Yöntem makalesi

Farede Optimize Edilmiş Minimal İnvaziv Transskleral Subretinal Enjeksiyon Tekniği

DOI:

10.3791/68631

⸱

25 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Duke University School of Medicine, 2Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Subretinal enjeksiyonlar, fotoreseptör ve RPE hastalıkları için terapötiklerin klinik öncesi gelişimi için vazgeçilmez bir tekniktir. Farelerde intraoperatif başarı oranlarını artıran ve retina hasarını en aza indiren optimize edilmiş bir transskleral subretinal enjeksiyon tekniğini tanımladık.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Faredeki subretinal boşluğa geleneksel materyal verme yöntemi, nöral retinanın ikili perforasyonunu içerir ve bu da geniş cerrahi hasara neden olur. Bu, elektroretinogram (ERG) kayıtları veya davranışsal görme tahlilleri gibi görsel fonksiyonun sonraki sonuç ölçümlerinde değişkenliğe yol açar ve bu da deneysel terapötiklerin etkinlik değerlendirmelerini karıştırır. Bu engellerin üstesinden gelmek için, farelerde transskleral minimal invaziv subretinal enjeksiyon tekniğini optimize ettik. Bu teknikte, konjonktival peritomi ve tenotomi yapmak için özel yapım bir tungsten tel göz kapağı spekulumu kullanılarak superior fornikse erişilir. Retinaya nüfuz etmeden elmas bir bıçak kullanılarak nokta atışı bir sklerotomi yapılır ve içinden ince bir cam iğne sığ bir açıyla dikkatlice yerleştirilir. Yük, bir mikroenjeksiyon pompası kullanılarak subretinal boşluğa iletilir. Optik koherens tomografi (OKT), enjeksiyondan hemen sonra subretinal blebin boyutunu ve konumunu değerlendirmek için kullanılır. Bu tekniğin sonuçlarını, 33G iğne sklerotomi ile yaylı bir şırınga kullanılarak gerçekleştirilen geleneksel transretinal yöntemle karşılaştırdık. ERG kayıtları, transskleral olarak enjekte edilen farelerde, enjekte edilmemiş kontrol farelerininkiyle karşılaştırılabilir şekilde retina fonksiyonunun mükemmel bir şekilde korunduğunu göstermiştir. Buna karşılık, geleneksel olarak enjekte edilen kohortlarda kayda değer bir ERG sinyal azalması gözlendi. Özetle, farelerde subretinal enjeksiyon için minimal invaziv bir tekniği optimize ettik. Bu tekniğin, retinadaki anatomik hasarı en aza indiren ve retina fonksiyonu üzerinde minimum etkiye sahip olan gen terapisi uygulaması için sağlam ve etkili bir yöntem olduğunu gösterdik. Bu yöntem, çok çeşitli retina ve makula hastalıklarını tedavi etmek için hem retina pigmentli epiteli hem de fotoreseptörleri hedef alan tedavilerin geliştirilmesi için eşiği düşürür.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Subretinal enjeksiyon, materyalin retina ile retina pigmentli epitel (RPE) arasındaki potansiyel boşluğa verildiği oküler bir cerrahi prosedürdür. İntravitreal veya suprakoroidal enjeksiyonlar gibi arka segmente diğer ilaç verme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, subretinal enjeksiyonlar hem fotoreseptörlere hem de RPE'ye en hızlı erişimi sağlar. Viral gen terapisi partiküllerinin verilmesi için, subretinal enjeksiyon, daha düşük viral titrelere ve daha düşük viral toksisite riskine izin veren çok daha yüksek fotoreseptör ve RPE transdüksiyon oranlarına ulaşır1. Ek olarak, subretinal boşluk anatomik olarak sınırlıdır, bu da viral partiküllerin sistemik yayılmasını sınırlar ve bağışıklık tepkileri riskini azaltır2. İnsanlarda, subretinal enjeksiyonların güvenlik profili çok olumludur, retina yapısı ve fonksiyonu enjeksiyondan sonraki 1 ay içinde başlangıç seviyelerine geri döner 3,4. Subretinal enjeksiyonlar, kök hücre nakli ve küçük moleküllü ilaç dağıtımı2 gibi bir dizi uygulamada kullanılmaktadır ve en yaygın kullanımları retina hastalıklarının gen tedavisi tedavileri için viral vektörlerin verilmesidir. Nispeten düşük viral titreler, minimal sistemik maruziyet ve subretinal enjeksiyonlarla ilişkili yüksek transdüksiyon oranı ve özgüllüğü, onları retina alanında vazgeçilmez bir teknik haline getirmiştir. Subretinal enjeksiyonlar, retinitis pigmentosa ve Leber konjenital amaurozis 5,6 dahil olmak üzere kalıtsal retina bozukluklarının tedavisinde hastalarda başarıyla kullanılmaktadır.

