırlama ve saklama ile ilgili tavsiyelerine uyun.
   1. Steril bir şırınga kullanarak, septum yoluyla şişeye 5 mL% 0.9 sodyum klorür çözeltisi enjekte edin.
      NOT: Tekrarlanan bolus uygulamaları veya sürekli infüzyon için, daha konsantre bir mikro kabarcık süspansiyonu hazırlamak için daha düşük hacimde% 0.9 sodyum klorür çözeltisi kullanılabilir. Seyreltme faktörünü amaçlanan uygulamaya göre buna göre ayarlayın.
   2. Mikro kabarcıkları tamamen yeniden süspanse etmek ve düzgün bir dağılım elde etmek için şişeyi 20 saniye kuvvetlice çalkalayın.
2. ULM kaydı
   1. Ultrason dizisi, kare hızı ve toplam kayıt süresi dahil olmak üzere kayıt parametrelerini önceden tanımlayın.
      NOT: Kayıt için önerilen parametreler 2,5 Hz'de 5-10 dakikadır.
   2. Enjekte edilecek mikro kabarcıkların hacmini çizin ve alıma başlayın. Satın alma işlemi başladıktan sonra mikro kabarcık enjeksiyonuna devam edin. Uygun seyreltmede sıçanlar için 200 μL ve fareler için 100 μL enjekte edilmesi önerilir.
   3. Canlı Görüntü görüntüsünde kontrast geliştirmeyi onaylayın. Hemen ardından kateter içine fizyolojik sıvı enjekte ederek ölü hacimde kalan mikro kabarcıkları yıkayın. Bir mikro kabarcık yoğunluk profilinin tipik bir örneği Şekil 3'te gösterilmektedir.
   4. Alım işleminin tamamlanmasını bekleyin ve verileri kaydedin.
   5. Satın alma işleminin sonunda, kullanılan protokole bağlı olarak aşağıdaki şekilde ilerleyin:
      1. Fareler için (noninvaziv protokol): İzofluran uygulamasını durdurarak anesteziyi tersine çevirin ve iyileşme sırasında hayvanı tamamen uyanana kadar sıcak bir ortamda izleyin.
      2. Sıçanlar için (kraniyal pencereli invaziv protokol): Kurumsal ve etik kurallara uygun olarak hayvana intraperitoneal Euthasol (pentobarbital sodyum, 140 mg/kg) enjeksiyonu ile ötenazi yapın.

Şekil 3: Zaman içindeki mikro kabarcık sinyal yoğunluğu. (A) Tüm koronal beyin dilimini kapsayan, sinyal çıkarma için kullanılan ilgi alanının (ROI) gösterimi. (B) 5 dakikalık bir alım sırasında mikro kabarcık sinyal yoğunluğunun zaman süreci. Mikro kabarcık bolusu 30 saniyede enjekte edildi ve bu da sinyal genliğinde karakteristik bir artışa neden oldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. IcoLab yazılımını kullanarak görüntü yeniden yapılandırma

