Yöntem makalesi

Kordon Kanı Progenitörlerinin İndüklenmiş Pluripotent ve Blastomer Benzeri Kök Hücrelere Ksenofree Yeniden Programlanması Tanımlanmıştır

581 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68613

⸱

22 Ağustos 2025

 ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, The Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, insan kordon kanı (CB) miyeloid progenitörlerinin konvansiyonel insan kaynaklı pluripotent kök hücrelere (hiPSC) ksenofree (XF), besleyicisiz (FF), epizomal yeniden programlanması için kimyasal olarak tanımlanmış yöntemleri ana hatlarıyla belirtir. Bu XF / FF CB-hiPSC (XF-hiPSC), artırılmış farklılaşma ve türler arası kimera potansiyeline sahip blastomer benzeri Tankyrase / PARP1 İnhibitörü Düzenlenmiş Naif kök hücrelere (TIRN-SC) verimli bir şekilde geri döndürülebilir.

Özet

İnsan kordon kanı (CB) miyeloid progenitörünün yüksek kaliteli insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) durumuna yeniden programlanması, entegre olmayan epizomal vektörler ve stromal sinyaller kullanılarak elde edilebilir. Bu konvansiyonel, astarlanmış CB-hiPSC hatları daha sonra kimyasal olarak yüksek verimliliklerle fonksiyonel totipotens ile blastomer benzeri bir Tankyrase / PARP İnhibitörü Düzenlenmiş Naif Kök Hücre (TIRN-SC) durumuna geri döndürülebilir. PARP tarafından düzenlenen TIRN-SC'ler, yüksek epigenetik plastisiteye, stabil epigenomik izlere sahip insan kök hücreleridir ve geleneksel, soy astarlı hiPSC'lerden daha fazla farklılaşma potansiyeline sahiptir. Burada, CD34+ CD33+ CB miyeloid progenitörlerinin konvansiyonel XF/FF hiPSC'ye verimli mezenkimal stroma ile aktive edilen epizomal yeniden programlanması için optimize edilmiş XF/FF yöntemleri özetlenmiştir. TIRN geri dönüşü, azalmış soy astarlı gen ekspresyonu ile bölünme evresi insan embriyo hücrelerinin transkripsiyonel, epigenetik ve fonksiyonel özelliklerini benimsemek için XF/FF konvansiyonel hiPSC'yi tekrarlanabilir şekilde güçlendirdi. TIRN ile geri döndürülen CB'den türetilen XF-hiPSC'nin, genetik olarak bağımsız geçmişlere sahip geniş bir repertuar boyunca yönlendirilmiş çok soylu farklılaşmada (hematovasküler soylar dahil) belirgin bir iyileşme gösterdiğini doğruladık. Bu yöntemler, klinik dereceli HLA tanımlı 'Evrensel' donör TIRN-SC (UTIRN-SC) bankaları için cGMP uyumlu TIRN-SC hatları oluşturmak için ilk adım olarak hizmet eder. CD34 + CD33 + CB progenitörlerinden gelişmiş farklılaşma çok yönlülüğü ile UTIRN-SC hatlarının türetilmesi, rejeneratif tıp üzerinde yüksek bir etkiye sahip olabilir. Örneğin, UTIRN-SC'ler, kapsamlı çok soylu "kullanıma hazır" hücresel tedaviler için HLA tanımlı, kriyo ile korunmuş kardiyak, vasküler ve nöral donör progenitörlerinin doku bankalarını oluşturabilir.

Giriş

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler) kişiselleştirilmiş hücresel tedaviler için umut verici fırsatlar sunsa da, klinik uygulamaları, güvenliklerini, etkinliklerini ve maliyet etkinliklerini etkileyen tümörjenite, immünojenisite ve fenotipik ve fonksiyonel heterojenite1 gibi büyük zorluklarla karşı karşıyadır. Ayrıca, geleneksel, astarlanmış hiPSC hatlarından türetilen soy taahhütlü progenitörler, oldukça değişken hatlar arası farklılaşma verimlilikleri2 ile üretilir ve sınırlı in vivo aşılama ve işlevsellik sergiler. Bununla birlikte, bu tür sınırlamalar, optimize edilmiş yeniden programlama yöntemleri3 veya alternatif kök hücre durumları 4,5 kullanılarak aşılabilir.

Deri veya kan somatik hücrelerinin hiPSC'ye viral olmayan epizomal yeniden programlama etkinlikleri düşük olmasına rağmen (~% 0.01 -% 2)6, CB progenitörlerinin yüksek derecede optimize edilmiş dört faktörlü yeniden programlanması elde edilebilir ve mezenkimal stromal kök progenitör (MSC) ile aktive edilen ko-kültür koşullarında% 50'ye kadar toplu verimliliğe ulaşabilir7. Bu sistemde, CB miyeloid progenitörlerinin hücresel olarak yeniden programlanması, çözünür ve temasa bağımlı stromal sinyallerle hızlandırıldı. Stroma primeli (SP) epizomal CB kaynaklı hiPSC hatları, konvansiyonel fibroblast kaynaklı hiPSC 3,5'ten daha yüksek verimlilikle vasküler progenitörlere (VP) farklılaşmıştır. SP-CB-iPSC'den türetilen VP, daha otantik embriyonik VP transkripsiyonel kimliği, azalmış yaşlanma ve DNA hasarına duyarlılık sergiledi 3,4. SP-CB-iPSC'den türetilen VP ayrıca, retinal iskemi reperfüzyonu ile yaralanmış yetişkin immün yetmezliği olan farelerin vitreusuna sistemik veya doğrudan transplantasyonu takiben konvansiyonel hiPSC'den türetilmiş VP'den daha sağlam in vivo engraftman göstermiştir 3,4.

Zimmerlin ve ark. hazırlanmış, konvansiyonel insan pluripotent kök hücrelerini, geliştirilmiş çok soylu farklılaşma potansiyeline sahip bir TIRN-SC durumuna geçiren iki aşamalı bir kimyasal yeniden programlama sistemi ('LIF-5i -> LIF-3i') kurdu5. Diferansiye TIRN-SC'den türetilmiş vasküler progenitörler, iskemik retinanın derin nöral katmanlarına göç etme ve yeniden vaskülarizasyon için gelişmiş kapasiteleri ile gösterildiği gibi, daha yüksek işlevsellik, daha fazla genomik stabilite ve üstün in vivo engraftman sergiledi4. TIRN-SC, türler arası kimera testinde yüksek katkı ile fonksiyonel bir hibrit blastomer benzeri durum elde etmek için proteogenomik yeniden programlamaya tabi tutuldu8. TIRN-SC, DNMT1 ekspresyonunu korudu ve CpG ile metillenmiş genomik baskılı bölgelerde erozyona karşı korundu. İlginç bir şekilde, SP-CB-hiPSC, alternatif, daha az verimli yöntemlerletüretilen hiPSC'den daha verimli bir şekilde TIRN-SC'ye geri döndürüldü 5,9.

Bu nedenle, TIRN-SC'ler, geliştirilmiş çoklu soy farklılaşma kapasitesi ve verimli kimera katkısı ile alternatif bir kök hücre durumudur. Daha fazla optimizasyon
Tanımlanmış, cGMP uyumlu kültür koşullarında TIRN-SC'nin yeniden programlanması, tedaviler için çok çeşitli fonksiyonel, aşılanabilir hücre tiplerinin ve dokuların oluşturulmasını kolaylaştıracaktır. Uygun maliyetli terapötik progenitörlere olan ihtiyacı karşılamak için, bu yöntemler HLA tanımlı CD34 + hematopoietik CB veya periferik kan progenitörleri kullanılarak cGMP dereceli 'Evrensel Donör' TIRN-SC (UTIRN-SC) bankaları üretmek için uygulanabilir. HLA tanımlı UTIRN-SC'den türetilmiş progenitörler, karmaşık dokuların hemen, çok soylu rejenerasyonunu gerektiren daha fazla sayıda hastanın ihtiyaçlarına hizmet edebilir.

