Yöntem makalesi

Çift Vektör Dönüşümlü Hücrelerin Saflaştırılması için Lösin Fermuar Tabanlı Hücre Ayırma

DOI:

10.3791/68628

⸱

24 Ekim 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1City of Hope Los Angeles and National Medical Center, 2Lymphoma and Cellular Therapy Services, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 3Department of Hematology and Hematopoietic Cell Transplantation, City of Hope National Medical Center

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, birlikte dönüştürülmüş T hücrelerinin bir karışımından çift dönüştürülmüş T hücrelerinin seçici olarak saflaştırılması için bir protokol açıklıyoruz. Bu yaklaşım, her biri, çift vektör transdüksiyonlu hücrelerin seçici immünomanyetik saflaştırılmasını sağlayan eşleştirilmiş lösin fermuar bazlı hücre sıralama metodolojisinin bir bileşenini kodlayan iki retroviral vektörü birleştirir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri de dahil olmak üzere evlat edinen T hücresi tedavileri, hematolojik malignitelere karşı etkileyici klinik aktivite göstermiştir ve katı tümör malignitelerinin tedavisinde umut vaat etmektedir. Bu başarılara rağmen, hedef antijenlerin kaybı veya zayıf ekspresyonu, T hücresi tükenmesinin gelişimi ve immünosupresif bir tümör mikroçevresinin varlığı dahil olmak üzere terapötik başarıyı sınırlayan T hücresi immünoterapisine karşı çok sayıda direnç mekanizması tanımlanmıştır. Bu direnç mekanizmalarının üstesinden gelmek için çoklu hücre mühendisliği stratejileri geliştirilmiştir. Bununla birlikte, birden fazla direnç mekanizması aynı anda ortaya çıkabilir ve bu da anti-tümör aktivitesini optimize etmek için birden fazla mühendislik stratejisinin bir kombinasyonunu gerektirir. Vektör paketleme kısıtlamaları, büyük miktarlarda genetik bilginin T hücrelerine iletilmesini sınırlar ve birden fazla mühendislik yapısının birlikte ifade edilmesinde bir zorluk teşkil eder. Burada, birden fazla transgeni kodlamak için T hücrelerini iki vektörle birlikte dönüştürmek için bir protokol açıklıyoruz, böylece tasarlanmış fonksiyonların sayısını artırıyoruz. Zip-sort olarak adlandırılan lösin fermuar bazlı bir hücre sıralama metodolojisini birlikte eksprese ederek, iki farklı vektör içeren çift transdüksiyonlu hücrelerin seçici immünomanyetik saflaştırılmasını yönlendiriyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CAR T hücresi tedavisi, B hücreli lösemi, lenfoma ve multipl miyelom tedavisinde devrim yarattı 1,2. CAR T hücreleri ayrıca katı tümör maligniteleri açısından da araştırılmaktadır3. Bununla birlikte, CAR hedef antijen molekülünün zayıf ekspresyonu veya kaybı, T hücresi disfonksiyonunun gelişimi (tükenme), tümör mikroçevresi tarafından aktif immün baskılama ve sınırlı T hücresi kaçakçılığı ve tümör mikroçevresinde kalıcılık dahil olmak üzere, CAR T hücresi tedavisinin başarısızlığı için tekrarlayan mekanizmalar tanımlanmıştır 3,4,5,6 . Bu CAR T hücresi direnç mekanizmalarının 3 her birinin üstesinden gelmeye çalışmak için bireysel mühendislik çözümleri tasarlanmış olsa da, retroviral ve lentiviral vektör sistemlerininsınırlı genetik paketleme kapasitesi nedeniyle aynı anda birden fazla direnç mekanizmasının üstesinden gelmek için bir hücre terapisi ürününe birden fazla mühendislik işlevi eklemek zordur7.

Vektör paketleme kapasitesindeki sınırlamaların üstesinden gelmek için, T hücrelerinin çoklu vektörlerle birlikte transdüksiyonu giderek daha fazla kullanılmaktadır. Vektör ko-transdüksiyonu, klinik öncesi çalışmalarda 8,9,10 ve vektör paketleme sınırlamalarının üstesinden gelmek için CD19/CD22 ikili CAR T hücrelerini değerlendiren yakın tarihli bir klinik çalışmada mantık kapılı ve ilaçla düzenlenen T hücresi mühendisliği stratejilerini incelemek için kullanılmıştır11. Bununla birlikte, ko-transdüksiyon, tek ve çift transdüksiyonlu T hücrelerinin kombinasyonlarını içeren karışık hücre ürünleri üretir, bu da her iki vektör tarafından kodlanan bileşenlere bağlıysa ürünün işlevselliğini bozabilir ve ayrıca tek transdüksiyonlu T hücreleri12 arasında rekabete yol açabilir.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, çift transdüksiyonlu hücrelerin tek adımlı immünomanyetik saflaştırılmasını yönlendirmek için her biri birlikte transdüksiyona tabi tutulan iki vektörden birinden eksprese edilen heterodimerize edici lösin fermuarlarını kullanan Zip-sort adlı bir metodoloji geliştirdik13. Bu protokolde, Zip-sort metodolojimizi, retroviral süpernatant üretimini ve konsantrasyonunu, T hücresi aktivasyonunu ve ko-transdüksiyonunu ve çift transdüksiyonlu hücrelerin immünomanyetik saflaştırılmasını (Zip-sort) içeren retroviral vektörler oluşturma yöntemlerini açıklıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan çalışmaları, COH Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan #23145 protokolü kapsamında City of Hope (COH) Parvin Hayvan Araştırma Laboratuvarı'nda ve MSKCC Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan #99-07-025 protokolü kapsamında Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi (MSKCC) vivaryumunda gerçekleştirildi. İnsan T hücreleri, City of Hope Kan Donör Merkezi'nden elde edilen lökosit indirgeme filtrelerinden saflaştırılan ve City of Hope Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan protokol #24427 kapsamında kullanılan Ficoll-Paque'in tanımlanmamış Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden (PBMC'ler) izole edildi. Tüm prosedürler kurumsal biyogüvenlik standartlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Zip sıralama vektör tasarımı

