Yöntem makalesi

Ex Vivo ve In Vivo Görüntüleme için Emici Moleküller Kullanarak Geçici Optik Temizleme

6.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68629

⸱

11 Temmuz 2025

 ,  ,  , 
1Department of Physics, The University of Texas at Dallas, 2Department of Electrical and Computer Engineering, The University of Texas at Dallas

Bu makalede

Özet

Emici molekül çözeltileri gibi optik temizleme teknikleri, biyolojik görüntülemeyi geliştirmek için ışık saçılımını geçici olarak azaltır ve derine gömülü organlar için biyouyumlu, geri dönüşümlü in vivo görüntüleme stratejileri sunar. Bu protokol, canlı hayvanlarda gerçek zamanlı dinamikler için yüksek kaliteli, dinamik görüntüleme elde etmek için ayrıntılı deneysel prosedürlerin yanı sıra gelişmiş görüntü işleme sunar.

Özet

Dinamik görüntüleme, biyoloji ve tıpta temel bir araçtır, ancak biyolojik dokularda penetrasyon derinliğini ve çözünürlüğünü azaltan kırılma indisi uyumsuzluklarının neden olduğu canlı dokularda ışık saçılımı ile sınırlıdır. Önceki çalışmalar, güçlü emici moleküller kullanarak canlı hayvanlarda optik şeffaflık elde etmek için yeni bir yaklaşım getirmiştir. Gıdalarda yaygın olarak kullanılan FDA onaylı bir boya olan Tartrazin gibi bu emici moleküller suda çözündüğünde, Kramers-Kronig ilişkileri yoluyla sulu ortamın kırılma indisini değiştirirler. Bu modülasyon, farklı kırılma indekslerine sahip dokudaki ayrı bileşenler arasındaki kırılma indisi uyumsuzluğunun azaltılmasına izin verir, böylece saçılmayı azaltır. Bu makale, hem ex vivo hem de in vivo numunelere uygulanan Tartrazin bazlı sulu çözelti kullanılarak doku temizleme tekniğinin ayrıntılı metodolojisini bildirmektedir. Bu yaklaşım, canlı fare gövdelerini görünür spektrumda tersine çevrilebilir bir şekilde şeffaf hale getirerek, iç süreçlerin ve yapıların daha net ve daha derin görüntülenmesini sağlar. Daha sonra, ilgilenilen organların kontrastını ve segmentasyonunu iyileştirmek için gelişmiş bir görüntü işleme algoritması kullanıldı. Ek olarak, Tartrazin bazlı çözelti ile muamele edilmiş tavuk göğsü gibi ex vivo numunelerde yüksek şeffaflık gösterilmiştir. Bu yöntem, çeşitli modalitelerde görüntüleme yeteneklerini geliştirmek için çok yönlü ve erişilebilir bir yaklaşım sunar ve karmaşık biyolojik sistemlerin anlaşılmasında ilerlemenin yolunu açar.