Alan için önemi göz önüne alındığında, farelerde subretinal enjeksiyonlar gerçekleştirme yeteneği, kalıtsal retina hastalıkları için tedavileri araştıran klinik öncesi çalışmalar için çok önemlidir. Bununla birlikte, fare subretinal enjeksiyonları için mevcut yöntemler yüksek başarısızlık oranlarına sahiptir ve sıklıkla retinada cerrahi hasara neden olur, bu da fonksiyonel sonuç ölçümlerinin güvenilirliğini ve tutarlılığını sınırlayabilir. Geleneksel olarak, kemirgenlerde subretinal enjeksiyonlar, iğne ön retinaya nüfuz edecek, lensin yanından geçecek ve retinanın ikinci bir penetrasyonunun bir sonucu olarak subretinal boşluğa girecek şekilde transretinal olarak gerçekleştirilir 7,8 (Şekil 1A). Gerçekleştirilmesi nispeten kolay olsa da, bu prosedür, cerrahi hasarın değişken kapsamı nedeniyle deneysel sonuçlarda belirgin bir tutarsızlık ortaya çıkarmaktadır. Bu, özellikle davranışsal ve fonksiyonel görme sonuç ölçütlerini kullanan çalışmalar için sınırlayıcıdır. Ek olarak, kristal mercek, farelerde insanlara kıyasla orantısız bir şekilde büyüktür; Bu, transretinal enjeksiyon sırasında lense zarar verme riskini önemli ölçüde artırır ve hayvanı fonksiyonel görme değerlendirmeleri için kullanılamaz hale getirir4.

Alternatif bir seçenek, iğnenin sklera, koroid, Bruch membranı ve RPE4,9'a nüfuz ettiği posterior bir yaklaşım kullanarak subretinal boşluğa erişerek bu sorunları önleyen transskleral enjeksiyon yoludur (Şekil 1B). Bu yaklaşım, retina penetrasyonunu tamamen önleyerek retina hasarını en aza indirir. Aynı zamanda, daha tutarlı sonuçlara ve daha küçük deneysel kohortlara izin veren subretinal boşluktan10 enjekte edilen materyalin azalmış geri akışı ile ilişkilidir. Farelerde transskleral subretinal enjeksiyon tekniği literatürde daha önce tanımlanmış olmasına rağmen, yaygın olarak benimsenmesi, başarı oranını engelleyebilecek teknik zorluğu nedeniyle sınırlı kalmaktadır4. Burada, transskleral enjeksiyon prosedüründe, gerçekleştirmeyi daha kolay ve daha hızlı hale getiren, deneysel değişkenliği azaltan ve enjeksiyon başarı oranlarını iyileştiren çeşitli iyileştirmeleri açıklıyoruz. Bu iyileştirmeler arasında bir fare göz kapağı spekulumunun geliştirilmesi, ameliyat öncesi atropin uygulaması, bir elmas bıçak kullanılarak nokta atışı bir sklerotomi oluşturulması ve iğne boyutunun ve enjeksiyon yaklaşımının optimizasyonu yer almaktadır. Bu teknik, ERG tarafından tespit edilebilen herhangi bir cerrahi etkiye neden olmadan fotoreseptörlerin ve RPE'nin mükemmel viral transdüksiyon kapsamını sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler, Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Görme ve Görme Araştırmaları Derneği Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Bildirisi'ne uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Hayvan hazırlama

