Bu çalışma, bupivakain kullanarak kornea duyusal sinir tükenmesi için rafine bir model oluşturarak, kornea siniri ve bakteriyel yapışma üzerindeki etkisini ortaya koymaktadır. Model, nöropatik durumları simüle eder, oküler enfeksiyonlarda nöroimmün etkileşimler hakkında bilgi sağlar ve ilaç dağıtımı, nöroproteksiyon, bağışıklık modülasyonu ve gen modifikasyonu çalışmalarında uygulamalar sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Subkonjonktival Enjeksiyon ile Hedefe Yönelik Kornea Duyusal Sinir Tükenmesi: Bakteriyel Adezyon ve Nöroimmün Etkileşimlerin Araştırılması İçin Bir Model
Bu makalede
Özet
Özet
Kornea duyu sinirleri, oküler yüzey bütünlüğünü ve bağışıklık savunma mekanizmalarını desteklemede çok önemli bir rol oynar. Bu innervasyonun kaybı, mikrobiyal istilaya karşı artan savunmasızlık ile ilişkilendirilmiştir, ancak sinir tükenmesinin kornea üzerindeki bakteriyel yapışmaya kesin katkısı yetersiz bir şekilde karakterize edilmiştir. Burada, uzun etkili bir sodyum kanal blokeri olan bupivakain kullanılarak selektif kornea duyusal sinir supresyonu için tekrarlanabilir ve zamansal olarak kontrol edilen bir yöntem sunuyoruz. Subkonjonktival ve topikal uygulama yollarını birleştirerek, bu ikili uygulama stratejisi, değişmiş duyusal girdinin bakteri kolonizasyonuna kornea epitel duyarlılığını nasıl etkilediğinin kesin olarak araştırılmasına olanak tanıyan sağlam, sürekli denervasyon sağlar.
Bu modeli kullanarak, farklı adezyon mekanizmalarına sahip klinik olarak anlamlı üç patojen olan Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis ve Pseudomonas aeruginosa için duyusal denervasyonun mikrobiyal adezyon dinamiklerini nasıl etkilediğini araştırıyoruz. Laboratuvar mendili kurutma yöntemi ile standartlaştırılmış bakteri inokülasyonu, kornea yüzeyinde homojen bir birikim sağlar ve ardından bakteriyel yapışmanın kantitatif değerlendirmesini yapar. Bupivakain kaynaklı sinir tükenmesi, kornea sinir yoğunluğunun azalması ve bakteriyel yapışmanın artması ile ilişkilidir ve duyusal tükenme ile mikrobiyal duyarlılık arasında fonksiyonel bir bağlantı olduğunu doğrular.
Diyabetik nöropati ve nörotrofik keratit gibi nöropatik durumları simüle eden bu yaklaşım, oküler enfeksiyonlarda nöroimmün etkileşimleri incelemek için yeni bir çerçeve sağlar. Enfeksiyon modellerinin ötesinde, bu subkonjonktival enjeksiyon stratejisi, oküler ilaç farmakokinetiğini, nöroprotektif müdahaleleri ve bağışıklık modülasyonunu araştırmak için çok yönlü bir platform sunar. Ayrıca, CRISPR/Cas yapılarının veya viral vektörlerin subkonjonktival iletimi de dahil olmak üzere gen modifikasyon çalışmaları için uyarlanabilir ve oftalmik araştırma ve terapötiklerdeki uygulamalarını genişletir.
Giriş
Kornea duyusal innervasyonu, oküler yüzey bütünlüğünün ve immün homeostazın korunmasında kritik bir rol oynar. Kornea, vücuttaki en yoğun innerve edilen dokulardan biridir ve ağırlıklı olarak trigeminal sinirin1 oftalmik bölünmesi tarafından sağlanır. Bu duyusal sinirler sadece nosisepsiyon ve göz kırpma reflekslerine aracılık etmekle kalmaz, aynı zamanda epitel proliferasyonunu, yara iyileşmesini ve bağışıklık sürveyansını da düzenler 2,3. Bu nedenle, duyusal innervasyondaki herhangi bir bozulma, kornea bariyerini tehlikeye atabilir, oküler yüzey mikro çevresini değiştirebilir ve mikrobiyal enfeksiyonlara karşı duyarlılığı artırabilir.