Klinik kemik iliği transplantasyonu (KİT) için geliştirilen paradigmalar, ulusal donör kayıtlarından kısmen HLA uyumlu veya HLA-haplo ile özdeş hematopoietik kök hücrelerden UTIRN-SC bankalarının geliştirilmesine rehberlik edebilir. ABD de dahil olmak üzere 18 ülkeden birleştirilmiş ilk 10 haplotipin tahmine dayalı, küresel bir hesaplamalı analizi, bu tür hiPSC 'haplobankalarından' ortalama %68,4'lük bir hasta kapsamı sağlayacaktır10. Tanımlanmış bir UTIRN-SC bankası, yalnızca soya bağlı progenitörler sağlamakla kalmaz, aynı zamanda geniş genetik çeşitliliğe sahip popülasyonlarda (örneğin, ABD) greft reddini azaltmak için toleransa neden olan hematopoietik progenitörlerin üretilmesi de dahil olmak üzere, tüm organ üretimi11,12 için evcil hayvanlarda (örneğin domuzlar) türler arası blastosist tamamlama sistemlerinin terapötik TIRN-SC uygulamalarını da destekleyebilir.

TIRN yetkin XF/FF hiPSC hatları oluşturmak için bu değiştirilmiş yeniden programlama protokolü, gelecekteki cGMP uyumlu UTIRN-SC bankalarını geliştirmek için ilk adımdır. Bu protokol, insan CB miyeloid progenitörlerinin geleneksel XF-hiPSC hatlarına kademeli stroma astarlı yeniden programlamasını ve fonksiyonel doğrulamasını ana hatlarıyla belirtir. Bu XF-hiPSC, XF olmayan yöntemlerebenzer verimlilikle TIRN-SC'ye kolay geri dönüş gösterdi 7 ve iyi şekillendirilmiş soy yanlılığı azaltılmış teratomlar (izojenik primed XF-hiPSC'ye göre) üretmek için geliştirilmiş kapasite dahil olmak üzere sınırsız fonksiyonel pluripotentlik elde etti4,5,9. Ayrıca, hematovasküler soylara gelişmiş ve sağlam doğrudan farklılaşmaları için TIRN ile geri döndürülmüş XF-hiPSC'yi doğrulayan protokolleri de özetliyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm yeniden programlama deneyleri, Ulusal Bilimler Akademisi ve Uluslararası Kök Hücre Araştırmaları Derneği (ISSCR) tarafından yayınlanan yönergelere uygundur. HiPSC üretimi için, donör hücre toplama protokolleri ve donör bilgilendirilmiş onam, Johns Hopkins Üniversitesi (JHU) Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) gözetimi tarafından onaylandı. Tüm deneyler, JHU Kurumsal Kök Hücre Araştırma Gözetimi (ISCRO) kapsamında gerçekleştirilmiştir ve bilgilendirilmiş onam ve köken değerlendirmesi ile ilgili Kurumsal standartlara uygundur. Ek olarak, tüm hayvan kullanımı ve cerrahi prosedürler, JHU Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Enstitüsü (IACUC) tarafından onaylanan protokollere uygun olarak gerçekleştirildi. Hayvan prosedürlerini içeren tüm deneyler (ör., NOD'un deri altı / kas içi enjeksiyonları. Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NOG SCID) fareleri (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) teratom analizi ve ICR psödogebe farelere blastosist transferi için) JHU IACUC tarafından gözden geçirildi ve onaylandı. Bu incelemeler, etik fedakarlık, insancıl barınma ve hayvan rahatsızlığını en aza indirmek için uygun önlemler ile ilgili hususları içeriyordu.