  1. İlgilenilen hücreleri genetik olarak değiştirmek için tercih edilen ekspresyon vektörünü seçin.
    NOT: Zip sıralama metodolojisi, her ikisi de farklı vektörlerden ifade edilen ve her iki vektörü de içeren hücrelerin seçici saflaştırılmasını sağlamak için hücre içi olarak eşleşen ve hücre yüzeyine trafik yapan salgılanan fermuarları ve yakalama fermuarlarını içerir (Şekil 1A-D)13. Salgılanan fermuarlar Vektör 1'den ifade edilir ve bir yakınlık etiketi içerir. Yakalama fermuarları Vektör 2'den ifade edilir ve salgılanan fermuarı hücrenin yüzeyinde tutar. Bloke edici fermuar modifikasyonu, salgılanan fermuarın spesifik olmayan hücre dışı fermuar eşleşmesini bloke eden kovalent olarak bağlı ikinci bir fermuardan oluşur. Bloke edici fermuar modifikasyonu, uzun hücre dışı alanlara (tipik olarak kısa menteşeli alandan daha büyük hücre dışı alanlar) sahip proteinlere bir yakalama fermuarı eklerken hücre dışı eşleşmeyi önlemek için gereklidir.
  2. Vektörleri test etmek ve oluşturmak için Ek Tablo 1 ve Ek Dosya 1'den bir dizi gizli ve yakalama fermuarı seçin.
  3. Standart moleküler biyoloji tekniklerini kullanarak fermuar dizilerini eşleştirilmiş ekspresyon vektörlerine klonlayın13- iki vektörün her biri ya afinite etiketi salgılanan fermuarı ya da yakalama fermuarını kodlayacaktır (Şekil 1D).
    1. Fermuar yapı dizileri için Ek Tablo 1 ve Ek Dosya 1'e bakın. Fermuar dizileri, ifadelerini geliştirmek ve böylece sıralama verimini artırmak için bir polisistronik mesajın 5' (N terminali) noktasına yerleştirilmiştir. Sonraki transgenleri, kendi kendini parçalayan 2A peptitleri ile ayırarak aşağı akışa yerleştirin (Şekil 1D). Bununla birlikte, önceki deneyler, yüksek ifade korunursa fermuarları 3' konfigürasyonuna yerleştirmede başarılı olmuştur.

