Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

zpc:cas9 knock-in zebra balığı kullanılarak maternal mutantların üretilmesi

1.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68642

⸱

22 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Cell and Developmental Biology, School of Life Sciences Qilu Hospital (Qingdao), Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), UMR CNRS 8263, INSERM U1345, Development, Adaptation and Ageing, Sorbonne Université, 3College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, 4Key Laboratory for Experimental Teratology of the Ministry of Education, Shandong University, 5State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, 6Shandong University-Yuanchen Joint Biomedical Technology Laboratory

Bu makalede

Özet

Burada, sgRNA ekspresyon kasetlerinin Tol2 aracılı iletimi ile kararlı bir zpc:cas9 knock-in hattını birleştiren maternal mutant üretmek için bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Oogenez ve erken embriyonik gelişim, kritik olarak maternal olarak türetilmiş mRNA'lara ve proteinlere bağlıdır. Bu maternal faktörlerin ortadan kaldırılması, dişi zebra balıklarında homozigot mutasyonları gerektirir ve genellikle maternal mutant embriyoların edinilmesini önleyen ölümcül veya kısır fenotiplerle sonuçlanır. Önceki çalışmamız, oosit spesifik genom düzenleme yoluyla zigotik ölümcüllüğü atlamak için hızlı bir yaklaşım getirdi. Bununla birlikte, daha önce bildirilen cas9 transgeni kararsızlık sergiler ve ardışık nesiller boyunca kademeli olarak susturulur. Ayrıca, bu çizgide zpc:cas9 kasetini çevreleyen Tol2 transpoze edilebilir elemanların varlığı, şu anda zebra balıklarında en verimli transgenik sistem olan Tol2 sistemini kullanarak daha fazla sgRNA transgenezi potansiyelini engellemektedir. Sonuç olarak, istikrarlı ve sağlam oosit spesifik Cas9 ekspresyonu sağlayan Tol2 içermeyen bir zebra balığı hattına kritik bir ihtiyaç vardır. Burada, bu gereksinimi karşılayan rbm24a lokusunda zpccas9 knock-in ile bir hat sunuyoruz. Bu gelişmiş aracı kullanarak, zebra balığı modelinde zigotik olarak ölümcül mutant fenotiplere sahip genlerin maternal mutantlarının hızlı bir şekilde üretilmesi için bir boru hattı sağlıyoruz.

Giriş

Omurgalıların erken embriyonik gelişimi, büyük ölçüde yumurta içinde depolanan RNA ve proteinlere dayanır ve topluca maternal faktörler olarak adlandırılır. Bu maternal ürünler ağırlıklı olarak mayoz I 1,2,3'ün diploten aşaması sırasında sentezlenir. İşlevsel rollerini araştırmak için, homozigot mutant dişi bireyler oluşturmak esastır, çünkü sadece oositlerdeki homozigot mutasyon bu maternal faktörleri tamamen tüketebilir. Bununla birlikte, bu tür homozigot mutant dişilerin elde edilmesi, zigotik homozigot mutasyonlar ölümcüllük veya kısırlık ile sonuçlandığında zorlaşır 4,5. Bu, zigotik, öldürücü veya steril genler tarafından kodlanan maternal ürünlerin işlevlerinin aydınlatılmasında önemli bir engel teşkil etmektedir. Bu teknik sınırlamanın üstesinden gelmek için çeşitli yenilikçi yaklaşımlar geliştirilmiştir6,7,8. Bununla birlikte, bu teknikler genellikle uzun süreli deneysel zaman çizelgelerinden veya önemli teknik zorluklardan muzdariptir.

Önceki çalışmamızda, tek bir nesil 9,10 içinde maternal mutantların üretilmesine izin veren koşullu bir nakavt stratejisi de geliştirdik. Sistem iki ana bileşenden oluşur: Tg(zpczcas9) transgenik zebra balığı ve 3-4 sgRNA ekspresyon kasetini barındıran bir I-SceI transgenik plazmit sistemi. Bu sistemden yararlanarak, oositlerde 9,10 maternal faktörlerin şartlı olarak ortadan kaldırılmasını başarıyla başardık, ancak hala iyileştirme için yer var. İlk olarak, daha önce bildirilen Tg (zpczcas9) transgenik hattının genom düzenleme verimliliği, Cas9'un transgenik ekspresyonunun korunmasında stabil değildi. Ayrıca, bu transgenik hat Tol2 transpozon sistemi kullanılarak oluşturulduğundan, Tol2 transpozisyonu, sgRNA ekspresyon kasetinin entegrasyonu için daha fazla kullanılamaz; bunun yerine, I-SceI aracılı bir transgenez gereklidir. Bununla birlikte, bu yaklaşım Tol2'den daha az verimlidir ve aynı zamanda nesiller arası susturmaya karşı daha hassastır.