Giriş

Biyolojik görüntüleme, ilgilenilen yapıları gizleyen ışığın saçılması nedeniyle uzun süredir sorgulanmaktadır1. Optik temizleme teknikleri, ışık saçılımını azaltmayı ve görsel netliği artırmayı amaçlayarak daha önce gizlenmiş yapıların görselleştirilmesini sağlar2. Bu tekniklerin geliştirilmesi, örneklerin fiziksel diseksiyonu olmadan ex vivo biyolojik dokuların, hatta bütün hayvanların bile optik görüntülemesini iyileştirmek için tasarlanmış çok çeşitli yöntemlere yol açmıştır3. Bununla birlikte, in vivo uygulamalar için benzer tekniklerin geliştirilmesi zor olmuştur. CLARITY Clear Lipid değişimli Akrilamid-hibritleştirilmiş Rigid Görüntüleme / Immunostaining / in situ-hibridizasyon uyumlu Tissue hYdrogel gibi teknikler, yüksek çözünürlüklü görüntüleme sunar, ancak geri dönüşümden yoksundur, bu da onları canlı hayvan çalışmaları için uygun hale getirmez4. Constantini ve ark. in vivo görüntülemede ex vivo görüntüleme netliğine kıyasla daha yavaş ilerleme göstermiştir, bu da doku şeffaflığı için gerekli toksik ajan seviyelerinden kaçınırken doku canlılığını korumanın karmaşıklığından kaynaklanmaktadır5. Genina, non-invaziv ve geri dönüşümlü yöntemlere bağlı olarak optik doku temizlemenin geleceğini vurguluyor6. Son çalışmalar, in vivo optik temizleme için suda çözünür emici boyaların etkinliğini göstermiştir. Örneğin, Miller ve ark. Tartrazin'in topikal olarak uygulanmasının, canlı fare derisinin hem OCT hem de fotoakustik mikroskopisinde (PAM) görüntüleme derinliğini, saçılmayı azaltarak ve interstisyel doku bileşenlerinin kırılma indisini artırarak önemli ölçüde artırdığını gösterdi7. Jia ve ark. fare kulağı ve karın dokusunun in vivo PAM görüntülemesini geliştirmek için ağırlıkça %15'lik bir Tartrazin solüsyonu kullandı ve aksi takdirde gizlenen hücre altı çözünürlüğe sahip ince mikrovasküler yapıları ortaya çıkardı8. Zuo ve ark. ayrıca 0.6 M Tartrazin kullanarak canlı farelerde sağlam kafa derisi ve kafatası yoluyla beyin görüntülemeyi gösterdi ve tedavi edilmemiş dokuya kıyasla dört kat daha yüksek sinyal yoğunluğu ve 3.5 kat daha iyi çözünürlük elde etti9. Başka bir uygulamada, Narawane ve ark. Tartrazin uygulayarak domuz gözlerinde derin transskleral OCT görüntülemeyi mümkün kıldı ve daha önce güçlü skleral saçılma nedeniyle erişilemeyen suprakoroidal boşluğun net bir şekilde görüntülenmesini sağladı10. CLARITY ve iDISCO (Solventle temizlenmiş organların immüno-etiketleme özellikli üç boyutlu görüntülemesi) gibi ex vivo doku temizleme yöntemleri, lipid uzaklaştırma veya solvent bazlı temizleme yoluyla yüksek optik şeffaflık ve hücre altı çözünürlük sağlasa da, genellikle canlı hayvanlarla in vivo görüntüleme için uygun değildir 4,11,12. Bu sınırlama, hastalık gelişimi ve terapötikler gibi canlı hayvanlardaki dinamik süreçlerin biyomedikal görüntülenmesi için çok önemli olan dinamik görüntülemeyi etkiler.

Gıda sınıfı bir boya olan Tartrazin gibi yüksek suda çözünürlüğe ve farklı absorpsiyon bandı şekillerine sahip emici moleküller, canlı hayvanlarda optik şeffaflık elde etmek için umut verici avantajlar sunar13. Doku, özellikle Tartrazin'i ekleyerek, boyanın benzersiz spektral özellikleri nedeniyle ultraviyole ve mavi dalga boylarını seçici olarak emer ve bu da daha uzun dalga boylarında saçılmayı azaltan modifiye edilmiş bir kırılma indisi profili ile sonuçlanır. Bu sezgisel optik doku temizleme tekniği, in vivo görüntüleme için optimize edilmiştir ve Kramers-Kronig ilişkileri, Tartrazin14,15 gibi güçlü emici moleküller kullanıldığında gözlemlenen şeffaflık için bilimsel bir temel sağlar. İn vivo görüntüleme için Tartrazin, cilde daha iyi yapışan yapışkan bir çözelti oluşturmak için ısıtılmış agaroz parçacıkları ve su ile birleştirilir. Tartrazinin suda çözünür doğası ayrıca boya bazlı çözeltinin canlı hayvanlardan kolayca çıkarılmasını kolaylaştırarak, boya çözeltilerine uzun süre maruz kalmanın potansiyel etkilerini azaltır. Ek olarak, yöntem, optik koherens tomografi 7,16 ve fotoakustik görüntüleme 7,9 dahil olmak üzere görüntüleme derinliğini, çözünürlüğünü ve hassasiyetini iyileştirmek için çeşitli biyomedikal uygulamalar için uyarlanmıştır ve bu da daha geniş biyomedikal görüntüleme topluluğu için potansiyelini göstermektedir.