1. Besleyici içermeyen xenofree hiPSC epizomal yeniden programlama

  1. Donör hematopoetik progenitör hücre hazırlığı
    1. Kriyoprezervasyonlu CD34 + hematopoietik kök / progenitör hücreleri (ör., 1x106 yenidoğan CB hücreleri) doğumdan hemen sonra veya kriyoviyalleri sıvı nitrojen depolama tankında saklayın. Taşıma ve taşıma sırasında hücrelerin sürekli olarak donmuş halde tutulduğundan emin olun.
      NOT: Alternatif olarak, dondurularak saklanmamış donör hücreler, onaylanmış protokoller kullanılarak toplama ve CD34 zenginleştirmesinden hemen sonra da kullanılabilir.
    2. Hücreleri su banyosunda çözmeden önce, şişenin içinde sıkışan gazı serbest bırakmak için sterilize edilmiş kriyoviali bir biyogüvenlik kabini içinde nazikçe açın ve ardından şişeyi sıkıca kapatın.
    3. Şişeyi 1 ila 2 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Neredeyse hiç buz kalmayana kadar şişeyi hafifçe döndürün. Şişeyi su banyosundan çıkarın ve iyice sterilize edin (yani, % 70 etanol spreyi).
      NOT: Tüm adımlar uygun aseptik teknik gerektirir ve steril bir biyolojik güvenlik davlumbaz kabini içinde gerçekleştirilir.
    4. Hücreleri yavaşça ve yavaşça 50 mL'lik boş bir steril konik tüpe aktarın. Şişeyi 1 mL soğuk ksenofree hematopoietik progenitör (XF-HP) genleşme ortamı ile yıkayın (Tablo 1) ve DMSO kriyoprotektanı seyreltmek için hücrelerle nazikçe birleştirin (tüpün kenarları boyunca damla damla).
    5. Tüpü 30 saniye boyunca bir rafta bekletin ve yavaşça (damla damla) 2 mL soğuk XF-HP ortamı ekleyin. Ortamı eklerken hücre süspansiyonunu hafifçe döndürün. Sırayla 4, 8 ve 4 mL soğuk XF-HP ortamı (toplam 20 mL'ye kadar hacim) ekleyerek bu adımı iki kez tekrarlayın. Seyreltilmiş hücreleri 100 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
      NOT: Kriyoprotektan çözeltisinde ve seyreltme adımları sırasında hücreleri yukarı ve aşağı pipetlemeyin. XP-HP medium'u damla damla ve DMSO en az 10 kat seyreltilene kadar yavaşça ekleyin. DMSO seyreltmesi ekzotermik bir reaksiyona neden olduğu için soğuk ortam kullanın.
    6. Biyogüvenlik kabininde hücresiz süpernatanı aspire edin. Hücre peletini nazikçe yerinden çıkarın. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre sayımı için 2 mL XF-HP genleşme ortamında yeniden süspanse edin.
    7. Çözülmüş hücreleri ultra düşük bağlı hücre kültürü çok kuyucuklu plakalara aktarın (ör. 2 mL hücre / XF-HP ortam karışımını 6 oyuklu bir plakanın 1 oyuğuna aktarın).
    8. Hipoksik koşulları taklit etmek için plakayı Saran sargısına sıkıca sarın. Plakayı bir inkübatöre aktarın (37 °C ,% 5 CO2, nemli atmosfer). Alternatif olarak, ambalajsız plakayı O2 kontrollü bir inkübatöre yerleştirin (% 5 O2, % 5 CO2, nemli atmosfer).
    9. Hematopoietik progenitörleri XF-HP ortamında 3 gün boyunca kültürleyin.
  2. Mezenkimal kök progenitör hücre (MSC) hazırlığı
    1. Dondurularak saklanmış bir alikotu 37 ° C'lik bir su banyosunda 1 ila 2 dakika inkübe ederek düşük geçişli (p2 ila p3) insan MSC'sinin bir alikotunu (0.75 - 1x106 hücre) çözün. Neredeyse hiç buz kalmayana kadar şişeyi hafifçe döndürün. Şişeyi su banyosundan çıkarın ve iyice sterilize edin (yani% 70 etanol).
      NOT: Düşük geçişli (p2) insan MSC'si, yerleşik protokoller ve kriyoprezervasyon kullanılarak insan kemik iliğinden satın alınabilir veya hazırlanabilir. MSC yaklaşık 7-10 gün önceden çözülebilir ve nükleofeksiyondan bir gün önce besleyici tabaka olarak ışınlanabilir / kaplanabilir (Şekil 1).
    2. DMSO kriyoprotektanını en az 10 kat seyreltmek için hücreleri nazikçe ve yavaşça (tüpün kenarları boyunca damla damla) bir biyogüvenlik kabini içinde soğuk ksenofree serumsuz mezenkimal kök hücre (XF-MSC) ortamı (Tablo 1) içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın (ör., 1 mL kriyoprezervasyonlu hücre alikotunu 9 mL XF-MSC ortamına aktarın).
    3. Tüpü durulamak ve konik tüpte birleştirmek için 1 veya 2 mL soğuk XF-MSC ortamı kullanın. Seyreltilmiş hücreleri 100 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
    4. Biyogüvenlik kabininde hücresiz süpernatanı aspire edin. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre sayımı için hücre peletini 1 mL XF-MSC ortamında nazikçe yeniden süspanse edin.
    5. Çözülmüş hücreleri doku ile muamele edilmiş hücre kültürü çok kuyulu plakalara aktarın (örneğin, cm2 başına 5.000-6.000 hücre veya 6 oyuklu bir plakanın 1 oyuğunda yaklaşık 50.000 hücre). Plakaları bir inkübatöre yerleştirin (37 °C,% 5 CO2, nemli atmosfer). XF-MSC ortamını bir biyogüvenlik kabini içinde her 2-3 günde bir yenileyin.
    6. Nükleofeksiyondan bir gün önce, bir biyogüvenlik kabininde hücresiz süpernatanı aspire edin. MSC'yi PBS (2 mL / kuyu) ile bir kez yıkayın. PBS'yi aspire edin. 1 ml / kuyucuk hücre ayrışma reaktifi ekleyin (ör., 1X Tripsin-EDTA çözeltisi). Bir CO2 inkübatörde 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
    7. 1 mL XF-MSC ortamı (en az 2 kat seyreltme) ekleyerek ayrışma reaktifini nötralize edin ve bir pipetle tek hücreli bir süspansiyona hafifçe ezin. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe toplayın. 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin.
    8. Süpernatanı aspire edin. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre sayımı için hücre peletini 1 mL XF-MSC ortamında yeniden süspanse edin.
    9. (2.000 rad) mezenkimal progenitörleri bir g- veya X-ışını ışınlayıcı ve plaka kullanarak 5 pasaj altında Arg-Gly-Asp (RGD) peptit kaplı sentetik yüzey 6 oyuklu plakalara (2x10;5 hücre) ışınlayın. Plakaları gece boyunca bir inkübatörde saklayın (37 °C, %5 CO2, nemli atmosfer).
  3. Xenofree epizomal yeniden programlama
    1. 3 günlük CB HP kültürlerini XF-HP genişletme ortamında bir biyogüvenlik kabininde 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
    2. Biyogüvenlik kabininde hücresiz süpernatanı aspire edin.  Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre sayımı için hücre peletini 1 mL XF-HP genleşme ortamında nazikçe yeniden süspanse edin.
    3. 1x106 genişletilmiş HP hücrelerini 100 μL insan CD34+ hücre nükleofeksiyon solüsyonu (insan CD34+ hücre nükleofektör kiti) ile birleştirin. 6 μg saflaştırılmış konsantre epizom (<5 μL) ekleyin ve nükleofeksiyon kitinin plastik transfer pipetini kullanarak dikkatlice bir nükleofektör küvetine aktarın. Baloncuklardan kaçının. Küveti nükleofektör cihazına yerleştirin ve U-008 programını kullanın.
      NOT: TOP10 E. coli'de rutin dönüşüm ile epizomal EBNA bazlı pCEP4 vektör pEP4 EO2S EM2K (OCT4, SOX2, MYC, KLF4) stoklarını hazırlayın ve plazmid Maxi-hazırlık kitlerini kullanarak saflaştırın. Nükleofeksiyon günü, bir PCR saflaştırma kiti 7 kullanarak plazmidi temizleyin ve konsantre edin.
    4. Nükleofeksiyonun hemen ardından, küvete 500 μL önceden ısıtılmış XF-HP genleşme ortamı ekleyin ve hücreleri 1 mL XF-HP ortamındaki hücreleri, steril bir transfer pipeti kullanarak 1 oyuklu ultra düşük bağlı hücre kültürü 6 oyuklu plakaya aktarın.
      NOT: Nükleofected hücreler çok kırılgandır ve normal 1 mL pipet uçlarından kaynaklanan kesme gerilimine dayanamazlar. Ultra düşük bağlanma kültürü plakalarına aktarma, RGD kaplı plakalara son bağlanmadan önce nükleofeksiyon sonrası hücre geri kazanımını destekleyen bir adımdır.
    5. Hipoksik koşulları taklit etmek için plakayı plastik sargıya sıkıca sarın. Plakayı bir CO2 inkübatöre yerleştirin (37 °C,% 5 CO2, nemli atmosfer). Alternatif olarak, ambalajsız plakayı O2 kontrollü bir inkübatöre yerleştirin (% 5 O2, % 5 CO2, nemli atmosfer). 4 ila 6 saat kuluçkaya yatırın.
      NOT: Bu adım, nükleofected HP hücrelerinin MSC tek katmanlarına aktarılmadan önce iyileşmesine izin verecektir.
    6. Hücreleri bir biyogüvenlik kabininde 15 mL'lik konik bir tüpe toplayın. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
    7. Süpernatanı bir biyogüvenlik kabini içinde aspire edin. Hücre peletini 1 mL XF-HP genleşme ortamında yeniden süspanse edin. ROCK inhibitörü Y-27632 (nihai konsantrasyon 10 μM) ile desteklenmiş XF-HP genleşme ortamında (2 mL / kuyu) RGD kaplı plakalarda cm2 başına yaklaşık 17.500 hücre yoğunluğunda ışınlanmış MSC üzerine plaka nükleofected HP hücreleri. Plakayı bir CO2 inkübatöre yerleştirin (37 °C,% 5 CO2, nemli atmosfer).
    8. Nükleofeksiyondan iki gün sonra, bir biyogüvenlik kabini içindeki her bir oyuğa 2 mL (eşit hacimde) E8 ortamı ekleyin.
    9. Her gün kültür ortamı hacminin yarısını E8 ortamı ile değiştirin. Yüzen hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe toplayın, 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin ve geri kazanılan hücreleri kültüre geri ekleyin.
    10. 21. günde, vitronektin kaplı doku kültürü ile muamele edilmiş 6 oyuklu plakalar hazırlayın. 1 mL seyreltilmiş vitronektin çözeltisi ekleyin (ör., Vitronektin-XF için 40 mL / mL) 6 oyuklu bir plakanın 1 oyuğuna ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    11. Bir biyogüvenlik kabini içinde ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak tek tek XF-hiPSC kolonilerini manuel olarak seçin. Pipet ile ezin ve tek kolonileri ROCK inhibitörü Y-27632 (nihai konsantrasyon 5 μM) ile desteklenmiş E8 ortamında vitronektin kaplı plakalara aktarın. Plakayı bir CO2 inkübatöre yerleştirin (37 °C,% 5 CO2, nemli atmosfer).
    12. Ertesi gün, ortamı ROCK inhibitörü takviyesi olmadan dikkatlice E8 ortamı ile değiştirin. Daha sonra E8 ortamını her gün (2 mL/kuyu) bir biyogüvenlik kabininde değiştirin.

2. Rutin hiPSC kültürü ve bakımı

  1. Koloniler 5 ila 6 gün sonra büyüdüğünde (yani, 0,5 ila 1 mm çap veya yaklaşık% 80 birleşme), ortamı bir biyogüvenlik kabininde aspire edin.
  2. Hücreleri yıkamak için 2 mL / kuyu PBS ekleyin. PBS'yi aspire edin. 1 mL EDTA bazlı hücre ayrışma çözeltisi ekleyin. Bir CO2 inkübatörde 5 dakika inkübe edin (37 ° C,% 5 CO2, nemli atmosfer). Bir mikroskop kullanarak hücrelerin gevşek bir şekilde bağlandığını (örneğin, parlak yuvarlak hücreler, ancak yine de plakaya bağlı) kontrol edin.
  3. Hücreleri bozmadan ayrışma solüsyonunu bir biyogüvenlik kabini içinde nazikçe aspire edin.
  4. Hücreleri, hücre kümelerini korumak için kuvvetli olmayan pipetleme ile ROCK inhibitörü Y-27632 (son konsantrasyon 5 μM) ile desteklenmiş 1-2 mL E8 ortamında toplayın. Hücre kümelerini vitronektin kaplı (bkz. bölüm 1.3.11) 6 oyuklu hücre kültürü ile muamele edilmiş plakalara (oyuk başına 10 koloniye eşdeğer veya 1:10 bölünme) aktarın. Plakayı bir CO2 inkübatöre yerleştirin (37 °C,% 5 CO2, nemli atmosfer).
  5. Her 5-7 günde bir EDTA bazlı hücre ayrışma solüsyonu kullanarak alt kültürlemeye devam edin.
    NOT: SP-CB-hiPSC yeniden programlaması için genellikle ek alt klonlama veya manuel koloni toplama gerekli değildir, ancak hiPSC klonları anormal morfolojiye sahip koloniler içeriyorsa (örneğin, fibroblastlar veya embriyoid vücut oluşumu gibi spontan farklılaşma, anormal düz olmayan kolonilerin ortaya çıkması), bir biyogüvenlik kabini içinde bir mikro pipet ve mikroskop kullanarak kolonileri manuel olarak seçin veya anormal klonları atın. hiPSC'nin verimli olmayan, kararlı olmayan yeniden programlanması, TIRN-SC geri dönüşü ile uyumlu değildir.