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, oositin spesifik Cas9 ekspresyonunu mümkün kılan sağlam ve stabil bir giriş hattı oluşturmaya çalıştık. Bu hat, zebra balıklarında sgRNA ekspresyon plazmitlerinin yüksek verimli bir şekilde iletilmesi için Tol2 transpozon sisteminin kullanılmasına izin verir. İntron tabanlı bir genom düzenleme stratejisi11 kullanarak, rbm24a geninin son intronundaki entegre bölge ile başarılı bir şekilde bir zpccas9 knock-in hattı oluşturduk (Şekil 1A,B). Bu lokusu, iki bağımsız gözleme dayanarak maternal transgen ekspresyonu için aday bir genomik güvenli liman olarak seçtik. 1) Zararsız entegrasyon: Son çalışmamızda12, bu bölgede eksojen DNA taşıyan homozigot knock-in balıklar tamamen canlı ve verimli kalmıştır. 2) Sağlam ifade: Aynı lokusa bir zpccas9 kaseti yerleştirildiğinde, Cas9 yüksek seviyelerde eksprese edildi ve nesiller boyunca sürekli olarak güçlü genom düzenleme verimlilikleri sağladı (Şekil 1C). Bir çekirdek germ plazma bileşeni olarak, RNA bağlayıcı protein Rbm24a, germ plazma RNA'larını germ granüllerine dahil etmek için Buc ile ortaktır. Sonuç olarak, maternal Rbm24a eksikliği, ilkel germ hücrelerinin (PGC'ler) tamamen yokluğuna yol açar12. Burada, son çalışmalarımızda bir örnek olarak rbm24a'yı hedefleyerek, zigotik öldürücü genler için maternal mutantların üretilmesi ve karakterize edilmesi için geliştirilmiş bir video protokolü sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Deneyler ARRIVE yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve Shandong Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi tarafından etik olarak onaylandı (Onay No. SYDWLL-2021-15). Bu protokole genel bakış Şekil 2'de gösterilmektedir.