2. Retrovirüs üretimi

  1. Transfeksiyondan 1 gün önce Phoenix-Eco hücrelerini (ATCC CRL-3214, fare-tropik virüs) veya Phoenix-Eco ɑ-V β-3 hücreleri13 (Phoenix-Eco'nun yapışmasını arttırmak için tasarlanmış ɑ-V β-3 ilavesi) veya 293Vec-RD11414 (insan-tropik virüs) veya 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 hücrelerini (293Vec-RD114'ün yapışmasını arttırmak için tasarlanmış ɑ-V β-3 ilavesi) transfeksiyondan 1 gün önce hazırlayın.
    NOT: Bu protokol, paketleme hatlarının ɑ-V β-3 integrinleri ile modifikasyonunu gerektirmez, ancak bu modifikasyon, bu hücre hattının doku kültürü şişelerine yapışmasını iyileştirir ve retroviral süpernatan toplamayı kolaylaştırır.
    1. Phoenix veya 293Vec-RD114 hücreleri içeren T175 şişesindeki hücreleri, %0.25 tripsin-EDTA ile ~%80 birleşmede tripsinize edin.
      1. Ortamı çıkarın, yapışık hücreleri 10 mL PBS ile yıkayın, tripsini inhibe eden serum bileşenlerini çıkarmak için hücreleri rahatsız etmeyin, 5 mL %0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri 37 °C'de 5 dakika inkübe edin.
      2. Hücreleri, %10 fetal sığır serumu (FBS), %1 Penisilin/Streptomisin ve %1 GlutaMAX (tam DMEM olarak anılır) ile desteklenmiş 5 mL DMEM'de ayırın ve toplayın.
      3. Hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpte, 4 °C'de 5 dakika boyunca 340 x g'da santrifüjleyerek peletleyin. Boşaltma ortamı.
    2. Santrifüjle peletlenmiş hücreleri 10 mL tam DMEM'de yeniden süspanse edin ve yaklaşık 1.5 x 106 Phoenix-Eco hücresi, Phoenix-Eco ɑ-V β-3, 293Vec-RD114 hücresi veya 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 hücresi bir hematitometre ile sayılan 10 cm'lik bir doku kültürü kabı üzerinde plakalayın.
    3. Hücreleri eşit olarak dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın veya döndürün ve hücrelerin plakaya yapışmasını sağlamak için gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
  2. Yaklaşık 18-24 saat sonra, hücrelerin %60-70 oranında birleştiğini ve sağlıklı, yapışık hücrelerin dendritik çıkıntılar sergilediğini doğrulayın.
  3. Retroviral LZRS-vektör yapılarına sahip Phoenix-Eco, Phoenix-Eco ɑ-V β-3 hücreleri, 293Vec-RD114 veya 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 hücrelerini kararlı bir şekilde transfekte edin (Addgene Plazmid #31601, EBNA tabanlı epizomal stabil transfeksiyon) veya PB-vektör yapıları13 (piggyBac transpozon tabanlı genomik stabil entegrasyon, Ek Dosya 1) aşağıda açıklandığı gibi transfeksiyon kitini (Malzeme Tablosu) kullanarak.
    1. Her transfeksiyon reaksiyonu için bir mikrosantrifüj tüpünde 2 μg LZRS-vektör DNA veya PB-vektör DNA'sı ve 16 μL güçlendirici reaktifi 300 μL EC tamponunda birleştirin.
    2. PB-vektör yapılarının kararlı entegrasyonu için, ayrıca 1 μg hiperaktif piggyBac transpozaz vektörü pCMV-hyPBase15 (Sanger Enstitüsü) ekleyin.
    3. 5 saniye boyunca hafifçe girdap yapın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. 20 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin, 10 saniye vorteksleyin ve DNA misel kompleksleri oluşturmak için oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
    4. Tüpe 300 μL tam DMEM ekleyin, iyice karıştırmak için birkaç kez pipetleyin ve 1 mL'lik bir pipet kullanarak kaplanmış paketleme hattı hücrelerine damla damla misel süspansiyonu ekleyin.
    5. Misellerin eşit şekilde birikmesini sağlamak için hafifçe döndürün. 24 saat sonra, transfekte edilmiş hücreleri tripsinize edin ve akış sitometrisi ile ilk retroviral kodlanmış yapı ekspresyonunu değerlendirin.
    6. Tripsinize edilmiş hücreleri 20 mL tam DMEM içeren bir T75 şişesine aktarın ve transfekte edilmiş hücreleri seçmek için antibiyotik direnç genlerine bağlı olarak 2 μg/mL puromisin veya 10 μg/mL blastisidin ekleyin. Hücreler %70-%75 birleşmeye ulaştığında, tripsinize edin ve 40 mL tam DMEM içeren bir T175 şişesine aktarın. Paketleme hattının genişletilmesi sırasında ortamdaki antibiyotik seçimini sürdürün.
    7. Hücreler %80-%85 birleştiğinde, tekrar tripsinize edin ve akış sitometrisi ile yapı ekspresyonunu doğrulayın. Dondurma ortamı (%50 tam DMEM, %40 FBS, %10 DMSO) kullanarak bir hücre alikotunu dondurun ve hücreleri 40 mL tam DMEM ile iki T175 şişesine (1:10-1:12 bölünme oranı) geçirin.
  4. Hücreler %80-%85 birleşmeye ulaştığında T175 şişelerinde büyütülen tamamen seçilmiş stabil paketleme hatlarından retroviral süpernatantı toplayın ve konsantre edin.
    1. T175'teki ortamı, amaçlanan ilk toplamadan 24 saat önce 40 mL taze, tam DMEM ile değiştirerek ilk hasattan önce antibiyotikleri ortamdan çıkarın.
    2. Ortam değişiminden 24 saat sonra, toplanan süpernatanı şırınga filtreleri (0.45 μm, poliviniliden florür) ile donatılmış 50 mL'lik şırıngalardan geçirerek süpernatanları toplayın ve filtreleyin. 50 mL'lik konik bir tüpte toplayın.
    3. 5x polietilen glikol (PEG) çözelti konsantresi (%40 (ağırlıkça/hacim) PEG 8.000 MW, %2,4 (ağırlıkça/hacim) NaCl içeren) filtrelenmiş süpernatant ekleyin ve iyice karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin (PEG çökeltme adımı).
    4. Orijinal hasat edilen T175 şişesine 40 mL tam DMEM ekleyin, 24 saat daha inkübe edin ve toplamda 2 ardışık gün boyunca günlük viral süpernatant toplayın.
    5. Virüsü 4 °C'de 1-2 gün çökeltin. Çöken virüs, topaklaşan, yüzen veya çökelmiş malzeme olarak görünecektir.
    6. PEG ile çökeltilmiş virüs süspansiyonunu 4 °C'de 15 dakika boyunca 2.100 x g'da santrifüjleyin. Çökelmemiş süpernatanı atın.
    7. PEG ile çökeltilmiş her viral peleti, %10 FBS, %1 Penisilin/Streptomisin, %1 GlutaMAX, %1 Sodyum Piruvat, %1 Esansiyel Olmayan Amino Asitler ve %0.1 β-merkaptoetanol (tam RPMI olarak anılır) ile desteklenmiş 500 μL RPMI içinde yeniden süspanse edin.
    8. Yeniden süspanse edilen virüsü transdüksiyon için hemen kullanın veya bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve -80 °C'de saklayın.