3. XF-hiPSC klonlarının fenotipik doğrulaması

  1. XF-hiPSC klonlarını, uzun süreli kriyoprezervasyon ve fonksiyonel çalışmalarda uygulamadan önce, bölüm 2'de açıklandığı gibi ilk doğrulama için (Şekil 2) en az 5-7 geçiş için genişletin. Her bir kriyoprezervasyon şişesindeki geçiş sayısını kaydedin.
    NOT: Düşük geçişli XF-hiPSC klonlarının ilk karakterizasyonu, akalin fosfataz aktivitesi ve TRA-1 antijeni veya NANOG immün tespiti gibi çoklu tahlillerle doğrulanabilir.
  2. Alkalen fosfataz boyama ile XF-hiPSC doğrulaması ve sayımı gerçekleştirin (Şekil 2A,B).
    NOT: Toplu kültürlerde yeniden programlama verimlilikleri, epizomal nükleofeksiyonlardan 3-5 hafta sonra P0'da, 3. günde kaplanan tek giriş hücreleri başına tamamen yeniden programlanmış kolonilerin sayısı numaralandırılarakbelirlenebilir 7,13.
    1. Biyogüvenlik kabininde aspire kültürü ortamı.
    2. Hücreleri PBS ile yıkayın (kuyu başına 2 mL). PBS'yi aspire edin. % 2 paraformaldehit/PBS çözeltisi ekleyerek hücreleri sabitleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
    3. Paraformaldehit/PBS çözeltisini kimyasal atık güvenliği yönergelerine göre çıkarın ve atın.
    4. Hücreleri PBS ile yıkayın (kuyu başına 2 mL). PBS'yi aspire edin. 1-2 mL alkalin fosfataz substratı ekleyin ve yavaş çalkalama ile oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika inkübe edin.
    5. Reaksiyonu durdurmak için PBS ile 3 kez yıkayın. Fotomikrograf ve numaralandırma.
      NOT: Yanlış pozitif lekelenmeye neden olabileceğinden aşırı inkübasyon süresinden veya sıcaklığından kaçının.
  3. TRA-1 antijen immün boyaları ile XF-hiPSC boyama doğrulaması ve sayımı gerçekleştirin (Şekil 2C).
    NOT: Epizomal yeniden programlama için, ilk geçişler sırasında transgenik ekspresyonun ve EBNA1 vektör omurgasının tespiti, yayınlanmış protokoller7 kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Rutin doğrulama, G-bandı (Şekil 2D) veya tüm genom dizisi tabanlı kapsama testleri ile karyotiplemeyi içerir. Temel fonksiyonel pluripotens, teratom farklılaşma protokolleri (Şekil 2E) veya yönlendirilmemiş embriyoid vücut farklılaşmalarının kantitatif çok gen ekspresyon skor kartları kullanılarak da test edilebilir14.
    1. Bir biyogüvenlik kabininde, immünokrom, uygun konsantrasyonda E8 ortamına florokrom konjuge canlı leke antikorları ekleyerek 30 dakika boyunca TRA-1-60 veya TRA-1-81 antijenleri için kuyucukları çoğaltır.
    2. Kültür ortamını aspire edin. E8 ortamı ile iki kez yıkayın (kuyu başına 2 mL).
    3. E8 ortamında veya Fenol Kırmızısı içermeyen ortamda fotomikrograf ve numaralandırma.
      NOT: Alternatif olarak, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 2 paraformaldehit / PBS çözeltisi kullanarak hücreleri sabitleyin ve standart antikorlar kullanarak TRA-1 antijenleri için immünostain yapın.
  4. Akış sitometrisi ile XF-hiPSC immünofenotipini doğrulayın.
    1. Bir biyogüvenlik kabininde, aspire kültürü ortamı.
    2. Hücreleri PBS'de yıkayın (kuyu başına 2 mL). PBS'yi aspire edin. Enzimatik ayrışma reaktifi ekleyin (ör., Accutase, oyuk başına 1 mL). Plakayı bir CO2 inkübatörde (% 5 CO2, nemli atmosfer) 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
    3. Eşit hacimde kültür ortamı ekleyerek hücreleri toplayın ve bir hücre süzgecinden (40-70 μm filtre) geçirin. Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
    4. PBS'de hücre peletini %5 FBS (kuyu eşdeğeri başına 1 mL) ile yeniden süspanse edin. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın. FACS testi başına yaklaşık 100.000-200.000 hücreyi yuvarlak tabanlı tüplere dağıtın (hacimleri test başına yaklaşık 100 μL'de tutun).
    5. Hücre dışı boyamalar için, saf fare serumu kullanarak isteğe bağlı bir engelleme adımından sonra (test başına 5 μL ekleyin, oda sıcaklığında 5 dakika), florokrom konjuge antikorlarla inkübe edin (ör., TRA-1-81 PE, SSEA4 APC) üreticinin talimatlarına göre. 3 mL PBS ile yıkayın. 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. FACS tamponunda yeniden askıya alın (örneğin, %5 FBS'li PBS) ve bir FACS cihazı kullanarak edinin.
      NOT: immün yolla tespit edilen proteinlerin özgüllüğünü doğrulamak için her zaman uygun izotip kontrollerini kullanın ve paralel numuneleri boyayın.
    6. Hücre içi boyamalar için (ör., NANOG-PE, OCT3 / 4-PE, SOX2-PE), fiksasyon / geçirgenlik adımları için üreticinin talimatlarını izleyin. Florokrom konjuge antikorlar veya eşleşen izotip kontrolleri ile inkübe edin. Bir FACS cihazı kullanarak edinin.

4. XF-hiPSC klonlarının dondurularak saklanması ve çözülmesi

  1. Uzun süreli kriyoprezervasyon ve fonksiyonel çalışmalarda uygulamadan önce ilk doğrulamayı gerçekleştirmek için (Şekil 2) XF-hiPSC klonlarını en az 5-7 geçiş için genişletin. Her bir kriyoprezervasyon şişesindeki geçiş sayısını kaydedin.
    1. Biyogüvenlik kabininde aspire kültürü ortamı.
    2. Hücreleri PBS ile yıkayın (kuyu başına 2 mL). PBS'yi aspire edin.  XF-hiPSC kolonilerini hücre kümelerine ayırmak için EDTA bazlı hücre ayırma çözeltisi (oyuk başına 1 mL) ekleyin. Plakayı bir CO2 inkübatörde (37 ° C,% 5 CO2, nemli atmosfer) 5 dakika inkübe edin. Bir mikroskop kullanarak hücrelerin gevşek bir şekilde bağlandığını (örneğin, parlak yuvarlak hücreler) kontrol edin.
    3. Hücre tek tabaka kolonilerini bozmadan nazikçe ayrışma solüsyonunu aspire edin ve hücre kümelerini korumak için hücreleri kuvvetli olmayan pipetleme ile 1-2 mL E8 ortamında toplayın (küme başına 10-50 hücre). XF-hiPSC'yi steril 15 mL'lik konik bir tüpe toplayın. Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
    4. Süpernatanı bir biyogüvenlik kabininde aspire edin. Hücre peletini dondurma çözeltisinde yeniden süspanse edin (Tablo 2, mL başına ~ 1 kuyu eşdeğeri).
    5. Hücreleri uzun süreli depolama kriyojenik tüplerine aktarın. Tüpleri yavaş donduruculu bir kaba koyun ve numunelerin -80 °C'lik bir dondurucuda gece boyunca donmasına izin verin. Ertesi gün, kriyovialleri uzun süreli saklama için sıvı nitrojen dondurucuya koyun.
  2. Çözdürme için, vitronektin ile ön kaplama yaparak bir plaka hazırlayın (bkz. bölüm 1.3.11).
    1. Dondurulmuş şişeyi 37 ° C'lik bir su banyosuna koyun ve hücreleri ~ 1-2 dakika boyunca çözdürün. Sterilize edin (yani etanol spreyi).
    2. XF-hiPSC'yi, steril bir biyolojik güvenlik başlığı kabini içinde hücreleri 10 kat yavaşça seyreltmek için 9 mL çözülme ortamı içeren steril 15 mL'lik bir konik tüpe yavaşça aktarın (Tablo 2).
      NOT: Kuvvetlice pipetlemeyin.
    3. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
    4. Hücresiz süpernatanı bir biyogüvenlik kabininde aspire edin. ROCK inhibitörü (son konsantrasyon 5 mM) ile desteklenmiş E8 ortamında (1-2 mL) hücre peletini yeniden süspanse edin.
      Not: Y-27632'nin hariç tutulması, çözülme sonrası geri kazanım verimliliğinin düşük olmasına neden olacaktır.
    5. Çözülmüş hücreleri 6 oyuklu bir plakanın 1 veya 2 vitronektin kaplı kuyucuğuna aktarın. Ertesi gün, hücre genişlemesi için ortamı ROCK inhibitörü olmayan normal E8 ortamı ile değiştirin.