1. rbm24a-RFP zpc: cas9 knock-in hattının oluşturulması

  1. Knock-in için sgRNA ekranı
    1. Knock-in sgRNA adaylarını seçin ve sentezleyin
      1. Hem yüksek CRISPRscan puanları (hedef içi verimliliğin göstergesi) hem de düşük CFD puanları (hedef dışı etkileri yansıtan) sergileyen optimal sgRNA adaylarını belirlemek için rbm24a'nın son intron dizisini CRISPRscan'a (http://www.crisprscan.org) gönderin. Her sgRNA (sgRNA oligo) için uzun oligo'yu sentezleyin.
        NOT: CRISPRscan, T7 promotör dizisi, 20 nükleotid sgRNA hedef dizisi ve 16 nükleotid sgRNA iskele dizisi dahil olmak üzere temel fonksiyonel elementleri içeren sgRNA oligoları üretir. Burada, aşağıdaki diziye sahip bir sgRNA seçtik: 5'-taatacgactcactataGGGCTGCTGTCATGTTGG
        GTgttttagagctagaa-3' (T7 promotör küçük harf, 20-nt kılavuz büyük harf, kısmi iskele küçük harf).
      2. sgRNA sentezi için DNA şablonunu elde etmek için 50 μL Fill-in PCR reaksiyonu hazırlayın: 2x Taq Master karışımı 25 μL; sgRNA primer (10 μM) 2 μL; Üniversal astar (10 μM) 2 μL; DeiyonizeH2O21μL.
        NOT: Tüm astarların dizileri Malzeme Tablosunda gösterilmiştir.
      3. İyice karıştırın ve reaksiyon karışımını önceden programlanmış bir termal döngüleyiciye aktarın ve aşağıdaki döngü parametrelerini kullanarak amplifikasyon protokolünü başlatın: 3 dakika boyunca 94 ° C'de 1 döngü, 35 döngü (15 s için 94 ° C, 15 s için 50 ° C, 30 s için 72 ° C) ve 5 dakika boyunca 72 ° C'de 1 döngü.
      4. Reaksiyon karışımını 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde sgRNA sentezi için hazırlayın; tüm bileşenleri oda sıcaklığında aşağıdaki sırayla birleştirin: 11 μL damıtılmış su, 2 μL ATP/GTP/CTP/UTP (her biri 10 mM), 10 μL PCR ürünü, 4 μL 10x RNA polimeraz reaksiyon tamponu, 2 μL T7 RNA polimeraz ve 1 μL RNaz inhibitörü. Toplam reaksiyon hacmi 40 μL'dir. Fiske vurarak iyice karıştırın ve kısa bir santrifüjleme yapın.
      5. 37 °C'de 1,5 saat inkübe edin. 1 μL DNaz I ekleyin, hafifçe vurarak karıştırın ve kısa bir süre santrifüjleyin. DNA şablonunun tamamen çıkarılmasını sağlamak için 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
      6. 5 μL silika manyetik boncuk, ardından 120 μL (4x hacim) RNA bağlama tamponu (Gu-HCl 1 M 9.55 g, Tween-20 %0.05, etanol 100 mL) ekleyin. Pipetleme ile iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 1,500 rpm'de 10 dakika boyunca bir termomikser üzerinde inkübe edin.
      7. Tüpü manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve bir pipet veya vakum sistemi kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın.
      8. Boncukları yeniden süspanse etmek için 400 μL %90 etanol ve girdap ekleyin. Tüpü manyetik standa yerleştirin ve süpernatanı atın.
      9. Toplam iki yıkama döngüsünü tamamlamak için etanol yıkama adımlarını tekrarlayın.
      10. Kalan süpernatanı çıkarın ve açık tüpü 50 °C'lik bir ısıtma bloğunda 10 dakika havayla kurutun.
      11. 15 μL nükleaz içermeyen su ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.500 rpm'de bir termomikser üzerinde inkübe edin.
      12. Tüpü manyetik standın üzerine yerleştirin ve elüatı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      13. 98 bp sgRNA bandını agaroz elektroforezi ile onaylayın. Mikro spektrofotometre ve agaroz elektroforezi ile RNA konsantrasyonunu ölçün, net bir şekilde etiketleyin ve -20 °C'de saklayın.
    2. sgRNA verimliliğini test edin
      1. sgRNA'ların gerçek verimliliğini belirlemek için, mikroenjeksiyon için ribonükleoprotein (RNP) kompleksini hazırlayın. Her bir sgRNA'nın 1 μL'sini (50 ng/μL nihai konsantrasyon) 1 μL Cas9 proteini (100 ng/μL nihai konsantrasyon) ile buz üzerinde pipetleme ile karıştırın. Mikroenjeksiyon ile tek hücreli aşamada her embriyoya 2 nL RNP kompleksi verin.
      2. Döllenmeden 24 saat sonra (hpf), enjekte edilen her Cas9 RNP için 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 10 embriyo toplayın ve fazla ortamı dikkatlice çıkarın. 100 μL 50 mM NaOH (embriyo başına 10 μL) ekleyin ve bir ısıtma bloğu veya termosiklayıcı kullanarak 95 ° C'de 15 dakika inkübe edin. 10 μL 1 M Tris-HCl (pH 7.0) ekleyerek lizatı nötralize edin.
      3. Nötralize edilmiş embriyo lizatını doğrudan PCR amplifikasyonu için şablon olarak kullanın. Hedef bölgeyi içeren bir parçayı her iki tarafta ≥100 bp yan dizileri ile büyütmek için astarlar tasarlayın. PCR ürünlerini agaroz jel elektroforezi ile doğrulayın ve gerektiğinde jel ekstraksiyonu kullanarak saflaştırın. Amplifiye edilmiş ürünlerin Sanger dizilimini gerçekleştirin.
      4. CRISPR düzenleme verimliliği ölçümü: ICE (CRISPR Düzenlemelerinin Çıkarımı) analiz aracını (https://ice.synthego.com/#/) kullanarak sıralama kromatogramlarını analiz edin. Web sitesi tarafından önerilen protokolleri izleyerek enjekte edilmemiş kontrol örneklerine karşı düzenleme verimliliğini normalleştirin.
  2. Knock-in için bir donör plazmidinin yapımı
    1. Ligasyon reaksiyonunu gerçekleştirmek için yerleşik TEDA (T5 eksonükleaz DNA düzeneği) metodolojisini kullanın13.
    2. rbm24a-RFP KIzpc:cas9 knock-in donör plazmidinin inşası için üç parçalı bir Gibson montaj stratejisi kullanın. İlk fragman, rbm24a durdurma kodonunun hemen yukarısındaki genomik bölgeyi kapsayan 1.704 bp 5' homoloji kolunu içerir. İkincisi, GFP kodlama dizisidir. Üçüncüsü, rbm24a durdurma kodonunun aşağı akışında 2.274 bp 3' homoloji kolu, ardından rbm9a 3'-UTR'nin distalinde 24' yönünde konumlandırılmış zpccas3 ekspresyon kasetini içerir.
    3. Gibson montajını kullanarak üç parçayı pBluescript SK- vektörünün ApaI sitesine birleştirin.
    4. Kısıtlama sindirimi ve Sanger dizilimi yoluyla son plazmidi doğrulayın.
  3. Erken entegrasyon ile mikroenjeksiyon ve embriyo seçimi
    1. Nükleaz içermeyen suda 12 pg rbm24a-RFP KIzpc:cas9 knock-in donör plazmidi, 200 pg sgRNA ve 600 ng rekombinant Cas9 proteini içeren enjeksiyon karışımını hazırlayın. Karışımın 1-2 nL'sini standart mikroenjeksiyon tekniklerini kullanarak tek hücreli evre embriyolarının blastodiskine verin. 30 hpf'de, rbm24a'nın endojen ekspresyonunu taklit eden RFP ekspresyon paternleri için embriyoları tarayın, bu da donör plazmidinin bölünme aşaması kadar erken bir zamanda entegrasyonunu gösterir. Lens, kalp, iskelet kası ve iç kulak kılı hücrelerinde RFP sinyali gösteren üreme için erken entegrasyona sahip bu embriyoları seçin (Şekil 3A,B).
      NOT: Plazmid hazırlığı sırasında ortaya çıkan kalıntı RNazları ortadan kaldırmak için enjeksiyondan önce plazmiti fenol-kloroform ekstraksiyonu ile saflaştırın.
    2. rbm24a-RFP KIzpc:cas9 çaprazlamalarından türetilen F1 nesil embriyolarda maternal Rbm24a-RFP'nin ekspresyon modellerini analiz edin (Şekil 4A,B).
  4. Cas9 protein ekspresyonunun ve düzenleme verimliliğinin değerlendirilmesi
    1. Cas9 düzenleme verimliliğini değerlendirmek için, 200 hücreli rbm2a-RFP KIzpc:cas24 embriyolarına 24 pg bmp9b sgRNA'yı mikroenjekte edin (Şekil 1C,D).
    2. Cas9 düzenlemesinin stabilitesini değerlendirmek için, dorsalizasyon fenotiplerini sergileyen embriyoların sayısını ölçün ve düzenleme verimliliğini değerlendirmek için Sanger dizileme analizi yapın (Şekil 5A-D).
      NOT: Üç nesil boyunca Cas9 ifadesinde herhangi bir azalma tespit etmemiş olsak da, yine de bu knock-in serisinin her neslinde düzenleme verimliliğini doğrulamanızı öneririz.

