Method Article

Eş Zamanlı Etiketsiz Otofloresan Çoklu Harmonik Mikroskopi

DOI:

10.3791/68637

⸱

August 29th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Bioengineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 4NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics, University of Illinois Urbana-Champaign

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, lazer ışık kaynağının nasıl oluşturulacağı, bir doku örneğinin nasıl hazırlanacağı, görüntüleme yapılacağı ve verilerin nasıl analiz edileceğine ilişkin ayrıntılar da dahil olmak üzere Eşzamanlı Etiketsiz Otofloresan Çoklu Harmonik (SLAM) mikroskobik teknik için adım adım bir kılavuz sunar. SLAM, doku mikro ortamını araştırmak için dört tamamlayıcı etiketsiz kontrastı ölçerek doğrusal olmayan mikroskobu geliştirir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğrusal olmayan optik mikroskopi, ultra kısa lazer darbelerinin endojen moleküllerle doğrusal olmayan etkileşiminden gelen sinyalleri tespit ederek biyolojik numuneleri görüntüler. Bu yöntem, etiketsiz veya etiketsiz ve tahribatsız bir şekilde hücre altı çözünürlükte hızlı kimyasal ve yapısal tanımlamaya izin verir, böylece hücreleri ve dokuları araştırmak için güçlü bir yaklaşım sağlar. Bu ayırt edici doğrusal olmayan kontrastlar, çoklu foton uyarımlı otofloresan ve harmonik üretimi içerir. Bu kontrastların her biri benzersiz avantajlar ve sınırlamalar sunduğundan, bunların kombinasyonu ve uzay-zamansal birlikte kaydı, doğrusal olmayan optik mikroskobun analitik yeteneklerini geliştiren tamamlayıcı bir kontrast paleti sağlar. Bu nedenle grubumuz, biyolojik örneklerdeki farklı morfolojik, metabolik ve fonksiyonel özellikleri tanımlamayı amaçlayan, aynı anda üretilen dört veya daha fazla doğrusal olmayan optik sinyali ölçen bir görüntüleme tekniği olan Eşzamanlı Etiketsiz Otofloresan Çoklu Harmonik (SLAM) mikroskobu geliştirdi. Burada, lazer kaynağı, darbe sıkıştırma ve mikroskop dahil olmak üzere tekniğin temel bileşenlerine odaklanarak dokuların SLAM görüntülemesi için bir protokol sunuyoruz. Ek olarak, numune hazırlamayı tartışıyor ve SLAM verileri için veri işleme hattını özetliyoruz. Sunulan iş akışı, dışsal etiketlere güvenmeden hem insan hem de hayvan dokularının metabolik durumunu, düzenini, hücresel tepkilerini ve bileşimini araştırmak için uygundur.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğrusal olmayan optik mikroskopi, indüklenen polarizasyonun (ve dolayısıyla üretilen sinyalin) doğrusal olmayan bir şekilde olay yoğunluğunabağlı olduğu görüntü kontrastını elde etmek için bir numunenin yoğun optik radyasyona (3 × 103 V/cm'den daha büyük elektrik alanlarına sahip ışık) tepkisinden yararlanır. Bu çoklu kontrastların her birine farklı ışık-madde etkileşimleri aracılık ettiğinden, doğrusal olmayan mikroskopi, bir numunenin 1,2,3'ün hem morfolojisi hem de kimyasal manzarası ile ilgili benzersiz bilgilere eşzamanlı erişim sağlar. Aydınlatma ışığı ile doğrusal bir etkileşimi içeren geleneksel mikroskopi teknikleri de kantitatif görüntülemeyi mümkün kılarken, doğrusal olmayan mikroskopi, genellikle gelişmiş görüntüleme derinliği ve optik kesitlemeye sahip olan daha multimodal bir yaklaşıma izin verirken, aynı zamanda numuneye daha az foto hasara neden olur4. Doku 5,6'nın intraoperatif histoloji benzeri değerlendirmesi gibi biyomedikal uygulamalar bağlamında, bu teknik, doğal biyomoleküllerin doğrudan araştırılmasını sağlayarak, harici belirteçlere veya modifikasyonlara ihtiyaç duymadan canlı hücrelerin sorunsuz bir şekilde araştırılmasını kolaylaştırır. Bu yaklaşım, yalnızca yoğun işçilik gerektirmekle kalmayıp aynı zamanda numunenin doğal biyokimyasını bozma ve hedef hücreleri veya dokuları olumsuz etkileme potansiyeline sahip etiketlerin, etiketlerin7, eksojen moleküllerin, genetik olarak ifade edilen floresan proteinlerin veya nanopartiküllerin kullanımından kaçınır 8,9,10. Bu nedenle, doğrusal olmayan mikroskop, numunenin kimyasal ve yapısal bütünlüğünü değiştirmeden mikroskobik yapıların sürekli görüntülenmesini sağlayan güçlü ve gerçek bir analitik araç olarak hizmet eder. Bu yetenek, teşhis ve ilaç keşfinden hücre sinyalizasyonu ve sistem biyolojisine kadar geniş bir uygulama yelpazesinin önünü açar.