1. IcoLab'ı açın ve ekranın en sol kısmındaki ULM sekmesine tıklayarak ULM'ye gidin.
2. Şekil 4'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi işleme iş akışını başlatmak için ULM Haritalarını Hesapla'ya tıklayın.
3. Alınan verileri içeren kaynak klasörü seçin.
4. İşlenecek özel taramayı seçin ve gerekirse işlem süresi sınırlarını ayarlayın.
5. Raporlama adımına geçmek için İleri'ye tıklayın. Raporlama adımında, işlenen dosyaların kaydedileceği çıktı klasörü yolunu yapılandırın. PowerPoint raporuna dahil edilecek görüntüler için görselleştirme parametrelerini ayarlayın.
6. Son ekranda görüntülenen seçili seçeneklerin özetini gözden geçirin.
7. Hazır olduğunuzda, işlemi başlatmak için ÇALIŞTIR'a tıklayın. İşlem tamamlandıktan sonra, yerelleştirilmiş mikro kabarcıkların tüm koordinatlarının yanı sıra yoğunluk, hız ve geri saçılan genlik (BSA) için rasterleştirilmiş TIFF dosyalarını içeren bir .trk dosyası oluşturulacaktır.
   NOT: 5 dakikalık bir satın alma, birkaç saatlik işlem gerektirebilir. Bu adım en iyi şekilde gece boyunca veya özel bir iş istasyonunda gerçekleştirilir.
   1. Mikro kabarcık yoğunluk haritalarının oluşturulması: Tespit edilen tüm mikro kabarcıkların lokalize konumları, seçilen alım süresi boyunca toplanır. Bu konumları sabit çözünürlüklü bir uzamsal ızgaraya eşleyin.
      NOT: Ortaya çıkan yoğunluk haritasındaki her piksel, o uzamsal bölme içinde lokalize olan mikro kabarcıkların sayısını yansıtır. Nihai çıktı, piksel yoğunluğunun damar doluluğuna karşılık geldiği ve vasküler ağın yüksek çözünürlüklü yeniden yapılandırılmasını sağlayan gri tonlamalı bir görüntüdür (TIFF).
   2. Hız haritalarının oluşturulması: Yazılım, yörüngeler oluşturmak için ardışık kareler boyunca bireysel mikro kabarcıkları izler. Her yörünge için yazılım, yer değiştirmeyi geçen süreye bölerek bir hız vektörü hesaplar (mm/s cinsinden bir hız vektörü verir).
      NOT: İki tür hız haritası oluşturulabilir: her pikselin içinden geçen mikro kabarcıkların ortalama hız büyüklüğünü depoladığı mutlak hız haritaları ve hızın seçilen bir anatomik eksen (yani, x veya z) boyunca ayrıştırıldığı ve karşılık gelen işaretli bileşenin saklandığı yönlü hız haritaları. Bu haritalar aynı uzamsal ızgaraya rasterleştirilir ve ayrı ayrı TIFF görüntüleri olarak kaydedilir.
   3. BSA haritalarının oluşturulması: Her lokalize mikro kabarcık için ham ultrason sinyal genliği (geri saçılan yoğunluk) görüntülenir. Bu genlikleri uzaysal ızgaraya yansıtın ve her pikselde sinyal yoğunluğunu biriktirin. Ortaya çıkan BSA haritası, mikro kabarcıkların ışının odak alanından geçtiği bölgeleri vurgulayarak yoğunluk ve hız haritalarını¹⁵ tamamlayan kontrast sağlar.

Şekil 4: ULM haritasının yeniden yapılandırılması için işleme hattının akış şeması. Şekil, ham ultrason verilerinden ULM haritaları oluşturmak için analiz yazılımında gerçekleştirilen sıralı işleme adımlarını göstermektedir. Bileşik çerçevelerden başlayarak (n = 200), Adım 1, mikro kabarcık (MB) sinyallerini doku arka planından izole etmek için tekil değer ayrıştırma (SVD) dağınıklık filtrelemesi uygular. Adım 2'de, MB sinyalleri Lanczos enterpolasyonuna tabi tutulur ve bu da önceden işlenmiş bir görüntü yığınıyla sonuçlanır. Adım 3, yerel maksimum tespiti gerçekleştirir ve aday mikro kabarcık konumlarını belirlemek için bunları sistemin nokta yayılma fonksiyonu (PSF) ile ilişkilendirir. Adım 4'te, hız ve geri saçılan genlik haritalarının hesaplandığı mikro kabarcık yörüngelerini çıkarmak için alt piksel lokalizasyonu (ağırlık merkezi tespiti) ve parçacık izleme kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. IcoStudio yazılımını kullanarak veri görselleştirme

1. Veri keşfine başlamak için IcoStudio'ya bir .trk dosyası yükleyin.
2. Veri gösterimini iyileştirmek için sağ taraftaki panelde kontrast, sıkıştırma ve renk haritası gibi görselleştirme parametrelerini ayarlayın.
3. Başlangıç ve bitiş karelerini tanımlamak için ana görünümün altındaki çift kaydırıcıyı kullanarak entegrasyon süresini ayarlayın.
4. Mikro kabarcık oluşumlarını görüntülemek için Yoğunluk sekmesini açın ve Mutlak Yoğunluk (piksel başına sayı) ile Yönlü Yoğunluk (eksenel ağırlıklı) arasında seçim yapın.
5. Mikro kabarcık hızını birden fazla mod aracılığıyla mm/sn cinsinden görüntülemek için Hız sekmesini kullanın: Mutlak, Yönlü, Eksenel ve Yanal. Görselleştirmeyi geliştirmek için kontrast, sıkıştırma ve hız eşiklerini ayarlayın.
6. Mikrovasküler yapıları ve düzlem dışı hareketi vurgulayan alternatif bir kontrast mekanizması sağlayan mikro kabarcık yansımasını görselleştirmek için BSA sekmesini keşfedin. Yüksek çözünürlüklü PNG ekran görüntülerini dışa aktarın veya özelleştirilebilir piksel boyutu ve veri türü ayarlarıyla nicel analiz için TIFF dosyaları oluşturun.