2. rbm24a-RFP KI zpc cas9 hattında sgRNA transgenezi

  1. rbm24a nakavt için sgRNA'ları seçin ve sentezleyin.
    1. Adım 1.1.1'de açıklandığı gibi sgRNA adaylarını seçin ve sentezleyin.
      NOT: Yüksek verimli bir fonksiyon kaybı sağlamak için kodlama bölgesinin ön yarısını hedef alan sgRNA'ların seçilmesi çok önemlidir. Ek olarak, C-terminal bölgesinde kritik protein alanları tanımlanırsa, kodlama dizisinin 3' ucunu hedefleyen sgRNA'lar da kabul edilebilir. CRISPRscan, T7 promotör dizisi, 20 nükleotid sgRNA hedef dizisi ve 16 nükleotid sgRNA iskele dizisi dahil olmak üzere temel fonksiyonel elementleri içeren sgRNA oligoları üretir. Etkili bir maternal gen nakavtı elde etmek için, 3-4 yüksek verimli sgRNA'yı güvenilir bir şekilde tanımlamak için 6-8 aday tasarlanması tavsiye edilir. Ayrıntılı bir protokol önceki bir makalede bulunabilir9.
    2. Adım 1.1.2'de açıklandığı gibi erken zebra balığı embriyosunda sgRNA verimliliğini test edin.
      NOT: Düzenleme verimliliği %50'yi aşan sgRNA'lar tercih edilir.
  2. SgRNA eksprese eden transgenik plazmitin yapısı
    NOT: Düzenleme verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için, her biri en az 36 bp ile ayrılmış dört farklı, örtüşmeyen sgRNA kullanmanızı öneririz. Bu sgRNA'lar, her biri 3' iskele ile birlikte benzersiz bir U6 promotörünü barındıran pU6x:sgRNA vektörlerine (pU6x:sgRNA #1, #2, #3, #4) ayrı ayrı bağlanır14. Daha sonra, her biri bir sgRNA ekspresyon kaseti içeren bu dört U6 vektörü, Golden Gate ligasyonu yoluyla pGGDestISceIEB-4sgRNA hedef vektörüne birleştirilir.
    pU6x:sgRNA vektörleri sırayla seçilmelidir. Örneğin, üç sgRNA'yı klonluyorsanız, #1 ila #3 arasındaki vektörleri kullanın; dört sgRNA klonluyorsanız, #1 ila #4 vektörlerini kullanın.
    1. sgRNA hedef dizisinin pU6x:sgRNA vektörlerine alt klonlanması
      1. Seçilen sgRNA dizisine göre, tavlama primerlerini sentezleyin: İleri astar: TTCGN(19); Ters astar: AAAC[N(19)]*. Burada GN(19), sgRNA'nın 20 nt hedef dizisidir. [N(19)]*, sgRNA hedefinin 19 nt'sinin 3' yönünde ters tamamlayıcı dizisini temsil eder.
      2. Astarları tavlamak için karışımı şu şekilde hazırlayın: 1 μL ileri astar (100 μM), 1 μL ters astar (100 μM), 2 μL 10x tampon ve 16 μL deiyonize H2O toplam 20 μL hacme ulaşmak için. İyice karıştırın.
        NOT: Tüm astarların dizileri Malzeme Tablosunda gösterilmiştir.
      3. Karışımı bir termocycler'a yerleştirin ve programı şu şekilde çalıştırın: 95 °C'de 15 dakika boyunca 1 döngü, ardından 0,1 °C/s'lik kontrollü bir rampa hızında kademeli olarak 50 °C'ye soğutun ve bu sıcaklığı 10 dakika koruyun; 4 °C'de 10 dakika tutun.
      4. Tavlanmış sgRNA hedef dizisini belirtildiği gibi pU6x-sgRNA vektörlerine klonlamak için reaksiyon karışımını hazırlayın: 1 μL 10x kısıtlama enzimi tamponu, 1 μL 10x T4 ligaz tamponu, 0.3 μL T4 ligaz, 0.3 μL BsmBI, 0.2 μL PstI, 0.2 μL Sal I, 1 μL tavlanmış sgRNA astarı, 5 μL pU6x:sgRNA#x (20 ng/μL) ve 1 μL deiyonizeH2O, son reaksiyon hacmini 10 μL'ye ayarlar.
      5. Reaksiyon bileşenlerini iyice karıştırın ve aşağıdaki termodöngüleyici programını çalıştırın: 6 döngü (37 °C 20 dakika, 16 °C 15 dakika), 37 °C'de 1 döngü 10 dakika, 55 °C'de 1 döngü 15 dakika, 1 döngü 80 °C'de 15 dakika.
      6. Dönüşüm için, DH5α yetkin hücreleri buz üzerinde çözdürün, tüpü hafifçe vurarak 50 μL hücreleri ligasyon karışımıyla nazikçe karıştırın ve karışımı buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. 42 °C'de 60 saniye boyunca bir ısı şoku uygulayın, ardından tüpü hemen 2 dakika boyunca tekrar buza aktarın. Dönüştürülmüş hücreleri 100 μg / mL spektinomisin içeren bir LB plakasına yayın ve koloni oluşumuna izin vermek için plakayı en az 16 saat boyunca 37 ° C'de baş aşağı inkübe edin.
      7. Koloni PCR için, her bakteri kolonisini bir pipet ucu ile seçin ve 10 μL deiyonize H2O'ya aktarın. 5 μL 2x Taq Karışımı, 2 μL koloni sıvısı, her biri 0.4 μL M13 ileri primer (10 μM) ve ters primer (10 μM) ve 2.2 μL deiyonize H2O'yu birleştirerek PCR reaksiyon karışımını hazırlayın, toplam 10 μL reaksiyon hacmi elde edilir.