Biyomedikal görüntülemede emici moleküllerin uygulanmasına olan ilginin artmasıyla17,18, protokol, görüntü işleme ve geri dönüşümlü in vivo görüntüleme ile birlikte ex vivo ve in vivo uygulamalar için gıda boyasının kullanımına ilişkin ayrıntılı bir prosedür sunar. Bu protokol, ex vivo şeffaflığı göstermek için tavuk göğsü dokusuna uygulanır ve daha sonra farelerin in vivo baş ve abdominal görüntülemesi için modifiye edilerek geri dönüşümlülük gösterilir. Fare cildine in vivo olarak uygulanan bir solüsyon, cilde veya doku bütünlüğüne zarar vermeden geçici, geri dönüşümlü şeffaflık oluşturur. Bu teknik, iç organların in vivo optik görüntülemesi için optimize edilmiş bir görüntüleme protokolü oluşturmak üzere gürültü giderme de dahil olmak üzere bir görüntü işleme boru hattı ile entegre edilebilir. Birleştirildiğinde, bu teknikler biyolojik süreçlerin gerçek zamanlı gözlemleri için daha iyi non-invaziv, uzunlamasına görüntüleme sağlar. Tersinirlik gösteren daha güvenli ajanların kullanımı, önceki sınırlamaların üstesinden gelir ve dinamik biyolojik görüntüleme için daha uygun bir yöntem sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Yapılan tüm hayvan deneyleri, NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak Dallas'taki Texas Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Reaktifler ve kullanılan ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Görüntü işleme kodu Github'da mevcuttur: https://github.com/ou-group-utd/JoVE-2025-Image-Processing

1. Tartrazin çözeltisinin hazırlanması

  1. Ex vivo numuneler için
    1. Boya çözeltilerini hazırlamak için, istenen çözelti hacmini hazırlamak için gerekli boya tozu kütlesini (Tartrazin) hesaplayın. Aşağıdaki formülü kullanın:
      Kütle (g) = Molarite (M) × Molekül Ağırlığı (g/mol) × Hacim (L)
      NOT: Gerçek molariteyi kalibre etmek için, bir UV-VIS spektrometresi kullanarak hazırlanan çözeltilerin absorpsiyonunu ölçün ve Beer-Lambert Yasası19'u uygulayın.
      DİKKAT: Tozun kesin miktarını tartmak için analitik bir terazi kullanın. Boya tozlarıyla çalışırken laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük dahil olmak üzere uygun KKD (kişisel koruyucu ekipman) kullanın. Solumaktan veya cilt temasından kaçının.
    2. Boya tozunu temiz bir cam şişeye aktarın ve hacimsel hassasiyeti sağlamak için hacimsel bir pipet kullanarak gerekli hacimde deiyonize (DI) su ekleyin.
    3. Toz oda sıcaklığında tamamen çözünmezse, cam şişeyi önceden 40 °C'ye ısıtılmış bir laboratuvar fırınına veya fırına koyun ve 10 dakika veya toz tamamen eriyene kadar ısıtın (Şekil 1A).
      NOT: Düşük molariteli çözeltiler oda sıcaklığında tamamen çözünür ve sıvı halde kalırken, yüksek konsantrasyonlu (>0,37 M) çözeltiler ısıtma gerektirir.
      DİKKAT: Aşırı ısıtma suyu buharlaştıracak ve çözeltinin gerçek konsantrasyonunu değiştirecektir.
    4. Tam çözünmeyi sağlamak için vorteks karıştırıcısını 30 s ila 1 dakika karıştırın.
    5. 0.65 M'lik bir çözelti hazırlamak için, 427.5 mg Tartrazin tozunu 1 mL DI su19 içinde çözün. Diğer konsantrasyonlar için Tablo 1'e bakın.
      NOT: Kullanılmayan boya çözeltilerini ve kontamine malzemeleri standart kimyasal atık imha prosedürlerine göre atın.
  2. İn vivo numuneler için
    1. % 0.4 (4 mg / mL) agaroz hidrojel çözeltisi ile 0.65 M'lik bir konsantrasyon hazırlamak için gerekli düşük erime sıcaklığına sahip agaroz mikropartikülleri ve Tartrazin kütlesini hesaplayın.
      NOT: Tüm reaktifleri kullanırken adım 1.1.1'de açıklanan standart güvenlik önlemlerini izleyin.
    2. Ağırlıklı tozları temiz bir cam şişeye aktarın. Hacimsel bir pipet kullanarak DI suyu ekleyin.
    3. Şişeyi, yaklaşık 10-15 dakika veya agaroz parçacıkları tamamen çözülene kadar 75 ° C'ye ısıtılmış bir laboratuvar fırınına veya fırına yerleştirin.
    4. Homojen çözünme için ısıtma işlemi sırasında ara sıra bir girdap karıştırıcı kullanarak karıştırın.
    5. Kullanmadan önce çözeltinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Jel formuna katılaşırsa, yeniden sıvılaştırmak için girdap karıştırıcısını 30 saniye boyunca kullanın.
    6. 0.65 M'lik bir hidrojel çözeltisi hazırlamak için 427.5 mg Tartrazin tozu ve 4 mg agarozu 1 mL DI suda çözün. Diğer konsantrasyonlarda çözeltiler hazırlamak için, agaroz konsantrasyonunu %0.4'te (4 mg / mL) tutun ve karşılık gelen Tartrazin kütlesi 17 için Tablo 1'e bakın.

