Subretinal enjeksiyonlar, fotoreseptör ve RPE hastalıkları için terapötiklerin klinik öncesi gelişimi için vazgeçilmez bir tekniktir. Farelerde intraoperatif başarı oranlarını artıran ve retina hasarını en aza indiren optimize edilmiş bir transskleral subretinal enjeksiyon tekniğini tanımladık.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farede Optimize Edilmiş Minimal İnvaziv Transskleral Subretinal Enjeksiyon Tekniği
Bu makalede
Özet
Özet
Faredeki subretinal boşluğa geleneksel materyal verme yöntemi, nöral retinanın ikili perforasyonunu içerir ve bu da geniş cerrahi hasara neden olur. Bu, elektroretinogram (ERG) kayıtları veya davranışsal görme tahlilleri gibi görsel fonksiyonun sonraki sonuç ölçümlerinde değişkenliğe yol açar ve bu da deneysel terapötiklerin etkinlik değerlendirmelerini karıştırır. Bu engellerin üstesinden gelmek için, farelerde transskleral minimal invaziv subretinal enjeksiyon tekniğini optimize ettik. Bu teknikte, konjonktival peritomi ve tenotomi yapmak için özel yapım bir tungsten tel göz kapağı spekulumu kullanılarak superior fornikse erişilir. Retinaya nüfuz etmeden elmas bir bıçak kullanılarak nokta atışı bir sklerotomi yapılır ve içinden ince bir cam iğne sığ bir açıyla dikkatlice yerleştirilir. Yük, bir mikroenjeksiyon pompası kullanılarak subretinal boşluğa iletilir. Optik koherens tomografi (OKT), enjeksiyondan hemen sonra subretinal blebin boyutunu ve konumunu değerlendirmek için kullanılır. Bu tekniğin sonuçlarını, 33G iğne sklerotomi ile yaylı bir şırınga kullanılarak gerçekleştirilen geleneksel transretinal yöntemle karşılaştırdık. ERG kayıtları, transskleral olarak enjekte edilen farelerde, enjekte edilmemiş kontrol farelerininkiyle karşılaştırılabilir şekilde retina fonksiyonunun mükemmel bir şekilde korunduğunu göstermiştir. Buna karşılık, geleneksel olarak enjekte edilen kohortlarda kayda değer bir ERG sinyal azalması gözlendi. Özetle, farelerde subretinal enjeksiyon için minimal invaziv bir tekniği optimize ettik. Bu tekniğin, retinadaki anatomik hasarı en aza indiren ve retina fonksiyonu üzerinde minimum etkiye sahip olan gen terapisi uygulaması için sağlam ve etkili bir yöntem olduğunu gösterdik. Bu yöntem, çok çeşitli retina ve makula hastalıklarını tedavi etmek için hem retina pigmentli epiteli hem de fotoreseptörleri hedef alan tedavilerin geliştirilmesi için eşiği düşürür.
Giriş
Subretinal enjeksiyon, materyalin retina ile retina pigmentli epitel (RPE) arasındaki potansiyel boşluğa verildiği oküler bir cerrahi prosedürdür. İntravitreal veya suprakoroidal enjeksiyonlar gibi arka segmente diğer ilaç verme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, subretinal enjeksiyonlar hem fotoreseptörlere hem de RPE'ye en hızlı erişimi sağlar. Viral gen terapisi partiküllerinin verilmesi için, subretinal enjeksiyon, daha düşük viral titrelere ve daha düşük viral toksisite riskine izin veren çok daha yüksek fotoreseptör ve RPE transdüksiyon oranlarına ulaşır1. Ek olarak, subretinal boşluk anatomik olarak sın....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm deneyler, Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Görme ve Görme Araştırmaları Derneği Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Bildirisi'ne uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Hayvan hazırlama