      8. Programı aşağıda gösterildiği gibi çalıştırın: 94 °C'de 3 dakika boyunca 1 döngü, 23 döngü (94 saniye boyunca 15 °C, 55 saniye boyunca 15 °C, 72 saniye boyunca 30 °C) ve 1 döngü 72 °C'de 5 dakika.
      9. PCR ürünlerini elektroforeze tabi tutun. Beklenen boyutu 482 bp olan pozitif koloniyi seçin (Şekil 6).
      10. Kalan koloni sıvısını 100 μg / mL spektinomisin ile desteklenmiş 3 mL LB ortamına aşılayın. 37 °C'de 200 rpm'de 14 saat çalkalayarak inkübe edin.
      11. Üreticinin talimatlarına göre Plazmid Miniprep Kitini kullanarak bakteri kültüründen plazmitleri ekstrakte edin. Bir mikrospektrofotometre kullanarak plazmit konsantrasyonunu ölçün.
      12. Ekstrakte edilen plazmitleri M13 ileri astar kullanarak Sanger dizilimine tabi tutun. sgRNA hedefinin doğru yerleştirildiğini doğrulamak için sıralama sonuçlarını beklenen U6 vektör haritasıyla hizalayın.
    2. pGGDestEB-4sgRNA vektörünün montajı
      NOT: Şekil 7'de gösterildiği gibi, dört U6 tahrikli sgRNA ekspresyon kaseti, Golden Gate düzeneği kullanılarak pGGDestEB-4sgRNA omurga vektörüne verimli bir şekilde bağlanabilir. Bağlanacak sgRNA'ların sayısı vektörlerin kullanımını belirler. Örneğin, dört sgRNA kasetini birleştirirken pU6a:sgRNA#1, pU6a:sgRNA#2, pU6b:sgRNA#3, pU6c:sgRNA#4 ve pGGDestEB-4sgRNA kullanın.
      1. Aşağıdakileri içeren 20 μL Golden Gate reaksiyon karışımını hazırlayın: 2 μL 10× kısıtlama enzimi tamponu, 2 μL 10x T4 DNA ligaz tamponu, her birinden 100 ng pU6x:sgRNA#x yapısı, 50 ng pGGDestIEB-4sgRNA hedef vektörü, 1 μL BsaI, 1 μL T4 DNA ligaz ve nihai hacmi 20 μL'ye ayarlamak için deiyonize su.
      2. Golden Gate montaj reaksiyonunu 37 ° C'de 20 dakikalık 3 döngü boyunca çalıştırın, ardından 16 ° C'de 15 dakika boyunca çalıştırın, ardından enzim inaktivasyonu için 80 ° C'de son 15 dakikalık bir inkübasyon ile tamamlayın.
      3. Dönüştürmek için, reaksiyon karışımının 5 μL'sini yetkin hücrelere aktarın ve ampisilin takviyeli LB ortamına plakalayın.
      4. Ek parçanın varlığını doğrulamak için Dest ileri ve Ters primerleri ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak kolonileri tarayarak koloni PCR'si gerçekleştirin (Şekil 8).
        NOT: Pozitif bir klon için 2.415 bp'lik ana bant ve bir merdiven modeli mevcut olmalıdır.
      5. Pozitif kolonilerden plazmitleri çıkarın ve her sgRNA hedefi için Dest ileri ve Ters primerleri kullanarak dizileyin.
      6. Doğrulama için Sanger sıralama sonuçlarını tahmin edilen vektör dizisiyle hizalayın.
  3. Transgenik kurucuların mikroenjeksiyonu ve ön taraması
    1. Homozigot rbm24a-RFP KIzpc:cas9 balığı tarafından üretilen embriyoları toplayın.
    2. 1 μL pGGDestEB-rbm24a-4sgRNA'yı (12 ng/μL) 1 μL Tol2 transpozaz mRNA'sı (50 ng/μL) ile birleştirerek enjeksiyon karışımını hazırlayın.
      NOT: Plazmit ekstraksiyon işlemi sırasında sokulmuş olabilecek herhangi bir kalıntı RNazı uzaklaştırmak için enjeksiyondan önce fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanarak plazmiti saflaştırın. Plazmid ve Tol2 mRNA doğrudan saf suda seyreltildi.
    3. 15 cm'lik bir tabağa bir cam lamel yerleştirin. Embriyoları lamel kenarı boyunca hizalayın ve bir pipet kullanarak fazla suyu dikkatlice alın. Karışımın 2 nL'sini her 1 hücreli aşama embriyosunun blastodiskine enjekte edin. Enjeksiyonu takiben, embriyoları mavi suyla nazikçe durulayın ve taze bir tabağa aktarın. Son olarak, tabağı yetiştirme için 28 °C'lik bir inkübatöre koyun.
      NOT: Metilen mavisi çalışma solüsyonunu (mavi su) aşağıdaki gibi hazırlayın: 180 g deniz tuzunu 2,7 L damıtılmış suda çözün ve 100x deniz suyu stoğu yapmak için sterilize edin. 1/100x deniz suyu elde etmek için bu stoğu steril damıtılmış su ile 200 kat seyreltin. Nihai çalışma çözeltisini hazırlamak için bu 1/100x deniz suyunun 1 L'sine 10 μL %5 (m/h) metilen mavisi stok çözeltisi ekleyin.
    4. 24 hpf'de, sağlam ve her yerde BFP ekspresyonu sergileyen embriyoları seçin. 4 dpf'de, yalnızca güçlü transgenik floresan sinyallerini koruyanları yükseltin (Şekil 9).