Sonuçlar

Şekil 5'teki temsili örnekler, 10 μm çözünürlükte 200 μL mikro kabarcık bolus enjeksiyonunu takiben 1 dakikadan fazla kayıt elde edilen bir sıçan beyninin ULM verilerinin tipik bir örneğini göstermektedir.

Şekil 5: Tek bir mikro kabarcık enjeksiyonunu takiben kraniyotomlanmış bir sıçandan elde edilen temsili ULM çıktıları. Mikro kabarcık (MB) yoğunluğu (solda), hız (ortada) ve geri saçılan genlik (sağda) örnek haritaları, 200 μL bolus mikro kabarcık enjeksiyonunu takiben 1 dakikadan fazla kayıt elde edilen tam bir koronal beyin dilimi için gösterilmiştir. Ölçek çubuğu: 2mm. Yakınlaştırılmış ekler sol kortikal mikro damar sistemini vurgular (ölçek çubuğu: 0,5 mm). Yoğunluk haritası, MB oluşumlarının mekansal dağılımını yansıtarak vasküler ağın yapısını ortaya çıkarır. Hız haritası, bireysel MB'lerin akış hızını ve yönlülüğünü göstererek kap türleri arasında ayrım yapılmasını sağlar. Genlik haritası, MB'lerden gelen geri saçılan ultrason sinyalini göstererek, damar morfolojisinin ve düzlem dışı hareketin görselleştirilmesini geliştiren ek bir kontrast mekanizması sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ortaya çıkan haritalar, serebral mikro damar sisteminin birbirini tamamlayan üç görünümünü göstermektedir: mikro kabarcık (MB) yoğunluğu (solda), hız (ortada) ve geri saçılan genlik (sağda). Her harita, sol kortikal mikrovasküler sistemi vurgulayan yakınlaştırılmış eklerle beynin tam bir koronal dilimine karşılık gelir (ölçek çubukları: sırasıyla 2 mm ve 0,5 mm).

Yoğunluk haritası, görüş alanı boyunca MB oluşumlarının uzamsal dağılımını gösterir. Damar morfolojisi, kırınım sınırının çok altında çözülerek hem büyük damarları hem de ince kılcal yapıları ortaya çıkarır. Bu tür bir harita, derin kortikal bölgelerde bile çatallanmalar ve dallanma modelleri dahil olmak üzere vasküler ağ topolojisinin net bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.

Hız haritası, eksenel (z) yönü boyunca yansıtılan bireysel MB'lerin akış hızını gösterir. Bu projeksiyon, negatif hızların kortekse yukarı doğru akışı ve pozitif değerlerin aşağı doğru akışı yansıttığı işaretli hız değerleri üretir. Kemirgen serebral korteksinde, vasküler mimari oldukça klişedir: nüfuz eden arteriyoller pial yüzeyden kortikal katmanlara inerken, venüller oksijensiz kanı boşaltmak için korteksten yüzeye geri yükselir¹⁶. Bu tutarlı anatomik düzenleme, tipik olarak arteriyel akışı gösteren pozitif eksenel hızlar ve venöz drenajı gösteren negatif hızlar ile damar tiplerini ayırt etmek için yönlü hız ölçümlerinin kullanılmasını sağlar. Genel olarak, ULM ile ölçülen hız değerleri, literatürde ^10,17 daha önce bildirilen aralıklarla tutarlıdır^ve penetran arteriyollerde 10-20 mm/s'den majör intrakraniyal arterlerde saniyede birkaç santimetreye kadar uzanır. Bu bulgular, akan mikro kabarcıkların kırmızı kan hücrelerinin¹⁸ reolojik davranışını yakından taklit ettiğine dair daha önceki gözlemlerle uyumludur ve mikro ölçekte fizyolojik kan akışı dinamiklerini ölçmek için ULM kullanımını doğrulamaktadır.