İki fotonlu otofloresan (2PAF), üç fotonlu otofloresan (3PAF), ikinci harmonik nesil (SHG) ve üçüncü harmonik jenerasyon (THG) gibi çoklu foton kontrastlarının her biri, numunelerin karakterize edilmesinde analitik avantajlar sağlar. 2PAF, endojen flavinler tarafından üretilir ve flavin adenozin dinükleotidi (FAD) biyolojik sistemlerde en bol olanıdır11. 3PAF, NAD(P)H gibi içsel kromoforları görselleştirmek için yakın kızılötesi uyarımdan yararlanır ve UV ile ilgili fototoksisite ve zayıflama sorunlarını ortadan kaldırırken metabolik görüntülemeyi mümkün kılar12. SHG, özellikle fibriller kollajen (tip I, II ve III) ve protein dizileri 13,14,15,16,17 gibi sentrosimetrik olmayan moleküler yapıları ortaya çıkararak yapısal içgörüler sağlar 1. Son olarak, arayüzlere ve küçük yapısal özelliklere duyarlı olan THG, lipid dağılımlarını ve hücre dışı veziküllerigörüntülemede mükemmeldir 18,19,20,21,22.

Bu kontrast sinyallerinin her biri araştırma grupları tarafından bağımsız olarak araştırıldı ve biyolojik uygulamalar için güvenilir ve çok yönlü bir araç olarak multifoton doğrusal olmayan mikroskopi için niş oluşturdu 23,24,25,26. Bu çabalara, doku morfolojisi, hücre metabolizması ve hatta Alzheimer hastalığı ve kanser gibi patolojilerin morfofonksiyonel özellikleri hakkında yeni bilgiler edinmek için yenilikçi teknolojilerinden yararlanan 2PAF mikroskobunun mucitleri öncülük etti23. Çalışmaları nihayetinde sinirbilimde çığır açan uygulamaları yönlendirdi27,28. İlerleyen yıllarda, birkaç araştırmacı, SHG'nin, hücrelere yapısal destek sağlayan ve kanser patogenezi sırasında önemli değişikliklere uğrayan yapı iskelesi olan hücre dışı matristeki değişikliklere duyarlılığını vurguladı29. Özellikle, Campagnola ve ark.14,24,30,31, SHG mikroskobunun makromoleküler ve supramoleküler düzeneklerin görselleştirilmesini sağladığını, geleneksel floresan bazlı tekniklerle tespit edilemeyen kollajenin düzenlenmesi, konsantrasyonu ve tipi gibi ayrıntıları ortaya çıkardığını göstermiştir. Bu sonuçlar, SHG mikroskobunun klinik ortamlarda uygulanabilir bir tanı aracı olarak potansiyelinin altını çizdi. Son olarak, THG mikroskobu, kemirgenlerde retina katmanlarını hücre altı çözünürlükte25 görselleştirmek, beyin yapılarınıharitalamak 32 ve melanom hücre istilasının33 çoklu arayüzey topografisini yakalamak için başarıyla uygulandı.