5. XF-hiPSC'nin ksenofree hematovasküler farklılaşması

  1. Optimize edilmiş ksenofree hemato-vasküler farklılaşma protokolümüzü kullanarak XF-hiPSC'yi ayırt edin (Şekil 3)4.
    NOT: Bu protokol15'ten değiştirilmiştir.
    1. XF-hiPSC'yi ~% 40-50 birleşmede hazırlayın (geçtikten 1-3 gün sonra).
    2. Kültür ortamını aspire edin ve bir biyogüvenlik kabinine 2 mL mezodermal tayin ortamı (Tablo 2) ekleyin.
    3. 2 gün sonra, besiyerini aspire edin ve bir biyogüvenlik kabinine 2 mL / kuyucuk vasküler farklılaşma ortamı (Tablo 2) ekleyin. Bu adımda çok sayıda ölü veya yüzen hücre görünüyorsa, 2 mL PBS ile bir kez yıkayın.
    4. Vasküler farklılaşma ortamını 11. güne kadar bir biyogüvenlik kabininde iki günde bir değiştirin.
      NOT: Yüksek hücre yoğunluğu ve düşük pH nedeniyle ortam sararırsa, 1 mL taze ortam ekleyin veya her gün değiştirin.
  2. Vasküler farklılaşma ortamında 7-10 günlük kültürden sonra, manyetik boncuk hücre sıralama yöntemi ile CD31 + veya CD34 + vasküler hücreleri yapışık tek tabakadan saflaştırın.
    NOT: Her bir klon, farklı farklılaşma kinetiği gösterebilir. FACS analizi ile CD31/CD34 ekspresyonu için tepe zaman noktasını belirleyin (Şekil 4A). Manyetik boncuk zenginleştirme öncesi ve sonrası zenginleştirme FACS analizi gereklidir. Hematopoietik progenitörler (HP) bu aşamada süpernatanttan geri kazanılabilir ve CD34 mikroboncukları kullanılarak zenginleştirilebilir. CD34 + XF-hiPSC'den türetilen HP, metilselüloz testi kullanılarak daha fazla doğrulanabilir (Şekil 4B-C)16.
    1. Bir biyogüvenlik kabininde, aspire kültür ortamı ve hücreleri PBS'de yıkayın (kuyu başına 2 mL). PBS'yi aspire edin ve enzimatik ayrışma reaktifi ekleyerek hiPSC kolonilerini tek hücrelere ayırın (ör., Accutase, kuyucuk başına 1 mL). Hücreleri bir CO2 inkübatöründe (% 5 CO2, nemli atmosfer) 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
    2. Bir biyogüvenlik kabininde, eşit hacimde kültür ortamı ekleyerek hücreleri toplayın. Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
    3. Vasküler farklılaşma ortamında hücre peletini yeniden süspanse edin (Tablo 2). Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın. Doğrudan konjuge anti-CD31 veya anti-CD34 antikoru kullanarak manyetik boncuk zenginleştirme FACS testi için yaklaşık 50.000-100.000 hücre ayırın.
    4. Kalan hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Hücre peletini bir biyogüvenlik kabininde manyetik boncuk zenginleştirme tamponunda (PBS pH 7.2, %0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM EDTA) yeniden süspanse edin.
    5. Hücreleri bir hücre süzgecinden (40-70 μm filtre) geçirin. 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. 60 μL manyetik boncuk zenginleştirme tamponunda yeniden süspansiyon haline getirin.
    6. 20 μL FcR Bloke Edici Reaktif ekleyin, ardından 20 μL CD31 veya CD34 mikro boncuk ekleyin ve 4 ° C'de 15-20 dakika inkübe edin.
    7. Hücreleri 2 mL manyetik boncuk zenginleştirme tamponu ile bir biyogüvenlik kabininde ve santrifüjde (300 x g, 5 dakika) yıkayın.
    8. Hücre peletini bir biyogüvenlik kabininde 1 mL manyetik boncuk zenginleştirme tamponunda yeniden süspanse edin.
    9. Biyogüvenlik kabini içindeki bir manyetik hücre ayırıcısının manyetik alanına bir LS Sütunu yerleştirin. Sütunu 3 mL manyetik boncuk zenginleştirme tamponu ile yıkayın.
    10. Hücreleri sütuna uygulayın.  Etiketlenmemiş hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın. Kolonu 3 mL manyetik boncuk zenginleştirme tamponu ile 3 kez yıkayın.
    11. Kolonu ayırıcıdan çıkarın ve 15 mL'lik yeni bir konik tüpe yerleştirin.
    12. 3-5 mL endotelyal büyüme ortamı ekleyerek manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri yıkayın. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
    13. Bir biyogüvenlik kabininde 1 mL endotelyal büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın. Doğrudan konjuge anti-CD31 veya anti-CD34 antikoru kullanarak FACS analizi ile manyetik boncuk zenginleştirme sıralama saflığı için yaklaşık 50.000 hücre ayırın.
    14. İzole edilmiş VP, endotelyal büyüme ortamında fibronektin kaplı (10 μg/mL) doku kültürü ile tedavi edilmiş şişe plakaları üzerinde daha da genişletilebilir.

6. XF-hiPSC'nin işlevsel doğrulaması için deneysel tasarım yönergeleri

  1. Epizomal 7,17, Sendai virüsü18 veya mRNA19 yeniden programlaması gibi yerleşik bir entegre olmayan yöntem kullanarak en erken geçişlerde doğrulanmış XF-hiPSC stokları oluşturun.
    NOT: Yeniden programlamayan yöntemlerin verimliliği ve güvenilirliğinin bir karşılaştırması başka bir yerdeverilmiştir 6. Epizomal veya Sendai virüsü yeniden programlama yöntemlerinde transgenik materyal klerensi, PCR yöntemleri 7,20 kullanılarak ilk geçişler sırasında doğrulanabilir. Transgen retansiyonu TIRN-SC üretimi ile uyumlu değildir.
  2. XF-hiPSC klonlarında normal karyotipi G-bandı veya tüm genom dizisi tabanlı kapsama testleriile doğrulayın 9.
  3. DNA metilasyonu ve gen ekspresyon dizileri veya dizileme yöntemleri 5,11,14 kullanarak XF-hiPSC hatlarının gen ekspresyonunu ve epigenomik bütünlüğünü (yani ebeveyn baskıları, X aktivasyonu) doğrulayın.
  4. Teratom farklılaşma protokollerini (Şekil 2E), RT-PCR dizilerini14 kullanarak kantitatif embriyoid cisim (EB) farklılaşma testlerini veya 3 germ katmanına9 doğru yönlendirilmiş diferansiyasyon testlerini kullanarak temel fonksiyonel pluripotensi doğrulayın.
    NOT: Mikroskopi ile histolojik karakterizasyon kullanılarak teratom testlerinin çok soylu farklılaşma kapasitesi ve soy içi proliferatif indeksi için kantitatif yöntemler başka bir yerde sağlanmaktadır4. Mezodermal soylara ve hemato-vasküler spesifikasyona doğru yönlendirilmiş farklılaşma protokolleri (Şekil 4A-C) daha önce detaylandırılmıştır 4,5,9 ve ayrıca kesin endoderme doğru yönlendirilmiş farklılaşma testi (Şekil 4D)5. Ektoderme yönelik yönlendirilmiş farklılaşma testinin örnekleri başka bir yerde verilmiştir 4,5.

