Büyük Etki için Ölçeği Küçültme: Kolaylaştırılmış Yüksek Verimli Rekombinant Adeno-İlişkili Virüs Üretimi

Philip Ohland; Miriam L. Ferreiro; Jatina Schumacher; Linda E. Franken; Catherine McKenzie; Thomas Steininger; Philippe Ringler; Matthias E. Lauer; Denis Phichith; Julia Fakhiri

doi:10.3791/68646

Yöntem makalesi

Büyük Etki için Ölçeği Küçültme: Kolaylaştırılmış Yüksek Verimli Rekombinant Adeno-İlişkili Virüs Üretimi

DOI:

10.3791/68646

⸱

12 Eylül 2025

Philip Ohland¹^,²^,³ , Miriam L. Ferreiro¹ , Jatina Schumacher¹ , Linda E. Franken¹ , Catherine McKenzie¹ , Thomas Steininger⁴ , Philippe Ringler¹^,⁵ , Matthias E. Lauer¹ , Denis Phichith¹ , Julia Fakhiri⁴

¹Roche Pharma Research and Early Development, Therapeutic Modalities, Roche Innovation Center Basel, Hoffmann-La Roche Ltd, ²Roche Pharma technical development Cell and Gene Therapy, Roche Innovation Center Munich, Roche Diagnostics GmbH, ³Center of Biomedical Education and Research - ZBAF, University of Witten/Herdecke, ⁴Roche Pharma Research and Early Development, Therapeutic Modalities, Roche Innovation Center Munich, Roche Diagnostics GmbH, ⁵Biozentrum, University of Basel

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen aktarımında yaygın olarak kullanılmasına rağmen, rekombinant adeno-ilişkili viral (rAAV) vektörler dikkate değer üretim zorluklarıyla karşı karşıyadır. Bu protokol, hem yapışkan hem de süspansiyon hücrelerini kullanan mikro ölçekli ve mini ölçekli üretim yöntemlerini özetlemektedir. Yöntemler vektör üretimini, saflaştırmayı ve optimizasyonu kolaylaştırır, böylece klinik öncesi araştırmaları hızlandırır ve gen terapisi hattındaki ilerlemeyi kolaylaştırır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, rekombinant adeno-ilişkili viral (rAAV) vektörler, gen terapisi uygulamaları için önde gelen bir platform olarak ortaya çıkmıştır. Ancak hantal üretim ve saflaştırma süreçleri ilaç geliştirmede önemli darboğazlar olmaya devam ediyor. Emek yoğun ve zaman alıcı saflaştırma prosedürleri olmadan yüksek verimli, küçük ölçekli rAAV üretimi, klinik öncesi araştırmaları ve erken aşama terapötik taramayı hızlandırmak için değerli bir alternatif strateji sunar. Bu yaklaşım, ilk in vitro ve in vivo değerlendirme için yeterli kalitede çeşitli rAAV varyantlarının veya terapötik yapıların hızlı bir şekilde üretilmesini sağlar. Bu protokol, hücre tipi ve üretim ölçeğine göre ayırt edilen iki yöntem sunar: mikro ölçekli ve mini ölçekli rAAV üretimi. Mikro ölçekli üretim, yapışık insan embriyonik böbreği (HEK) 293T hücreleri (mikro-6 kuyulu) kullanılarak 6 oyuklu bir formatta gerçekleştirilirken, mini ölçekli üretim, 24 oyuklu plakalarda (mini-HT24) süspansiyon hücrelerini kullanır. Bu yöntemlerle üretilen vektörler, hücre kültürleme koşullarını optimize etmek için aşağı akış analizlerine tabi tutulur ve/veya transgenlerin biyolojik aktivitesini değerlendirmek için kullanılır. Temel analitik okumalar arasında vektör genom titrasyonu (vg/mL), kapsid titresi tayini (vp/mL), western blot analizi ve hücre transdüksiyon analizleri yer alır. Ek olarak, mini ölçekte üretilen ve afinite reçineleri kullanılarak yarı saflaştırılmış vektörler, sezyum klorür yoğunluk gradyanları ile saflaştırılan orta ölçekli preparatlarla karşılaştırılır. Burada açıklanan kolaylaştırılmış yöntemler, hücre kültürü parametrelerinin rafine edilmesi, taramalar sırasında lider adayların belirlenmesi (yani, optimize edilmiş transgen kasetleri veya üstün AAV kapsidleri) ve transgen ekspresyonunun arttırılması için önemli bir potansiyel göstermektedir. Toplu olarak, sunulan iş akışları, herhangi bir araştırma laboratuvarında kolayca uygulanabilen gen terapisi boru hattında yinelemeli geliştirme için sağlam ve verimli bir platformun kurulmasını destekler.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlaç geliştirme, hedef belirleme, klinik öncesi doğrulama ve klinik araştırmalar dahil olmak üzere çeşitli aşamalardan yüksek kaliteli verilerin entegre edilmesini gerektiren karmaşık ve kaynak yoğun bir süreçtir¹. Daha hızlı zaman çizelgeleri ve daha düşük maliyetler² için artan taleplere yanıt olarak, ilaç endüstrisi, modern geliştirme stratejilerinin ^3,4,5 temel taşı olarak gelişmiş yapay zeka (AI) ile birlikte yüksek verimli (HT) küçük ölçekli tahlilleri giderek daha fazla benimsemiştir. HT tahlilleri, geleneksel yöntemlere kıyasla çok sayıda ilaç adayının veya tahlil değişkeninin zaman ve maliyetten çok daha az bir maliyetle hızlı bir şekilde taranmasına ve değerlendirilmesine olanak tanır ^5,6.

Gen terapisi uygulamalarında, özellikle adeno-ilişkili viral (AAV) vektörleri kullananlarda, yüksek mal maliyeti ve uzun üretim zaman çizelgeleri önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır⁷. Geliştirme süreci, transfeksiyon için gerekli plazmit materyalinin üretilmesiyle başlar, ardından viral vektör üretimi için yeterli yüksek yoğunluklara hücre büyümesi gelir. Transfeksiyondan sonra, hasattan önce iki ila beş günlük bir inkübasyon süresine ihtiyaç vardır ve süreç, saflaştırma ve parti karakterizasyonu ^8,9 ile sona erer. Toplu olarak, bu iş akışı bir aya kadar sürebilir ve tipik olarak afinite sütunları veya gradyan ultrasantrifüjleme ^9,10,11,12 kullanılırken paralel olarak çalışabilen sınırlı sayıda hazırlıkla sınırlıdır.

Küçük, mini veya mikro ölçekli AAV üretim protokollerine olan ihtiyacın farkında olan alan, küçük laboratuvar ölçekli kurulumlarda rekombinant AAV (rAAV) üretmek için çeşitli yaklaşımlar benimsemiştir. Bu yaklaşımlar tipik olarak, süspansiyon kültürleri için^13,14 veya 50-2000 mL 15 çalkalama şişeleri için yapışık hücreler için birden fazla¹⁵ cm'lik tabakların kullanılmasını içerir. Geçmişte, gradyan ultrasantrifüjleme (örneğin, iyodiksanol¹⁶, sezyum klorür (CsCl)¹⁷ veya sükroz gradyanları¹⁸) gibi AAV saflaştırma yöntemleri kullanılmıştır. Bu ucuz ve serotipten bağımsız yöntem, laboratuvar ölçeğinde rAAV üretmek için oldukça uygundu, ancak emek yoğun doğası ve sınırlı ultrasantrifüj kapasitesi, onu yüksek verimli uygulamalar için daha az elverişli hale getiriyor^19,20.

Daha yüksek verim için devam eden talep, rAAV üretiminin ölçeğini küçültmek için alternatif yaklaşımların araştırılmasına yol açtı. Yapışık hücreler kullanılarak, 6 oyuklu ^13,21,22, 96 oyuklu²³ ve hatta 384 oyuklu plakalar²⁴ gibi formatlar araştırılmıştır. Daha yakın zamanlarda, geliştirilmiş ölçeklenebilirlikleri ve vektör preparatlarının karşılaştırılabilir ve hatta üstün gücü göz önüne alındığında, süspansiyon hücreleri benimsenmiştir⁸.

Bununla birlikte, kültür hacimleri 15 mL'den az olan süspansiyon hücrelerinde yüksek verimli rAAV üretimi, sınırlı yayınlanmış protokoller ^7,25,26 ile özel bir alan olmaya devam etmektedir. Çoğu çalışma, aşağı akış uygulamaları ^8,9,27 için yeterli verim elde etmek için daha büyük hacimlere odaklanır, ancak yapışık hücrelerde olduğu gibi, mini ölçekli formatlar kaynak tüketiminde ve işlem süresinde önemli azalmalar sunar ve böylece sahadaki kritik bir ihtiyacı karşılar. Daha da önemlisi, mini ve mikro ölçekli protokoller, aşağı akış karakterizasyonu ve analizleri için sıklıkla "ham lizatlar" veya vektör parçacıkları içeren saflaştırılmamış hücre kültürü hasatlarını kullanır.