Kornea duyusal disfonksiyonu, diabetes mellitus gibi sistemik durumlarla ilişkilidir ve kuru göz hastalığı, diyabetik keratopati, nörotrofik keratit ve cerrahi sonrası komplikasyonlar dahil olmak üzere oküler patolojilere katkıda bulunur 3,4,5,6,7,8,9,10 . Duyusal sinir bozukluğu, gözyaşı üretiminin azalmasına, epitel incelmesine ve yara iyileşmesinin gecikmesine yol açar ve bunların tümü bakteri kolonizasyonunu kolaylaştırır11,12. Bununla birlikte, duyusal sinir tükenmesi ile bakteriyel yapışma arasındaki kesin mekanik bağlantı yeterince anlaşılamamıştır. Çalışmalar, kornea denervasyonunu takiben bakteriyel adezyonun arttığını göstermiş olsa da, bu ilişkinin kontrollü bir şekilde araştırılmasına izin veren standart modellerin eksikliği vardır.
Bu boşluğu gidermek için, kalıcı sinir hasarına neden olmadan klinik nöropatiyi taklit eden uzun etkili bir sodyum kanal blokeri olan bupivakain kullanarak hedeflenmiş bir kornea duyusal sinir tükenmesi modeli geliştirdik 13,14,15. Bu farmakolojik yaklaşım, kornea siniri tükenmesini ve bunun oküler yüzey üzerindeki etkilerini incelemek için kontrollü ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar15. Bu modeli bakteriyel adezyon testleriyle entegre ederek, diyabetik keratopati ve nörotrofik keratitin temel yönlerini taklit ederek duyusal sinir tükenmesinin mikrobiyal kolonizasyon üzerindeki etkisini sistematik olarak değerlendirebiliriz.
Mikrobiyal adezyon, kornea enfeksiyonlarında gözyaşı filmi bileşimi, epitel yüzey özellikleri ve konak immün yanıtlarından etkilenen kritik bir erken olaydır. Oküler yüzeyi kolonize edebilen çeşitli patojenler arasında, S. aureus, S. epidermidis ve P. aeruginosa, farklı yapışma mekanizmalarına sahip klinik olarak önemli üç bakteriyi temsil eder. Oldukça öldürücü bir Gram-negatif bakteri olan P. aeruginosa, kornea epitel hücrelerine hızla yapışmak ve istila etmek için pili, flagella ve salgılanan virülans faktörlerini kullanır ve genellikle şiddetli ülseratif keratite yol açar16,17. Buna karşılık, Gram pozitif kommensal bir bakteri olan S. epidermidis, biyofilmler oluşturmak için ağırlıklı olarak bozulmuş epitel yüzeylerinden ve gözyaşı filmi değişikliklerinden yararlanarak kalıcı ve sıklıkla subklinik enfeksiyonlara katkıda bulunur18,19. Bu türler arasındaki yapışma stratejilerindeki farklılıklar, kornea siniri tükenmesinin oküler mikro çevreyi bakteri kolonizasyonunu desteklemek için nasıl değiştirdiğini anlama ihtiyacını vurgulamaktadır.
Bakteriyel adezyonu incelemedeki önemli bir zorluk, uygun bir aşılama modelinin seçimidir. Enfeksiyon çalışmalarında sıklıkla kullanılan konvansiyonel çizik yaralanması modeli, bakteri aderansını kolaylaştırmak için epitel defektleri oluşturur. Travmaya bağlı enfeksiyonları simüle etmede etkili olsa da, bu yaklaşım, nöropatik kornealarda bakteri kolonizasyonunun erken aşamalarını doğru bir şekilde temsil etmeyen aşırı doku hasarı ve abartılı bir inflamatuar yanıt dahil olmak üzere önemli kafa karıştırıcı değişkenler ortaya koymaktadır. Ek olarak, mekanik yaralanmadaki değişkenlik, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmeyi zorlaştırır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için daha kontrollü ve fizyolojik olarak ilgili bir bakteri aşılama yöntemi gereklidir.
Laboratuvar mendili kurutma tekniği, bakteri birikimine standart bir yaklaşım sunarak, epitel bariyerini20 bozmadan tek tip bakteri yapışması sağlar. Bu yöntem, bakteriyel yapışmanın açık mekanik travmanın yokluğunda, ancak değişmiş gözyaşı bileşimi ve epitelyal homeostaz koşulları altında meydana geldiği gerçek dünyadaki duyarlılık senaryolarını yakından taklit eder. Laboratuvar mendil lekeleme yöntemi, mekanik yaralanma ile ilişkili değişkenliği ortadan kaldırarak, nöropatik kornealarda mikrobiyal adezyon dinamiklerinin daha doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Ayrıca, gözyaşı filminin bakteri kolonizasyonuna katkılarının kontrollü bir şekilde değerlendirilmesine izin verir, bu da özellikle gözyaşı sekresyonunun bozulduğu kornea duyusal disfonksiyonu durumlarında önemlidir.