2. Ex vivo dokuların optik olarak temizlenmesi

  1. Numune hazırlama
    1. Ex vivo doku hazırlamak için tavuk göğsü dokusunu kollajen liflerine paralel olarak istenilen kalınlıkta dilimleyin.
    2. Dilimlenmiş dokuyu suyla nazikçe temizleyin.
    3. Dokuyu iki temiz mikroskop lamı arasına yerleştirerek kalınlığı ölçün. Slaytları hafifçe birbirine bastırın ve dokunun ortasındaki slaytlar arasındaki mesafeyi ölçmek için bir Sürmeli kumpas kullanın.
    4. Dokuyu boya çözeltisine batırın.
      DİKKAT: Çözeltinin hacminin numune hacminden daha fazla olduğundan ve dokunun tamamen suya batırıldığından emin olun.
    5. Kabı bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve 10 dakika boyunca dakikada 100 devirde sallayın.
    6. Dokunun çözelti içinde 60 dakika boyunca düşük konsantrasyonlar için oda sıcaklığında ≤0.4 M ve daha yüksek konsantrasyonlar için 40 ° C'de >0.4 M) kalmasına izin verin.
  2. Görüntüleme
    1. Temiz forseps kullanarak dokuyu boya çözeltisinden çıkarın.
    2. Numuneyi iki şeffaf cam slayt arasına yerleştirin ve uygun çözünürlük ve büyütme ayarlarına sahip bir dijital veya bilimsel kamera kullanarak görüntüleri yakalayın.
    3. Harici ışık girişimini en aza indirmek için görüntüleme işlemini kontrollü bir ışık ortamında gerçekleştirin.
    4. Farklı kalınlıklara ve boya çözeltisi konsantrasyonlarına sahip doku örnekleri için görüntüleme işlemini tekrarlayın (Şekil 2B).
      NOT: Arka aydınlatma için bir LED ışık kaynağı kullanın. Bununla birlikte, üstten aydınlatmalı bir ışık kaynağı için de aynı şekilde çalışır.
  3. Optik iletim ölçümleri
    1. Optik iletimi ölçmek için, tavuk dokusunu iki şeffaf cam slayt arasına sıkıştırın ve bir UV-Görünür-NIR Spektrometresi kullanarak iletimi ölçün (Şekil 2C).
    2. Sistemin düzgün bir şekilde temellendirildiğinden ve ışık huzmesinin, tutarlılığı korumak için boya çözeltileri ile işlemden önce ve sonra dokunun aynı bölgesinden geçtiğinden emin olun.
      NOT: Orta tarama hızı ve 400 nm veri aralığı kullanarak iletim spektrumlarını 2000 nm ila 1.0 nm dalga boyu aralığında kaydedin. Tam spektral tarama, numune başına yaklaşık 5 dakika sürer.