Bu çalışma, hem yapışık hem de süspansiyon üretici hücreleri kullanan iki protokolü özetlemektedir (Şekil 1). Yapışık HEK293T hücrelerinden üretilen ham rAAV lizatları, hedef hücrelerin transdüksiyonu gibi sonraki uygulamalar için doğrudan kullanılır. Buna karşılık, süspansiyon hücrelerinde üretilen rAAV'ler, yüksek verimli afinite reçinesi saflaştırması yoluyla daha fazla işleme tabi tutulur. Bu yöntemler, pahalı reaktiflerin ve malzemelerin tüketimini en aza indirirken verimi artırmak, vektör kalitesini değerlendirmek ve transgen ekspresyonunu izlemek için özel olarak geliştirilmiştir. Burada sunulan sonuçlar, uygulamanın kapsamına bağlı olarak hem ham lizatların (yapışık hücrelerden) hem de afiniteyle saflaştırılmış malzemenin (süspansiyon hücrelerinden) uygun olduğunu göstermektedir. Ayrıca, afinite reçineleri kullanılarak elde edilen rAAV, insan kaynaklı nöronal ko-kültürlerde verim, saflık ve transdüksiyon verimliliği açısından geleneksel sezyum klorür ultrasantrifüjleme kullanılarak saflaştırılan muadilleriyle doğrudan karşılaştırıldı.

Gen terapisi ilaç geliştirmede yüksek verimli, küçük ölçekli analizlerin benimsenmesi, yeniliği hızlandıran ve bilimsel keşif ile terapötik gerçeklik arasındaki boşluğu dolduran vazgeçilmez bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Bu yöntemler yalnızca maliyetleri ve zaman çizelgelerini azaltmakla kalmaz, aynı zamanda çok sayıda koşulun paralel olarak test edilmesini sağlar ve sonuçta dönüştürücü tedavilerin verimli bir şekilde geliştirilmesine katkıda bulunur.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Yapışık hücrelerde rAAV vektörlerinin mikro-6 kuyulu üretimi

NOT: rAAV'nin mikro-6 kuyucuklu üretimi, Fakhiri ve ^ark.21 tarafından daha önce yayınlanmış bir protokolden uyarlanmış bir versiyondur.

HEK293T hücrelerinin tohumlanması ve transfeksiyonu
1. Bir şişe HEK293T hücresi^28'i 37 °C'de bir su banyosunda çözün.
2. Hücreleri T175 şişelerinde 30 mL yapışkan hücre kültürü ortamına aktarın ve Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) + %10 Fetal Buzağı Serumu (FCS), 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de tutun.
3. Her 2-3 günde bir HEK293T bölün: Hücre kültürü ortamını aspire edin ve hücreleri yıkamak için dikkatlice 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
  NOT: Bu protokolde, rAAV üretimini doğrudan etkileyen hücrelerin bütünlüğünü ve sağlığını sağlamak için sadece 15 numaralı pasajın altındaki hücre pasajları kullanılmıştır.
4. Hücrelere 2 mL %0.025 Tripsin/Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve 37 °C'de (veya hücreler ayrılana kadar) 2 dakika inkübe edin.
5. 20 mL taze ortam ekleyerek ve hücreleri 25 mL'lik bir pipet kullanarak ortamdaki süspanse ederek reaksiyonu durdurun. Birleşmeye bağlı olarak, hücreler 24 mL DMEM yüksek glikoz ortamında 1:10 veya 1:20 oranında seyreltilebilir. Transfeksiyon için yeterli hücre yoğunluğu elde etmek için, bir T175 şişesinde 7^{× 10 6 HEK293T}hücre tohumlayın.
6. 37 °C'de 72 saat sonra, hücreleri tripsinizasyon yoluyla toplayın (adım 1.1.3-1.1.5'te açıklandığı gibi), 20 mL ortamda tekrar süspanse edin ve hücreleri sayın.
  NOT: Hücreler, istenen doğruluğa, verime ve mevcut ekipmana bağlı olarak çeşitli yöntemler kullanılarak sayılabilir. Temel olarak iki yaklaşım kullanılır: manuel sayım (Neubauer odası) ve otomatik hücre sayaçları. Bu protokol, canlılık, hücre yoğunluğu ve toplanma hızı gibi kritik hücre parametrelerini ölçmek için tam otomatik, görüntü tabanlı bir hücre analizörü kullanır.
7. 6 oyuklu bir plakada 0,5 × 10⁶ hücre/kuyu yoğunluğunda tohum hücreleri. Hücreleri eşit olarak dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın ve CO₂ inkübatörüne yerleştirin.
8. 24 saat sonra hücreler %60-70'lik bir birleşme noktasına ulaşır ve üçlü transfekte edilebilir.
9. Her kuyucuk için 90 μL serumsuz ortamı pTransgene, pRep/Cap ve pHelper dahil olmak üzere toplam 2.6 μg plazmit DNA ile 1:1:1 molar oranında karıştırın.
10. İkinci bir tüpte, transfeksiyondan hemen önce 90 μL serumsuz ortama 5 μL Polietilenimin (PEI) ekleyin.
11. İki çözeltiyi birleştirdikten sonra, karışımı vorteksleyin ve oda sıcaklığında (RT) 10 dakika inkübe edin.
12. Transfeksiyon karışımını her bir kuyucuğa damla damla ekleyin. Plakaları inkübatöre geri yerleştirmeden önce hafifçe sallayın.
  NOT: Transfeksiyondan sonra bir ortam değişikliği yapılabilir, ancak hücreler deney boyunca iyi canlılığı koruduğu için standart bir uygulama olarak uygulanmamıştır.
Hücrelerin hasadı ve parçalanması
1. Transfeksiyondan 72 saat sonra, hücre ortamını plaka(lar)dan dikkatlice aspire edin.
2. Her bir oyuğa 500 μL PBS ekleyerek Hücreleri ayırın ve dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin.
3. Hücre süspansiyonunu 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
4. Üreticinin talimatlarını izleyerek hücre canlılığını ve yoğunluğunu manuel veya otomatik olarak ölçün.
5. Akış sitometrisi yoluyla raportör-pozitif popülasyonları ölçerek transfeksiyon verimliliğini belirlemek için süspansiyondan 50 μL'yi 96 U-tabanlı bir plakaya aktarın.
  NOT: Her zaman paralel olarak bir transfeksiyon kontrolünün yapılması önerilir, yani plaka üzerindeki transfeksiyon verimliliğini izlemek için bir floresan proteini (örneğin, yeşil floresan proteini (GFP), mCherry, vb.) taşıyan bir transgen ile 1-2 kuyucuğun transfeksiyonu. Transdüksiyona tabi tutulmamış hücrelere sahip kuyucuklar negatif kontrol görevi görür.
6. Kalan hücre süspansiyonunu, üretilen vektörlerin ana kısmını içeren pelet hücrelerine RT'de 10 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin.
7. Süpernatanı atın ve hücreleri 100 μL PBS'de yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonu -80 °C'de saklanabilir.
  NOT: Hasat edilen hücrelerden ham bir lizat elde etmek için aşağıda açıklanan iki yaklaşımdan birini kullanın.
8. İlk yaklaşımda hücreler, 37 °C'lik önceden ısıtılmış su banyosu ve sıvı nitrojen kullanılarak her biri 5 dakikalık beş donma-çözülme döngüsüne tabi tutulabilir. Numuneleri döngüler arasında 2-3 saniye boyunca kısaca vorteksleyin.
9. Bu protokolde ikinci ve esas olarak kullanılan seçenek sonikasyondur. Burada, hücre süspansiyonunu ince duvarlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) plakalarına veya tüplerine aktarın ve 4 ° C'de bir su banyosu sonikatörüne yerleştirin.
  1. Örnekleri %25 genlikte (yoğunluk) 30 s açma-kapama artışlarıyla toplam 3 dakika boyunca sonikasyon yapın.
10. Sonikasyondan sonra, hücre kalıntılarını gidermek ve hücresiz bir vektör süspansiyonu elde etmek için hücreleri bir masa üstü santrifüj (4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.100 × g ) kullanarak peletleyin.
11. Süpernatanları 1.5 mL'lik tüplere aktarın ve dijital damlacık (dd)PCR veya dijital (d)PCR analizi için her numuneden 10 μL'yi düşük bağlayıcı 96 oyuklu bir plakaya pipetleyin.
12. Tüpleri ve 96 oyuklu plakaları daha fazla kullanana kadar -80 °C'de saklayın.
Ham lizatlar kullanılarak HEK293A hücrelerinin transdüksiyonu
NOT: HEK293A hücreler tüm AAV serotipleri için uygun olmayabilir. Uygun bir hücre hattını belirlemek için lütfen SPIRIT²⁹ (SPIRIT veritabanına bağlantı için Malzeme Tablosuna bakın) veya ilgili orijinal araştırma makaleleri^30,31 gibi veritabanlarına bakın.
1. Tohum HEK293A hücreleri, transdüksiyondan bir gün önce plaka başına 1.5 × 10⁶ hücre yoğunluklarında üç adet 96 oyuklu plakaya yerleştirin.
2. Ertesi gün, 1:2, 1:10 ve 1:100 seyreltmeler oluşturmak için üretilen vektörlerin 10 μL'sini farklı hacimlerde PBS ile karıştırın.
3. Çok kanallı bir pipet kullanarak, hücreleri 96 oyuklu plakalar halinde teknik üçlü kopyalar halinde dönüştürün.
4. Hücreleri 72 saat boyunca ortam değişimi olmadan rAAV'lerle inkübe edin. Bundan sonra, protein seviyesi ölçümleri, floresan protein ekspresyonu için akış sitometrisi analizi, nakavt/nakavt analizleri vb. gibi eksprese edilen transgene bağlı olarak aşağı akış deneylerini gerçekleştirin.
5. Bu protokolde gerçekleştirilen standart akış sitometrisi için, ortamı aspire edin ve 25 μL %0.025 Tripsin/EDTA ekleyerek hücreleri ayırın.
6. 37 °C'de 3 dakika inkübe edin.
7. Her bir oyuğa PBS'de 175 μL %1 sığır serum albümini (BSA) ekleyerek reaksiyonu durdurun.
8. Akış sitometrisi analizi için 100 μL hücre süspansiyonu kullanın.