  1. Subretinal enjeksiyonu gerçekleştirmeden 30 dakika önce 1 mg / kg atropin (toplam 50 μL hacimde) intraperitoneal enjeksiyon uygulayın. Bu adım, enjeksiyon sırasında geçici göz içi basıncının yükselmesi ile tetiklenen potansiyel olarak ölümcül okülokardiyak ve okülorespiratuar refleksleri önleyerek başarı oranlarını büyük ölçüde artırır11,12.
    NOT: Atropin dozajımız C57BL / 6 fareler için optimize edilmiştir ve diğer fare suşları için ayarlanması gerekebilir. Atropin dozunda kayda değer bir cinsiyet veya yaş farkı gözlemlemedik.
  2. Tüm prosedür boyunca, hayvan konforunu en üst düzeye çıkarmak ve soğuk katarakt gelişimini azaltmak için fareyi sıcak bir yüzeyde tutun.
  3. Oksijende (2 L / dak) %2 inhale izofluran kullanarak, yaslanma gözlenene ve hayvan artık ayak parmağını sıkıştırmaya yanıt vermeyene kadar fareyi uyuşturun. Topikal anestezi için göze %0.5 proparakain damlatın.
  4. OCT ile subretinal blebin postoperatif görüntülemesi için göz bebeğini genişletmek için% 0.2 siklopentolat ve% 1 fenilefrin karışımından bir damla uygulayın. Fenilefrin ayrıca yüzeysel kan damarlarını daraltarak intraoperatif kanamayı azaltmaya hizmet eder13.

2. Sklerotomi

  1. Prosedüre başlamadan önce, enjekte edilecek istenen hacimde çözelti içeren bir cam mikro iğne yükleyin. Kılcal hareketi önlemek için dengeleme basıncı 5 hektopaskal (hPa) olarak ayarlanmış şekilde iğneyi mikroenjektöre takın. Subretinal enjeksiyonlar için genellikle 1 μL'lik hacimler kullanırız.
  2. Fareyi diseksiyon stereomikroskobunun altına yerleştirin. 2.3-2.6. adımlar için 20x büyütme ve 2.7-3.5. adımlar için 50x büyütme kullanın.
  3. Genç fareler için, cerrahi bölgeye geniş erişim ve görselleştirme sağlamak için işlemden önce lateral kantotomi yapın.
  4. Özel yapım bir minyatür tel spekulum yardımıyla üstün forniksi ortaya çıkarın (Şekil 1C). Eller serbest üst göz kapağı retraksiyonuna izin vermek için spekulumu hareketsiz hale getirin.
  5. Açılı Vannas makası kullanarak, skleranın üstün 3-4 saat saatini ortaya çıkarmak için superior konjonktiva ve Tenon'un kapsülünde paralimbal bir insizyon (limbusun ~ 1 mm arkasında) yapın. Retroorbital venöz sinüsün delinmesini önlemeye dikkat edin. Amaçlanan enjeksiyon bölgesinin üzerindeki Tenon kapsülünün kalıntılarını dikkatli ama kapsamlı bir şekilde çıkarın.
  6. Konjonktival peritomi ve tenotominin ön kenarını kilitli dişli forseps ile kavrayın ve superior sklerayı ortaya çıkarmak için küreyi nazikçe inferoduct edin. Eller serbest inferodüksiyona izin vermek için kilitli forsepsleri hareketsiz hale getirin.
  7. Çıplak skleranın kurumasını önlemek için göze hemen bir damla dengeli tamponlu salin (BSS) uygulayın. BSS damlacığı tarafından üretilen optik büyütmeyi de yardımcı buluyoruz.
  8. Elmas bir bıçak kullanarak, ~ saat 12 konumunda ve limbustan ~ 1-2 mm uzakta nokta atışı bir sklerotomi yapın. Sklerotominin mümkün olduğunca küçük ve sığ olmasını sağlamak için bıçağı skleraya göre teğet bir düzlemde konumlandırın.
    NOT: Bu iki nedenden dolayı yapılır: (1) küçük bir sklerotomi, cam iğnenin sıkı bir şekilde oturmasına izin verir, böylece enjeksiyon adımı sırasında reflüyü azaltır ve (2) retinaya nüfuz etmekten kaçınmak için sığ bir sklerotomi kritiktir. Sklerotomi bölgesinde az miktarda koroid kanının görülebileceğini ve bunun işlemin sonucu için herhangi bir olumsuz etki anlamına gelmediğini unutmayın.