Kornea duyusal sinirlerinin gözyaşı üretimini ve epitelyal homeostazı düzenlemedeki kritik rolü göz önüne alındığında, duyusal sinir tükenmesinin mikrobiyal adezyon üzerindeki sonuçlarını incelemek için tekrarlanabilir bir model oluşturmak önemlidir. Bu çalışma, gözyaşı sekresyonu ve bakteriyel adezyon üzerindeki etkilerini değerlendirmek için uzun etkili bir lokal anestezik olan bupivakain kullanılarak hedeflenen kornea duyusal sinir tükenmesi için bir protokolü rafine etmeyi amaçlamaktadır. Subkonjonktival ve topikal bupivakain uygulamasının bir kombinasyonunu kullanarak, bu yaklaşım, en yüksek etkinliğin tanımlanmış bir zaman noktasında lokalize ve sürekli duyusal tükenmeyi sağlar. Bu modeli kullanarak, duyusal denervasyonun S. aureus, S. epidermidis ve P. aeruginosa'nın adezyon dinamiklerini nasıl değiştirdiğini araştırarak sinir tükenmesi, gözyaşı filmi değişiklikleri ve mikrobiyal duyarlılık arasındaki ilişkiye dair değerli bilgiler sağlıyoruz. Bu bulgular, diyabetik keratopati ve nörotrofik keratit gibi nöropatik durumlarda enfeksiyona yatkınlığı anlamak için daha geniş etkilere sahiptir ve oküler nöroimmün etkileşimler ve terapötik müdahaleler üzerine gelecekteki çalışmalar için bir temel sunmaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvanları içeren tüm prosedürler, Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği tarafından belirlenen standartlara uygun olarak gerçekleştirildi ve New England Optometri Koleji'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve laboratuvar hayvanlarının insancıl bakımı ve kullanımına ilişkin PHS politikasına bağlı kaldı. Altı ila sekiz haftalık erkek ve dişi C57BL / 6J (Vahşi Tip; suş no. 000664) fareler Jackson Laboratuvarı'ndan elde edildi ve fareler normal sirkadiyen ritimler altında (12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngü) yetiştirildi ve yiyecek ve su sağlandı. Tüm prosedürler boyunca steril tekniği koruyun.
1. Subkonjonktival enjeksiyon için hayvan hazırlığı
- Kalibre edilmiş bir buharlaştırıcı aracılığıyla oksijende% 2-3 izofluran kullanarak anesteziyi indükleyin. Nazik bir ayak parmağı tutamına refleks yanıt olup olmadığını kontrol ederek anestezi derinliğini izleyin.
- Hayvanı herhangi bir ciddi rahatsızlık veya sıkıntı belirtisi açısından sürekli olarak gözlemleyin.
- Sıkıntı görülürse,% 5 izofluran ile derin anestezi uygulayın ve yanıt vermediğini onaylayın.
- Ötenaziyi sağlamak için servikal çıkık yapın.
- Aksi takdirde, aşağı akış analizleri için kavisli enükleasyon forsepsleri kullanarak hemen enükleasyon gerçekleştirin.
2. Subkonjonktival enjeksiyon kullanılarak kornea sinir bloğu
NOT: Hedeflenen kornea duyusal sinir tükenmesini elde etmek için subkonjonktival enjeksiyon ve topikal bupivakain uygulamasını içeren iki aşamalı bir protokol uygulayın. Sistemik anestezik maruziyeti en aza indirmek için subkonjonktival enjeksiyonları ve topikal uygulamaları 15 dakika içinde tamamlayın.
- Saha hazırlığı ve insizyon
- 30 G'lik bir iğne kullanarak süperotemporal limbal bölgede küçük (~ 0,5 mm) bir kesi oluşturun. Kan damarlarından kaçının ve doku travmasını en aza indirin. Kontrollü ilaç dağıtımı için subkonjonktival boşluğa erişmek için insizyonu kullanın.
- Bupivakain enjeksiyonu
- Steril koşullar altında% 0.5'lik bir bupivakain hidroklorür çözeltisi hazırlayın.
- 5 μL solüsyonu, 33 G küçük göbekli künt iğne (nokta stili 3) ile donatılmış bir Hamilton 10 μL şırıngaya yükleyin.
- Reflüyü en aza indirmek ve düzgün dağılımı sağlamak için çözeltiyi subkonjonktival boşluğa 15-20 ° açıyla enjekte edin.
- Enjeksiyon bölgesinde kabarcık oluşumunu gözlemleyin; 5-10 saniye devam etmesine izin verin ve tamamen emilene kadar subkonjonktival cep içinde dağılın.