2. Süspansiyon hücrelerinde rAAV vektörlerinin Mini-HT24 üretimi

NOT: Mini-HT24 kurulumunda, daha önce açıklanan mikro-6 kuyulu üretimin aksine, süspansiyon hücreleri kullanılarak rAAV vektörlerinin saflaştırılmış preparatları üretilir. Süspansiyon kültürleri, aynı kültür hacmi içinde elde edilebilecek artan hücre yoğunlukları nedeniyle daha yüksek miktarlarda rAAV verir. Bu protokolde 24 derinlikli kuyu formatı kullanılmıştır. Ham hücre lizatları, ham lizatların uygun olmadığı belirli uygulamalar için gerekli olan daha temiz ürünler üretmek amacıyla AAVX afinite reçineleri kullanılarak yüksek verimde saflaştırılır (Tartışma bölümüne bakınız).

24 derin kuyucuklu plakalarda süspansiyon hücrelerinin yetiştirilmesi ve üçlü transfeksiyonu
1. Bir şişe süspansiyon Viral Üretim Hücresini (VPC) 37 °C'de bir su banyosunda çözün. Üretilen vektörlerin tutarlı kalitesini garanti etmek için hücreleri 30 defadan az geçirin.
2. Hücreleri bir çalkalama şişesinde 30 mL süspansiyon kültür ortamına aktarın ve bakım kültürü koşullarında 2-3 gün boyunca kültürleyin: 37 °C, %8 CO_2, %95 nem ve 140 rpm (çalkalama platformu yarıçapı 25 mm).
3. 2-3 gün sonra canlı hücre yoğunluğunu belirleyin (bkz. adım 1.1.6'daki NOT). AAV üretimi için gerekli olan istenen canlı hücre sayısına ulaşılana kadar alt kültürleme ve genişletme ile devam edin.
  NOT: > 4 × 10⁶ hücre/mL canlı yoğunlukta ve < 6 ×^{10 6} hücre/mL'lik canlı yoğunlukta veya kullanılan bireysel hücre hattına göre üreticinin talimatlarına göre alt kültür hücreleri. 3 gün boyunca 6 × 10⁵ hücre/mL canlı yoğunlukta tohumlayın, bölün veya 4 gün boyunca 3 × 10⁵ hücre/mL. Üreticinin talimatlarına göre bölün.
4. 24 × kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğunun 2,5 mL'sine 3^{10 6} hücre/mL tohumlayın ve plakayı steril bir membran kapağı ile kapatın.
5. Her rAAV yapısı için üçlü transfeksiyon karışımını aşağıdaki gibi hazırlayın:
  1. Üretim plazmitlerinin DNA Karışımını hazırlayın (pHelper, pRep/Capsid, pTransgene) 1:1:1 molar oranda, 1 × 10⁶ canlı hücre başına 600 ng DNA'lık bir nihai kütlede.
  2. Karışımı, transfekte edilecek kültür hacminin %2,5'i kadar bir nihai hacimde Süspansiyon Kültür Ortamında hazırlayın.
  3. PEI-Mix'i Süspansiyon Kültür Ortamında transfekte edilecek kültür hacminin %2.5'lik bir nihai hacminde hazırlayın. 1 ng DNA başına 1 ng PEI'lik bir son kütle kullanın.
  4. Tek tek PEI-Mix'in tüm hacmini karşılık gelen DNA-Mix'e aktararak hem DNA-Mix hem de PEI-Mix'i birleştirin, bu da kültür hacminin %5'i kadar bir transfeksiyon karışımı hacmi ile sonuçlanır.
  5. 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
    NOT: İnkübasyon³² sırasında oluşan PEI-DNA komplekslerinin bozulmasını önlemek için inkübasyon süresinden sonra transfeksiyon karışımını vortekslemeyin.
  6. RT'de 10 dakika inkübe edin.
6. Derin kuyu plakasını dikkatlice çalkalarken transfeksiyon karışımlarını ilgili kuyucuklara damla damla ekleyin.
7. Plakayı steril, nefes alabilen bir suni ipek film kullanarak kapatın ve buharlaşmayı en aza indirmek için ek olarak ilgili membran kapağıyla kapatın.
8. Plakanın uygun bir derin kuyu çalkalayıcı tepsisine yerleştirildiğinden emin olun ve sıkıca sabitleyin.
9. Hücreleri 37 °C, %8_CO2, %95 nem ve 225 rpm'de 72 saat inkübe edin.
  NOT: Farklı derin kuyulu plaka formatları, verimli gaz değişimini ve hücrelerin zamanla dibe çökmeden homojen bir süspansiyon içinde kültürlenmesini sağlamak için çalkalama hızının ayrı ayrı değerlendirilmesini gerektirir. Bu, bireysel laboratuvar ekipmanı ve kurulumunun yanı sıra üretim için kullanılan hücre hatlarına bağlı olarak ilk testleri gerektirir. Hücre süspansiyonunu homojen tutmak ve hücrelerin dibe çökmesini önlemek için özellikle çalkalama yarıçapını, plaka formatını ve kuyu tabanı şeklini göz önünde bulundurun.
Hasat ve lizis
1. Her bir oyuğun tam kültür hacmini ayrı ayrı etiketlenmiş 5 mL'lik tüplere aktararak hücreleri hasat edin ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca 800 × g'da santrifüjleyin.
2. Süpernatanı aspire edin ve peleti 550 μL Dulbecco'nun (D)PBS'sinde yeniden süspanse edin ve tüpleri açarken aerosolleri ve damlaları önlemek için süspansiyonu 1.8-2.0 mL vidalı kapaklı tüpe aktarın.
  NOT: Peletler daha sonra saflaştırma işlemine devam etmek için bu noktada da saklanabilir. Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) yeniden süspanse edilmiş peletlerini -80 °C'de saklayın ve donma-çözülme döngüsü adımları sırasında bunu dikkate aldığınızdan emin olun.
3. Tüpleri yaklaşık 2 dakika sıvı nitrojen içine koyarak ve ardından 37 °C'lik bir su banyosunda çözdürerek lizatları hazırlayın. Bu döngüyü 3-5x tekrarlayın.
4. 4 °C'de 1000 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj lizatları. Santrifüj kovalarını aerosol geçirmez kapaklarla kapatın.
5. Tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın.
  NOT: Saflaştırma işleminde kullanılan reçinenin tıkanmasını önlemek için lizatların berrak olması ve görünür kalıntı veya bulanıklık içermemesi gerekir. Peletleri sallamaktan veya rahatsız etmekten kaçının. Süpernatanların net olmaması durumunda santrifüjleme adımını tekrarlayın. Yüksek konsantrasyonlu numuneler veya büyük miktarda döküntü içeren numuneler durumunda daha yüksek bir santrifüj hızı veya daha uzun süre düşünün.
Afinite reçinesi bazlı yüksek verimli rAAV saflaştırması
1. Bir beherde, 75 mM sitrik asitlik nihai konsantrasyona ulaşmak için 50 mL ultra saf suya 720 mg sitrik asit ekleyerek Elüsyon Tamponunu hazırlayın.
2. Toz tamamen eriyene kadar Tamponu karıştırın.
  NOT: Kuyu hacminin, komşu kuyucukları dökmeden veya çapraz kontaminasyon riski oluşturmadan tampon hacimlerini ve pipet uçlarını barındırmak için yeterli olduğundan emin olun.
3. Tamponu sürekli karıştırırken ve bir pH elektrodu ile ölçerken damla damla 1 M hidroklorik asit (HCl) ekleyerek pH'ı 3,0'a ayarlayın.
4. 0,22 μm'lik bir gözenek boyutu kullanarak tampon üzerinde steril filtrasyon yapın.
5. Tablo 1'de açıklanan şemaya göre saflaştırma için 2-2,2 mL kuyu hacmine sahip 96 derin kuyulu bir plakanın kolonlarını hazırlayın.
  NOT: Buradaki numuneler elektronik çok kanallı pipet kurulumu kullanılarak saflaştırılmıştır. Proses, otomatik sıvı işleme sistemleriyle uyumludur ve daha yüksek numune verimi için ölçeklendirilebilir.
6. Saflaştırma şemasında gösterilen parametreleri kullanarak saflaştırmayı RT'deki bir biyogüvenlik kabininde çalıştırın (bkz. Tablo 1) veya reçine veya numune hacmine, beklenen titreye vb. bağlı olarak parametreleri bireysel gereksinimlere göre optimize edin.
7. Elüsyondan sonra, her numuneye 1/4 elüsyon hacmi Nötralizasyon Tamponu ekleyin.
8. Hacmin %80'ini 10x yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
9. Membran kasetlerini çıkararak ve her bir kuyucuğa 1600 μL Diyaliz Tamponu ekleyerek diyaliz plakalarını hazırlayın.
  NOT: Diyalizi gerçekleştirmeden önce membranları sıvı ile temas ettirmediğinizden emin olun, çünkü yeniden kurutma membran bütünlüğünü ve işlevini bozabilir.
10. Tam numune hacmini (maksimum 300 μL) uygun hacim formatına ve membran gözenek boyutuna (≥ 20.000 moleküler ağırlık kesimine (MWCO)) sahip bir diyaliz kasetine aktarın. Membranların homojen bir şekilde yüklendiğinden ve hava kabarcığı olmadığından emin olun.
11. Kasetleri diyaliz plakasının yüklü kuyucuklarına yerleştirin ve plakayı bir sızdırmazlık folyosu ile kapatın.
12. Diyaliz plakasını çalkalama platformuna aktarın ve 300 rpm, 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
13. Diyaliz tamponunu değiştirin ve inkübasyonu 300 rpm, 4 °C'de 30 dakika boyunca tekrarlayın.
14. Tampon değişimini ve inkübasyonu toplamda 3 kez tekrarlayın.
15. Diyalize edilmiş numunelerin tüm hacmini etiketli saklama tüplerine aktarın ve daha sonra karakterizasyon veya diğer deneyler için kullanılacaksa 4 °C'de saklayın.
16. Uzun süreli depolama için -80 °C'de saklayın. AAV'lerin gücünü etkileyebileceğinden donma çözülme döngülerinden kaçının ve gerekirse küçük hacimli alikotlar hazırlayın.
Ham lizatlardan rAAV genomik titresinin titrasyonu ve dijital PCR (dPCR) kullanılarak reçine bazlı saflaştırma
1. Ham lizatların genomik titresini, yani mL başına viral genomları (vg/mL) belirlemek için, hasat edilen vektör örneklerini RT'de çözün ve ardından 10 μL'yi bir tüpe pipetleyin.
  NOT: Bir vektör preparatının viral genom (vg / mL) titresini belirlemek için çeşitli yöntemler mevcuttur ve mutlak niceleme tipik olarak iki ana yaklaşıma dayanır: damlacık veya emülsiyon bazlı yöntem (ddPCR) ve dijital PCR (dPCR) ^33,34 ile temsil edilen mikroplaka tabanlı yöntem. Bu dijital yöntemlere ek olarak, kantitatif PCR (qPCR) kullanılarak mutlak miktar tayini de elde edilebilir. qPCR geleneksel olarak göreceli bir niceleme yöntemi olsa da, bir plazmit standart eğrisi kullanılarak mutlak niceleme için uyarlanabilir. Bu, viral genom titresi ^21,33'ü tahmin etmek için bir referans görevi gören, bilinen bir konsantrasyonda hedef diziyi içeren bir plazmidi içerir. qPCR, ddPCR veya dPCR'den daha hızlı ve daha ucuz olmasına rağmen, daha az kesindir ve büyük ölçüde plazmit standardının¹⁶ doğruluğuna dayanır. Miktar belirleme yönteminden bağımsız olarak, viral genomları parçacıklardan serbest bırakmak için numunelerin ön işleme tabi tutulması gerekir. Bu protokol, Dobnik, D. ve diğerleri³⁵ tarafından daha önce açıklanan bir yöntemi takip eder.