3. Canlı hayvanlarda optik şeffaflık

  1. Hayvan hazırlama
    1. Deneyden önce, hayvanın ağırlığını ölçün ve fizyolojik bir temel oluşturmak için genel aktivite seviyesini not edin.
    2. Deney sırasında hayvanın vücut ısısını korumak için sıcaklığı 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı kullanın.
      DİKKAT: Aşırı ısınmayı önlemek için hayvanı sürekli olarak izleyin.
    3. Görüntüleme bölgelerine dayalı olarak canlı hayvanların optik görüntülenmesi için anestezi uygulayın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Abdominal görüntüleme için, hızlı iyileşme için inhalasyon anestezikleri ve beyin görüntüleme için enjekte edilebilir anestezi kullanın.
    4. İnhalasyon anestezisi için, görüntüleme deneyinden önce yaklaşık 5 dakika boyunca% 1.5 -% 3 ve akış hızı 0.8 L / dk'da izofluran ile indükleyin ve deney boyunca% 1 -% 2'de tutun.
      DİKKAT: Hayvanın nefes alma düzenini ve derinliğini sürekli olarak izleyin. Personelin anestezik maruziyetini en aza indirmek için iyi havalandırılan bir alan kullanın.
    5. Enjekte edilebilir anestezi için Ketamin HCL (16 mg / mL) ve Deksmedetomidin HCL 0.2 mg / mL içeren bir kokteyl hazırlayın. Hayvan ağırlığına ve onaylanmış kurumsal protokollere göre dozlayın.
    6. İstenilen görüntüleme alanından küçük hayvan makası kullanarak kürkü kesin.
    7. Kalan tüyleri gidermek için kesilen cilt bölgesine 60 saniyeden daha kısa bir süre boyunca tüy dökücü krem uygulayın. Kremi hemen çıkarın ve cilt tahrişini önlemek için alkollü mendiller kullanarak cildi temizleyin.
    8. Deneyden sonra enjekte edilebilir anestezi için tersine çevrilmiş bir ilaç olarak Atipamezole kullanın. İyileşme sırasında hayvanı izleyin ve ev kafesine dönmeden önce normal solunum ve hareketliliğe döndüğünden emin olun.
  2. Dokuyu şeffaf hale getirme prosedürü
    1. Hipotermiyi önlemek için hayvanın altına 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı yerleştirerek görüntüleme kurulumunu hazırlayın. Görüntüleri yakalamak için ışık kaynağını ve kamerayı hizalayın.
    2. Uygulama için %0,3 -%0,4 agaroz jel ile karıştırılmış 0,65 M Tartrazin hidrojel solüsyonu kullanın (adım 1.2).
    3. Solüsyonu bir damlalık kullanarak cilde (deneyin doğasına bağlı olarak göbek veya baş) uygulayın ve emilimi başlatmak için birkaç saniye bekletin (Şekil 3A).
    4. Boya çözeltisinin eşit dağılımı için pamuklu çubuk kullanarak alanı nazikçe ovalayın ve dermal emilimi kolaylaştırın.
    5. Bölgeye temiz bir pamuklu çubukla nazikçe masaj yapın ve cilt şeffaflık göstermeye başlayana ve iç organlar görünmeye başlayana kadar daha fazla solüsyon uygulayın. Emilim sırasında, cilt ilk önce yavaş yavaş tek tip bir renge dönüşen turuncu-kırmızı noktaların görünümünü gösterecektir. Bu renk değişimi, yeterli boya penetrasyonunun ve optik temizlemenin başlangıcının önemli bir görsel göstergesidir.
      DİKKAT: Solüsyonun uygulama alanı üzerinde kristalleşmediğinden emin olun - kristalleşme cilt geçişlerini tıkayarak boya moleküllerinin ciltte emilimini engelleyebilir, bu da şeffaflık elde etmek için son derece önemlidir. Boya moleküllerinin yeterli emilimi cildin rengini turuncu-kırmızıya çevirir.
    6. Cilt şeffaflık göstermeye başlayana ve iç organlar görünür hale gelene kadar bölgeye nazikçe masaj yapmaya devam edin. Bu işlem tipik olarak küçük bir alan için yaklaşık 3-5 dakika masaj gerektirir, ancak süre hayvan boyutuna ve deri kalınlığına bağlı olarak değişebilir.
    7. Hizalanmış kamerayı kullanarak görüntü yakalayın. Görüntü kalitesini optimize etmek için odağı, pozlamayı ve beyaz dengesini ayarlayın.
    8. Daha kaliteli görüntüler için parlamayı en aza indirmek ve yansımayı azaltmak için cildinize nazikçe bir cam slayt veya örtü yerleştirin.
      DİKKAT: Tüm kimyasal solüsyonları uygun kişisel koruyucu ekipmanla (laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması) kullanın ve kullanılmış malzemeleri kurumun kimyasal atık imha protokollerine uygun olarak atın.