3. Gün 0: Fare T hücresi zenginleştirmesi ve aktivasyonu

  1. 2 μg/mL anti-CD3 (klon 145-2C11) ve 2 μg/mL anti-CD28 (klon 37.51) içeren kuyucuk başına 1.5 mL PBS ile doku kültürü ile muamele edilmiş 6 oyuklu bir plakayı kaplayın. 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
  2. Donör fareden dalak toplayın, hücreleri 40 μm'lik bir filtreden ayırın ve splenositleri tam RPMI'da toplayın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 340 x g'da santrifüj edilerek splenositleri peletleyin.
    NOT: Bu çalışmada donör fare olarak 6-8 haftalık dişi BALB/cJ fareleri kullanıldı.
  3. Süpernatanı atın, peleti hafifçe vorteksleyin, 1 mL RBC lizis tamponu ekleyin, karıştırmak için 3x-5x pipetleyin, oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin, 10 mL tam RPMI ile söndürün ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 340 x g'da santrifüjleyerek hücreleri döndürün.
  4. Süpernatanı atın, %0,5 BSA ve 2 mM EDTA (MACS TAMPONU OLARAK ANILIR) ile 800 μL PBS ekleyin ve 200 μL fare-CD19 mikro boncukları ekleyin. Karıştırmak ve 4 °C'de 15 dakika inkübe etmek için pipetleyin.
  5. Fare dalağı başına 1 LD sütunu hazırlayın. LD sütununu bir MACS ayırıcısına sabitleyin. CD19'u tükenmiş splenositleri toplamak için altına 15 mL'lik konik bir tüp yerleştirin. Kolonu 2 mL MACS tamponu ile ıslatın.
  6. CD19 mikro boncukları ile inkübasyondan sonra, hücreleri 5 mL soğuk MACS tamponu ile yıkayın, pelet hücrelerini 340 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyerek yıkayın ve süpernatanı atın. 1 mL MACS arabelleğinde yeniden askıya alın ve LD sütununa hücreler ekleyin. 1 mL ve ardından 2 mL MACS tamponu ile yıkamadan önce süspansiyonun geçmesini bekleyin.
  7. Aşağı akışta kullanmak için CD19'u tükenmiş splenositlerin akışını toplayın. LD kolonunu atın, CD19'u tükenmiş splenositleri 340 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyerek döndürün. Süpernatanı atın ve 18 mL tam RPMI içinde yeniden süspanse edin. 50 IU/mL'lik bir nihai konsantrasyona rekombinant insan IL-2 (rhIL-2) ekleyin.
  8. Antikor solüsyonunu antikor kaplı 6 oyuklu plakadan atın. Antikor kaplı 6 oyuklu plakanın her bir kuyucuğuna 3 mL yeniden süspanse edilmiş B hücresi tükenmiş splenosit ekleyin.

4. Gün 1: Fare T hücrelerinin retroviral transdüksiyonu

  1. 2 μg/mL anti-CD3 (klon 145-2C11), 2 μg/mL anti-CD28 (klon 37.51) ve 20 μg/mL RetroNektin içeren kuyucuk başına 1.5 mL PBS ile doku kültürü ile muamele edilmemiş 6 oyuklu bir plakayı kaplayın.
    NOT: RetroNektin kaplama sırasında üreticinin tavsiyelerine göre doku kültürü olmayan plakalar kullanılır.
  2. 37 °C'de 2 saat inkübe edin. Kaplama solüsyonunu atın veya yeniden kullanmak üzere saklayın (bir kez yeniden kullanılabilir). Kuyu başına% 2 BSA içeren 1 mL PBS içeren plakayı bloke edin, 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin ve bloke edici çözeltiyi atın.
  3. Bu arada, PEG ile çökeltilmiş viral süpernatanı 37 °C'lik bir su banyosunda çözün.
    NOT: Bir T175 şişesinden üretilen her bir birlikte transdüksiyonlu PEG konsantre retrovirüsün 500 μL'si, %20'lik > çift transdüksiyon verimliliği ile kuyu başına 2 x 106 aktive edilmiş T hücresine kadar çift transdüksiyon için yeterli olmalıdır.
  4. İstenilen koşullara göre 6 oyuklu plaka kuyusuna ko-transdüksiyon viral süpernatanları ekleyin, nihai hacmi tam RPMI ve 50 IU/mL rhIL-2 ile en az 2 mL'ye getirin ve 2.100 x g ve 32 °C'de 1 saat döndürün.
  5. Kuyu başına 0.5-2 x 106 aktive edilmiş T hücresi ekleyin ve plakayı 32 °C'de 10 dakika boyunca 340 x g'da döndürün. Hücreler yapışık değilse, 32 °C'de 10-20 dakika daha 340 x g'da döndürmeyi tekrarlayın. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.

5. Gün 2: Vektör ekspresyonu değerlendirmesi ve isteğe bağlı yeniden dönüştürme

  1. Akış sitometrisi için transdüksiyon plakasından koşul başına 100-200 μL yapışık hücreyi bozun. Kullanıcı, her bir vektör ve afinite etiketi için akış sitometrisi ile saptanabilir bir işaretleyici tanımlamalı ve bunları akış sitometrisi kullanarak vektör tek vektör transdüksiyon verimliliğini, çift vektör transdüksiyon verimliliğini ve afinite etiketi sunumunu değerlendirmek için kullanmalıdır.
  2. Aşağıda açıklandığı gibi birlikte transdüksiyona tabi tutulan hücreler üzerinde akış sitometrisi gerçekleştirin.
    1. Vektör 1 ve Vektör 2 için vektör raporlayıcılarını görüntülemek üzere edinme parametresi eksenlerini ayarlayın (Şekil 1C).
    2. Afinite etiketi boyamanın Vektör 1 ve Vektör 2 transdüksiyon raportörlerini birlikte eksprese eden hücrelerle sınırlı olmasını sağlamak için dört Vektör 1 ve Vektör 2 ekspresyon çeyreğinin her biri için afinite etiketi fermuar boyaması (örneğin, FLAG veya CD34) için histogramlar çizin.
  3. Hücreler, aşağı akış deneyleri için yeterli hücre sağlamak için yeterince çift transdüksiyona sahipse (genellikle %20 veya daha fazla ikili transdüksiyon), aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
    1. T hücresi stimülasyonunu sürdürmek için 2 μg/mL anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları içeren PBS ile her bir T hücre hattını dönüştürmek için kullanılan ilk kuyucukların sayısını iki katına çıkarın. 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
    2. 50 IU/mL rhIL-2 ile tam RPMI ile hücreleri yeni kuyucuklara aktarın (T hücresi stimülasyonunu korur).
  4. Hücreler, aşağı akış deneyleri için yeterli hücre sağlamak için yeterince çift transdüksiyona sahip değilse (genellikle %20 çift transdüksiyon <), aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
    1. 1. Gün ile aynı protokolü kullanarak yeniden dönüştürün, ancak başlangıçta T hücresi genişlemesini hesaba katmak için kullanılan kuyu sayısını iki katına çıkarın.
    2. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Akış sitometrisini 24 saat sonra tekrarlayın.
      NOT: Yakınlık etiketi fermuarı da dahil olmak üzere vektör kodlu yapılar, ilk transdüksiyondan 2 gün sonra maksimum ifade gösterir.