3. Transskleral subretinal enjeksiyon

  1. Enjeksiyona hazırlanırken, tüm BSS'yi göz yüzeyinden nazikçe çıkarmak için cerrahi bir sünger kullanın.
  2. İğne eğimini skleraya sığ bir açıyla tutun ve subretinal boşluğa erişmek için ucu yavaş ve dikkatli bir şekilde sklerotomiye sokun. Retinaya nüfuz etmekten kaçınmak için, bunu nispeten sığ bir açıyla ve sklerotomi açıklığını 0,5-1 mm temizleyecek kadar derin bir şekilde yapın.
    NOT: Koroidal doğum olasılığını en aza indirmek ve ilerleyen iğne ucu ile retinanın delinme olasılığını azaltmak için iğnenin eğimi aşağı doğru konumlandırılmıştır.
  3. İğneyi sabit bir konumda tutarken, bir ayak pedalı kullanarak 500 hPa'da enjeksiyonu başlatın ve 15 saniye boyunca kesintisiz basıncı koruyun.
  4. Enjeksiyonu bitirmek için, iğne sklerotomiden tamamen çıkana kadar enjeksiyon basıncını koruyun. İğne hala subretinal boşluktayken basınç erken kesilirse, enjekte edilen yükün büyük bir kısmı kılcal hareket ile gözün içine hızlı bir şekilde geri çıkabilir.
  5. İğne geri çekildikten sonra, enjekte edilen çözeltinin sklerotomi bölgesinden kısmi bir geri akışına dikkat edin. 1 μL'lik hacmin yetişkin farelerde bile subretinal boşluğun kapasitesini aştığı göz önüne alındığında bu beklenen bir durumdur. Reflü olmaması, yanlışlıkla koroidal veya intravitreal doğum nedeniyle başarısız bir enjeksiyonu gösterebilir.
  6. Kilitleme forsepslerini ve göz kapağı spekulumunu gözden çıkarın. Enjekte edilen solüsyonun daha fazla geri akışına neden olabileceğinden, küreye baskı uygulamaktan kaçınmaya dikkat edin.
  7. Enjeksiyondan hemen sonra, subretinal bleb'in Ekim14'e kadar görselleştirilmesini sağlamak için göze bol miktarda kayganlaştırıcı göz merhemi sürün.
  8. Göze topikal eritromisin merhem sürün ve hayvana genel ameliyat sonrası bakım sağlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu transskleral teknik kullanılarak yapılan başarılı bir enjeksiyon, enjeksiyon prosedürünü hemen takiben OCT'de gözlenebilen bir subretinal bleb oluşturur (Şekil 2A). Bu tekniğin teknik zorluğu göz önüne alındığında, görüntüleme adımı, başarılı bir şekilde enjekte edilen hayvanları tanımlamak için vazgeçilmezdir. Bu tekniği gen terapisi deneyleri için kullanmayı planlayan araştırmacılar için, bir floresan raportör geni taşıyan adeno-ilişkili virüs (AAV) parçacıkları ile uygulama enjeksiyonl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan teknik, daha önce tarif edilen transskleral enjeksiyon yaklaşımına4 prosedürün güvenilirliğini artıran ve gözdeki cerrahi hasarı daha da azaltan çeşitli iyileştirmeler getirmektedir. Böyle bir gelişme, üst göz kapağını geri çekmek için bir spekulum kullanılmasıdır, bu da göze sabit, engelsiz ve eller serbest erişim sağlar. Ticari spekulumlar, yetişkin fareler için bile genellikle kötü bir şekilde optimize edilmiştir ve gençler için tamamen mevcut ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