Geri saçılan genlik (BSA) haritası, her MB tarafından döndürülen ultrason sinyal yoğunluğunun uzamsal bir temsilini sağlar. MB'ler odak bölgesinden geçtiğinde geri saçılan enerji maksimize edildiğinden, bu harita yükseklik konumuna dayalı kontrast sunar. Özellikle daha derinlerde veya odak kenarlarının yakınında düzlem dışı hareketi veya düşük genlikli damarları tanımlayarak segmentasyonun iyileştirilmesine yardımcı olur. BSA haritaları, derinlikle ilgili sinyal zayıflamasını tespit etmek veya odak hizalamasındaki uyumsuzlukları belirlemek için de değerlidir¹⁵.

Beyin Konumlandırma Sistemi ile düzlem hedeflemenin tekrarlanabilirliğini göstermek için, Şekil 6A , aynı koronal düzlemi hedefleyerek 0. günde (Hafta 1) ve 7. günde (Hafta 2) anestezi altında aynı farede elde edilen ULM vasküler yoğunluk haritalarını göstermektedir. Her iki haritanın üst üste bindirilmesi, daha önce gösterildiği gibi, düzlemin yeniden konumlandırılmasının kesinliğini ve uzunlamasına deneylerin güvenilirliğini doğrulayan vasküler sinyalin güçlü bir uzamsal yazışmasını gösterir¹⁹.

Kantitatif analiz bu çıktılardan herhangi birine uygulanabilir. Örneğin, kullanıcılar yoğunluk eşiklerini veya kümeleme algoritmalarını kullanarak damarları bölümlere ayırabilir ve ardından damar yoğunluğu, ortalama akış hızı gibi bölgesel istatistikleri ve damar yarıçapı, ortalama uzunluk, dal sayısı ve damar ağının diğer yapısal tanımlayıcıları dahil olmak üzere morfometrik parametreleri çıkarabilir. Kortikal bölgeler veya deney grupları arasındaki karşılaştırmalar (örneğin, ilaç enjeksiyonuna karşı kontrol) doğrudan bu haritalar üzerinde veya yaygın olarak tanımlanan damarlar^20,21 üzerinde türetilmiş parametrik istatistikler yoluyla gerçekleştirilebilir. Bu tür bir analize örnek olarak, sol somatosensoriyel korteks (S1BF, Şekil 6B) ve sol talamusta (Şekil 6C) vasküler parametrelerin bölgesel nicelleştirmelerini gerçekleştirdik. Yoğunluk haritaları önce ikilileştirildi, iskeletleştirildi ve bir Öklid mesafe dönüşümü kullanılarak damar yarıçapları tahmin edildi. Akış hızları doğrudan MB yörüngelerinden elde edildi ve akış hızı, daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı gibi Poiseuille yasası kullanılarak kap yarıçapından elde edildi²¹. Bu çalışmada açıklanan metodolojinin aynısı burada da uygulandı. Bıyık grafikleri, d0 ve d7 için kap yarıçapı, hız ve akış hızı dağılımlarını göstererek oturumlar arasında iyi bir tekrarlanabilirlik gösterir. Bu multimodal ULM çıktıları birlikte, beynin mikrovasküler ağının kapsamlı karakterizasyonuna olanak tanıyarak, benzeri görülmemiş bir çözünürlükle hem anatomik hem de dinamik bilgiler sunar.