6. Gün 3: T hücresi immünomanyetik seçimi (Zip-sort)

  1. Aynı ko-transdüksiyon koşulları kullanılarak üretilen hücrelerin kuyularını 15 mL'lik konik bir tüpe havuzlayın.
  2. Hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 340 x g'da santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve hücreleri, 4 °C'de 30 dakika boyunca 1 x 107 hücre başına 30 μL mikro boncuk (DYKDDDDK (FLAG) veya insan CD34) içeren 500 μL MACS tamponunda inkübe edin.
  3. İnkübasyondan sonra hücreleri 5 mL soğuk MACS tamponu ile yıkayın. Hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 340 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 1 mL MACS tamponunda yeniden süspanse edin.
  4. Aşağıda açıklandığı gibi bir LS sütunu kullanarak dönüştürülmüş T hücrelerini pozitif olarak seçin.
    1. Kolonu 2 mL MACS tamponu ile ıslatın. Manyetik standdaki LS kolonuna hücre süspansiyonu uygulayın.
    2. MACS tamponu (1 mL, 2 mL, 3 mL) ile sırayla yıkayın. Kolonu manyetik standdan çıkararak, kolona 5 mL tam RPMI ekleyerek ve hücre pistonunu yerleştirerek tutulan hücreleri kolondan ayırın.
    3. Hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpte veya doğrudan bir T25 şişesinde yakalayın. Hücreleri 0.5 x 106 hücre/mL'de tam RPMI'de 50 IU/mL rhIL-2 ile dengeleyin.
    4. %20'lik < çift transdüksiyondan başlıyorsanız, sıralama sonrası saflığı artırmak için sıralı pozitif seçim için isteğe bağlı olarak hücreleri ikinci bir LS sütununa ayrıştırın.
  5. T25 veya T75 şişelerindeki kültür CAR T hücreleri, yaklaşık 0.5 x 106 hücre /mL tam RPMI ve 50 IU/mL rhIL-2'de.
  6. İsteğe bağlı: T hücreleri in vivo deneyler için kullanılacaksa, ilk kültür periyodu13,16 sırasında karşılaşılan CAR T hücresi tonik sinyalinin neden olduğu işlev bozukluğunu azaltmak için 1 μM dasatinib içinde kültürlemeyi düşünün.
  7. Zip sıralama sonrası verimi ve saflığı (% çift dönüştürülmüş) değerlendirmek için önceden sıralanmış ve sonradan sıralanmış T hücreleri için yukarıdaki 2.1 ve 2.2 adımlarına göre akış sitometrisi gerçekleştirin.
    Verim = 100 x toplam çift transdüksiyonlu hücreler geri kazanılmış / ön sıralama popülasyonunda bulunan toplam çift transdüksiyonlu hücreler)

7. Gün 4: Devam eden T hücre kültürü

  1. T hücre konsantrasyonunu 0.5-1 x 106 hücre /mL'de tutmak için tüm kültür hacmi için taze tam RPMI ve 50 IU/mL rhIL-2 ekleyin.
  2. İsteğe bağlı: İn vivo deneyler için T hücreleri kullanılacaksa, taze 1 μM dasatinib ekleyin.

8. Gün 5: Zip sıralamalı T hücrelerinin karakterizasyonu

  1. İsteğe bağlı: Akış sitometrisi kullanarak Zip sıralama vektörleri tarafından kodlanan CAR'ları veya diğer protein ürünlerini tespit etmek için antikorlarla boyanmış durum başına 100-200 μL T hücresi süspansiyonu hazırlayın.
  2. CAR T hücreleriyle in vitro veya in vivo deneyler yapın.
  3. İsteğe bağlı: T hücreleri in vivo deneyler için kullanılacaksa, dasatinib'i çıkarmak için hücreleri yıkayın. Hücreleri, kurumsal yönergelere göre retro-orbital veya kuyruk-ven enjeksiyonu için gereken konsantrasyonda yeniden süspanse edin.