3. Çift transgenik embriyoların karakterizasyonu

  1. Çift transgenik embriyoların fenotiplendirilmesi
    1. Vahşi tip erkeklerle çiftleşen mozaik transgenik kurucu dişilerden embriyoları toplayın.
    2. BFP pozitif (BFP +) embriyoları bir floresan steromikroskop altında tek hücreli aşamada alın.
    3. BFP + embriyolarında ortaya çıkan ancak BFP embriyolarında ortaya çıkmayan gelişimsel kusurları tanımlayın.
    4. Embriyoları gece boyunca 4 ° C'de% 4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin. Gerektiğinde tam montajlı in situ hibridizasyon, immünofloresan boyama veya diğer histolojik analizler yapın.
      NOT: Yalnızca GFP veya BFP pozitif sgRNA eksprese eden embriyolarda ortaya çıkan kusurlu fenotipler güvenilirdir. Sonuçlar dikkatli bir şekilde çıkarılmalı ve maternal mutant fenotipler 10'dan fazla vaka ile doğrulanmalıdır.
  2. Maternal mutant embriyoların genotiplenmesi
    NOT: M'nin tanımlanması içinrbm24a embriyolar, floresan mikroskobu altında Rbm24a-RFP'nin yokluğuyla kolayca alınabilirler. Buna karşılık, diğer genlerin maternal mutantlarının tanımlanması, esas olarak zigotik genom aktivasyonundan önce bir hücre aspirasyon stratejisine ve ardından toplanan hücrelerdeki maternal mRNA'ların RT-PCR analizine dayanır (Şekil 10).
    1. Hücre aspirasyonu
      1. 1/3x Ringer tamponunda çözerek ve eriyene kadar kaynatarak %1.5'lik bir agaroz çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi 90 mm'lik bir Petri kabına dökün ve erimiş agarozun içine bir kalıp (WPI, z-kalıpları) yerleştirin. Katılaştıktan sonra kalıbı nazikçe çıkarın ve kullanıma hazır bir plaka elde edin.
      2. Eriyik sızdırmaz iğneler oluşturmak için cam kılcal damarlar ve bir çektirme kullanın. Optimum hücre aspirasyon iğneleri için, iki hafif ağırlığı ve ısıtma gücünü Lv1: 60 ve Lv2: 90 olarak ayarlayın ve Adım 2 prosedürünü seçin. 30-40 μm'lik bir açılma çapı elde etmek için kılcal uçları sivri uçlu cımbızla kesin ( Malzeme Tablosuna bakın). Daha sonra, penetrasyona yardımcı olan ve embriyoya verilen zararı en aza indiren bir mikro dövme kullanarak iğne ucunda bir sivri uç oluşturun.
      3. Varsayılan kadın kurucuları vahşi tip zebra balığı ile eşleştirin ve embriyoları toplayın. BFP pozitif embriyoları tek hücreli aşamada izole edin.
      4. 3 hpf'de, embriyoları 1 mg / mL Pronaz'da 1/3x Ringer tamponunda 10 dakika inkübe ederek ve hafif pipetleme ile dekoryonlayın ve embriyoları 1x penisilin-streptomisin ile desteklenmiş 1/3x Ringer tamponu ile doldurulmuş agaroz plakasına dikkatlice yerleştirin. Embriyoları, blastomer kılcal uca doğru yönlendirilecek şekilde yeniden yönlendirin.
        NOT: Embriyoların dikkatli bir şekilde transfer edilmesi çok önemlidir, çünkü koryonun koruması olmadan son derece kırılgandırlar. Ortamın yüzeyine dokunmalarına izin vermeyin!
      5. Kılcal hareketten15 gelen aspirasyon kuvvetini telafi eden denge basıncını dikkatlice azaltarak her embriyodan 20-40 hücreyi aspire etmek için bir mikroenjektör kullanın. Denge basıncını artırarak bu hücreleri PCR tüplerinin açılış kenarında 2 μL deiyonize H2O'ya bırakın.
        NOT: Çapraz kontaminasyonu önlemek için, cam iğne her aspirasyondan önce deiyonize H2O 3x emilerek ve çıkarılarak temizlenmelidir.
      6. Hücreleri yıkamak için 200 μL RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyin ve tüpleri geçici olarak buz üzerinde saklayın. Daha sonra, gelişimsel kusurları olan veya olmayan embriyolardan elde edilen hücrelerin genotiplerini analiz edin.
        NOT: Ekstraksiyon reaktifinde korunan hücreler, karşılık gelen embriyolar anormal fenotipler sergileyene kadar -20 ° C'de saklanabilir.
      7. Hücre aspirasyonundan sonra embriyoları agaroz plakasında bırakın veya 1x penisilin-streptomisin içeren 1/3x Ringer solüsyonu ile su basmış 24 oyuklu plakalara tek tek yerleştirin.
        NOT: Dekoryonlu embriyoların transferine özen gösterilmelidir! Tipik olarak, yaklaşık 1 saat süren bir deneyde 20-40 embriyoyu inceliyoruz.
    2. Aspire edilen hücrelerde ilgilenilen maternal mRNA'nın analizi
      1. Ekstraksiyon reaktifindeki hücrelere 40 μL kloroform ekleyin ve hafifçe karıştırın. Karışımı 12.000 × g'da 4 °C'de 1 dakika santrifüjleyin.
      2. Süpernatanı dikkatlice toplayın. 1 μL glikojen çözeltisi (20 mg / mL) ve eşit miktarda izopropanol ekleyin (Süpernatantın hacmi 100 μL ise, 100 μL izopropanol ekleyin) ve iyice karıştırın. Çökelmeyi kolaylaştırmak için karışımı -20 °C'de 30 dakika inkübe edin.
        NOT: Aspire edilen hücrelerdeki az miktarda toplam RNA nedeniyle, çökeltme verimliliğini artırmak ve çökeltinin görselleştirilmesini kolaylaştırmak için glikojen eklenmelidir.
      3. Numuneyi 12.000 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
      4. Peleti 500 mL %70 etanol ilavesiyle 2x yıkayın ve 12.000 × g'da 1 dakika santrifüjleyin.
      5. Sıvıyı atın ve peletin oda sıcaklığında 5 dakika kurumasını sağlamak için kapağı açın.
      6. Peleti çözmek için 7 μL su ekleyin. Kullanım kılavuzunda verilen ayrıntılı protokolü izleyerek Birinci iplikli cDNA sentez kitini kullanarak ters transkripsiyon yapın.
      7. Tüm kodlama bölgesini uygun primerlerle yükseltin (Malzeme Tablosuna bakın) ve agaroz elektroforezini çalıştırın.
      8. PCR ürünlerini klonlayın ve mRNA'larda ortaya çıkan mutasyonu analiz etmek için her embriyo için en az 30 klon dizileyin.
        NOT: Kusurlu bir fenotipin varlığının, ilgili maternal faktörün hedeflenen mutasyonundan kaynaklandığını doğrulamak için, kusurlu fenotiplere sahip tüm embriyolar (n > 5) vahşi tip maternal transkriptlerin yokluğunu göstermelidir. Tersine, vahşi tip maternal mRNA'lar, normal olarak gelişen tüm sgRNA eksprese eden embriyolarda bulunmalıdır (n > 5). Aynı zamanda, sgRNA-negatif embriyolarda, sadece vahşi tip mRNA'lar tespit edilebilir (n > 5).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