2. Transfeksiyon işleminden serbest plazmit DNA'yı parçalamak için rAAV örneklerini 37 °C'de 30 dakika boyunca bir nükleaz ile muamele edin.
  NOT: İsteğe bağlı, kullanılan enzime bağlı olarak: enzimi inaktive etmek ve vektörün kapsidini parçalamak için numuneleri 15 dakika boyunca 95 °C'ye ısıtın.
3. RT'ye soğuttuktan sonra, kapsid fragmanlarını sindirmek için 15 dakika boyunca Proteinaz K ekleyin.
4. Proteinaz K'nin inaktivasyonu için numuneleri tekrar 95 °C'ye 15 dakika ısıtın.
5. Üreticinin talimatlarını izleyerek ddPCR veya dPCR ana karışımlarını hazırlayın.
6. Araya giren boyalardan daha spesifik bir sinyal sağladıkları için etiketli DNA problarını kullanın. Promotör veya poliA kuyruğu yerine viral genomda, yani transgende (bkz. NOT) "merkezi olarak" bağlanacak problar tasarlayın ve heksakloro-6-karboksifloresein (HEX) veya 6-karboksifloresein (FAM) gibi bir florofor seçin ilgili PCR sistemi ile uyumludur.
  NOT: Son zamanlarda, titre belirleme^36,37'nin doğruluğunu arttırmak için viral genomun farklı bölgelerini hedefleyen primer/prob setleri kullanan multipleks ddPCR veya dPCR kullanılmıştır. Bu yaklaşım, referans verilen çalışmalarda özetlenen formülleri uygulayarak veya entegre yazılım çözümleri kullanarak bozulmamış genomların miktarının belirlenmesini sağlar.
7. Düşük DNA bağlayıcı 96 oyuklu plakalar kullanarak_ddH2O'da sonradan işlenmiş numunelerin 10 kat seri seyreltmesini gerçekleştirin. Son olarak, şablonun (10⁴- ve 10⁵ seyreltmeleri) 5.5 μL'sini (ddPCR için) veya 2 μL'sini (dPCR için) primer/problar dahil ddPCR/dPCR Master Mix'i zaten içeren ddPCR 96 oyuklu plakaya aktarın. Ölçümlerin doğrusal algılama aralığına girmesini sağlamak için seyreltme aralığını bireysel yapıların üretim verimliliğine göre ayarlayın.
  NOT: dPCR / ddPCR miktar tayini oldukça hassas bir yöntem olduğundan, numunelerin 10⁴ ve 10⁵ seyreltmesine ihtiyaç vardır.
8. ddPCR için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
  1. PCR amplifikasyonu için, kullanılan primer/prob set(ler)ine göre tavlama ve amplifikasyon sürelerinde ayarlamalar da dahil olmak üzere, test koşullarını optimize etmek için üreticinin talimatlarını izleyin. Bu çalışmada kullanılan standart döngü protokolü şu şekildeydi: 9 °C'de 10 dakika boyunca ilk denatürasyon (°C/s'lik rampa); 30 saniye boyunca 9 °C'de 35 döngü denatürasyon ve 60 saniye boyunca 6 °C'de amplifikasyon; ardından 9 °C'de 10 dakika boyunca son bir uzama adımı (rampa °C/s).
  2. rAAV viral genom hedeflerinin PCR amplifikasyonundan sonra, plakayı damlacık okuyucuya aktarın ve her bir kuyucuktaki floresan yoğunluğunu ölçmek için üreticinin talimatlarını izleyin. Damlacık okuyucu, viral genom kopya sayılarının pe μL reaksiyonunun mutlak miktarının belirlenmesini sağlar.
9. dPCR için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
  1. ddPCR tabanlı miktar tayini için açıklandığı gibi, test koşullarını optimize etmek için üreticinin talimatlarını izleyin.
  2. Başlangıç noktası olarak, 9 °C'de 2 dakika boyunca bir ilk denatürasyon adımını, ardından 9 °C'de 15 saniye boyunca 40 döngü denatürasyon ve 5 °C'de 30 saniye boyunca tavlama/uzatmayı içeren dPCR cihazında önceden ayarlanmış termal profili izleyin.
    NOT: Bu protokol, üretici tarafından belirtilen önerilen rampa hızları ve reaksiyon hacimleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
10. Tipik olarak cihaz üreticisi tarafından sağlanan çeşitli yazılım çözümlerini kullanarak ddPCR ve dPCR verilerini analiz edin (örneğin, sırasıyla QX yöneticisi ve QIAcuity Software Suite 1.2). Her iki yöntem için de, niceleme için yalnızca yeterli oranda pozitif/negatif bölüm/damlacık içeren numune seyreltmelerini seçin.
  NOT: Ham lizatlardan ve AAVX reçinesi ile saflaştırılmış malzemeden rAAV partikül titrelerinin (vp/mL; vp = viral partiküller) belirlenmesi için, bir Enzime bağlı İmmünosorbent Testi (ELISA) kullanılabilir., AAV miktar tayini için ticari olarak temin edilebilen çeşitli standart sandviç ELISA kitleri mevcuttur (bu çalışmada kullanılan kitler Malzeme Tablosunda listelenmiştir). Testi üreticinin kılavuz(lar)ına göre gerçekleştirin. Kullanılan ELISA kitinin üretilen AAV serotipiyle uyumlu olduğundan emin olun.
Saflaştırılmış rAAV'lerden VP oranının analizi
NOT: 24 derin kuyu kurulumunun ayrı kuyucuklarından alınan her numunenin viral kapsid protein (VP) oranını belirlemek için, standart western blot veya otomatik kılcal tabanlı protokoller gerçekleştirilebilir.
1. AAV2 kapsid proteinleri VP1, VP2 ve VP3'ü saptamak için birincil anti-AAV VP1/VP2/VP3 monoklonal antikoru kullanın. Birincil antikorun ilgili serotip veya kapsid varyantı ile çalıştığından emin olun.
2. Rekombinant VP1, VP2 ve VP3 veya bir AAV referans standardı gibi uygun pozitif kontroller kullanın.
3. Beklenen VP oranını taklit etmek için pozitif kontrolü 1:1:10 (VP1:VP2:VP3) moleküler oranında hazırlayın. Bu aynı zamanda sinyal alanı entegrasyonunu kullanarak VP oranı ölçümü için bir referans görevi görür.
4. En küçüğü (~ 60 kDa'lık VP3) ve en büyüğü (~82 kDa'lık VP1) dahil olmak üzere tespit edilecek kapsid proteinlerini kapsayan uygun bir aralığa sahip bir kılcal kit seçin. Bu, kullanılan serotip ve kapsid varyantına bağlı olarak değişebilir.
5. Kitte verilen reaktifleri ve biyotinlenmiş merdiveni üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
6. Her numune için iyi bir algılama aralığı sağlamak üzere kitin sağlanan seyreltme tamponunda numunelerin bir seyreltme serisini (1 ×^{10 12} vg/mL'den 1 × 10^vg /mL'ye kadar genomik titreye veya seyreltilmemiş numuneden başlayarak 1:64'e kadar 1:2 seyreltmelere dayalı) hazırlayın.
7. Birincil antikoru, üreticinin talimatlarına göre veya önceki testlere bağlı olarak sağlanan antikor seyreltme tamponunda seyreltin. 1:100 ile başlayın.
8. Birincil antikorun kaynağına bağlı olarak ilgili bir tespit kiti kullanın.
9. Plakayı kit ile birlikte verilen şemaya göre yükleyin.
10. Kuru çalışarak alet kılcal damarlarına zarar vermemek için boş sütunları su veya numune seyreltme tamponu ile doldurduğunuzdan emin olun.
11. Plakayı bir sızdırmazlık folyosu ile örtün ve 1200 × g, 5 dakika, 4 °C'de santrifüjleyin.
12. Plakayı ve kılcal damarları cihaza aktarın ve çalışma için önceden ayarlanmış standart koşulları kullanın.
13. Compass (sürüm 6.3.0)³⁸ gibi bir veri analizi yazılımı kullanarak çalıştırmayı analiz edin.
  NOT: Partikül bütünlüğünü, monodispersiteyi ve saflığı analiz etmek için negatif boyama transmisyon elektron mikroskobu (ns-TEM) önerilir. TEM analizi, Steininger ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi gerçekleştirilebilir. AL²⁵. Bununla birlikte, Kütle fotometrisi³⁹, SEC-MALS⁴⁰ ve şerit boyama⁴¹ gibi diğer yöntemler de rAAV preparatlarının kalitesini değerlendirmek için tamamlayıcı okumalar sağlayabilir.
Saflaştırılmış viral partiküller ile transdüksiyon
NOT: Saflaştırılmış viral vektörlere sahip hücreleri dönüştürmek için, çok sayıda enfeksiyon (MOI) belirlenmelidir. MOI, hücre başına eklenen partikül içeren genomların sayısı olarak tanımlanır. Bunun teorik bir değer olduğunu belirtmek önemlidir; hücre başına iletilen gerçek rAAV genom sayısı, kapsidin hedef hücreleri başarılı bir şekilde dönüştürme yeteneğine bağlıdır. Bu nedenle, optimal MOI her zaman deneysel olarak belirlenmelidir. Bu bölümde amaç, farklı saflaştırma yöntemleri (sezyum klorür ultrasantrifüjleme ve AAVX afinite reçinesi) kullanılarak üretilen iki viral vektör stokunu karşılaştırmaktı. Bu amaçla, insan kaynaklı nöronal ko-kültürler iki preparat ile transdüksiyona tabi tutuldu ve transdüksiyon etkinliği floresan mikroskobu kullanılarak değerlendirildi.
1. 96 oyuklu siyah bir optik alt plakayı gece boyunca 4 °C'de %0,1 (Poli-L-Ornitin) PLO ile kaplayın veya 37 °C'de ≥ 1 saat inkübe edin.
2. Tohumlama gününde, PLO kaplama reaktifini aspire edin ve Azaltılmış Büyüme Faktörü Bazal Membran Matrisi ile kaplayın ve 37 °C'de ≥1 saat inkübe edin.
3. Astrositli motor nöronları 1:6 oranında veya tedarikçinin tavsiyesine göre kültürleyin.
4. 2 gün in vitro (DIV), ko-kültürü 50.000'lik bir MOI'de dönüştürün.
5. Viral alikotları 4 °C'de çözün.
6. Transdüksiyon ortamı hazırlayın (hücre başına viral genomlara dayalı olarak istenen MOI'de viral vektörler + kuyu başına kültür ortamının %50'sini ikame etmek için uygun hacimlerde hücre kültürü ortamı).
7. Transdüksiyon ortamıyla %50 ortam değişimi gerçekleştirin.
8. 5 DIV'de, normal kültür ortamıyla tam ortam alışverişi gerçekleştirin.
9. Hücreleri her 2-3 günde bir veya tedarikçinin tavsiyesine göre düzenli kültür ortamı değişimi ile koruyun.
10. Raportör transgeni için doğru uyarımla donatılmış canlı bir görüntüleme mikroskobu ile ekspresyon seviyelerini izleyin. İnsan kaynaklı nöronlar için, transdüksiyondan 10-14 gün sonra plato ekspresyonu gözlenir (bkz. Şekil 4A).