9. Gün 0: İnsan T hücrelerinin saflaştırılması ve uyarılması

  1. Dondurularak saklanmış insan periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) bir şişesini bir su banyosunda hızla çözün (veya yeni izole edilmiş PBMC'ler kullanın). Çözülmüş PBMC'leri 5 mL MACS tamponu içeren 15 mL'lik konik bir tüpe ekleyin, sayım için bir alikot hazırlayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 340 x g'da santrifüjleyerek hücreleri pelet haline getirin.
  2. Süpernatanı atın ve hücreleri MACS tamponunda yeniden askıya alın (1 x 10 toplam7 hücre başına 40 μL tampon kullanın). Üreticinin talimatlarına göre Pan T hücre izolasyon Kitini (insan) kullanarak T hücresi izolasyonuna devam edin.
    1. Kısaca, toplam 1 x 107 hücre başına 10 μL Pan T Hücresi Biotin-Antikor Kokteyli ekleyin. 4 °C'de 5 dakika inkübe edin.
    2. Toplam 1 x 107 hücre başına 30 μL MACS tamponu ekleyin. Toplam 1 x 107 hücre başına 20 μL Pan T Cell MicroBead Kokteyli ekleyin.
    3. 4 °C'de 10 dakika inkübe edin. MACS tamponu kullanarak hücre süspansiyonu hacmini en az 500 μL'ye kadar doldurun.
    4. Bir LS kolonu kullanarak manyetik hücre ayrımına geçin ve zenginleştirilmiş (el değmemiş) T hücreleri içeren akışı toplayın.
  3. 4 °C'de 5 dakika boyunca 340 x g'da santrifüjleyerek T hücresi verimini ve pelet hücrelerini sayın. Süpernatanı atın. İnsan T hücrelerini 1 x 106 hücre/mL'de rhIL-2 ile 50 IU/mL'de tam RPM'de yeniden süspanse edin.
  4. 2 mL PBS içeren 15 mL'lik konik bir tüpe, T Hücresi Genişlemesi ve Aktivasyonu için gerekli hacimde Dynabeads İnsan T-Aktivatörü CD3/CD28 ekleyin (1:1 boncuk/T hücresi oranı kullanılarak 1 x10 6 hücre başına 25 μL boncuk) ve boncukları yıkamak için 4 °C'de 5 dakika boyunca 340 x g'da döndürün. Süpernatanı atın.
  5. Yeniden süspanse edilmiş T hücrelerini yıkanmış boncuklarla karıştırın ve kültür için bir T25 şişesine aktarın.

10. Gün 3: İnsan T hücrelerinin retroviral transdüksiyonu

  1. 20 μg/mL RetroNektin içeren kuyucuk başına 1.5 mL PBS ile doku kültürü olmayan 6 oyuklu bir plakayı kaplayın.
  2. 37 °C'de 2 saat inkübe edin. Kaplama solüsyonunu atın veya yeniden kullanmak üzere saklayın (bir kez yeniden kullanılabilir).
  3. Bu arada, 37 °C'lik bir su banyosunda birlikte transdüksiyon için PEG ile çökeltilmiş viral süpernatanları çözün.
  4. İstenilen transdüksiyon koşullarına göre RetroNektin kaplı 6 oyuklu plakanın kuyucuklarına ko-transdüksiyon viral süpernatantı ekleyin, istenen miktarda T hücresi sayın ve ekleyin (genellikle 0.5 - 2 x 106 T hücresi/kuyu), rhIL-2 içeren tam RPMI ile hacmi 3 mL'ye getirin ve 32 °C'de 340 x g'da 45 dakika döndürün.
  5. 24 saat sonra, 50 IU/mL rhIL-2 ile tam RPMI'da T hücrelerini 1 x 106 hücre/ mL'de tutun.
  6. İstenen T hücresi konsantrasyonunu korumak için gereken hacim, 6 oyuklu plakanın hacim kapasitesini aşarsa, hücreleri 6 oyuklu plakadan T25 şişesine aktarın.

11. Gün 6: İnsan CAR T hücrelerinin fermuarla sınıflandırılması

  1. Manyetik kolonda olası Dynabead ile ilişkili tutulmayı önlemek için afinite etiketi tabanlı immünomanyetik saflaştırmadan (Zip-sort) önce ve akış sitometrik analizine olası müdahaleyi önlemek için akış sitometrisinden önce Dynabeads'i T hücrelerinden çıkarın.
  2. Dynabeads'i ayrıştırmak ve T hücrelerini 15 mL'lik konik bir tüpe aktarmak ve Dynabead Magnet'e yerleştirmek için kısaca vorteksleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirin ve Dynabeads mıknatısa bağlanana kadar 5 dakika bekleyin.
  3. Dynabeads içermeyen hücre süspansiyonunu bir pipetle aspire ederek yeni bir 15 mL konik tüpe dikkatlice aktarın. Geri kazanılan hücre konsantrasyonunu sayın ve toplam hücre verimini hesaplamak için hacmi kullanın.
  4. Yukarıdaki fare transdüksiyon protokolüne göre akış sitometrisi kullanarak CAR ekspresyonunu değerlendirin.
  5. 4 °C'de 5 dakika boyunca 340 x g'da santrifüjleyerek hücreleri döndürün ve 1 x 107 hücre başına 30 μL mikro boncuk (DYKDDDDK (FLAG) veya insan CD34) içeren 500 μL MACS tamponunda inkübe edin.
  6. Zip sıralamalı insan CAR T hücrelerini elde etmek için 6.3-6.5 adımlarını izleyin.
  7. Tripan mavisi dışlamasını kullanarak hemasitometre canlılık kontrolü ile sıralama sonrası canlılığı değerlendirin. Ön sıralama canlılığının %80'> olması bekleniyor. Bu, Zip sıralamasını takiben %80'in altına düşebilir, ancak 4-5 gün içinde düzelir.
  8. İnsan T hücrelerini 50 IU/mL rhIL-2 ile tam RPMI'da genişletin ve T hücresi konsantrasyonunu yaklaşık 1 x 106 hücre/mL'de tutun. Sıralama sonrası T hücresi genişletme ve bakımı, kullanıcının standart genişletme ve kullanım protokollerine göre uyarlanabilir.
  9. Genellikle 8. günden sonra T hücrelerini kullanarak öldürme deneyleri, sitokin üretimi, in vivo analiz gibi aşağı akış deneysel testleri gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, iki farklı retroviral vektör (Zip-sort, Şekil 1) ile çift transdüksiyonlu T hücrelerinin birlikte transdüksiyonunu ve tek aşamalı immünomanyetik seçimini gösteriyoruz13. Her vektör, çift transdüksiyonlu T hücrelerinin yüzeyinde seçici olarak görüntülenen heterodimerize edici bir lösin fermuar çiftinin bir bölümünü kodlar (Şekil 1A). Bir afinite etiketi salgılanan fermuar, Vektör 1'den ifade edilir ve hücre içinde Vektör 2'd...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Zip-sort vektör setleri oluşturmak, retrovirüs üretmek, fare ve insan T hücrelerini birlikte dönüştürmek ve çift transdüksiyonlu hücreleri immünomanyetik olarak saflaştırmak (Zip-sort) için bir protokol tanımladık. Yukarıdaki protokol, retroviral vektörler ve fare ve insan T hücreleri için optimize edilmiştir. Zip-sort metodolojisi diğer vektör sistemleriyle değerlendirilmemiş olsa da, prensip olarak, yeterince yüksek yüzey ekspresyonunun elde edilmesi koşuluyla, lentivirüs