Şekil 6: Beyin Konumlandırma Sistemi kullanılarak düzlem hedeflemenin uzunlamasına tekrarlanabilirliği ve vasküler niceleme örneği. (A) 0. günde (1. hafta) ve 7. günde (2. hafta) aynı anestezi uygulanmış fareden elde edilen ULM vasküler yoğunluk haritaları, Beyin Konumlandırma Sistemi (ölçek çubuğu = 1 cm) kullanılarak aynı koronal düzlemi hedefler. Her iki haritanın üst üste bindirilmesi, vasküler sinyalin güçlü bir uzamsal yazışmasını gösterir ve seanslar arasında düzlem konumlandırmanın tekrarlanabilirliğini gösterir. (M.Ö.) İki ilgi bölgesinden çıkarılan vasküler parametrelerin temsili nicelleştirilmesi: sol somatosensoriyel korteks (S1BF, B) ve sol talamus (C). Her bölge için, damar yarıçapının dağılımını gösteren bıyık grafikleriyle birlikte d0'da (ölçek çubuğu = 0,5 cm) vasküler yoğunluk haritasını görüntülüyoruz (μm), akış hızı (mm/s) ve akış hızı (mm³/s) d0 ve d7'de (medyan, 25.-75. persentil, bıyık = 1.5×IQR, aykırı değerler ayrı ayrı çizilir). Bu sonuçlar, boru hattının ULM verilerinden morfometrik ve hemodinamik ölçümleri çıkarma yeteneğini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Ultrason Lokalizasyon Mikroskobu (ULM), ultrason görüntülemede dönüştürücü bir ilerlemeyi temsil eder ve mikro damar sisteminin geleneksel kırınım sınırının ötesinde süper çözünürlüklü görselleştirilmesini sağlar. Bu tartışma, ULM protokolündeki kritik adımları vurgulamakta, olası değişiklikleri ve sorun giderme stratejilerini ele almakta, yöntemin sınırlamalarını araştırmakta, alternatif görüntüleme yöntemlerine kıyasla önemini değerlendirmekte ve biyomedikal araştırmalardaki önemini ve potansiyel uygulamalarını ele almaktadır.

ULM protokolündeki kritik adımlar

ULM'nin başarılı bir şekilde uygulanması için birkaç adım çok önemlidir ve bunların etkisi Şekil 7'de gösterilmektedir. Hem konsantrasyon hem de dağıtım kalitesi görüntüleme sonuçlarını doğrudan etkilediği için en önemli adımlardan biri mikro kabarcıkların uygulanmasıdır. Uzamsal çözünürlük ve tespit edilebilirliği dengelemek için optimal bir konsantrasyon gereklidir. Kötü kateter yerleşimi veya ekstravazasyon gibi yetersiz uygulama, Şekil 7B'de gösterildiği gibi, kan dolaşımına yalnızca seyrek sayıda mikro kabarcıkların ulaştığı çok düşük vasküler sinyale ve eksik rekonstrüksiyonlara neden olabilir. Tipik olarak kilohertz aralığındaki yüksek kare hızlı görüntüleme, mikro kabarcıkların hızlı hareketini yakalamak ve çerçeveler arasında güvenilir izleme sağlamak için gereklidir. Nefes almanın neden olduğu hareket, zayıf fiksasyon veya yetersiz anestezi gibi çekim sırasındaki herhangi bir dengesizlik, lokalizasyon doğruluğunu bozabilir. Bunun bir örneği, elde etme sırasındaki aşırı hareketin bulanık ve kullanılamaz bir yoğunluk haritasına neden olduğu Şekil 7C'de gösterilmektedir.

Mikro kabarcık lokalizasyonu ve izlemesi, tek tek baloncukları algılayan, alt piksel lokalizasyonu gerçekleştiren ve yörüngeleri alt kırınım hassasiyetiyle yeniden yapılandıran gelişmiş görüntü işleme algoritmalarına bağlıdır. Uygun toplama ve işleme ile bile, kafatasının neden olduğu sapmalar gibi anatomik faktörler görüntü kalitesini etkileyebilir. Transkraniyal görüntülemede, özellikle yaşlı farelerde, kafatası kalınlaşması akustik bozulmaya neden olabilir. Bu, Şekil 7D'de gösterildiği gibi, hiçbir mikro kabarcıkların tespit edilmediği sagital sütürün altında karakteristik gölgeleme artefaktlarına yol açar. Bu tür sapmalar, sinyal-gürültü oranını azaltır ve uyarlanabilir filtreleme veya prob yerleşiminin iyileştirilmesi ile düzeltilmedikçe vasküler yapıları gizleyebilir.

Tüm adımlar başarılı bir şekilde gerçekleştirildiğinde, Şekil 7A'da gösterildiği gibi, yoğun ve iyi çözülmüş bir vasküler ağın transkraniyal bir yaklaşımla yeniden yapılandırıldığı yüksek kaliteli ULM haritaları elde edilebilir.