Adım	Tampon/Malzeme	Kuyu hacmi [μL]	Çalışma Hacmi [μL]	Döngü	Akış hızı [μL/dak]
1. Dengeleme	Dengeleme/ Yıkama I Tampon	1100	950	2	500
2. Yükleniyor/ Yakalama	Örnek Süpernatan	550	500	4
3. Yıkama I	Dengeleme/ Yıkama I Tampon	1100	950	2
4. Yıkama II	Yıkama II Tamponu	1100	950	2
5. Elüsyon	Elüsyon Tamponu	70 μL (20 μL Reçine uçları) 250 μL (80 μL Reçine uçlar)	60 μL (20 μL Reçine uçlar) 240 μL (80 μL Reçine uçlar)	4
6. Nötralizasyon	Nötralizasyon Tamponu	Elüsyon hacminin 1/4'ünü doğrudan her numuneye ekleyin 70 μL ayrıştırılmış numune → 17,5 μL ekleyin 250 μL ayrıştırılmış numune → 62,5 μL ekleyin		-	-

Tablo 1: rAAV'lerin afinite reçinesi saflaştırması için plaka yerleşimi ve saflaştırma parametreleri.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, laboratuvar ölçeğinde AAV vektör üretimine olan talep önemli ölçüde artmış ve bunu bir hizmet olarak sunan çok sayıda sözleşmeli araştırma kuruluşunun kurulmasına yol açmıştır⁴². Genellikle dış kaynak kullanımıyla ilişkilendirilen yüksek maliyetler ve gecikmiş zaman çizelgeleri göz önüne alındığında, şirket içi rAAV üretimi cazip bir seçenek olmaya devam ediyor. Özellikle, saflaştırma adımlarını entegre ederken malzeme tüketimini ve çalışma saatlerini en aza indiren yüksek verimli protokoller, ilaç geliştirme hattında oldukça faydalıdır.

Bu protokol, rAAV üretimi için iki yüksek verimli kurulumun ana hatlarını çizmektedir: yapışık hücreler kullanan bir mikro-6 kuyucuklu yaklaşım ve süspansiyon hücreleri için bir mini-HT24 protokolü ( Şekil 1'deki genel bakışa bakınız). Mikro-6 oyuklu kurulum, 6 oyuklu bir formatta rAAV üretmek için yapışık HEK293T hücrelerini kullanır. Bu materyal, ticari olarak temin edilebilen iki PEI transfeksiyon reaktifinin ve sodyum klorürün (NaCl) rAAV2 üretimi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanıldı (Şekil 2A). Burada, aynı anda farklı parametreler izlendi: (i) bir GFP transgeni kullanılarak üretici hücrenin canlılığı ve transfeksiyon verimliliği (Şekil 2B ve Ek Şekil 1) ve (iii) ham lizatlarla transdüksiyondan sonra GFP-pozitif (GFP+) hücrelerin yüzdesi (Şekil 2C). Transdüksiyon deneyi, vektör titrelerinin ve işlevlerinin ucuz ve hızlı bir dolaylı okuması olarak hizmet etti. İlginç bir şekilde, transfeksiyon reaktifinin DNA'ya daha düşük oranları, iyi hücre canlılığını korurken verimli vektör üretimini (Şekil 2B) teşvik etmek için yeterliydi. Ayrıca, özellikle PEIpro reaktifi kullanıldığında 150 mM NaCl ilavesi faydalı göründü. Bu deneyin mikro ölçekte gerçekleştirilmesi çeşitli avantajlar sağladı: (i) hücre tohumlama, transfeksiyon ve vektör hasadının bir hafta içinde tamamlandığı hızlı bir iş akışı; (ii) standart aşağı akış analitik tahlilleri ile uyumluluk; ve (iii) tüm AAV serotiplerine geniş uygulanabilirlik.