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.R., S.C., S.E.J. ve M.V.D.B. Zip-sort teknolojisi ile ilgili patent başvurularının ortak mucitleridir. APB, Abbvie ve Bristol Myers Squibb'e danışmanlık sağlıyor. M.V.D.B., Seres Therapeutics'ten araştırma desteği ve Seres Therapeutics ve ThymoFox'tan hisse senedi opsiyonları aldı; Wolters Kluwer'dan telif ücreti aldı; Seres Therapeutics, Vor Biopharma, Rheos Medicines, Frazier Healthcare Partners, Nektar Therapeutics, Notch Therapeutics, Ceramedix, Lygenesis, Pluto Therapeutics, GlaskoSmithKline, Da Volterra, ThymoFox, Garuda, Novartis (eş), Synthekine (eş), Beigene (eş), Kite (eş), MustangBio (eş) ve Cellectar (eş); Seres Therapeutics ve Juno Therapeutics'ten fikri mülkiyet lisansına sahiptir; DKMS'nin (kar amacı gütmeyen bir kuruluş) Vakıf Kurulu'nda mütevelli rolü üstlenmektedir; ve Smart Immune'un bilimsel danışma kurulu başkanıdır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.C., Alman Araştırma Vakfı'ndan (Araştırma Bursu; Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG). SEC, NCI'dan bir kariyer geliştirme ödülünden destek alır (ödül numarası K08-CA252157). SEC ayrıca Amerikan Klinik Onkoloji Derneği (Genç Araştırmacı ödülü), Ulusal İlik Donör Programı (Amy Programı ödülü) ve Parker Kanser İmmünoterapi Enstitüsü'nden (Bridge Scholar ödülü) destek aldı. Van den Brink laboratuvarındaki araştırmalar, Ulusal Kanser Enstitüsü ödülleri P01-CA023766, R35-CA284024, R01-CA228308; Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü ödülü R01-HL164902 ve Ulusal Yaşlanma Enstitüsü ödülü P01-AG052359. Bu araştırma kısmen Deana ve Steve Campbell Başhekim Seçkin Kürsü bağışı tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Tümör hücre dizisi ile ilgili
C1498 (İngilizce)ATCCTİB-49
BM185-CD19Referans 13
BM185-CD20Referans 13
4D-Nükleofektör Çekirdek BirimiLonzaAAF-1003B
4D-Nükleofektör X ÜnitesiLonzaAAF-1003X
Lonza SF tampon kiti
Virüs Üretimi
10 cm Doku kültürü (TC) ile işlenmiş Hücre Kültürü KabıCorning353003
50 mL konik tüpTermo Bilimsel339652
EtkiliQiagen301425
pENTR1a plazmidiAddgene17398
LZRS-RfaAddgene31601
PB MMLV puro (fare T hücreleri için viral vektör)Referans 13
PB SFG blastR (insan T hücreleri için viral vektör)Referans 13
pCMV-hyPBaseSanger Enstitüsü
Anka kuşu-EkoATCCCRL-3214 (İngilizce)
Phoenix-Eco alfa V beta 3Referans 13Phoenix-Eco, daha yüksek avidite ile kültür şişelerine yapışacak şekilde modifiye edildi
PB-EF1a intron WPRE mCD4 P2A MCS integrin beta 3Referans 13Paketleme hattı hücrelerinin kültür şişelerine yapışmasını arttırmak için isteğe bağlı
PB-EF1a intron WPRE hCD8a 2A integrin alfa VReferans 13Paketleme hattı hücrelerinin kültür şişelerine yapışmasını arttırmak için isteğe bağlı
Biovec-RD113 SerisiBiovec İlaç
Biovec-RD113 alfa V beta 3Biovec İlaçBu çalışma, alfa V beta 3 vektörleri ile transfekte edilmiştir
Millex-HV şırınga filtreleri (0.45 μ m)KırlangıçSLHVR33RRS
Polietilen glikol 8000 (PEG)Fisher BilimselBP233-1
Sodyum klorürFisher BilimselS271-500 Serisi
PuromisinSanta Cruz BiyoteknolojiSC-108071B
BlastisidinSanta Cruz BiyoteknolojiSC-204655 (İngilizce)
T175 TC-işlem görmüş mataralar Corning353112
Tripsin-EDTA (%0,25), fenol kırmızısıGibco25200056
Hücre ortamı
2-merkaptoetanolGibco21985023
RPMI1640Gibco11-875-119
DMEMGibco11-965-118
FBS'ninSigmaF2442 Serisi
GlutamaxGibco35050061
MEM esansiyel olmayan amino asitlerGibco11140050
Penisilin-streptomisinGibco15140-163
Sodyum piruvatGibco11360070
T hücre stimülasyonu/transdüksiyonu
15 mL konik tüpTermo Bilimsel339650
6 oyuklu TC olmayan plakaGibco351146
6 oyuklu TC plakasıGibco353046
anti-CD19 mikroboncuklar Miltenyi Biotec130-121-301
InVivoMab anti-fare CD28 (Klon 37.51)BioXCellBE0015-1
InVivoPlus anti-fare CD3ε (Klon 145-2C11)BioXCellBE0001-1
Sığır Serum AlbüminiSigma AldrichA4737-1G
DasatinibCayman Kimya11498
Dynabeads İnsan T-Aktivatörü CD3/CD28Gibco11131D
EDTA (0,5 M), pH 8,0, RNaz içermezDavetliAM9260G
HybriMax RBC lizis tamponuSigmaR7757-100ML Serisi
LD sütunuMiltenyi Biotec130-042-901
Pan T Hücre İzolasyon Kiti, insanMiltenyi Biotec130-096-535
Dynamag-15 MıknatısDavetli12301D
Fosfat Tamponlu Salin (1X)Corning21040CV
RetronektinTakaraT100B
rhIL-2Prolökin (aldesleukin)
T25 hücre kültürü şişesiCorning353109
Zip-sort
&mikro; MACS DYKDDDDK İzolasyon KitiMiltenyi Biotec130-101-591
CD34 MicroBead Kiti, insanMiltenyi Biotec130-046-702
QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
MACS Çoklu StandMiltenyi Biotec130-042-303
LS sütunuMiltenyi Biotec130-042-401
Akış Sitometrisi ve hücre izleme
Anti-CD90.1 Thy1.1 APC (Klon OX-7)BD Biyolojik BilimlerKedi# 561409; RRID:AB_10683163
Anti-V5 etiketi Antikoru, (Klon 4C12E11) iFluor 488GenScriptKedi# A01803, RRID:AB_2925231
Benim PEHücre Sinyalizasyon TeknolojisiKedi# 2233; RRID:AB_823474
Myc Alexa 647Hücre Sinyalizasyon TeknolojisiKedi# 2233; RRID:AB_823474
APC anti-DYKDDDK Etiketi (Klon L5)Biyolojik EfsaneKedi# 637307; RRID:AB_2561496
Fare Anti CD34 Antikoru, Alexa Fluor 647, (Klon QBEnd/10)Novus Biyolojik ÜrünlerKedi# NBP2-34713AF647; RRID:AB_2925234
Streptag FITCGenScriptKedi# A01736; RRID:AB_2622221
Incucyte SX5Sartorius
Penteon Akış SitometresiGilent