Şekil 7: Farelerde ULM görüntüleme kalitesi için referans ve sorun giderme örnekleri. Panel (A), genç yetişkin bir farede elde edilen ve tam koronal düzlem boyunca başarılı vasküler haritalamayı gösteren yüksek kaliteli bir transkraniyal ULM mikro kabarcık (MB) yoğunluk haritasını göstermektedir. Panel (B), mikro kabarcık ekstravazasyonu veya yetersiz venöz erişim nedeniyle seyrek MB tespitlerine neden olan zayıf bir vasküler sinyal örneği görüntüler. Panel (C), bulanık ve yorumlanamayan bir yoğunluk haritası üreterek aşırı hayvan hareketinden etkilenen bir edinimi gösterir. Panel (D), yaşlı farelerde yaygın olarak gözlemlenen, azalmış sinyal-gürültü oranı nedeniyle MB'lerin tespit edilmediği sagital sütürün altında bir gölge konisi olarak görülebilen kafatası kaynaklı akustik sapmayı vurgular. Bu örnekler, ULM görüntülemede yaygın deneysel artefaktların tanımlanması ve ele alınması için görsel referanslar görevi görür. Ölçek çubuğu: 1mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yöntemin sınırlamaları

Pek çok avantajına rağmen ULM'nin uygulanabilirliğini etkileyen doğal sınırlamaları vardır. Düzlem dışı damar yanlılığı, görüntüleme düzleminin dışına uzanan damarların yeterince yeniden yapılandırılmaması ve eksik vasküler haritalara yol açması nedeniyle 2D görüntülemede önemli bir sorundur. Bu sınırlama, hacimsel (3D) görüntüleme yaklaşımlarına²² geçilerek hafifletilebilir, ancak bu, hesaplama karmaşıklığını artırır. İntravenöz kateterizasyon zorlukları, özellikle tutarlı mikro kabarcık iletiminin teknik olarak zorlu olabileceği küçük hayvan modellerinde de bir engel teşkil etmektedir. Mikro kabarcık stabilitesi de özellikle uzun süreli görüntüleme seansları sırasında sınırlayıcı bir faktördür. Kısa dolaşım yarı ömürleri nedeniyle, mikro kabarcıklar, edinim süresi boyunca yeterli kontrastı korumak için tekrarlanan bolus enjeksiyonları veya sürekli infüzyon protokolleri gerektirebilir. Hareket artefaktları, özellikle küçük istemsiz hareketlerin bile süper çözünürlüklü görüntülemeyi bozabileceği uyanık denekler için önemli bir endişe kaynağı olmaya devam ediyor. Son olarak, ULM'de derinlik penetrasyonu doğal olarak ultrason zayıflaması ile sınırlıdır. Bu, yüksek frekanslarda (örneğin, 15 MHz) kemirgen görüntüleme için genellikle sorun teşkil etmese de, domuz veya insan olmayan primatlar gibi daha büyük hayvanlarda daha zor hale gelir. Bu durumlarda, yeterli görüntüleme derinliği elde etmek için daha düşük frekanslı problar gerekebilir, ancak bu, ULM'yi daha büyük klinik öncesi modellere çevirirken dikkate alınması gereken derinlik ve ayrıntı arasındaki önemli bir değiş tokuşun altını çizen azaltılmış uzamsal çözünürlük pahasına gelir.

Mevcut yöntemlere kıyasla ULM'nin önemi

Ultrason Lokalizasyon Mikroskobu (ULM), özellikle mikrovasküler görüntüleme bağlamında, geleneksel görüntüleme yöntemlerine göre önemli avantajlar sunar. En dikkate değer güçlü yönleri arasında, geleneksel ultrasonun kırınım sınırını aşma ve iki foton mikroskobu gibi optik tekniklerle karşılaştırılabilir uzaysal ölçeklerde alt kırınım görüntüleme elde etme yeteneği yer alır. Bununla birlikte, bu optik yöntemlerden farklı olarak, ULM daha derin doku penetrasyonu sağlayarak, aksi takdirde invaziv olmayan bir şekilde görselleştirilmesi zor olan beyin bölgelerine erişim sağlar.