İn vivo deneyler veya in vitro kinetik çalışmalar (daha yüksek veya daha geniş bir MOI aralığının uygulandığı) gibi daha büyük miktarlarda rAAV vektörü gerektiren uygulamalar için ölçeğin büyütülmesi gereklidir. Yüksek verimli saflaştırma için yeterli malzeme sağlayan bir mini-HT24 protokolü oluşturmak için süspansiyon hücreleri kullanıldı. Yapışık hücrelerle karşılaştırıldığında, süspansiyon kültürleri daha iyi ölçeklenebilirlik sunar ve yüzey alanı ile sınırlı olmadıkları için yerden daha verimlidir. Süspansiyon hücreleri ortamda serbestçe büyüdüğünden, tüm kültür hacmini kaplayabilirler ve bu da üç boyutlu ölçek büyütmeyi daha kolay hale getirir. Bu, katman kültürlerine kıyasla daha yüksek hücre yoğunlukları elde edilmesini sağlar. Ek olarak, pasifaj veya hasat sırasında herhangi bir ayırma adımına gerek olmadığından süspansiyon sistemlerinin bakımı ve işlenmesi daha kolaydır. 24 oyuklu formatta rAAV üretiminin tekdüzeliği, plaka boyunca üç temel parametre analiz edilerek değerlendirildi (Şekil 3): (A) Parçacık titresi (vp/mL); (B) Kapsiddeki VP oranı; (C) Genomik titre (vg/mL) ve (D) Boş-dolu oranı.

Bu parametreler arasında bir miktar değişkenlik gözlemlenirken, büyük ölçüde ölçüm hatası marjı içinde olan iki kat aralıkta kaldı. VP protein ekspresyonu da otomatik western blot analizi kullanılarak değerlendirildi (Şekil 3E). Son olarak, deneysel gereksinimlere ve aşağı akış analitik ihtiyaçlarına dayalı olarak uygun ölçeğin seçimine rehberlik etmek için mikro-6 kuyulu, mini-HT24 ve orta ölçekli (çalkalama şişesi) üretimden elde edilen toplam verimlerin bir karşılaştırması sunulmuştur (Şekil 3F).

Herhangi bir AAV saflaştırma protokolünün kritik bir yönü, vektör saflığının ve gücünün değerlendirilmesidir. Burada, reçine saflaştırılmış vektörler, iki aşamalı sezyum klorür (CsCl) bazlı ultrasantrifüjleme (UC) yöntemi kullanılarak saflaştırılanlarla yan yana karşılaştırıldı (Şekil 4). İki preparat arasındaki karşılaştırılabilir güç, motor nöronların ve astrositlerin başarılı transdüksiyonu ile gösterildiği gibi, floresan mikroskobu ile gözlenmiştir (Şekil 4A). Elektron mikroskobu analizi, parçacık şekli veya toplanma durumunda önemli bir fark ortaya çıkarmadı. Bununla birlikte, CsCl saflaştırmasının daha tutarlı bir şekilde daha temiz preparatlar verdiğini gösteren hafif bir eğilim vardı (Şekil 4B).

figure-results-1
Şekil 1: rAAV üretim ve hazırlama yaklaşımlarına genel bakış. Bu şekil, midi ölçekli çalkalama şişelerinden mini-HT24 süspansiyon kültürlerine ve mikro-6 kuyucuklu yapışkan kültürlere kadar değişen rAAV üretim yöntemlerini göstermektedir. Bu yaklaşımlar, farklı hücre lizizi ve vektör saflaştırma stratejileri kullanarak çeşitli ölçeklerde rAAV üretimini mümkün kılar. rAAV'lerin nihai karakterizasyonu tipik olarak viral genom ölçümü (vg/mL) için qPCR/dPCR'yi, kapsid titresi (vp/mL) tayini için ELISA'yı ve biyolojik aktiviteyi değerlendirmek için hücre transdüksiyon testlerini içerir. BioRender'da oluşturuldu. Ohland, P. (2025) https://BioRender.com/x3sfbdd. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Mikro-6 oyuklu rAAV üretimi için transfeksiyon protokolünün optimizasyonu. (A) Test edilen parametreler ve analitik okumalarla deneyin şematik genel görünümü. (B) HEK293T hücreler, transfeksiyondan 24 saat önce 0.5 × 10⁶ hücre/kuyu yoğunluğunda 6 oyuklu plakalara ekildi. Farklı DNA miktarları, PEI tipleri (Pro veya Max), oranlar ve NaCl konsantrasyonları test edildi. (C) Panel A'dan eşit hacimlerde lizatlarla transdüksiyondan 72 saat sonra GFP-pozitif (GFP+) HEK293A hücrelerinin yüzdesi (her biri 10 μL). Basit olması için, yalnızca en yüksek vektör verimi (2650 ng) ile sonuçlanan DNA durumu gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Mini-HT24 kurulumunda üretilen rAAV'nin analitik karakterizasyonu ve farklı ölçeklerde titre karşılaştırması. (A) Her kuyucuktaki saflaştırılmış rAAV kapsid titrelerinin ELISA analizi. Değerler, saflaştırmadan sonra plakanın ortalama partikül titresinin üzerindeki varyasyonlar olarak temsil edilir. Beklenen titreler, kullanılan AAV kapsidine ve paketlenmiş transgene bağlıdır. Farklı AAV vektörleri için partikül titreleri, düşük 10¹¹ ile yüksek 10¹² VP/mL arasında değişiyordu. (B) Belirtilen kuyucuklardan saflaştırılmış rAAV'nin WES tarafından VP oranı analizi. Rekombinant AAV2 VP1, VP2 ve VP3, 1:1:10 molar oranında pozitif kontroller olarak kullanıldı. (C) her kuyucuktan saflaştırılmış rAAV'nin dPCR analizi. Değerler, saflaştırmadan sonra plakanın ortalama genomik titresinin üzerindeki varyasyonlar olarak gösterilir. Beklenen titreler, kullanılan AAV kapsidine ve paketlenmiş transgene bağlıdır. Farklı AAV vektörleri için genomik titreler, düşük 10¹⁰ (rAAV2) ile yüksek 10¹¹ vg/mL (rAAV9, burada gösterilmemiştir) arasında değişmektedir. (D) A ve C panellerinden elde edilen genomik ve partikül titresi sonuçlarına dayalı olarak belirtilen kuyucukların boş-dolu oranı (E/F) Değerler plaka ortalamasına normalleştirilir. Gösterilen rAAV2 için mini-HT24 formatındaki ortalama E/F, AAVX afinite reçinesi saflaştırmasından sonra .6 ± %3.0'dır. (E) Her kuyucuktan saflaştırılmış rAAV2 numunelerinde VP proteinlerinin kılcal western blot analizi. (F) Her yöntemin nihai numune hacimleri ve konsantrasyonu dikkate alınarak toplam viral genom verimlerinin karşılaştırılması. Veriler, biyolojik kopyalardan standart sapmayı (SD) gösteren hata çubukları ile en küçük format (mikro-6 kuyu) üzerinde ortalama kat farkı olarak gösterilir. AAVX afinite reçine saflaştırması ile yüksek verimli 24 derin kuyu üretimi için, SD = ±0,176 (n = 24); mikro-6 kuyulu sonikasyon için; SD = ±0.349 (n = 6); ve CsCl gradyan saflaştırması ile standart orta ölçekli üretim için, SD = ±134.70 (n = 2). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Yüksek verimli (HT) reçine ile saflaştırılmış rAAV ile standart CsCl ile saflaştırılmış numuneler arasındaki etki ve saflığın karşılaştırılması. (A) İnsan kaynaklı motor nöronlar ve astrositler, 50.000'lik bir MOI'de bir raportör olarak insan sinapsin promotörü altında floresan raportör mRuby3'ü eksprese eden aynı rAAV yapısı ile transdüksiyona tabi tutuldu. Floresan mikroskobu görüntüleri, transdüksiyondan (DPT) yedi gün sonra canlı bir görüntüleme mikroskobunda yakalandı. rAAV'ler, standart CsCl gradyan yöntemi (üstte) veya HT AAVX afinite reçinesi uç bazlı yaklaşım (altta) kullanılarak saflaştırıldı. CsCl ile saflaştırılmış numuneler, transdüksiyon gerçekleştirilmeden önce ek bir donma-çözülme döngüsüne maruz bırakıldı ve reçine ile saflaştırılmış rAAV'lerle karşılaştırıldı. (B

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol belgesi, hem yapışkan hem de süspansiyon hücrelerini kullanarak yüksek verimli, küçük ölçekli ortamlarda rAAV üretmek için etkili yöntemleri özetlemektedir. Bu metodolojiler, zaman, maliyet ve kaynak tüketimini en aza indirirken klinik öncesi araştırmaları destekleyen ölçeklenebilir ve esnek rAAV üretim süreçlerine yönelik artan talebi karşılamaktadır.