Doğrusal olmayan mikroskobun bu tarihsel uygulamaları genellikle, doğrusal olmayan sinyalleri üretmek ve toplamak için yüksek sayısal açıklık (NA) hedefine bağlanmış mod kilitli bir femtosaniye (fs) lazeri içeriyordu, bunlar daha sonra dikroik bir ayna ile bir bant geçiren filtreye yönlendirildi ve bir fotoçoğaltıcı tüp (PMT) ile toplandı34. Benzer uygulamalara rağmen, çoğu uygulama, diğerlerini gözden kaçırırken yalnızca bir veya en fazla iki karşıtlık elde etmeye odaklandı. Çoklu foton mikroskobunun potansiyelini tam olarak gerçekleştirmek için, Boppart ve ark. önce çoklu doğrusal olmayan kontrastların 21,35,36,37 sıralı edinimini gerçekleştirdi, ardından eşzamanlı tespitlerini gerçekleştirdi 4,22,38,39,40,41 . Eşzamanlı Etiketsiz Otofloresan Çoklu Harmonik (SLAM) mikroskobu olarak bilinen ortaya çıkan teknik, tek atışlı uyarma ve multipleks algılama yoluyla doğrusal olmayan 2PAF, 3PAF, SHG ve THG sinyallerini uzamsal ve zamansal olarak birlikte kaydeder ve böylece üstün analitik güç elde eder. Bu dört kanalın uzay-zamansal birlikte lokalizasyonu, hareket artefaktlarını ortadan kaldırarak ve gelişmiş görüntü kaydı sağlayarak sıralı olarak elde edilen verilere göre avantajlar sunan, yüksek dereceli ve zengin özelliklere sahip veriler42 sağlar. Sonuç olarak, SLAM, metabolik özellikleri 43,44,45 etkili bir şekilde karakterize eden optik indirgeme-oksidasyon oranları gibi kompozit özelliklerin oluşturulmasını sağlar. Ayrıca, modaliteler arasında sinyallerin birleşik analizi, kanalların korelasyonuna ve kolokalizasyonuna dayalı ek özelliklerin mühendisliğini kolaylaştırır. Örneğin, Shi ve ark. farmasötik üretimde kullanılan Çin Hamster Yumurtalık (CHO) hücrelerinin doğru bir şekilde sınıflandırılmasında SLAM mikroskobunun kolokalizasyon özelliklerinin önemini göstermiştir42. Bu şekilde, SLAM, çoklu foton mikroskobunda şu anda en son teknoloji olarak kabul edilen şeyin temelini atmakta ve bu alanda gelecekteki ilerlemelerin önünü açmaktadır46.

Bu protokolde, bir SLAM mikroskobunun temel bileşenlerini özetliyoruz (Şekil 1) ve uygulanması için adım adım bir metodoloji açıklıyoruz. Bu, uyarma darbelerinin oluşturulmasını ve şekillendirilmesini, temsili doku örneği hazırlanmasını, görüntüleme prosedürlerini ve işlemeyi ve ayrıca elde edilen verilerin görüntülenmesini içerir. Kullanıma hazır teknolojiyi ve yerleşik teknikleri kullanarak, bu protokol evrenseldir, aktarılabilir ve farklı laboratuvarlarda benzer optik sistemler kullanılarak kolayca çoğaltılabilir.

figure-introduction-1
Şekil 1: Eşzamanlı etiketsiz otofloresan multiharmonik (SLAM) mikroskobun optik tasarımı. Femtosaniye lazer, 10 MHz'lik bir tekrarlama hızında 370 fs darbelerde 1040 nm ışık verir. Lazerin yoğunluğu ve polarizasyonu, bir süper süreklilik oluşturmak için bir fotonik kristal pompalanmadan önce dikkatlice kontrol edilir. Darbeler daha sonra bir darbe şekillendirici tarafından sıkıştırılır ve özelleştirilmiş bir lazer tarama mikroskobuna (kesikli kutu) yönlendirilir. Dikroik aynalar ve bant geçiren filtreler, fotoçoğaltıcı tüpler (PMT'ler) veya hibrit fotodetektörler (HPD'ler) gibi yüksek hassasiyetli foton dedektörleri tarafından algılanmadan önce numune tarafından üretilen doğrusal olmayan sinyalleri izole eder. Optik tasarım, daha önce açıklanan bir sistemedayanmaktadır 41. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan çalışmaları, Illinois Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan UIUC#23031 protokolüne göre gerçekleştirildi ve ilgili tüm yönergelere ve düzenlemelere sıkı bir şekilde uydu.