ULM ayrıca kan akış hızının, perfüzyon dinamiklerinin ve vasküler yeniden şekillenmenin niceliksel olarak değerlendirilmesine olanak tanıyan fonksiyonel görüntüleme yetenekleri de sunar. Bu özellikler, onu hem fizyolojik süreçleri hem de nörovasküler ağlardaki patolojik değişiklikleri araştırmak için oldukça uygun hale getirir. MRI ve PET ile karşılaştırıldığında, ULM daha uygun maliyetlidir, ağır altyapı gerektirmez ve bilinen toksisite riskleri olan kontrast maddelerin kullanımından kaçınır, bunun yerine uygun güvenlik profillerine sahip gazla doldurulmuş mikro kabarcıklara güvenir.

Yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğün birleşimi, ULM'yi çeşitli araştırma uygulamaları için özellikle değerli kılmaktadır. Geleneksel yöntemlerin genellikle yetersiz kaldığı mikrovasküler yapıları ve derin beyin çekirdeklerini hedef alan çalışmalarda özellikle güçlüdür. Ayrıca, doku fiksasyonu ve boyama gerektiren histolojik yaklaşımlardan farklı olarak ULM, canlı hayvanlarda gerçek zamanlı görüntülemeye olanak tanıyarak uzunlamasına tasarımları ve farmakolojik zorluklar gibi dinamik müdahaleleri destekler.

ULM, statik vasküler haritalamanın ötesinde, serebral kan akışı dinamiklerini olağanüstü uzamsal ve zamansal hassasiyetle yakalayarak yüksek çözünürlüklü fonksiyonel görüntülemeye de olanak tanır. Son gelişmeler, kemirgenlerde tüm beyin fonksiyonel nörogörüntüleme için fizibilitesini göstererek, dağıtılmış beyin ağları boyunca kılcal düzeyde kan akışında uyaranla uyarılmış ve spontan aktiviteye bağlı değişiklikleri ortaya çıkarmıştır². Bu, ULM'yi fonksiyonel çalışmalar için güçlü bir araç olarak konumlandırıyor ve orta ölçekli hemodinamik görüntüleme ile nöronal aktivite haritalaması arasındaki boşluğu etkili bir şekilde kapatıyor.

Kullanılabilirlik, verimlilik ve tekrarlanabilirlik hususları

Bu protokolde açıklanan ULM iş akışı, farklı deney düzeneklerinde uygulama kolaylığı ve tekrarlanabilirlik için optimize edilmiştir. FDA ve EMA onaylı mikro kabarcıklar ve standart kemirgen anestezi prosedürleri dahil olmak üzere ticari olarak temin edilebilen bileşenlerin kullanımı, geniş erişilebilirlik sağlar. Ek olarak, tüm işleme hattının özel yazılıma (IcoLab) entegrasyonu, mikro kabarcık lokalizasyonu, yörünge yeniden yapılandırması ve harita oluşturma gibi karmaşık adımları otomatikleştirerek kullanılabilirliği büyük ölçüde artırır. Bu kolaylaştırılmış arayüz, özel kod ihtiyacını azaltır ve kullanıcı müdahalesini en aza indirerek kullanıcılar ve deneyler arasında tutarlı sonuçları destekler. Yüksek çözünürlüklü ULM işleme, özellikle uzun alımlar veya hacimsel veriler için hesaplama açısından yoğun olsa da, toplu işleme araçları ve GPU hızlandırma, analiz süresini önemli ölçüde azaltır. Protokolün modüler tasarımı aynı zamanda tekrarlanabilirliği de destekleyerek araştırmacıların sağlam bir analitik çerçeveyi korurken edinim ve işleme parametrelerine ince ayar yapmalarına olanak tanır. Protokol ayrıca, kullanıcıların probu oturumlar arasında tam olarak aynı görüntüleme diliminde yaklaşık 100 μm doğrulukla güvenilir bir şekilde yeniden konumlandırmasına olanak tanıyan IcoScan ve IcoStudio kullanılarak prob konumlandırmaya ilişkin özel bir bölüm içerir. Bu özellik, zaman içindeki vasküler değişiklikleri izlemek için hassas uzaysal tutarlılığın gerekli olduğu boylamsal çalışmalar için özellikle değerlidir. Bu özellikler toplu olarak yeni kullanıcılar için giriş engelini azaltır ve ULM'nin hem keşifsel hem de boylamsal görüntüleme çalışmalarında ölçeklenebilir dağıtımını destekler.