Hem yapışkan hem de süspansiyon hücre sistemleri, küçük ölçekli rAAV üretimi için farklı avantajlar ve zorluklar sunar. Çok kuyulu plaka formatlarında yetiştirilen HEK293T hücreleri²⁸ gibi yapışık hücre sistemleri, özellikle erken aşama vektör tasarımı ve karşılaştırmalı çalışmalar için çok uygundur. Yerleşik kültürleme ve transfeksiyon protokolleriyle uyumlulukları, çoğu laboratuvarda doğrudan uygulamaya olanak sağlar. Örneğin, Grosse ve diğerleri. viral kapsid^22'nin montajı için çok önemli bir protein olan AAP işlevselliğini araştırmak için 6 oyuklu plakalarda küçük ölçekli üretim kullanıldı. Drittanti ve ark. rAAV replikasyonunun kinetiğini değerlendirmek ve farklı Adenovirüs yardımcılarının rAAV üretimi üzerindeki etkilerini test etmek için 96 oyuklu plakalarda rAAV vektörleri üretti²³. Özellikle, ikinci çalışmada, sinyali daha da yükseltmek için AAV Rep ve Cap'i eksprese eden özel HeLa hücrelerini kullanan bir replikasyon testi tarif edildi. Daha yakın zamanlarda, Quan ve ark. bir siRNA taraması bağlamında 384 oyuklu yüksek verimli bir üretim protokolü uyguladı ve bağıl titreleri²⁴ bildirdi. Bununla birlikte, sınırlı miktarda malzeme göz önüne alındığında, kaç tane tahlil ve okumanın yapılabileceği veya floresan proteinlerin ölçümünün ötesinde hücre transdüksiyon deneylerinde yeterli MOI'lerin elde edilip edilemeyeceği hala belirsizliğini koruyor ve bu da potansiyel olarak tekrarlanabilirliği etkiliyor.

Bu çalışmada, rAAV2 için kültür koşullarını optimize etmek için yapışık HEK293T hücrelerinde mikro-6 kuyu bazlı üretim kullanılmıştır (Şekil 1 ve Şekil 2). Önceki çalışmalar ve teknik raporlar^43,44 doğrultusunda, daha düşük PEI-DNA oranları ve transfeksiyon sırasında NaCl ilavesi rAAV üretimini olumlu yönde etkiledi. Bu, HEK293A hücrelerde üretilen vektörlerin transdüksiyon verimliliklerine dolaylı olarak yansıdı. Daha düşük PEI:DNA oranlarıyla gözlemlenen çarpıcı farklılıklar, özellikle PEIpro ile düşük hücre canlılığının gösterdiği gibi, esas olarak hücresel strese atfedildi. PEImax koşulları altında etkiler daha az belirgin olmasına rağmen, mikroskopi görüntüleri hücresel katmanda stres veya hücre ayrılmasını gösteren hücresiz alanları ortaya çıkardı (Ek Şekil 1).

Daha da önemlisi, bu bulgular süspansiyon kültürlerinde vektör üretimine doğrudan uygulanamadı ve yapışık HEK293T hücrelerinde rAAV üretimini artıran deneysel koşulların, altta yatan hücre tipi aynı kalsa bile her zaman süspansiyon hücrelerine dönüşmeyebileceğini vurguladı. Bu tutarsızlık, bu iki sistem arasındaki transkriptomik ve proteomik seviyelerdeki farklılıklara bağlanabilir⁴⁵. Sonuç olarak, klinik üretim süreçleriyle daha yakın uyum, erken gelişim aşamalarında süspansiyon kültürlerinin kullanılmasını gerektirebilir. Bu gözlemlere ve süspansiyonda daha yüksek hücre yoğunlukları elde etme avantajına dayanarak, mini ölçekli süspansiyon kültürlerinde (mini-HT24) rAAV üretmek için 24 derinlikli bir kuyu sistemi benimsendi. Bu sistem, plaka boyunca tutarlı vg/mL ve vp/mL titrelerinin yanı sıra tek tip VP protein ekspresyonu ve oranları gösteren kapsamlı bir doğrulamaya tabi tutuldu (Şekil 3A-E). Gerçekten de, mini-HT24 kurulumunda (3 × 10⁶ hücre/mL) mikro-6 kuyucuklu formata (kuyu başına 5 × 10⁵ hücre) kıyasla elde edilen daha yüksek hücre yoğunlukları, Şekil 3F'de gösterildiği gibi daha yüksek rAAV titreleri ile sonuçlandı. Bu, kültür kabının yüzey alanıyla sınırlı olmayan süspansiyon bazlı sistemlerin önemli bir avantajını vurgulamaktadır. Ancak bu tür sistemlerin uygulanması, tüm laboratuvarlarda bulunmayabilecek özel ekipmanlar gerektirir. Son olarak, AMBR15 veya AMBR250 gibi minibiyoreaktör sistemleri kullanılarak mini-HT24 sisteminden tanımlanan kurşun moleküllerinin veya üstün kültürleme koşullarının daha fazla doğrulanması önerilir, çünkü bu sistemlerin büyük biyoreaktörlerdeki üretim koşullarını daha yakından taklit ettiği gösterilmiştir^46,47.

Saflaştırma seviyesinin seçimi, rAAV preparatlarının belirli sonraki uygulamalar için uygunluğunun belirlenmesinde çok önemli bir rol oynar. Hem yapışık (mikro-6 kuyulu) hem de süspansiyon kültürlerinden (mini-HT24) türetilen ham lizatlar, ön tarama testleri için hızlı ve kaynak açısından verimli bir seçenek sunar. Bu lizatlar, vektör genomik/partikül titresi, transdüksiyon verimliliği taraması ve western blot analizi gibi uygulamalar için kabul edilebilir olan viral partiküller, hücresel kalıntılar ve ortam bileşenlerinin bir karışımını içerir. Özellikle temel biyolojik soruları ele alan çalışmalarda (yukarıda AAP işlevselliğinin araştırılmasında örneklendiği gibi), hücre kültürü durum optimizasyonunda ve klinik öncesi aday taraması ve seçiminde uygulanabilir. Bununla birlikte, safsızlıkların varlığı daha yüksek seyreltmeler gerektirebilir ve bu da daha düşük tahlil hassasiyetlerine neden olabilir. Ek olarak safsızlıklar, birincil hücreler gibi hassas hücre tiplerinin canlılığını olumsuz yönde etkileyebilir.

Ham lizatların aksine, yalnızca süspansiyon bazlı protokolde kullanılan AAVX afinite reçinesi ile saflaştırılmış müstahzarlar, bozulmamış kapsidleri seçici olarak izole ederek daha yüksek bir saflık seviyesine ulaşır. Bu, ham hücre lizatlarının sınırlamalarının üstesinden gelir ve bu preparatları in vivo çalışmaların yanı sıra transgen ekspresyon kinetiğinin ayrıntılı in vitro analizleri ve genellikle daha büyük miktarlarda malzeme gerektiren hassas fonksiyonel okumalar gibi uygulamalar için daha uygun hale getirir ( Şekil 3F'deki verim karşılaştırmasına bakınız). İn vitro uygulamalar için, mini-HT24 ortamında üretilen rAAV vektörlerinin verimleri, hücre sayısına ve gerekli MOI'lere bağlı olarak, okumaların çoğu için genellikle yeterliydi. Buna karşılık, in vivo uygulamalar tipik olarak doza, uygulama yoluna ve hayvan modeline bağlı olarak midi çalkalama şişesi ölçeklerinde veya daha büyük ölçekte üretim gerektirir. Saflaştırma için gereken artan maliyet ve zamana rağmen, ortaya çıkan malzemenin tutarlılığı ve güvenilirliği çoğu zaman kritik kullanım durumlarına yönelik yatırımı haklı çıkarmaktadır. Özellikle, Şekil 4'te gösterilen sonuçlar, afinite reçinesi yöntemleri kullanılarak saflaştırılan rAAV vektörlerinin, geleneksel sezyum klorür (CsCl) ultrasantrifüjleme yoluyla saflaştırılanlarla karşılaştırılabilir performans gösterdiğini göstermektedir. Bu, boş kapsidlerin transdüksiyon üzerinde hiçbir etkisinin olmadığı veya mevcut AAV türlerine bağlı olarak onu artırabileceği yönündeki önceki gözlemlerle uyumludur⁴⁸. Bununla birlikte, bu deneyde yalnızca bir MOI ve bir zaman noktasının kullanıldığını ve her hücre tipi için en uygun koşulların ayrı ayrı belirlenmesi gerektiğini belirtmek önemlidir. CsCl saflaştırması genellikle daha temiz bir arka plan verirken, HT reçine ucuyla saflaştırılmış AAV'ler saflıkta daha fazla değişkenlik gösterir ( Şekil 4'teki TEM görüntülerine bakın). Toplu olarak, bu bulgular yüksek verimli, küçük ölçekli iş akışlarının benimsenmesini daha da desteklemektedir.