7. XF-hiPSC'nin kimyasal TIRN adaptasyonu

  1. Yayınlanmış protokoller 9,21'i izleyerek CF1 veya CF1 x DR4 hibrit E13.5 fare embriyolarından kurum içi düşük geçişli MEF besleyicileri satın alın veya hazırlayın. TIRN adaptasyon adımından en az bir gün önce jelatinize (suda %0.1 jelatin, kuyu başına 1 mL) doku kültürü ile muamele edilmiş 6 oyuklu plakada oyuk başına 200.000 MEF besleyiciyi plaka yapın (ayrıntılı TIRN protokolleri başka bir yerde verilmiştir 4,5,9).
  2. Besleyici içermeyen bir kültür sisteminde doğrulanmış normal karyotiplere sahip transgen içermeyen XF-hiPSC kültürlerini koruyun ve genişletin (örneğin, E8 ortamı, kurum içi formülasyon için Tablo 1'e bakınız).
  3. E8 ortamını LIF-5i ortamı ile değiştirin (kuyucuk başına 2 mL; Tablo 1) XF-hiPSC kültürleri bir biyogüvenlik kabininde ~% 50 birleşmeye ulaştıktan sonra (yani, ilk kaplamadan 3-5 gün sonra).
  4. Ertesi gün, kültür ortamını aspire edin ve LIF-5i'ye uyarlanmış XF-hiPSC'yi bir biyogüvenlik kabininde PBS (kuyu başına 2 mL) ile bir kez yıkayın. Süpernatanı aspire edin ve her oyuğa 1 mL enzimatik hücre ayrışma reaktifi ekleyin. Bir CO2 inkübatörde 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
  5. Bir pipetle nazikçe ezerek bir biyogüvenlik kabinindeki tek hücreli süspansiyona dönüştürün. LIF-5i ortamı (kuyu başına 1 mL) ile nötralize edin. Hücre süspansiyonunu steril 15 mL'lik konik bir tüpe toplayın.  5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
  6. Süpernatanı bir biyogüvenlik kabininde aspire edin. Hücre peletini 2 mL LIF-5i ortamında yeniden süspanse edin.
    NOT: Mümkünse, hücre sayımı için bir alikot alın. Enzimatik aktiviteyi, inhibitörler veya büyüme faktörleri ile takviye etmeden LIF-5i/LIF-3i ortamı ile nötralize etmek mümkündür.
  7. MEF plakasını PBS ile iki kez yıkayın (6 oyuklu plakalarda oyuk başına 2 mL) ve hücreleri ekleyin (2 mL LIF-5i ortamında 1 kuyulu MEF besleyiciye LIF-5i uyarlanmış hücrelerin 1 kuyu eşdeğeri).
    NOT: Her bir XF-hiPSC hattı için ilk kaplama yoğunluklarının optimizasyonu isteğe bağlıdır. Hücreler önceki adımda sayıldıysa, besleyicilere oyuk başına en az 1x106 hücre yerleştirin.  Plakayı bir CO2 inkübatörüne aktarın (37 °C,% 5 CO2, nemli atmosfer).
  8. XF-hiPSC'yi bir CO2 inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2, nemli atmosfer) MEF üzerinde LIF-5i'de 3-5 gün boyunca kültürleyin ve koruyun. LIF-5i ortamını günlük olarak değiştirin.
  9. Kubbe şeklinde TIRN-SC kolonileri oluştuğunda (besleyicilerde 3-5 günlük kültürden sonra), kültür ortamını bir biyogüvenlik kabininde aspire edin. Her kuyuyu 2 mL PBS ile yıkayın.
  10. PBS'yi aspire edin. Her oyuğa 1 mL hücre ayırma çözeltisi (örneğin, Accutase) ekleyin. Bir CO2 inkübatörde (% 5 CO2, nemli atmosfer) 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
  11. Ayrışma reaktifini nötralize etmek için bir biyogüvenlik kabinindeki her bir oyuğa 1 mL LIF-3i ortamı (Tablo 1) ekleyin. Hücreleri yavaşça ezin ve 15 mL'lik konik bir tüpe toplayın. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
  12. Süpernatanı bir biyogüvenlik kabininde aspire edin. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre sayımı için LIF-3i ortamında (oyuk başına 1 mL) yeniden askıya alın. Bir biyogüvenlik kabininde jelatinleştirilmiş 6 oyuklu plakalarda ışınlanmış MEF üzerine oyuk başına 2 mL LIF-3i ortamında ~ 5 x 105 hücre.
    NOT: sonraki tüm bölümler için 7.12 5o 7.16 adımlarını tekrarlayın.  İlk LIF-5i'ye uyarlanmış kültürü takiben, LIF-3i kültürlerini daha düşük bir yoğunlukta (2x105 hücre / oyuk) plakalayın ve her 3-4 günde bir pasaj.
  13. Fonksiyonel çalışmalarda veya kriyoprezervasyonda kullanılmadan önce LIF-6i ortamında en az 7-3 sürekli geçiş için TIRN ile geri döndürülen XF-hiPSC'nin geçişi. Geçiş sayısını ksenofree astarlanmış kültür ortamında (örn., E8) veya LIF-5i/LIF-3i TIRN ortamında kaydedin.
    NOT: Yüksek geçişli (örn. >p40) XF-hiPSC hatlarının TIRN versiyonu verimsizdir ve önerilmez. Yüksek geçişli hatlar genellikle kromozomal veya alt kromozomal kusurları barındırır, bu da verimli TIRN geri dönüşü ile uyumlu değildir ve zayıf geri dönüş verimlilikleri ve sınırlı kültür stabilitesi ile sonuçlanacaktır. Ayrıca, fonksiyonel çalışmalar için LIF-3i besiyerinde 15'ten fazla pasaj geçirmiş TIRN kültürlerinin kullanılması önerilmez. XF-hiPSC'nin TIRN geri dönüşünün işlevsel etkisi, LIF-3i ortamında 7 ila 15 geçiş arasında en belirgindir.