- Subretinal enjeksiyonu gerçekleştirmeden 30 dakika önce 1 mg / kg atropin (toplam 50 μL hacimde) intraperitoneal enjeksiyon uygulayın. Bu adım, enjeksiyon sırasında geçici göz içi basıncının yükselmesi ile tetiklenen potansiyel olarak ölümcül okülokardiyak ve okülorespiratuar refleksleri önleyerek başarı oranlarını büyü....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu transskleral teknik kullanılarak yapılan başarılı bir enjeksiyon, enjeksiyon prosedürünü hemen takiben OCT'de gözlenebilen bir subretinal bleb oluşturur (Şekil 2A). Bu tekniğin teknik zorluğu göz önüne alındığında, görüntüleme adımı, başarılı bir şekilde enjekte edilen hayvanları tanımlamak için vazgeçilmezdir. Bu tekniği gen terapisi deneyleri için kullanmayı planlayan araştırmacılar için, bir floresan raportör geni taşıyan adeno-ilişkili virüs (AAV) parçacıkları ile uygulama enjeksiyonl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan teknik, daha önce tarif edilen transskleral enjeksiyon yaklaşımına4 prosedürün güvenilirliğini artıran ve gözdeki cerrahi hasarı daha da azaltan çeşitli iyileştirmeler getirmektedir. Böyle bir gelişme, üst göz kapağını geri çekmek için bir spekulum kullanılmasıdır, bu da göze sabit, engelsiz ve eller serbest erişim sağlar. Ticari spekulumlar, yetişkin fareler için bile genellikle kötü bir şekilde optimize edilmiştir ve gençler için tamamen mevcut .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
John Flannery'ye (Kaliforniya Üniversitesi, Berkeley) bize AAV1-Best1-GFP virüsünü sağladığı için teşekkür ederiz. Alınan finansman: NIH R01 EY031748 (CBR), NIH P30 EY005722 (Duke Üniversitesi'ne); FFB Ücretsiz Aile AMD Ödülü (CBR); Körlüğü Önleme Araştırmalarından (Duke Göz Merkezi) sınırsız hibe; FFB Translasyonel Araştırma Hızlandırma Programı TA-GT-0424-0875-DUKE-TRAP (VA), NIH K08 EY033857 (OA); Duke Üniversitesi Doktor-Bilim İnsanı Güçlü Başlangıç Ödülü (OA).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| %0,9 Sodyum Klorür Enjeksiyonu, USP | Hospira | PAA130066 | |
| %1 Atropin Sülfat Oftalmik Solüsyon, USP | Akorn | NDC 17478-215-05 | |
| 30&derece; elmas bıçak | Katena Hakkında | K2-6560 Serisi | |
| AmScope 6W LED çift boynu aydınlatıcı | Kapsam | LED-11CR | |
| Açılı Vannas makası | Roboz | RS-5618 Serisi | |
| BSS Steril Sulama Solüsyonu | Alcon | 289010-0902 | |
| Cyclomydril genişletici göz damlası | Alcon | 0065-0359-02 | %0,2 siklopentolat, %1 fenilefrin |
| epT.I.P.S. MicroloaderTM pipet uçları | Eppendorf Belediyesi | 5242 956.003 | |
| FemtoJet 4i Mikro Enjektör | Eppendorf Belediyesi | E5252000021 | Üretimi durdurulan ürün |
| GenTeal Tears kayganlaştırıcı göz merhemi | Alcon | 16027802 | |
| Cam mikroenjeksiyon iğneleri | Clunbury Bilimsel | B100-58-50 | 30&derece; Eğim. Çap: 50 &mikro; m dış, 29 &mikro; m iç |
| İzofluran çözeltisi | Koyu Renkli | 29405 | |
| Görüntü kılavuzluğunda OCT'li MICRON IV retina görüntüleme mikroskobu | Anka | YOK | |
| Stereomikroskop SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Stern-Castroviejo kilitleme dişli forseps | Katena Hakkında | K5-2552 Serisi | |
| Dişli forseps | Roboz | RS-5172 Serisi | |
| 23s gauge iğneler için tungsten temizleme telleri | Hamilton | 18306 | |
| Ultracell PVA Göz Mızrakları | BVI Tıbbi | 40400-8 | |
| Ultra-Fine2015 insülin şırıngaları | BD | 328438 | 3/10 mL, 8 mm (5/16 inç), 31 G |
Kaynaklar
- Trapani, I., Banfi, S., Simonelli, F., Surace, E. M., Auricchio, A. Gene therapy of inherited retinal degenerations: prospects and challenges. Hum Gene Ther. 26, 193-200 (2015).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