1. Fotonik kristal fiberin (PCF) parçalanması ve hizalanması

  1. Fiber kesiciler veya tel kesiciler kullanarak, fotonik kristal fiberin (PCF, Malzeme Tablosu) bir bölümünü 15 cm'den biraz daha uzun bir uzunlukta kesin.
    NOT: PCF'nin her iki ucundan en az 1.5 cm'lik uzunluklar ayrılacaktır, çünkü bu uzunluk yarılma sırasında PCF'yi güvenli bir şekilde sıkıştırmak için gereklidir. Bu çalışmada kullanılan PCF'nin (12 cm) nihai uzunluğu, genelleştirilmiş doğrusal olmayan Schrödinger denklemi47 ve ampirik test kullanılarak önceki bir simülasyona dayalı olarak belirlenmiştir. Genel olarak, en iyi PCF uzunluğu, PCF tipine, pompa lazer girişine ve istenen süper sürekliliğe bağlı olarak değişebilir.
    DİKKAT: PCF'yi keserken, deneycinin gözlerini ve cildini korumak için kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın. Elyaf artıklarını hemen kesici alet imha kabına atın.
  2. Bir fiber sıyırıcı (Malzeme Tablosu) veya tıraş bıçağı kullanarak PCF'nin her iki ucundan yaklaşık 3 cm plastik kaplamayı sıyırın ve kalan plastiği kağıt mendil (Malzeme Tablosu) ve 0 metanol ile temizleyin.
  3. PCF'nin bir ucunu hassas bir fiber optik balta (Malzeme Tablosu) üzerindeki tutucuya yerleştirin ve bıçağı PCF'nin ucundan 1.5 cm uzakta hizalayın. Kelepçeleri dikkatlice kapatın ve yarma düğmesine basın.
    NOT: PCF'leri parçalamak için özel yönergeler de dahil olmak üzere fiber satırın kullanım kılavuzunu dikkatlice izleyin. Fiber gerginliği gibi ayarlar, her PCF türü için tutarlı ve yüksek kaliteli yarıklar için ince ayar gerektirebilir.
  4. Bir cam elyaf işleme iş istasyonunda (Malzeme Tablosu) entegre mikroskobu (10× büyütme) kullanarak PCF'nin parçalanmış yüzünü ve yanını inceleyin ve yarığın iyi kalitede olduğundan emin olun (Şekil 2A,C). Kalıntı (Şekil 2D), çizikler (Şekil 2E) varsa veya yarık yüzey düz ve PCF'nin uzunluğuna dik değilse (Şekil 2B) yeniden bölün.
    NOT: Hasara neden olmamak için PCF'nin bölünmüş uçlarına herhangi bir yüzeye dokunmaktan kaçınmak için bu adımda ve sonraki adımlarda çok dikkatli olunmalıdır.
  5. İstenen son uzunluğu sağlamak için PCF'nin ikinci ucunu bölün.
    NOT: Bu protokolde kullanılan PCF 12 cm'ye kadar kesilmiştir.
  6. Önceki adımlarda olduğu gibi, PCF'nin yeni bölünmüş ucunu inceleyin (adım 1.4'e bakın). Bölme hatalı veya tutarsız görünüyorsa, mevcut PCF'yi atın ve işlemi yenisiyle tekrarlayın.
  7. clamp PCF'nin giriş ucunu, bir cetvelle ölçüldüğü gibi fiber birleştirme merceğinin yaklaşık odak uzaklığında 3 eksenli bir aşamada (Malzeme Tablosu) yerleştirin. PCF'nin diğer ucunu geçici bir direk veya montaj parçasıyla güvenli bir şekilde destekleyin.