rbm24a maternal mutantların hızlı üretimi
Bir maternal BFP markörünün ve rbm24a kodlama dizisini hedefleyen dört yüksek verimli sgRNA'nın ekspresyonunu sağlayan bir transgenik vektör oluşturduk. Bu vektörün Tol2 transpozisyonu yoluyla homozigot rbm24a-RFP KIzpc:cas9 embriyolarına sokulmasını takiben, Rbm24a-RFP proteininin yokluğuna bağlı olarak BFP pozitif F1 embriyoları arasında Mrbm24a kolay ve hızlı bir şeki...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Ölümcül zigotik mutasyonlar, bir genin maternal katkısının analizini engeller. Alternatif stratejiler, özellikle germ hattı replasmanı ve Oosit Mikroenjeksiyonu In Situ (OMIS), teknik olarak zorlayıcıdır 6,8. Germ hattı replasmanının hücre nakli sürecinde, alıcı embriyo çok az sayıda PGC alır ve genellikle normal kadın gelişimini engeller 16,17,18.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Bu protokol, Çin Ulusal Fikri Mülkiyet İdaresi tarafından patent olarak verilmiş olup, yazarların izni alındıktan sonra yöntemin kısıtlı kullanımını ortadan kaldıracaktır. Yazarlar başka hiçbir rakip veya mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yaşam Bilimleri Okulu Çekirdek Tesis ve Hizmet Platformu'ndan Jianlin Shen, Yiteng Xu ve Qingqing Wei'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibeler 32170816, 32370860, 32450630 ve 31871451), Shandong Üniversitesi Seçkin Orta Yaşlı ve Genç Akademisyenler Programı, Shandong Eyaleti Taishan Bursluları tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2x M5 HiPer Taq PCR karışımıMei5bioKedi#MF001-BD-100
AgarozMDbiyografiKedi#A006L
AxyPrep Plazmid Miniprep KitiAxygenKedi#AP-MN-P-4
Kılcal elektroforez cihazı (Qsep400)BiOptikYOK
DIG etiketleme karışımıRocheKedi#11277073910
DNase IRocheKedi#4716728001
DTTThermo Fisher BilimselKedi#R0861
Birinci iplikli cDNA sentez kitiTransGen BiyoteknolojiKedi#AT301
GenCrispr NLS-Cas9-NLS NükleazGenScriptKedi#Z03389
Cam kılcal damarlar (1,0 x 100 mm)Rantai Eğitim Ekipmanları FabrikasıKedi#OS-2B
GlikojenBBI Yaşam BilimleriKedi#28985
GraphPad Prizma 9Grafik Pedihttps://www.graphpad.com/
ResimJAçık kaynakhttps://imagej.net/software/fiji/
Düşük erime noktalı agarozBiyoteknolojiKedi#CA1351
Mikro dövme (MF2)NARISHIGEYOK
Mikro spektrofotometre (Nano-300)ALLSHENGYOK
OlyVIAOLYMPUSYOK
Penisilin-streptomisinGibcoKedi#15140122
Pico-Litre Enjektör (PLI-100A) Harvard AparatıYOK
Sivri uçlu cımbızTEFEKedi#500341
Sivri uçlu cımbız  WPI 500341
Çektirme (PC-100)NARISHIGEYOK
RiboLock RNaz İnhibitörüThermo Fisher BilimselKedi#EO0381
rNTPThermo Fisher BilimselKedi#R0481
Silikon hidroksil manyetik boncuklarSangon BiyoteknolojiKedi#B518720-0001
T7 RNA polimerazNEBKedi#M0251L
ZoldTEFECat# z-kalıpları