4. Görüntü işleme ile organ görünürlüğünün artırılması

  1. Görüntü işleme adımları
    1. Görüntü işleme için OpenCV ile Python kullanılır. OpenCV, numpy, matplotlib ve PyWavelets'i içe aktarın.
    2. Orijinal Görüntüyü Yükleyin ve Normalleştirin . Orijinal yüksek bit derinliğine sahip .tif görüntüsünü yükleyin. Herhangi bir piksel değeri 255'i aşarsa, tüm pikselleri [0, 255] aralığına normalleştirin.
    3. İlgilenilen bölgeyi (ROI) kırpın. Organ alanının etrafına bir sınırlayıcı kutu çizmek için OpenCV'nin ROI seçicisini çağırın. Sonraki tüm adımlar için yalnızca kırpılmış sürümü kullanarak devam edin.
      NOT: Sınırlayıcı kutunun, ilgili yapıları kesmeden hedef alanı sıkıca çevrelediğinden emin olun.
    4. LAB Kanallarına bölün. Kırpılan renkli görüntüyü LAB renk uzayına dönüştürün ve L (açıklık), A ve B kanallarına bölün.
      NOT: Görüntüler renkli olarak işlenmektedir, bu nedenle laboratuvar renk uzayı, görüntü işleme teknikleri yalnızca piksel yoğunluklarının bulunduğu L kanalına uygulanarak kullanılmıştır.
    5. Piksel yoğunluğu dağılımını analiz edin. Kontrast ve yoğunluk yayılımını değerlendirmek için L kanalının histogramını çizin.
      NOT: Kontrast geliştirmenin gerekli olup olmadığını doğrulamak ve kontrast iyileştirme için parametre seçimine rehberlik etmek için histogramı kullanın. Histogramınızın [0, 255] boyunca yayılmasını istiyorsunuz.
    6. Yerel kontrast geliştirme için CLAHE (Kontrast Sınırlı Uyarlanabilir Histogram Eşitleme) uygulayın. clipLimit = 5.0 ve tileGridSize = (16,16) ile bir CLAHE nesnesi oluşturun. L kanalında CLAHE'yi yürütün ve CLAHE ile geliştirilmiş L kanalını orijinal A ve B kanallarıyla birleştirin. Gerekirse görselleştirme için CLAHE'yi LAB'den RGB'ye dönüştürün.
      NOT: Histogram aşırı yükseltilmiş parazit (ani yükselmeler) gösteriyorsa, dengeli yerel kontrast elde etmek için 'clipLimit' veya 'tileGridSize' öğesini ayarlayın ve yeniden uygulayın.
    7. Kontrastı artırılmış görüntünün gürültüsünü giderin. Normalleştirilmiş CLAHE L kanalında (ölçeklendirilmiş [0, 1]) 0,1'lik yumuşak bir eşikle 2 seviyeli ayrı bir dalgacık ayrışması gerçekleştirin. Gürültüsü giderilmiş L kanalını yeniden oluşturun, [0, 255]'e geri ölçeklendirin ve gürültüsü giderilmiş L kanalını orijinal A ve B kanallarıyla birleştirin. Orijinal kırpılmış renkli görüntüyü, dalgacık gürültüsünden arındırılmış sonuçla karşılaştırın.
      NOT: Dalgacık gürültü giderme, tekdüze bölgelerde ön plan olarak yanlış yorumlanabilecek küçük dalgalanmaları azaltır.
    8. Otsu'nun Uyarlanabilir Eşiklemesi ile ilgi alanlarını segmentlere ayırın. Gürültüden arındırılmış L kanalında Otsu'nun eşiğini hesaplayın. Düşük yoğunluklu organ bölgelerini dahil etmek için eşikten 15'lik bir sapma çıkarın.
      1. Organ piksellerinin bir maskesini elde etmek için önyargı değeriyle bir ikili eşik uygulayın. Maskeyi orijinal A ve B kanallarıyla birleştirin ve görüntülemek için RGB'ye dönüştürün.
        NOT: Önyargı ayarı, damarların altındaki organ bölgelerinin dahil edilmesini zorlar. Gerekirse farklı bir veri kümesi için önyargıyı yeniden ayarlayın.
    9. Analize istediğiniz gibi devam edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ex vivo tavuk göğsü dokusunda optik şeffaflığın gösterilmesi
Ex vivo doku yoluyla ışık yayılımını araştırmak için, 1.5 mm, 2.5 mm ve 3.5 mm kalınlığında dilimlenmiş çiğ kemiksiz tavuk göğsü parçaları kullandık (Şekil 2B). Dokular kollajen liflerine paralel olarak kesilerek tutarlı kas lifi oryantasyonu sağlandı. Görüntüler, farklı çözelti konsantrasyonları ile muameleden önce ve sonra do...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, emici moleküller, özellikle FDA onaylı gıda boyası Tartrazin (tıbbi uygulamalarda değil, gıda ürünlerinde kullanım için onaylanmıştır) kullanan biyolojik dokularda optik şeffaflık elde etmek için kapsamlı ve tekrarlanabilir bir protokol yöntemi sunmaktadır. Bu yöntem, dokunun mikro ortamındaki kırılma indisini değiştirerek dokudaki içsel saçılmayı etkili bir şekilde en aza indirir ve bu da optik şeffaflığı artırır. Bu çalışma, bu yöntemin etkinliğini hem ex vivo hem ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