    NOT: Brüt ayarlama sırasında PCF'nin kırılmasını önlemek için çıkışı henüz sıkıştırmayın.
    DİKKAT: Lazere maruz kalma riskini azaltmak için çıkış ucunu desteklemek ve yeterli ışın bloklarıyla çevrelemek gereklidir.
  8. Giriş gücünü ölçmek için PCF'den hemen önce ışın yoluna bir optik güç ölçer (Malzeme Tablosu) yerleştirin. Lazeri açmadan önce femtosaniye lazerin (Malzeme Tablosu) deklanşör 1 tarafından engellendiğinden emin olun.
    NOT: Lazer kullanımıyla ilişkili riskleri anlamak için her zaman gerekli lazer güvenliği eğitim programlarını tamamlayın.
    DİKKAT: Lazeri çalıştırırken, kullanılan lazerin dalga boyu ve gücü için özel olarak derecelendirilmiş uygun lazer güvenlik gözlüğü takın. Lazeri çalıştırmadan önce, tehlikeli başıboş yansımalara neden olabilecek tüm mücevherleri, saatleri ve diğer yansıtıcı öğeleri çıkarın.
  9. Lazeri açın ve lazerin belirttiği "soğuk ısınma süresi" kadar ısınmasına izin verin. Deklanşör 1'i açın ve güç ölçer 1 mW veya daha düşük okuyana kadar polarize ışın ayırıcıdan hemen önceki yarım dalga plakasını (HWP260) kullanarak gücü ayarlayın.
    NOT: Hizalama için 260 mW kullanımı, ampirik olarak, bir IR görüntüleyici veya floresan hedefte görselleştirme için parlak bir ışın sağlarken PCF'ye zarar vermekten kaçınmak için (yanlış hizalanmış olsa bile) yeterince düşük olarak belirlenmiştir.
  10. Deklanşör 1'i kullanarak lazeri engelleyin ve güç ölçeri PCF'nin çıkış ucuna getirin.
  11. Lazerin engelini kaldırın ve güç ölçerde PCF'nin çekirdeğine, kaplamasına veya plastik kaplamasına bir miktar ışık bağlandığını gösteren sinyal görünene kadar 3 eksenli s'yi kullanarak PCF giriş yüzünün optik eksenini ayarlayın. PCF girişini ışının odağına yerleştirmek 3 eksenli s'nin aralığının dışındaysatage, lazeri bloke edin, ardından PCF'yi ayarlayın ve yeniden clamp.
    NOT: Işının nereye odaklandığını görselleştirmek için bir kızılötesi (IR) görüntüleyici veya floresan hedef kullanılabilir.
  12. 3 eksenli aşamayı kullanarak, ışığın bağlandığı aralığı bulmak için PCF'nin optik ekseninin bir boyutunu ayarlayın, bu aralığın ortasını hesaplayın ve sahneyi oraya taşıyın. Işını PCF'nin çekirdeği üzerinde yaklaşık olarak ortalamak için ikinci boyut için bunu tekrarlayın.
    NOT: 3 eksenli aşamadaki μm onay işaretleri, mesafeleri ölçmeye ve PCF'nin merkezini bulmaya yardımcı olabilir.
  13. Işını PCF'nin çekirdeğine hassas bir şekilde merkezlemek ve odaklamak için kuplaj verimliliğini optimize ederken, 3 eksenli aşamanın üç boyutunu tekrar eden bir sırayla yinelemeli olarak ayarlayın.