- Kornea duyarsızlaştırmasının topikal olarak güçlendirilmesi
- Subkonjonktival enjeksiyondan hemen sonra doğrudan merkezi korneaya 5 μL% 0.5 bupivakain uygulayın.
NOT: Yüzey siniri duyarsızlaştırmayı artırmak ve lokal anestezik etkiyi uzatmak için bu adımı kullanın.
- Subkonjonktival enjeksiyondan hemen sonra doğrudan merkezi korneaya 5 μL% 0.5 bupivakain uygulayın.
- Kontrol grubu
- Kontrol hayvanları için aynı zaman noktalarında hem subkonjonktival enjeksiyon hem de topikal uygulama yoluyla 5 μL fosfat tamponlu salin (PBS) uygulayın. Enjeksiyonla ilgili etkileri hesaba katmak için prosedür adımlarını ve hacmi eşleştirin.
- Tedavi süresi ve son nokta analizi
- Toksisiteyi en aza indirirken sürekli duyusal sinir tükenmesi elde etmek için 15 gün boyunca her gün bupivakain tedavisi uygulayın.
- 15. günde, kalibre edilmiş bir buharlaştırıcı aracılığıyla oksijende% 5 izofluran kullanarak son bupivakain tedavisinden 4 saat sonra farelere ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık yapın.
- İmmünohistokimya kullanarak sinir yoğunluğu değişikliklerini değerlendirmek için bir fare grubundan (bkz. adım 5.5.) ve bakteriyel adezyon analizi için başka bir gruptan (protokolün Şekil 1 ve Bölüm 5'ine bakınız) hemen kornea toplayın (protokolün Şekil 1 ve Bölüm 5'ine bakınız).
3. Bakteri aşılaması için hayvan hazırlığı
- İntraperitoneal ketamin (80-100 mg / kg) ve deksmedetomidin (0.25-0.5 mg / kg) son bupivakain enjeksiyonundan ve 15. günde topikal uygulamadan dört saat sonra fareleri uyuşturmak için uygulayın.
- Ayak parmağını sıkıştırmaya refleks yanıtların olmadığını doğrulayarak derin anesteziyi onaylayın.
- Kalan gözyaşı sıvısını ve kalıntıları gidermek için oküler yüzeyi 5 μL steril PBS içeren bir pipet kullanarak 3x durulayın ve bakteriyel yapışma çalışmaları için temiz bir kornea yüzeyi sağlayın (bkz. Şekil 1)
- Belirlenen deney grubunda, kornea yüzeyini standart bir şekilde lekelemek için laboratuvar mendili tüy bırakmayan bir doku kullanın.
- Güvenli bir tutuş sağlamak için kağıt mendili katlayın.
- Anestezi uygulanmış farenin korneasını 4x, merkezi korneadan başlayarak ve periferik bölgeleri20 içerecek şekilde sağa ve sola dönme hareketi kullanarak nazikçe silin.
NOT: Bakteriyel yapışmayı kolaylaştırmak için gözyaşı sıvısını etkili bir şekilde çıkarırken mekanik yaralanmayı önlemek için minimum basınç uygulayın.
4. Bakteriyel aşı hazırlığı ve kornea aşılaması
- Bakteri kültürü ve hazırlanması
- Triptik soya agar (TSA) üzerinde S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 12228 ve P. aeruginosa O1'i kültürleyin ve nemi korumak için inkübatöre yerleştirilen steril su ile 37 ° C'de inkübe edin.
- Tek tek kolonileri hasat edin ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde süspanse edin. Ölü hücreleri ve metabolik yan ürünleri uzaklaştırmak için süspansiyonu 5.000 × g'da bir kez 5 dakika santrifüjleyin.
- Bakteri peletini PBS'de yeniden süspanse edin ve yapışma çalışmaları için yüksek bakteri yükü sağlamak için konsantrasyonu ~10¹¹ CFU/mL'ye ayarlayın.
- Kornea aşılama protokolü
- Hazırlanan bakteri süspansiyonunun 5 μL'lik bir alikotunu, sürekli anestezi altında 4 saat boyunca saatte bir kornea yüzeyine uygulayın.
- Akıntıyı önlemek ve aşıya tutarlı bir şekilde maruz kalmayı sağlamak için fareleri hafif bir eğime yerleştirin.
- Klinik enfeksiyon senaryolarıyla ilgili kalıcı bakteriyel maruziyeti taklit etmek için aşılamayı saatlik aralıklarla tekrarlayın.
- Aşılama sonrası ötenazi ve bakteriyel adezyon değerlendirmesi
- 4 saat sonra, derin anesteziyi sağlamak için intraperitoneal ketamin (80-100 mg / kg) ve ksilazin (5-10 mg / kg) enjeksiyonu uygulayın.