ZO, Dallas'taki Texas Üniversitesi'nden destek aldığını kabul eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Analitik TeraziHZKFA220'LER
Hayvan anestezi MakinesiRWD yaşam bilimleri şirketiTAIJI-IEİnhalasyon Anestezikleri
Atipamezol HCL enjeksiyonu 5 mg/mLCovertus82124Enjekte edilebilir anestezi
CMOS kameraThor laboratuvarlarıCS165CU/M, Zelux
Deksmedetomidin HCL enjeksiyonu 5 mg/10 mLCovertus72960Enjekte edilebilir anestezi
Fiber Işık AydınlatıcıRWD yaşam bilimleri şirketi76301Üstten aydınlatma için ışık kaynağı
Cam kaydıraklarCravitySci0303-2122Süper dereceli mikroskop slaytları
Homeotermik BattaniyeRWD yaşam bilimleri şirketi69027Hayvan sıcaklık kontrolörü
Görüntü İşlemeAçık CVPitonYazılım
İnsülin Şırıngası 0,5 mL 29 GKonfor noktası26028Enjekte edilebilir anestezi
İzofluranCovertusSKU 029405İnhalasyon Anestezikleri
Ketmin HCL enjeksiyonu 100 mg/mLDechra Hakkında20042240Enjekte edilebilir anestezi
LED ışık kaynağıGGE şirketiTLB-01Üstten aydınlatma için ışık kaynağı
MercekThor laboratuvarlarıMVL4WA3,5 mm odak uzaklığı ve f/1,4 diyafram açıklığı
NairKilise & DwightL 1224Tüy dökücü krem
PBS ph 7,4 (1x)Gibco2902869Enjekte edilebilir anestezi
Q-İpucuPüriten tıbbi ürünler şirketi806-WC Hastanesi
Deniz Plakası AgarozLonza50101Kimyasal
TartrazinMilliporeSigmaCAS numarası: 1934-21-0Kimyasal
Transfer pipetiBalıkçı markası13-711-9AMMD
UV-VIS-NIR SpektrofotometreŞimadzuKatı Özellikleri-3700iEnstrüman
ŞişeQorpak242633
Hacimsel pipetlerEppendorf araştırma artı3123000063100-1000&mikro; L
Su Arıtma SistemiAvidity bilimiSOLO SEnstrüman