8. XF/FF hiPSC'den türetilen TIRN-SC'nin yönlendirilmiş farklılaşması için deneysel tasarım yönergeleri.

  1. XF/FF hiPSC'den türetilen TIRN-SC'yi herhangi bir "yeniden hazırlama" adımı olmadan (yani, yönlendirilmiş farklılaşma testlerinde kullanılmadan önce TIRN kök hücrelerini geleneksel "hazırlanmış" koşullara geri geçirme gerekliliği olmadan) yerleşik yönlendirilmiş farklılaşma protokollerine doğrudan kullanın.
  2. TIRN'nin XF-hiPSC üzerindeki etkisinin fonksiyonel değerlendirmesi için, paralel olarak eşdeğer geçiş sayısında kardeş izojenik kültürleri ayarlayın. Astarlanmış / TIRN kardeş izojenik XF-hiPSC kültürlerini kendi ortamlarında paralel olarak koruyun (ör., vitronektin üzerinde E8 vs. MEF'de LIF-3i) ve aynı anda teratom testi yapın (Şekil 5) veya aynı embriyoid cisimciği veya yönlendirilmiş farklılaşma protokolleri ve materyalleri kullanarak farklılaştırın (Şekil 6).
  3. Mümkün olduğunda, terminal farklılaşmış soyların işlevsel değerlendirmesini yapın. Örneğin, vasküler progenitörler protein ekspresyonu, DiI konjuge asetillenmiş düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) alım testi ve Matrigel tüp testi ile değerlendirilebilir (Şekil 7).
    NOT: CB-hiPSC ve TIRN-SC'den türetilmiş VP için ek fonksiyonel testler (ör., DiI-Ac-LDL alımı/yaşlanma/proliferasyon/migrasyon deneyleri, in vitro Matrigel tüp deneyleri, hayvan Matrigel tıkaçları, ksenotransplantasyon deneyleri) başka bir yerde detaylandırılmıştır 3,4.
  4. Her bir farklılaşma testinde her bir XF-hiPSC klonu için ilk kaplama yoğunluklarını ve kinetiğini (Şekil 6) ayarlayın ve optimize edin.
    NOT: TIRN ile geri döndürülmüş XF-hiPSC, yönlendirilmiş farklılaşma testlerinde astarlanmış XF-hiPSC'den daha sağlam bir proliferatif ve farklılaşma kapasitesine sahiptir.TIRN kültürleri tipik olarak E8 kültürlerinden daha düşük bir başlangıç kaplama yoğunluğu gerektirir ve klonal sağkalımı artırmak için anti-apoptotik takviyelerin kullanılmasını gerektirmez.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol, epizomal vektörler ve stromal sinyaller7 kullanarak yüksek kaliteli hazırlanmış pluripotent bir duruma verimli miyeloid progenitör yeniden programlaması için yayınlanmış yöntemleri optimize eder. Protokol (Şekil 1), insan CB CD34 + progenitörlerinin XF-hiPSC'ye XF / FF stromal primli epizomal yeniden programlanması için tanımlanmış yöntemleri ana hatlarıyla belirtir ve yönlendirilmiş hemato-vasküler spesifikasyon yoluyla işlevsellikler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Zambidis grubu başlangıçta, saflaştırılmış epizom eksprese eden hücrelerde %50'ye varan toplu verimliliklerle soy taahhütlü CB miyeloid progenitörlerini CB-hiPSC'ye yeniden programlamak için yüksek derecede optimize edilmiş dört faktörlü bir epizomal yöntem bildirmiştir7. Burada, orijinal insan CB progenitör epizomal yeniden programlama protokolünün XF/FF stroma ile astarlanmış koşullarda değiştirilmiş bir versiyonunu sunduk. Bu yöntem, çözünür ve temasa bağımlı m...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Beyan edilecek açıklama yok.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH/NEI'den (R01EY032113; ETZ), Maryland Kök Hücre Araştırma Fonu (2023-MSCRFV-5995; 2024-MSCRFV-6248; 2025-MSCRFV-0005; 2025-R2-MSCRFV-0004 (ETZ) ve Lisa Dean Moseley Vakfı (ETZ).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Amaxa Biosystems Nükleofektör IILonzaAAB-1001 Serisi
anti-CD143 (BB9) antikoru, APC konjuge BD Biyolojik Bilimler55792910-20 µ kullanın; Test başına L (FACS)
anti-CD144 antikoru, PE konjuge BD Biyolojik Bilimler56041010-20 µ kullanın; Test başına L (FACS)
anti-CD146 antikoru, PE konjuge BD Biyolojik Bilimler55031510-20 µ kullanın; Test başına L (FACS)
anti-CD184/CXCR4 antikoru, APC konjuge BD Biyolojik Bilimler55597610-20 µ kullanın; Test başına L (FACS)
anti-CD31 antikoruBD Biyolojik Bilimler550389İmmünofloresan tahlili için bloke edici çözeltide 1:100 seyreltin
anti-CD31 antikoru, APC konjuge e-Biyobilim17-0319-422 µ kullanın; Test başına L (FACS)
anti-CD34 antikoru, APC konjuge BD Biyolojik Bilimler5558245 µ kullanın; Test başına L (FACS)
anti-CD45 antikoru, PE konjuge BD Biyolojik Bilimler55548310-20 µ kullanın; Test başına L (FACS)
anti-NANOG antikoru, PE konjugeBD Biyolojik Bilimler56048310-20 µ kullanın; Test başına L (FACS)
anti-OCT4 antikoru, PE konjugeR& D SistemleriIC1759P10 µ kullanın; Test başına L (FACS)
anti-SOX17 antikoru, Alexa488 konjuge BD Biyolojik Bilimler5622055 µ kullanın; Test başına L (FACS)
anti-SOX2 antikoru, PE konjugeR& D SistemleriIC2018P10 µ kullanın; Test başına L (FACS)
anti-SSEA-4 antikoru, APC konjuge R& D SistemiFAB1435A5 µ kullanın; Test başına L (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antikoru, NL493 konjugeR& D SistemiNLLC1435G1:50 seyreltmede kullanın (canlı ve sabit immün boyamalar)
anti-TRA-1-60 A488 konjugat kitiThermoFisher BilimselA25618 Serisi
anti-TRA1-60 antikoru, PE konjugeBD Biyolojik Bilimler56019310 µ kullanın; Test başına L (FACS)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antikoru, NL557 konjuge R& D SistemleriNLLC4770Rat  1:50 seyreltme (canlı ve sabit immün boyamalar)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antikoru, DyLight 488 konjugeKök09-00681:100 seyreltmede kullanın (canlı ve sabit immün boyamalar)
anti-TRA1-81 antikoru, PE konjugeBD Biyolojik Bilimler56016110 µ kullanın; Test başına L (FACS)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antikoru, DyLight 488 konjugeKök09-00691:100 seyreltmede kullanın (canlı ve sabit immün boyamalar)
CD31 MicroBead Kiti, insanMiltenyi Biotec130-091-935
CD34 MicroBead Kiti, insanMiltenyi Biotec130-046-702
CD34+ Karışık Donörler,  Kordon kanı, 1 milyon hücreTüm HücrelerCB, CR, CD34+, Karışık, PS, CS10, 1MAlternatif hücre kaynakları arasında fetal karaciğer, yetişkin kemik iliği ve mobilize periferik kan bulunur
CF1 fareCharles nehri023
CHIR99021R& D SistemiL5283 SerisiDMSO'da 100 mM'de sulandırılır
Corning Costar doku kültürü ile işlenmiş 6 oyuklu plakalarCorning3506
Corning Synthemax II-SC Substrat, 10 mg FlakonCorning35355 &mu'da kullanın; g/cm2 Corning 3978'in yerine
Corning Synthemax-R 6 oyuklu plakaCorning3978üretimden kaldırıldı ve 3535 olarak değiştirildi
Costar 6-oyuklu Şeffaf Düz Tabanlı Ultra-Düşük Ek 6-oyuklu plakaCorning3471
Kontes  Hücre Sayma Odası SlaytıThermo Fisher BilimselC10228 (İngilizce)
Kontes otomatik hücre sayacıThermo Fisher BilimselAMQAX1000
CryoStore CS10Kök Hücre Teknolojileri100-1061
DII-AC-LDLThermo Fisher BilimselL3484 Serisi5-15 µ'da kullanın; g/mL
DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta) Thermo Fisher Bilimsel11995065
DMEM/F-12, GlutaMAX takviyesiThermo Fisher Bilimsel10565018
DMEM/F-12, HEPESThermo Fisher Bilimsel11330032
DMSO (dimetil sülfoksit)Sigma AldrichD2650 Serisi
DR4 fareJackson Laboratuvarı3208
Essential 8 (E8) ortamıKök Hücre Teknolojileri5940
Fetal bovin serumu (FBS)Thermo Fisher BilimselSH30071.03
DÜZELT & PERM Hücre Geçirgenleştirme KitiThermo Fisher BilimselGAS004
ForskolinKök04-0025DMSO'da 100 mM'de sulandırılır
Jelatin (domuz)Sigma AldrichG1890-100Gsuda tekrar süspanse edin ve otoklavla sterilize edin
insan CD34+ hücre nükleofektor  kitLonzaVPA-1003 Serisi
İzotip fare IgG1 PE konjugeBD Biyolojik Bilimler554680
İzotip fare IgG2a PE konjugeBD Biyolojik Bilimler558595
İzotip sıçan IgG2b PE konjugeR& D SistemleriIC013P
Nakavt Serum DeğişimiThermo Fisher Bilimsel10828-028
L-Askorbik asitMillipore SigmaA8960 Serisi
L-Glutamin (100X)Thermo Fisher Bilimsel25030-081
LS sütunlarıMiltenyi Biotec130-042-401
MatrisCorning356237200 µ kullanın; 48 oyuklu plakalarda L/kuyu
MEM Esansiyel olmayan amino asit (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Bilimsel11140-050
MethoCult SF H4436Kök Hücre Teknolojileri04436
MidiMACS AyırıcıMiltenyi Biotec130-042-302
mTeSR1 ortaKök Hücre Teknolojileri85850
Nalgene kriyojenik şişelerThermo Fisher Bilimsel5000-0020
Paraformaldehit Çözeltisi, PBS'de %4Thermo Fisher BilimselJ19943. K2PBS kullanarak gerekli konsantrasyona seyreltin
PD0325901Sigma AldrichÜrün Kodu: 0162DMSO'da 100 mM'de sulandırılır
Penisilin/streptomisin (10.000 U/mL)Thermo Fisher Bilimsel15140-122
pEP4 E02S EM2K epizomAddgene20923Plazmitler TOP10 E.  coli (Invitrogen) ve QIAGEN plazmid Maxi kitleri ile saflaştırılmıştır. 
Fosfat tamponlu salin (PBS)Biyolojik Endüstriler02-023-1A
Poietics insan mezenkimal kök hücreler LonzaPT-2501 SerisiPasaj 2'deki 750.000 hücre, kullanımdan veya ikincil bankacılıktan önce 1-2 pasaj için üreticinin talimatlarına göre çözülebilir ve genişletilebilir
PurmorfaminKök04-0009DMSO'da 10 mM'de sulandırılır
rekombinant Aktivin APeprotech120-14EAT 'yi yeniden askıya alın; (100 &mikro; g/mL) steril PBS'de, %0,1 insan veya sığır serum albümini
rekombinant insan FGF2Peprotech100-18BAT 'yi yeniden askıya alın; (100 &mikro; g/mL) steril PBS'de, %0,1 insan veya sığır serum albümini
rekombinant insan FGF-bazik (bFGF)Peprotech100-18B100 µ'da yanıt; PBS'de %0.1 sığır serumu/insan albümini içinde g/mL
rekombinant insan FLT3 ligandıR& D Sistemleri308-FKHB veya  308E-GMPAT 'yi yeniden askıya alın; (100 &mikro; g/mL) steril PBS'de, %0,1 insan veya sığır serum albümini
rekombinant insan insüliniBiyogemler10-365
rekombinant insan Kit-ligandıR& D SistemleriBT-SCF veya BT-SCF-GMPAT 'yi yeniden askıya alın; (100 &mikro; g/mL) steril PBS'de, %0,1 insan veya sığır serum albümini
rekombinant insan lifiPeprotech300-05100 µ'da yanıt; PBS'de %0.1 sığır/insan serum albümini içinde g/mL
rekombinant insan TGFβ 1Peprotech  100-21100 µ'da yanıt; PBS'de %0.1 sığır/insan serum albümini içinde g/mL
rekombinant insan trombopoietin R& D Sistemleri288-TPN veya 288E-GMPAT 'yi yeniden askıya alın; (100 &mikro; g/mL) steril PBS'de, %0,1 insan veya sığır serum albümini
Rekombinant insan transferrinMillipore SigmaT3705 Serisi
Önerilen insan BMP4Peprotech120-05AT 'yi yeniden askıya alın; (100 &mikro; g/mL) steril PBS'de, %0,1 insan veya sığır serum albümini
SB431543SelleckchemS1067 SerisiDMSO'da 10 mM'de sulandırılır
SIGMAFAST, alkalin fosfataz substrat, kromojenik, tabletMillipore SigmaB5655 Serisi1 tableti 10 mL arıtılmış suda eritin
Sodyum selenitMillipore SigmaS5261 Serisi
Çözelti içinde Stemolecule Y27632Kök04-0012-02Çözelti içinde ROCK inhibitörü (10 mM)
StemPro Accutase Hücre Ayrışma ReaktifiThermo Fisher BilimselA11105-01 Serisi
StemPro MSC SFM XenoFree (XF-MSC)Thermo Fisher BilimselA10675015 mL StemPro MSC SFM XenoFree Takviyesini 500 mL StemPro MSC SFM Bazal Ortamı ile karıştırarak XF-MSC ortamını hazırlayın. Aliquoted besiyeri -20°C'de dondurularak saklanabilir.
StemSpan SFEMKök Hücre Teknolojileri9600
Thermo Scientific Mr. Frosty Dondurma KabıThermo Fisher Bilimsel5100-0001
Ulex Europaeus Agglutin I (UEA-1), biyotillenmişVektör LaboratuvarlarıB-1065-2floresan tahlili için bloke edici çözeltide 1:200 seyreltin
VEGFPeprotech100-20AT 'yi yeniden askıya alın; (100 &mikro; g/mL) steril PBS'de, %0,1 insan veya sığır serum albümini
Versene çözümüThermo Fisher Bilimsel15040066
Vitronektin XF matrisiKök Hücre Teknolojileri718040 µ'da seyreltin; CellAdhere seyreltme tamponunda L/mL
XAV939 SerisiSigma AldrichX3004 SerisiDMSO'da 100 mM'de sulandırılır
β-merkaptoetanolThermo Fisher Bilimsel21985-023Işığa duyarlı