- Fareleri insancıl bir şekilde ötenazi yapmak için servikal çıkık yapın.
- Kontaminasyonu önlemek için katı aseptik koşulları korurken steril, kavisli uçlu forseps kullanarak gözleri enüklee edin.
- Yapışmayan bakterileri iyice uzaklaştırmak için oküler yüzeyi 5-6x steril 2 mL PBS ile bir Petri kabında hafifçe çalkalayarak durulayın.
- Tutarlı bakteri geri kazanımı sağlamak ve kontaminasyonu önlemek için aseptik koşulları korumak için mekanik bir doku homojenizatörü kullanarak enükleasyonlu gözleri 1 mL steril PBS'de homojenize edin.
- Steril PBS'de homojenatın seri altı kat seyreltmelerini gerçekleştirin.
- TSA plakaları üzerindeki her seyreltmenin plaka alikotlarını alın ve koloni büyümesine izin vermek için gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Koloni oluşturan birimleri (CFU'lar) sayın ve kantitatif karşılaştırma için sonuçları kornea başına log CFU olarak ifade edin.
5. İmmünohistokimya
- Tedaviden sonraki 15. günde servikal çıkık yoluyla farelere ötenazi yapın.
- Gözleri dikkatlice enüklee edin ve hafifçe döndürerek oda sıcaklığında PBS ile bir kez durulayın.
- Yapısal bütünlüğü korumak için enükleasyonlu gözleri 1 saat boyunca %2 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin
- Sabit gözleri oda sıcaklığında hafif rotasyon altında 1 mL PBS'de 3 x 10 dakika yıkayın.
- Daha önce açıklanan kornea diseksiyon protokolünütakip edin 21,22
- Korneaları minimum miktarda PBS ile doldurulmuş 35 mm genişliğinde bir Petri kabı içinde inceleyin.
- Enükleasyonlu gözü stabilize etmek için düz kenarlı forseps ve dünyanın arka tarafında küçük bir kesi oluşturmak için cerrahi makas kullanın.
- Arka yönü 360° dikkatlice kesmek için küçük kesi noktasını kullanın.
- Murin retinasını, optik siniri, lensi, iris pigmentini ve kornea olmayan ek doku yapılarını atın.
- Düz kenarlı forseps kullanarak veya korneayı sağlam tutarak cerrahi makasla dikkatlice keserek fazla dokuyu çıkarın.
- Mikrosantrifüj tüplerine yerleştirilen disseke korneaları 3 x 10 dakika 1 mL PBS'de oda sıcaklığında hafifçe döndürerek yıkayın.
- Korneaları 1 mL bloke edici solüsyon (PBS'de% 3 BSA + Triton X-100) içinde oda sıcaklığında sürekli rotasyonla 1 saat inkübe edin.
- Aynı koşullar altında korneaları 1 mL% 20 EDTA'da ek bir saat boyunca inkübe ederek doku geçirgenliğini artırın.
- Korneaları gece boyunca 4 ° C'de tavşan anti-β-Tubulin III birincil antikoru ile oda sıcaklığında hafif rotasyon altında inkübe edin.
- Ertesi gün, dokuları karanlıkta 4 ° C'de 2-3 saat boyunca nükleer boyama için Alexa Fluor 488 konjuge Keçi anti-Tavşan IgG ikincil antikoru ve DAPI ile inkübe edin.
- Korneaları 3 x 10 dakika PBS ile nazikçe döndürerek yıkayın.
- Daha önce açıklanan Kornea düz montaj protokolünü izleyin21,22
- Fazla sıvıyı çıkarmak için korneayı sürgünün kenarına yerleştirerek lekeli korneaları cam slaytlara düz bir şekilde monte edin.
- Korneayı, epitel tarafı aşağı bakacak ve slayt yüzeyi ile temas edecek şekilde mikroskop lamının ortasına yeniden yerleştirin.
- Yarım kadranlar oluşturmak için cerrahi bir tüy bıçağı kullanarak periferik kenardan merkeze doğru dört düz kesi (1-2 mm uzunluğunda) yapın.
- 20 μL mountant uygulayın ve korneanın üzerine 8 mm'lik bir cam lamel yerleştirin.
- Hava kabarcıklarını gidermek ve korneanın kırışmasını önlemek için lamel üzerine hafifçe bastırın.
- Numuneyi kurutmak için oda sıcaklığında karanlıkta saklayın.
- Havayla kurumasını önlemek için lamel kenarlarını şeffaf tırnak koruyucu ile kapatın ve slaytları görüntülemeye hazır olana kadar karanlıkta saklayın.