figure-protocol-1























Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SLAM mikroskobunun karmaşık çok kanallı, çok modlu yaklaşımı (Şekil 1), yeni kullanıcıların sorunları gidermesini ve sonuçları anlamasını zorlaştırabilir. İlk olarak, iyi bölünmüş bir PCF, PCF'nin uzunluğuna dik olan düz bir yüzeye sahip temiz bir yüze (Şekil 2C) sahiptir (Şekil 2A). Açılı, yontulmuş bir yarık yüzü (Şekil 2B) ve çiziklerin varlığı (Şekil 2E) zayıf bir yarığ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Başarılı SLAM görüntüleme için uygun bir süper süreklilik oluşturmak çok önemlidir, ancak PCF'yi kurmanın karmaşıklığı nedeniyle zor olabilir. PCF'nin hassas bir şekilde parçalanmasını ve dikkatli bir şekilde kullanılmasını, yüzeylerin kalıntı, kir veya çiziklerden arındırılmış olmasını sağlamak çok önemlidir, bunların tümü etkili bağlantı, süper süreklilik üretimi ile müdahale edebilir ve hatta PCF'nin ömrünü kısaltabilir. PCF'nin düzenli olarak değiştirilmesi gerektiğinden, elyaf parça...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan ekipman için finansman, kısmen Beckman İleri Bilim ve Teknoloji Enstitüsü'ndeki Optik Moleküler Görüntüleme Merkezi aracılığıyla GSK tarafından sağlandı. Bu çalışma kısmen NIH / NIBIB Etiketsiz Görüntüleme ve Çok Ölçekli Biyofotonik Merkezi (CLIMB) (P41EB031772) ve NSF Kantitatif Hücre Biyolojisi Bilim ve Teknoloji Merkezi tarafından da desteklenmiştir. K.K.D.T, NIEHS Toksikoloji ve Çevre Sağlığı Araştırma Eğitim Programı (5T32ES007326-25), ADC, Beckman Institute for Advanced Science and Technology Doktora Sonrası Araştırmacılar programı ve A.H., NIBIB Doku Mikroçevre Eğitim Programı (T32EB019944) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, laboratuvar alanları, ekipman ve teknoloji yönetimi için Darold Spillman'a teşekkür eder ve bu çalışmada kullanılan SLAM mikroskop sistemine geçmişte yaptıkları katkılar için Dr. Janet E. Sorrells ve Rishyashring R. Iyer'e teşekkür eder.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3 eksenli tablaThorLaboratuvarlarıMAKS316Üretilmiyor.
35 mm cam tabanlı görüntüleme kabıMatTekP35G-0-14-CKaplamasız #0 kapak camı.
DMEMGibco21063029Yüksek glikoz, HEPES, fenol kırmızısı yok.
Endotel hücre büyüme ortamı takviyeleriPromosyon HücresiC-39210 SerisiFetal Buzağı Serumunu Atlayın.
FemtoTrain femtosaniye lazerSpektrum-Fizik1040-5Ortalama Güç: >5.0 W, Darbe Enerjisi: >500 nJ, Dalga Boyu: 1040 nm ± 8 nm, Tekrarlama Oranı: 10 MHz, Darbe Genişliği (FWHM): < 220 fs.
Fetal Sığır SerumuCytivaSH30071.03HyClone Karakterli.
Fiber sıyırıcıThorLaboratuvarlarıT10S13
Flavin adenin dinükleotid disodyum tuzu hidratSigma-AldrichF6625 Serisi
Galvanometre aynalarıCambridge Teknolojisi6215HÜretilmiyor.
Cam işleme iş istasyonuVytran HakkındaGPX3800
ResimJWisconsin Madison Üniversitesi'ndeki Eliceiri laboratuvarıSürüm 2.16.0FIJI Dağıtımı.
Kimwipe kağıt mendilKimberly-Clark Profesyonel34120
L-GlutaminCytivaSH30034.01
Mikroskop aşamasıUygulamalı Bilimsel EnstrümantasyonFTP-2050 (İngilizce)
Mikroskop tabla kontrolörüUygulamalı Bilimsel EnstrümantasyonMS-2000-500-UDSW
Mikroskopi otokorelatörAngewandte Physik und Elektronik GmbHCarpe
Objektif merceğiOlympusXLPLN25XWMP2Suya daldırma, 25X büyütme, 1,05 NA.
Optik güç ölçerNewport919P-003-10600 - 1700 deniz mili.
Optik spektrum analizörüThorLaboratuvarlarıOSA202C
Fotonik kristal fiberNKT FotonikLMA-PM-15 NKTGeniş mod alanı, polarizasyonun korunması. Çekirdek Çapı: 15 &mikro;m.
Hassas fiber optik satırFujikura KöyüCT-101
Nabız şekillendiriciBiyofotonik Çözümleri A.Ş.FemtoJock-DÜretilmiyor.
β-Nikotinamid adenin dinükleotid, indirgenmiş disodyum tuzu hidratSigma-Aldrich10128023001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyd, R. W. Nonlinear optics. , Academic Press. Amsterdam. (2008).
  2. Potma, E. O. Foundations of nonlinear optical microscopy. , John Wiley and Sons. (2024).
  3. Mukamel, S. Principles of nonlinear optical spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1999).
  4. Boppart, S. A., You, S., Li, L., Chen, J., Tu, H. Simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy and beyond. APL Photonics. 4 (10), 100901(2019).
  5. Sun, Y., et al. Real-time three-dimensional histology-like imaging by label-free nonlinear optical microscopy. Quant Imaging Med Surg. 10 (11), 2177-2190 (2020).