Son

Bu protokol, klinik öncesi araştırmalar için optimize edilmiş standartlaştırılmış bir toplama ve analiz platformu kullanarak cerrahi hazırlık, mikro kabarcık uygulaması, görüntü elde etme ve yüksek çözünürlüklü vasküler haritalamayı kapsayan, kemirgen beyin görüntülemesinde Ultrason Lokalizasyon Mikroskobu (ULM) uygulamak için eksiksiz bir iş akışı sunar. ULM, biyomedikal görüntülemede büyük bir ilerlemeyi temsil eder ve mikrovaskülatür sisteminin benzeri görülmemiş ayrıntılarla süper çözünürlüklü in vivo görselleştirmesini sunar. Mevcut görüntüleme yöntemleriyle karşılaştırıldığında ULM, yüksek uzamsal çözünürlük, fonksiyonel akış ölçümü ve erişilebilirliğin benzersiz bir kombinasyonunu sağlar ve bu da onu özellikle vasküler gelişim, nörovasküler eşleşme ve hastalık patofizyolojisi çalışmaları için çok uygun hale getirir. Teknoloji olgunlaşmaya devam ettikçe ULM, hem klinik öncesi araştırmalarda hem de sonuçta klinik nörogörüntüleme uygulamalarında bir mihenk taşı olmaya hazırlanıyor.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hayvan sıcaklık kontrolörü (ısıtma plakası ve rektal prob)	Fiziksel Sıcaklık	TCAT-2DF
Atipamezole	Orion Pharma, Fransa	Antisedan	5 mg/mL enjekte edilebilir çözelti
C57BL/6 fareleri	Janvier Laboratuvarları	SC-C57J-M	C57BL/6RJ erkek fare, 8 haftalık
Diş matkapı	Foredom, ABD	K.1070 Yüksek Hızlı Döner Mikromotor Kiti
Yıkıcı krem	Vichy	Yok
Göz merhemi	TVM, Birleşik Krallık	Ocry-jel
Saç kesici	Fimep	ISIS GT 421 Aesculap
IcoLab işleme yazılımı (v 1.2.0.0)	Iconeus, Fransa	IcoLab
Iconeus One Xpand yapılandırması	Iconeus, Fransa	IconeusOne Xpand
IcoPrime 15MHz Prob	Iconeus, Fransa	IcoPrime-15MHz Prob
IcoScan satın alma yazılımı (v1.9.0)	Iconeus, Fransa	IcoScan
IcoStudio analiz yazılımı (v2.2.0)	Iconeus, Fransa	IcoStudio
İyot çözeltisi	Mylan, Fransa	Yok
İzofloran anestezi istasyonu	Minerve, Esternay, Fransa	Yok
Ketamin	Virbac, Fransa	Ketamine1000	100 mg/mL enjekte edilebilir çözelti
Meloksikam	Boehringer Ingelheim	Metacam	0.5 mg/mL enjekte edilebilir çözelti
İğneler	Terumo, Fransa	AN*1838R1	18 G x & frac12; ” 8" iğne Boru
Tuzlu su	Laboratoire Gilbert Physiodose, Eczaci, Fransa	Yok
Skalpel	DREXCO tıp merkezi, Fransa	80011
SonoVue mikro kabarcıkları	Bracco Görüntüleme	SonoVue 8ul/ml
Spatula	Phymed, Fransa.	K.1070 Yüksek Hızlı Döner Mikromotor Kiti
Sprague-Dawley Rj:Han fareleri	Janvier Laboratuvarları	RN-SD-M	RjHan:SD - Sprague Dawley erkek fareleri, 200-300 g
Stereotaksik çerçeve	David Kopf (Tujunga, ABD)	900-WA	Fare Adaptörü  Kullanımı; (Referans: 922) ve Yırtılmayan Kulak Çubukları (referans: 922)
Şırın	DREXCO tıp merkezi, Fransa	2058
Ultrason jeli	DREXCO tıp merkezi, Fransa	Medi'Gel
Kanatlı infüzyon seti	Terumo, Fransa	SV*27EL
Xylazine 2%	Bayer, Fransa	Rompun	20 mg/mL enjekte edilebilir çözelti