6. Görüntüleme
- 20x/1.00 NA suya daldırma objektifine sahip dik iki fotonlu konfokal mikroskop kullanarak konfokal mikroskop gerçekleştirin.
- Düz monte edilmiş numuneleri mikroskop tablasına yerleştirin ve 20x/1.00 NA suya daldırmalı objektif lensini kurun.
- Görüntüleme sırasında dış ışık girişimini en aza indirmek için oda ışıklarını kısın ve mikroskobu opak siyah bir bezle örtün.
- Alexa Fluor 488 nm lazer kanalını kullanarak kornea sinirlerini görselleştirin ve DAPI 405 nm lazer kanalını kullanarak hücre çekirdeklerini tespit edin.
- Çerçeve boyutunu 1.536 x 1.536, iğne deliğini 1 Airy unit (AU) ve tarama hızını 1.02 μs olarak ayarlayın. Çift yönlü taramayı etkinleştirin ve 2x ortalama uygulayın.
- Net görüntü yakalama sağlarken foto ağartma ve fototoksisiteyi önlemek için ana kazancı (~ 750 V) ayarlayın ve lazer güç yoğunluğunu en aza indirin.
- Tam kornea kalınlığını yakalamak için Z-yığını görüntüleme gerçekleştirin. İlk odak düzlemini örneğin en ön yönüne ve Sonuncuyu örneğin en arka yönüne ayarlayın.
- 0,8 μm veya 1,0 μm adım aralıklarında Z yığınları elde edin ve numune başına yaklaşık 60 - 80 toplam yığın yakalayın.
- Kornea sinir yoğunluğu değerlendirmesi
- Imaris yazılımını kullanarak kornea sinir yoğunluğunu analiz edin.
- Ses boyutlarını kontrol ederek tam görüntü kalınlığını onaylayın.
- Bir 3B yeniden yapılandırma oluşturmak için hacim oluşturma seçeneğini etkinleştirin.
- Z yığınını görselleştirme ve niceleme için 2B görünüme dönüştürmek için bir maksimum yoğunluk projeksiyonu oluşturun.
- Objektif değerlendirmeyi sağlamak için kornea sinir yoğunluğunu kör değerlendiriciler tarafından 0-10 ölçeğinde derecelendirin.
7. İstatistiksel analiz
- Shapiro-Wilk ve Kolmogorov-Smirnov testlerini kullanarak veri dağılımını değerlendirin.
- Verilerin çoğunluğu normal bir dağılım izliyorsa, sonuçları ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunun.
- İki grup arasındaki karşılaştırmalar için Student t-testi uygulanmış ve üç veya daha fazla grup içeren analizler için tek yönlü varyans analizi ve ardından Tukey'in çoklu karşılaştırma testi kullanılmıştır.
- İstatistiksel olarak anlamlı < 0.05 p değerini düşünün.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Aksi belirtilmedikçe, tüm deneyler bağımsız olarak üç kopya halinde gerçekleştirildi ve her biri grup başına 3-4 fare içerecek şekilde tekrarlandı.
Bupivakain tedavisini takiben kornea sinir yoğunluğunda önemli azalma
Hedeflenen kornea duyusal sinir tükenmesinin etkisini sistematik olarak değerlendirmek için, kornea sinir yoğunluğu immünoetiketleme ve konfokal mikroskopi kullanılarak değerlendirildi. Farelere, kornea sinir bütünlüğünü modüle etmede farklı uygulama yollarını...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kornea duyu sinirleri, oküler yüzey bütünlüğünün korunmasında, epitelyal homeostazın düzenlenmesinde ve immün yanıtların modüle edilmesinde çok önemli bir rol oynar. Sinir dejenerasyonu ve iltihabı ile karakterize kornea nöriti, kronik hipergliseminin kornea sinir kaybı da dahil olmak üzere periferik nöropatiye katkıda bulunduğu diabetes mellitus gibi sistemik durumlarda yaygın olarak görülür. Çalışmalar, diyabetik nöropatinin kornea hassasiyetinin azalmasına, kuru göze, yara iyileşmesin...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| %0.5 bupivakain hidroklorür çözeltisi | Pfizer A.Ş. Amerika Birleşik Devletleri | NDC 00409-1162-01 | |
| 30 gr iğne | Üretici: BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, ABD | 305106 | |
| 33 G küçük göbekli küt iğne (nokta stili 3) | Hamilton Şirketi, Reno, NV, ABD | 7803-05 | |
| 4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür | Thermo Fisher Bilimsel, Waltham, MA, ABD | D1306 Serisi | |
| Sığır serum albümini | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD | A7906 Serisi | |