  6. Yang, L., et al. Intraoperative label-free multimodal nonlinear optical imaging for point-of-procedure cancer diagnostics. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 27 (4), 6801412(2021).
  7. Talone, B., et al. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals features of bone composition in pathophysiological conditions. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1042680(2022).
  8. Liu, H. S., Jan, M. S., Chou, C. K., Chen, P. H., Ke, N. J. Is green fluorescent protein toxic to the living cells. Biochem Biophys Res Commun. 260 (3), 712-717 (1999).
  9. Tsoi, K. M., Dai, Q., Alman, B. A., Chan, W. C. W. Are quantum dots toxic? Exploring the discrepancy between cell culture and animal studies. Acc Chem Res. 46 (3), 662-671 (2013).
  10. Alford, R., et al. Toxicity of organic fluorophores used in molecular imaging: Literature review. Mol Imaging. 8 (6), (2009).
  11. Macheroux, P., Kappes, B., Ealick, S. E. Flavogenomics - a genomic and structural view of flavin-dependent proteins. FEBS J. 278 (15), 2625-2634 (2011).
  12. Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. Top Fluoresc Spectrosc. 5, 471-540 (2002).
  13. Ranjit, S., et al. Imaging fibrosis and separating collagens using second harmonic generation and phasor approach to fluorescence lifetime imaging. Sci Rep. 5 (1), 13378(2015).
  14. Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
  15. Cox, G. Biological applications of second harmonic imaging. Biophys Rev. 3 (3), 131(2011).
  16. Aghigh, A., Bancelin, S., Rivard, M., Pinsard, M., Ibrahim, H., Légaré, F. Second harmonic generation microscopy: A powerful tool for bio-imaging. Biophys Rev. 15 (1), 43-70 (2023).
  17. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
  18. Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt Express. 5 (8), 169-175 (1999).
  19. Oron, D., et al. Depth-resolved structural imaging by third-harmonic generation microscopy. J Struct Biol. 147 (1), 3-11 (2004).
  20. Débarre, D., et al. Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy. Nat Methods. 3 (1), 47-53 (2006).
  21. Tu, H., et al. Stain-free histopathology by programmable supercontinuum pulses. Nat Photonics. 10 (8), 534-540 (2016).
  22. You, S., et al. Label-free visualization and characterization of extracellular vesicles in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (48), 24012-24018 (2019).
  23. Zipfel, W. R., et al. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  24. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  25. Masihzadeh, O., et al. Third harmonic generation microscopy of a mouse retina. Mol Vis. 21, 538-547 (2015).
  26. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  27. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: Why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
  28. Maiti, S., Shear, J. B., Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Measuring serotonin distribution in live cells with three-photon excitation. Science. 275 (5299), 530-532 (1997).
  29. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nat Commun. 11 (1), 5120(2020).
  30. Campagnola, P. J., Dong, C. Y. Second harmonic generation microscopy: Principles and applications to disease diagnosis. Laser Photonics Rev. 5 (1), 13-26 (2011).
  31. Pavone, F. S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging. , CRC Press. Boca Raton. (2016).
  32. Witte, S., et al. Label-free live brain imaging and targeted patching with third-harmonic generation microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 5970-5975 (2011).
  33. Weigelin, B., Bakker, G. J., Friedl, P. Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics. Intravital. 1 (1), 32-43 (2012).
  34. Carriles, R., et al. Imaging techniques for harmonic and multiphoton absorption fluorescence microscopy. Rev Sci Instrum. 80 (8), 081101(2009).
  35. Graf, B. W., Jiang, Z., Tu, H., Boppart, S. A. Dual-spectrum laser source based on fiber continuum generation for integrated optical coherence and multiphoton microscopy. J Biomed Opt. 14 (3), 034019(2009).
  36. Graf, B. W., et al. In vivo multimodal microscopy for detecting bone-marrow-derived cell contribution to skin regeneration. J Biophotonics. 7 (1-2), 96-102 (2014).