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric Antigen Receptor Therapy. New Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Mikkilineni, L., Kochenderfer, J. N. CAR T cell therapies for patients with multiple myeloma. Nat Rev Clin Oncol. 18 (2), 71-84 (2021).
  3. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614 (7949), 635-648 (2023).
  4. Berger, T. R., Maus, M. V. Mechanisms of response and resistance to CAR T cell therapies. Curr Opin Immunol. 69, 56-64 (2021).
  5. Labanieh, L., Majzner, R. G., Mackall, C. L. Programming CAR-T cells to kill cancer. Nat Biomed Eng. 2 (6), 377-391 (2018).
  6. Fucà, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. Enhancing Chimeric Antigen Receptor T-Cell Efficacy in Solid Tumors. Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).
  7. Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral Vector Systems for Gene Therapy: A Comprehensive Literature Review of Progress and Biosafety Challenges. Appl Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).
  8. Hyrenius-Wittsten, A., et al. SynNotch CAR circuits enhance solid tumor recognition and promote persistent antitumor activity in mouse models. Sci Transl Medi. 13 (591), eabd8836(2021).
  9. Tousley, A. M., et al. Co-opting signalling molecules enables logic-gated control of CAR T cells. Nature. 615 (7952), 507-516 (2023).
  10. Li, Y., et al. KIR-based inhibitory CARs overcome CAR-NK cell trogocytosis-mediated fratricide and tumor escape. Nat Med. 28 (10), 2133-2144 (2022).
  11. Ghorashian, S., et al. CD19/CD22 targeting with co-transduced CAR T-cells to prevent antigen negative relapse after CAR T-cell therapy of B-ALL. Blood J. , (2023).
  12. Qin, H., et al. Preclinical Development of Bivalent Chimeric Antigen Receptors Targeting Both CD19 and CD22. Mol Ther Oncol. 11, 127-137 (2018).
  13. James, S. E., et al. Leucine zipper-based immunomagnetic purification of CAR T cells displaying multiple receptors. Nat Biomed Eng. 8 (12), 1592-1614 (2024).
  14. Ghani, K., et al. Efficient Human Hematopoietic Cell Transduction Using RD114- and GALV-Pseudotyped Retroviral Vectors Produced in Suspension and Serum-Free Media. Human Gene Ther. 20 (9), 966-974 (2009).
  15. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc Natl Acad Sci U S Am. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  16. Weber, E. W., et al. Transient rest restores functionality in exhausted CAR-T cells through epigenetic remodeling. Science. 372 (6537), eaba1786(2021).
  17. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Targeted Ther. 6 (1), 1-24 (2021).
  18. Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L., Wilson, M. H. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc Natl Acad Sci. 107 (4), 1343-1348 (2010).
  19. Shy, B. R., et al. High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails. Nat Biotechnol. 41 (4), 521-531 (2023).
  20. Liu, Z., et al. Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector. Sci Rep. 7 (1), 2193(2017).
  21. Cui, Z., Yuan, P., Zhao, Z., Zhao, F., Lu, L. Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro. J Vis Exp. (213), e66966(2024).
  22. Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J Clin Invest. 119 (4), 964-975 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Leucine ZipperCell SortingDual Vector TransductionT Cell EngineeringImmunomagnetic PurificationAdoptive T Cell TherapyCAR T CellsTumor MicroenvironmentTransgene CoexpressionCell Purification

İlgili makaleler