Kaynaklar

  1. Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy: Promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
  2. Kyttala, A., et al. Genetic variability overrides the impact of parental cell type and determines iPS cell differentiation potential. Stem Cell Rep. 6 (2), 200-212 (2016).
  3. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  4. Park, T. S., et al. Vascular progenitors generated from tankyrase inhibitor-regulated naïve diabetic human iPS cells potentiate efficient revascularization of ischemic retina. Nat Commun. 11 (1), 1195(2020).
  5. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naïve pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  6. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotechnol. 33 (1), 58-63 (2015).
  7. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), e42838(2012).
  8. Zimmerlin, L., et al. Proteogenomic reprogramming to a functional human blastomere-like stem cell state via a PARP-DUX4 regulatory axis. Cell Rep. 44 (5), 115671(2025).
  9. Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical reversion of conventional human pluripotent stem cells to a naive-like state with improved multi-lineage differentiation potency. J Vis Exp. (136), e57921(2018).
  10. Maiers, M., et al. Harnessing global HLA data for enhanced patient matching in iPSC haplobanks. Cytotherapy. 27 (3), 300-306 (2025).
  11. Thomas, J., et al. Running the full human developmental clock in interspecies chimeras using alternative human stem cells with expanded embryonic potential. NPJ Regen Med. 6 (1), 25(2021).
  12. Zheng, C., Ballard, E. B., Wu, J. The road to generating transplantable organs: From blastocyst complementation to interspecies chimeras. Development. 148 (12), 195792(2021).
  13. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  14. Bock, C., et al. Reference maps of human ES and iPS cell variation enable high-throughput characterization of pluripotent cell lines. Cell. 144 (3), 439-452 (2011).
  15. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion, and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  16. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  17. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  18. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  19. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  20. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14234-14239 (2011).
  21. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  22. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing human naïve pluripotency in the embryo and in the dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  23. Brunner, S., et al. Circulating angiopoietic cells and diabetic retinopathy in type 2 diabetes mellitus, with or without macrovascular disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4655-4662 (2011).
  24. Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56 (4), 960-967 (2007).
  25. Jarajapu, Y. P., Grant, M. B. The promise of cell-based therapies for diabetic complications: Challenges and solutions. Circ Res. 106 (5), 854-869 (2010).
  26. Khullar, M., Cheema, B. S., Raut, S. K. Emerging evidence of epigenetic modifications in vascular complications of diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 8, 237(2017).
  27. Manzar, G. S., Kim, E. M., Zavazava, N. Demethylation of induced pluripotent stem cells from type 1 diabetic patients enhances differentiation into functional pancreatic beta cells. J Biol Chem. 292 (34), 14066-14079 (2017).
  28. French, A., et al. Enabling consistency in pluripotent stem cell-derived products for research and development and clinical applications through material standards. Stem Cells Transl Med. 4 (3), 217-223 (2015).
  29. Zimmerlin, L., Park, T. S., Bhutto, I., Lutty, G., Zambidis, E. T. Generation of pericytic-vascular progenitors from tankyrase/parp-inhibitor-regulated naïve (tirn) human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 2416, 133-156 (2022).
  30. Thorsell, A. G., et al. Structural basis for potency and promiscuity in poly(adp-ribose) polymerase (PARP) and tankyrase inhibitors. J Med Chem. 60 (4), 1262-1271 (2017).
  31. Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
  32. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  33. Theunissen, T. W., et al. Molecular criteria for defining the naïve human pluripotent state. Cell Stem Cell. 19 (4), 502-515 (2016).
  34. Pastor, W. A., et al. Naïve human pluripotent cells feature a methylation landscape devoid of blastocyst or germline memory. Cell Stem Cell. 18 (3), 323-329 (2016).
  35. Taapken, S. M., et al. Karyotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  36. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  37. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  38. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  39. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).
  40. Yang, Y., et al. Derivation of pluripotent stem cells with in vivo embryonic and extra-embryonic potency. Cell. 169 (2), 243-257.e25 (2017).
  41. Yang, J., et al. Establishment of mouse expanded potential stem cells. Nature. 550 (7676), 393-397 (2017).
  42. Gao, X., et al. Establishment of porcine and human expanded potential stem cells. Nat Cell Biol. 21 (6), 687-699 (2019).
  43. Liu, B., et al. Chemically defined and xeno-free culture condition for human extended pluripotent stem cells. Nat Commun. 12 (1), 3017(2021).
  44. Wu, J., et al. Interspecies chimerism with mammalian pluripotent stem cells. Cell. 168 (3), 473-486.e15 (2017).
  45. Yamaguchi, T., et al. Interspecies organogenesis generates autologous functional islets. Nature. 542 (7640), 191-196 (2017).
  46. Kobayashi, T., et al. Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells. Cell. 142 (5), 787-799 (2010).
  47. Theunissen, T. W., et al. Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naïve human pluripotency. Cell Stem Cell. 15 (4), 471-487 (2014).
  48. Gafni, O., et al. Derivation of novel human ground-state naïve pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
  49. Fang, R., et al. Generation of naïve induced pluripotent stem cells from rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 15 (4), 488-496 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Uyar lm Pluripotent K k H crelerEpizomal Yeniden ProgramlamaKsenosuz Y ntemlerTankiraz nhibit rPARP nhibit rNaif K k H crelerok Hatl DiferansiyasyonEvrensel Don r K k H creler
Video yakında

İlgili makaleler