Kaynaklar

  1. Fuentes, R., et al. The maternal coordinate system: Molecular-genetics of embryonic axis formation and patterning in the zebrafish. Curr Top Dev Biol. 140, 341-389 (2020).
  2. Yan, L., et al. Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates. Science. 362 (6417), eaat1045(2018).
  3. Abrams, E. W., et al. Molecular genetics of maternally-controlled cell divisions. PLoS Genet. 16 (4), e1008652(2020).
  4. Shao, M., et al. Rbm24 controls poly(A) tail length and translation efficiency of crystallin mRNAs in the lens via cytoplasmic polyadenylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (13), 7245-7254 (2020).
  5. Weidinger, G., et al. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13 (16), 1429-1434 (2003).
  6. Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14919-14924 (2002).
  7. Xing, Y. Y., et al. Mutational analysis of dishevelled genes in zebrafish reveals distinct functions in embryonic patterning and gastrulation cell movements. PLoS Genet. 14 (8), e1007551(2018).
  8. Wu, X., Shen, W., Zhang, B., Meng, A. The genetic program of oocytes can be modified in vivo in the zebrafish ovary. J Mol Cell Biol. 10 (6), 479-493 (2018).
  9. Zhang, C., et al. Generation of zebrafish maternal mutants via oocyte-specific knockout system. Bio Protoc. 14 (21), e5092(2024).
  10. Zhang, C., et al. Rapid generation of maternal mutants via oocyte transgenic expression of CRISPR-Cas9 and sgRNAs in zebrafish. Sci Adv. 7 (32), abg4243(2021).
  11. Li, J., et al. Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Cell Res. 25 (5), 634-637 (2015).
  12. Zhang, Y., et al. Rbm24a dictates mRNA recruitment for germ granule assembly in zebrafish. EMBO J. 44 (11), 3121-3149 (2025).
  13. Xia, Y., et al. T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 47 (3), e15(2019).
  14. Yin, L., et al. Multiplex conditional mutagenesis using transgenic expression of Cas9 and sgRNAs. Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).
  15. Shao, M., Cheng, X. N., Liu, Y. Y., Li, J. T., Shi, D. L. Transplantation of zebrafish cells by conventional pneumatic microinjector. Zebrafish. 15 (1), 73-76 (2018).
  16. Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
  17. Aharon, D., Marlow, F. L. Sexual determination in zebrafish. Cell Mol Life Sci. 79 (1), 8(2021).
  18. Ye, D., et al. Abundance of early embryonic primordial germ cells promotes zebrafish female differentiation as revealed by lifetime labeling of germline. Mar Biotechnol (NY). 21 (2), 217-228 (2019).
  19. Wang, X., et al. Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors. Nat Commun. 14 (1), 7918(2023).
  20. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  21. Bertho, S., et al. Zebrafish dazl regulates cystogenesis and germline stem cell specification during the primordial germ cell to germline stem cell transition. Development. 148 (7), dev.187773(2021).
  22. Houwing, S., et al. A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish. Cell. 129 (1), 69-82 (2007).
  23. Shao, M., et al. Vegetally localised Vrtn functions as a novel repressor to modulate bmp2b transcription during dorsoventral patterning in zebrafish. Development. 144 (18), 3361-3374 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Zebrafish Genom D zenlemeOosit zg NakavtTol2 siz ZebrafishMaternal Fakt r SilinmesiEmbriyo MikroenjeksiyonuH cre AspirasyonuFloresan Protein Mark rTers Transkripsiyon PCR
zpc:cas9 knock-in zebra balığı kullanılarak maternal mutantların üretilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.