Kaynaklar

  1. Yun, S. H., Kwok, S. J. J. Light in diagnosis, therapy and surgery. Nat Biomed Eng. 1 (1), 0008(2017).
  2. Tuchin, V. V. Optical clearing of tissues and blood. , SPIE Publications. (2005).
  3. Ertürk, A. Deep 3D histology powered by tissue clearing, omics and AI. Nat Methods. 21 (7), 1153-1165 (2024).
  4. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  5. Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In vivo and ex vivo optical clearing methods for biological tissues: Review. Biomed Opt Express. 10 (10), 5251-5267 (2019).
  6. Genina, E. A. Tissue optical clearing: State of the art and prospects. Diagnostics. 12 (7), 1534(2022).
  7. Miller, D. A., et al. Enhanced penetration depth in optical coherence tomography and photoacoustic microscopy in vivo enabled by absorbing dye molecules. Optica. 12 (1), 24-30 (2025).
  8. Jia, C., et al. Tartrazine-enabled optical clearing for in vivo optical resolution photoacoustic microscopy. Biomed Opt Express. 16 (6), 2504-2515 (2025).
  9. Zuo, T., Tao, C., Liu, X. Absorbing molecules as optical clearing agents improve the resolution and sensitivity of photoacoustic microscopy. Opt Lett. 50 (7), 2282-2285 (2025).
  10. Narawane, A., et al. Optical clearing with Tartrazine enables deep transscleral imaging with optical coherence tomography. J Biomed Photonics Eng. 29 (12), 120501(2024).
  11. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21 (2), 61-79 (2020).
  12. Mai, H., et al. Whole-body cellular mapping in mouse using standard IgG antibodies. Nat Biotechnol. 42, 617-627 (2024).
  13. Ou, Z., et al. Achieving optical transparency in live animals with absorbing molecules. Science. 385 (6713), eadm6869(2024).
  14. Sai, T., Saba, M., Dufresne, E. R., Steiner, U., Wilts, B. D. Designing refractive index fluids using the Kramers-Kronig relations. Faraday Discuss. 223, 136-144 (2020).
  15. Yu, T., Zhu, D. Strongly absorbing molecules make tissue transparent: A new insight for understanding tissue optical clearing. Light Sci Appl. 14 (1), 10(2025).
  16. Drexler, W., et al. Optical coherence tomography: Technology and applications. Drexler, W., Fujimoto, J. G. , Springer International Publishing. Cham. 277-318 (2015).
  17. Wang, F., Zhou, C. Transparent mice': Deep-tissue live imaging using food dyes. Commun Biol. 7 (1), 1307(2024).
  18. Yu, H., Liu, J. -B., Ma, Y. -S., Fu, D. Transparent live mice offer more possibilities for biomedical research. Innov Med. 2 (4), 100098(2024).
  19. Shabbir, M. W., Biswas, S., Kajla, R., Nadella, S., Ou, Z. Designing refractive index fluids of food dye for light propagation through scattering media. MRS Commun. , (2025).
  20. Scheele, C. L. G. J., et al. Multiphoton intravital microscopy of rodents. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 89(2022).
  21. Schmidt, E. L., et al. Near-infrared II fluorescence imaging. Nat Rev Methods Primers. 4 (1), 23(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ex Vivo G r nt lemeDoku Saydamla t rmaTartrazin BoyasI k Sa lmasK r lma ndeksiBiyomedikal G r nt lemeOptik Ge irgenlik

İlgili makaleler