| C57BL/6J (Vahşi Tip) fareler | Jackson Laboratuvarı | . 000664 | |
| Kantrifüj döndürücü | Laboratuvar Deposu, Inc. (Dawsonville, GA, ABD) | R2020 | |
| Şeffaf Tırnak Koruyucu | Islak ve Vahşi | YOK | |
| Diseksiyon mikroskobu (SMZ-160-TLED Stereo (diseksiyon) Trinoküler Portlu Mikroskop) | Yıldız Bilimsel (Baltimore, MD, ABD) | 1.1002E+12 | |
| Etilendiamintetraasetik asit | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD | E6511 | |
| Keçi anti-Tavşan IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Bilimsel, Waltham, MA, ABD | A-11008 | |
| Hamilton 10-μ L şırınga | Hamilton Şirketi, Reno, NV, ABD | 7635-01 | |
| Yüksek Hassasiyetli Diseksiyon Mikro Makas | Thermo Fisher Bilimsel, Waltham, MA, ABD | 08-953-1B | |
| İzofluran | Patterson Veterinerlik, ABD | 07-890-8115 | |
| İzofluran buharlaştırıcı | Kent Bilimsel, ABD | VETFLO1205S | |
| Ketamin Hidroklorür | Dechra Veteriner Ürünleri, Overland Park, KS, ABD | DP00050 | |
| Kimwipe tüy bırakmayan kağıt mendil | Kimberly-Clark Profesyonel, Roswell, GA, ABD | 34155 | |
| Mikro diseksiyon forseps kavisli ön (enükleasyon için) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD | F4142-1EA | |
| Mikro diseksiyon forsepsleri düz ön | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD | F4017 | |
| Petri Kapları (100 mm) | Thermo Fisher Bilimsel, Waltham, MA, ABD | 263991 | |
| Petri Kapları (35 mm) | Avantor, VWR International (Radnor, PA, ABD) aracılığıyla. | 25373-041 | |
| Fosfat tamponlu salin | Thomas Scientific, İsveçliler, NJ, ABD | C987D24 | |
| ProLong Altın Antifade Mountant | Thermo Fisher Bilimsel, Waltham, MA, ABD | P36930 | |
| Tavşan anti-β-Tubulin III | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) | T2200 Serisi | |
| Yuvarlak Kapak Kayma Alman Camı (8 mm) | Thermo Fisher Bilimsel, Waltham, MA, ABD | 50-949-314 | |
| Neşter kolları | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) | S2896-1EA | |
| Slaytlar, mikroskop | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) | S8902-1PAK | |
| Geçmeli Kapaklı Düşük Tutma Mikrosantrifüj Tüpleri | Thermo Fisher Bilimsel, Waltham, MA, ABD | 3453 | |
| Sorvall Instruments RT6000B Tezgah Üstü Santrifüj | Thermo Fisher Bilimsel, Waltham, MA, ABD | 3367898 | |
| Cerrahi tüy bıçakları | Dünya Hassas Aletler (Sarasota, FL, ABD) | 504169 | |
| Triptik soya agarı | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) | 22091 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD | 1236-20-8 |
Kaynaklar
- Belmonte, C. Pain, dryness, and itch sensations in eye surface disorders are defined by a balance between inflammation and sensory nerve injury. Cornea. 38 (Suppl 1), S11-S24 (2019).
- Müller, L. J., Marfurt, C. F., Kruse, F., Tervo, T. M. T. Corneal nerves: Structure, contents and function. Exp Eye Res. 76 (5), 521-542 (2003).
- Gao, N., Me, R., Yu, F. S. X. Diabetes exacerbates Pseudomonas aeruginosa keratitis in streptozotocin-induced and db/db mice via altering programmed cell death pathways. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (7), 14(2023).
- Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
- Asiedu, K., et al. Tear film and ocular surface neuropeptides: Characteristics, synthesis, signaling and implications for ocular surface and systemic diseases. Exp Eye Res. 218, 108973(2022).
- Zhou, T., Lee, A., Lo, A. C. Y., Kwok, J. S. W. J. Diabetic corneal neuropathy: Pathogenic mechanisms and therapeutic strategies. Front Pharmacol. 13, 816062(2022).
- Yu, F. S. X., et al. The impact of sensory neuropathy and inflammation on epithelial wound healing in diabetic corneas. Prog Retin Eye Res. 89, 101039(2022).
- Bron, A. J., et al. TFOS DEWS II pathophysiology report. Ocul Surf. 15 (3), 438-510 (2017).
- Belmonte, C., et al. TFOS DEWS II pain and sensation report. Ocul Surf. 15 (3), 404-437 (2017).