John Flannery'ye (Kaliforniya Üniversitesi, Berkeley) bize AAV1-Best1-GFP virüsünü sağladığı için teşekkür ederiz. Alınan finansman: NIH R01 EY031748 (CBR), NIH P30 EY005722 (Duke Üniversitesi'ne); FFB Ücretsiz Aile AMD Ödülü (CBR); Körlüğü Önleme Araştırmalarından (Duke Göz Merkezi) sınırsız hibe; FFB Translasyonel Araştırma Hızlandırma Programı TA-GT-0424-0875-DUKE-TRAP (VA), NIH K08 EY033857 (OA); Duke Üniversitesi Doktor-Bilim İnsanı Güçlü Başlangıç Ödülü (OA).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0,9 Sodyum Klorür Enjeksiyonu, USPHospiraPAA130066
%1 Atropin Sülfat Oftalmik Solüsyon, USPAkornNDC 17478-215-05
30&derece; elmas bıçakKatena HakkındaK2-6560 Serisi
AmScope 6W LED çift boynu aydınlatıcıKapsamLED-11CR
Açılı Vannas makasıRobozRS-5618 Serisi
BSS Steril Sulama SolüsyonuAlcon289010-0902
Cyclomydril genişletici göz damlasıAlcon0065-0359-02%0,2 siklopentolat, %1 fenilefrin
epT.I.P.S. MicroloaderTM pipet uçlarıEppendorf Belediyesi5242 956.003
FemtoJet 4i Mikro EnjektörEppendorf BelediyesiE5252000021Üretimi durdurulan ürün
GenTeal Tears kayganlaştırıcı göz merhemiAlcon16027802
Cam mikroenjeksiyon iğneleriClunbury BilimselB100-58-5030&derece; Eğim. Çap: 50 &mikro; m dış, 29 &mikro; m iç
İzofluran çözeltisiKoyu Renkli29405
Görüntü kılavuzluğunda OCT'li MICRON IV retina görüntüleme mikroskobuAnkaYOK
Stereomikroskop SteREO Discovery.V8Zeiss495015-0001-000
Stern-Castroviejo kilitleme dişli forsepsKatena HakkındaK5-2552 Serisi
Dişli forsepsRobozRS-5172 Serisi
23s gauge iğneler için tungsten temizleme telleriHamilton18306
Ultracell PVA Göz MızraklarıBVI Tıbbi40400-8
Ultra-Fine2015 insülin şırıngaları BD3284383/10 mL, 8 mm (5/16 inç), 31 G

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trapani, I., Banfi, S., Simonelli, F., Surace, E. M., Auricchio, A. Gene therapy of inherited retinal degenerations: prospects and challenges. Hum Gene Ther. 26, 193-200 (2015).
  2. Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Res. 58, 217-226 (2017).
  3. Simunovic, M. P., Xue, K., Jolly, J. K., MacLaren, R. E. Structural and Functional Recovery Following Limited Iatrogenic Macular Detachment for Retinal Gene Therapy. JAMA Ophthalmol. 135, 234-241 (2017).
  4. Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. J Vis Exp. (118), e54808(2016).
  5. Testa, F., et al. Three-year follow-up after unilateral subretinal delivery of adeno-associated virus in patients with Leber congenital Amaurosis type 2. Ophthalmology. 120, 1283-1291 (2013).
  6. Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Hum Genet. 135, 327-343 (2016).
  7. Bennett, J., Anand, V., Acland, G. M., Maguire, A. M. Cross-species comparison of in vivo reporter gene expression after recombinant adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Methods Enzymol. 316, 777-789 (2000).
  8. Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).
  9. Hejri, A., et al. A non-surgical method for subretinal delivery by trans-scleral microneedle injection. Bioeng Transl Med. 10 (3), e10755(2025).
  10. Sastry, A., et al. Microscope-Integrated OCT-Guided Volumetric Measurements of Subretinal Blebs Created by a Suprachoroidal Approach. Transl Vis Sci Technol. 10, 24(2021).
  11. Blanc, V. F., Jacob, J. L., Milot, J., Cyrenne, L. The oculorespiratory reflex revisited. Can J Anaesth. 35, 468-472 (1988).
  12. Dewar, K. M. The oculocardiac reflex. Proc R Soc Med. 69, 373-374 (1976).
  13. Katzung, B. G. Basic & clinical pharmacology. , 9th ed, Lange Medical Books/McGraw Hill. New York, USA. (2004).
  14. Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. K., Chen, H. Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy. J Vis Exp. (179), e63421(2022).
  15. L'Abbate, D., Prescott, K., Geraghty, B., Kearns, V. R., Steel, D. H. W. Biomechanical considerations for optimising subretinal injections. Surv Ophthalmol. 69, 722-732 (2024).
  16. Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nat Protoc. 17, 1468-1485 (2022).
  17. Stockslager, M. A., et al. Optical method for automated measurement of glass micropipette tip geometry. Precis Eng. 46, 88-95 (2016).
  18. Li, Q., Rycaj, K., Chen, X., Tang, D. G. Cancer stem cells and cell size: A causal link. Semin Cancer Biol. 35, 191-199 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Transskleral EnjeksiyonMinimal nvaziv TeknikFare RetinaRetinal Gen TedavisiFotoresept r HedeflemeRetinal Pigment EpiteliOptik Koherens TomografiElektroretinogram KaydAAV Transd ksiyonu

İlgili makaleler