  37. Liu, Y., Tu, H., Benalcazar, W. A., Chaney, E. J., Boppart, S. A. Multimodal nonlinear microscopy by shaping a fiber supercontinuum from 900 to 1160 nm. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 18 (3), (2012).
  38. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nat Commun. 9 (1), 2125(2018).
  39. You, S., Chaney, E. J., Tu, H., Sun, Y., Sinha, S., Boppart, S. A. Label-free deep profiling of the tumor microenvironment. Cancer Res. 81 (9), 2534-2544 (2021).
  40. Cadena, A. D. L., Park, J., Tehrani, K. F., Renteria, C. A., Monroy, G. L., Boppart, S. A. Simultaneous label-free autofluorescence multi-harmonic microscopy driven by the supercontinuum generated from a bulk nonlinear crystal. Biomed Opt Express. 15 (2), 491-505 (2024).
  41. Lee, J. H., et al. Simultaneous label-free autofluorescence and multi-harmonic imaging reveals in vivo structural and metabolic changes in murine skin. Biomed Opt Express. 10 (10), 5431-5444 (2019).
  42. Shi, J., et al. Accelerating biopharmaceutical cell line selection with label-free multimodal nonlinear optical microscopy and machine learning. Commun Biol. 8 (1), 157(2025).
  43. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  44. Alhallak, K., Rebello, L. G., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N. Optical redox ratio identifies metastatic potential-dependent changes in breast cancer cell metabolism. Biomed Opt Express. 7 (11), 4364-4374 (2016).
  45. Ostrander, J. H., et al. Optical redox ratio differentiates breast cancer cell lines based on estrogen receptor status. Cancer Res. 70 (11), (2010).
  46. Cadena, A. D. L., Renteria, C. A., Aksamitiene, E., Boppart, S. A. Label-free hyperspectral multiphoton microscopy. Opt Lett. 50 (5), 1484-1487 (2025).
  47. Agrawal, G. Nonlinear fiber optics. , 5th ed, Academic Press. 553-612 (2013).
  48. Trebino, R., et al. Measuring ultrashort laser pulses in the time-frequency domain using frequency-resolved optical gating. Rev Sci Instrum. 68 (9), 3277-3295 (1997).
  49. Stewart, K., Schroeder, V. A. Diagnostic necropsy and tissue harvest in rodents. J Vis Exp. , e10294(2020).
  50. Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney Int. 65 (6), 2223-2227 (2004).
  51. Huttunen, M. J., et al. Multiphoton microscopy of the dermoepidermal junction and automated identification of dysplastic tissues with deep learning. Biomed Opt Express. 11 (1), 186-199 (2020).
  52. Fung, A. A., et al. Label-free multimodal optical biopsy reveals biomolecular and morphological features of diabetic kidney tissue in 2D and 3D. Nat Commun. 16 (1), 4509(2025).
  53. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  54. Kovesi, P. Good colour maps: How to design them. arXiv. , (2015).
  55. Kovesi, P. ColorCET perceptually uniform colour maps. , https://colorcet.com (2025).
  56. Tian, Z., Liang, M. Renal metabolism and hypertension. Nat Commun. 12 (1), 963(2021).
  57. Wang, G., Shi, J., Iyer, R. R., Sorrells, J. E., Tu, H. Fiber-optic nonlinear wavelength converter for adaptive femtosecond biophotonics. arXiv. , (2024).
  58. Lozovoy, V. V., Pastirk, I., Dantus, M. Multiphoton intrapulse interference. IV. Ultrashort laser pulse spectral phase characterization and compensation. Opt Lett. 29 (7), 775-777 (2004).
  59. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. Eur J Histochem. 58 (4), (2014).
  60. Theodossiou, A., et al. Autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism. J Vis Exp. (177), e63282(2021).
  61. Yang, L., et al. Label-free multimodal polarization-sensitive optical microscope for multiparametric quantitative characterization of collagen. Optica. 11 (2), 155-165 (2024).
  62. Smith, H. E., et al. The use of NADH anisotropy to investigate mitochondrial cristae alignment. Sci Rep. 14 (1), 5980(2024).
  63. Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (4), (2011).
  64. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr Protoc Cytom. 61 (1), 9.39.1-9.39.18 (2012).
  65. Sorrells, J. E., et al. Label-free nonlinear optical signatures of extracellular vesicles in liquid and tissue biopsies of human breast cancer. Sci Rep. 14 (1), 5528(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Label Free MicroscopyNonlinear Optical MicroscopyMultiphoton MicroscopyHarmonic GenerationAutofluorescence ImagingPhotonic Crystal FiberPulse CompressionTissue ImagingMetabolic ImagingRedox Ratio

Related Articles