- Vereertbrugghen, A., Galletti, J. G. Corneal nerves and their role in dry eye pathophysiology. Exp Eye Res. 222, 109191(2022).
- Gonzalez, O. A., et al. Antimicrobial peptides: Defending the mucosal epithelial barrier. Front Oral Health. 1 (3), 958480(2022).
- Fusco, A., Savio, V., Perfetto, B., Mattina, R., Donnarumma, G. Antimicrobial peptide human β-defensin-2 improves in vitro cellular viability and reduces pro-inflammatory effects induced by enteroinvasive Escherichia coli in Caco-2 cells by inhibiting invasion and virulence factors' expression. Front Cell Infect Microbiol. 12, 1009415(2022).
- Nau, C., Vogel, W., Hempelmann, G., Brä, M. E. Stereoselectivity of bupivacaine in local anesthetic-sensitive ion channels of peripheral nerve. Anesthesiology. 91, 786-795 (1999).
- Valenzuela, C., Snyders, D. J., Bennett, P. B., Tamargo, J., Hondeghem, L. M. Stereoselective block of cardiac sodium channels by bupivacaine in guinea pig ventricular myocytes. Circulation. 92 (10), 3014-3024 (1995).
- Becker, D. E., Reed, K. L. Local anesthetics: Review of pharmacological considerations. Anesth Prog. 59 (2), quiz 103-103 90-102 (2012).
- Khalifa, A. B. H., Moissenet, D., Thien, H. V., Khedher, M. Virulence factors in Pseudomonas aeruginosa: Mechanisms and modes of regulation. Ann Biol Clin (Paris). 69 (4), 393-403 (2011).
- Laventie, B. J., et al. A surface-induced asymmetric program promotes tissue colonization by Pseudomonas aeruginosa. Cell Host Microbe. 25 (1), 140-152.e6 (2019).
- Büttner, H., Mack, D., Rohde, H. Structural basis of Staphylococcus epidermidis biofilm formation: Mechanisms and molecular interactions. Front Cell Infect Microbiol. 5 (17), 14(2015).
- Brescó, M. S., et al. Pathogenic mechanisms and host interactions in Staphylococcus epidermidis device-related infection. Front Microbiol. 8, 1401(2017).
- Wan, S., et al. Nerve-associated transient receptor potential ion channels can contribute to intrinsic resistance to bacterial adhesion in vivo. FASEB J. 35 (10), e21899(2021).
- Datta, A., et al. TRPA1 and TPRV1 ion channels are required for contact lens-induced corneal parainflammation and can modulate levels of resident corneal immune cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (11), 21(2023).
- Datta, A., et al. Contact lens-induced corneal parainflammation involving Ly6G+ cell infiltration requires IL-17A and γδ T cells. Ocul Surf. 28, 79-89 (2023).
- Datta, A., Orallo, G. K., Nelson, N. Corneal sensory nerve loss induced by repeated subconjunctival and topical bupivacaine disrupts tear secretion and enhances bacterial adhesion via neuropeptide modulation. PLOS ONE. , In Press (2025).
- Schultz, R. O., Peters, M. A., Sobocinski, K., Nassif, K., Schultz, K. J. Diabetic keratopathy as a manifestation of peripheral neuropathy. Am J Ophthalmol. 96 (3), 368-371 (1983).
- Belmonte, C., Acosta, M. C., Gallar, J. Neural basis of sensation in intact and injured corneas. Exp Eye Res. 78 (3), 513-525 (2004).
- Sitompul, R. Corneal sensitivity as a potential marker of diabetic neuropathy. Acta Med Indones. 49 (2), 166-172 (2017).
- O'Brien, P. D., Hur, J., Hayes, J. M., Backus, C., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. BTBR ob/ob mice as a novel diabetic neuropathy model: Neurological characterization and gene expression analyses. Neurobiol Dis. 73, 348-355 (2015).
- Wang, B., Chandrasekera, P. C., Pippin, J. J. Leptin-and leptin receptor-deficient rodent models: Relevance for human type 2 diabetes. Curr Diabetes Rev. 10 (2), 131-145 (2014).
- Islam, M. S. Animal models of diabetic neuropathy: Progress since 1960s. J Diabetes Res. 2013, 149452(2013).
- Ma, L., et al. CGRP released by corneal sensory nerve maintains tear secretion of the lacrimal gland. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (4), 30(2024).
- Bower, J. J., Song, Z., Song, L. Subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models. J Vis Exp. (181), e63532(2022).
- Jumelle, C., Gholizadeh, S., Annabi, N., Dana, R. Advances and limitations of drug delivery systems formulated as eye drops 1. J Control Release. 321, 1-22 (2020).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