Yüksek verimli saflaştırmada küçük ölçekli afinite reçinesi dolgulu uçların kullanılması, hızlı rAAV taraması için pratik bir çözüm sağlar, ancak güvenilir sonuçlar elde etmek için çeşitli teknik hususlara dikkat edilmesi gerekir. Sınırlı reçine yatağı hacmi nedeniyle bu uçlar, özellikle ham lizatların işlenmesi sırasında tıkanmaya özellikle eğilimlidir. Bu nedenle, yetersiz arıtma akış hızlarını azaltabileceğinden ve verimi tehlikeye atabileceğinden, yüklemeden önce hücresel kalıntıların uzaklaştırılması için lizatların yüksek hızlı santrifüjleme ile arıtılması önemlidir. Mini-HT24 kurulumu için, transfeksiyon protokollerinin optimize edilmesi ve kuyu başına maksimum 2,5-3 mL çalışma hacminin korunması önerilir. Çeşitli serotipler veya kapsid kütüphaneleri ile çalışırken, bağlanma etkinliği ve geri kazanımı kapsid yapısına⁴⁹ bağlı olarak değişebileceğinden, farklı afinite reçine tiplerinin test edilmesi tavsiye edilir. El tipi elektronik çok kanallı pipetleme sistemi, bu iş akışının küçük laboratuvarlara kolayca entegre edilmesini sağlayarak otomasyona ihtiyaç duymadan esneklik sunar. Bununla birlikte, manuel taşıma, değişkenliğe ve partiler arası farklılıklara neden olabilir. Daha fazla tutarlılık için otomatik sıvı taşıma platformları faydalı olabilir. Numune ve tampon ekleme sırasında çapraz kontaminasyonu önlemek için dikkatli olunmalı ve taşmayı önlemek için yeterli kuyu hacmine sahip uygun plaka formatlarının kullanılması esastır. Araştırmacılar, numunenin berraklaştırılması, protokol optimizasyonu, reçine seçimi ve dikkatli pipetleme dahil olmak üzere bu hususları ele alarak teknik sorunları en aza indirebilir ve yüksek verimli, küçük ölçekli afinite saflaştırma iş akışlarının sağlamlığını ve tekrarlanabilirliğini artırabilir.

Sonuç olarak, yüksek verimli, küçük ölçekli rAAV üretim yöntemlerinin uygulamaya özel saflaştırma stratejileriyle kombinasyonu, gen terapisi araştırmalarını ilerletmek için çok yönlü bir platform sağlar. Bu protokoller, çeşitli deneysel gereksinimleri karşılama esnekliğini korurken, uygun maliyetli ve verimli iş akışlarına yönelik artan talebi karşılar. Araştırmacılar saflık, ölçeklenebilirlik ve kaynak tüketimi arasındaki dengeyi sağlayarak klinik öncesi gelişimi hızlandırabilir ve klinik uygulamalara geçişi kolaylaştırabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Julia Fakhiri, Roche Doktora Sonrası Bursu aracılığıyla verdiği desteği minnetle kabul ediyor. Elektron mikroskobu verileri, Roche kriyo-EM tesisi Nautilus'ta elde edildi. Tesisin işletilmesine ve desteklenmesine katkılarından dolayı Moritz Classen ve Lubomir Kovacık'a teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%0,9 Tamponsuz Salin	B. Braun, Melsungen, Almanya	7647-14-5	Yıkama II tamponu
1 M Hidroklosirk asit	Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, ABD	1099700050	Tamponların pH ayarı
10x DNase I Arabelleği	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	AM8170G	ddPCR/dPCR
1M Tris-HCl, pH 9.0	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	J60707. AP	Nötralizasyon tamponu
24 derin kuyucuklu mikroplakalar	Enzyscreen, Heemstede, Hollanda	CR1424cl	Süspansiyon kültürü ekipmanı
250 mL Polikarbonat Havalandırma Kapaklı Erlenmeyer Matara	Corning, New York, NY, ABD	431144	Süspansiyon kültürü ekipmanı
66 - 440 kDa ayırma 8x25 kapiler kartuşlar	BioTechne, Minneapolis, MN, ABD	SM-W008 Serisi	Otomatik Western blot kiti
96 Kuyucuklu 2.2 mL Polipropilen DeepWell	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	AB0661	Numune işleme ve saklama plakası
96 Kuyucuklu Siyah/Şeffaf Alt Plaka, TC Yüzey	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	165305	Transdüksiyon testleri
AAV2 VP1, rekombinant protein	PROGEN, Heidelberg Almanya	640823	Wes reaktifi
AAV2 VP2, rekombinant protein	PROGEN, Heidelberg Almanya	640824	Wes reaktifi
AAV2 VP3, rekombinant protein	PROGEN, Heidelberg Almanya	640825	Wes reaktifi
AAV2 Xpress ELISA	PROGEN, Heidelberg Almanya	PRAAV2XP	HT reçinesi saflaştırılmış numuneler için kullanılır.
Wes için Fare Önleme Algılama Modülü	BioTechne, Minneapolis, MN, ABD	DM-002	Otomatik Western blot kiti
Test/Şablona özel ileri astar	Töre	Töre	ddPCR/dPCR
Test/Şablona özel prob	Töre	Töre	ddPCR/dPCR
Tahlil/Şablona özel ters astar	Töre	Töre	ddPCR/dPCR
BalanCD HEK293 - Sıvı	FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC INC, Santa Ana, CA, Amerika Birleşik Devletleri	NC1192689	Süspansiyon hücre kültürü için ortam
Sığır Serumu Albümin	SERVA Elektroforezi, Heidelberg, Almanya	cSığır Serum Albümini	Yapışık hücre ortamı için takviye
Nefes alabilen rayon film, steril	VWR Uluslararası LLC, Radnor, PA, ABD	391-1262	Süspansiyon kültürü ekipmanı
C1000 Termocycler	Bio-Rad Laboratuvarları, Herkül, ABD	1851096	ddPCR
CaptureSelec AAVX Ligand Sızıntısı ELISA Kiti	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	8113522000	ELİSA
Cedex HiRes Analizörü	Roche Holding AG, Basel, İsviçre	5650216001	Hücre sayacı
HÜCRE kültürü mikroplakası, 96 kuyucuklu	Greiner Bio-One, Kremsmü nster, Avusturya	655162	Adeherent hücre kültürü ekipmanı
Sitrik asit	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	5949-29-1	Saflaştırma reaktifi; DİKKAT
CMOS tabanlı TEM kamera TVIPS XF416	Tietz Video ve Görüntü İşleme Sistemleri GmbH, Gilching, Almanya	XF416	Video ve Görüntü İşleme Sistemi
Pusula yazılımı (sürüm 6.3.0)	BioTechne, Minneapolis, MN, ABD		WES Yazılımı
Costar 6-oyuklu Şeffaf TC-işlenmiş Çoklu Kuyu Plakaları	Corning, New York, NY, ABD	3516	Adeherent hücre kültürü ekipmanı
ddPCR Damlacık Jeneratörü Yağı	Bio-Rad Laboratuvarları, Herkül, ABD	#1864110	ddPCR reaktifi
ddPCR Damlacık Okuyucu Yağı	Bio-Rad Laboratuvarları, Herkül, ABD	#1863004	ddPCR reaktifi
ddPCR Supermix for Probes (dUTP yok)	Bio-Rad Laboratuvarları, Herkül, ABD	#1863023	ddPCR reaktifi
DMEM, yüksek glikoz	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	11960044	Yapışık hücre kültürü için ortam
DMEM, düşük glikoz	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	11885084	Yapışık hücre kültürü için ortam
DNA düşük bağlama 96 oyuklu plakalar	Eppendorf, Hamburg, Almanya	30129504	ddPCR/dPCR
DNA düşük bağlanma tüpleri	Eppendorf, Hamburg, Almanya	30108051	ddPCR/dPCR
DPBS'nin	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	14190094	Yıkama tamponu
EM ızgaralar (T600H-Cu 698 l/inç Altıgen ağ İnce Çubuk; EMS)	Elektron Mikroskobu Bilimleri, Hatfield, PA, ABD	FFTH600-CU-UL	Elektron mikroskobu analizi
EVO M5000 Görüntüleme Sistemi	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	AMF5000	Transdüksiyon testleri için canlı görüntüleme mikroskobu
EZ Standart Paket 3	BioTechne, Minneapolis, MN, ABD	PS-ST03EZ-8	Otomatik Western blot kiti
Falcon 15mL Konik Santrifüj Tüpleri	Fisher Scientific, Schwerte, Almanya	11507411	Örnek işleme
Falcon 50mL Konik Santrifüj Tüpleri	Fisher Scientific, Schwerte, Almanya	10203001	Örnek işleme
Geltrex LDEV İçermeyen Azaltılmış Büyüme Faktörlü Bazal Membran Matrisi	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	A1413201	Kültür plakası kaplaması
GlutaMAX Takviyesi (L-Alanil-L-Glutamin)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	35050061	Yapışık hücre ortamı için takviye
HEK293A	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	R70507 Serisi	Transdüksiyon testleri (yalnızca araştırma amaçlı kullanım)
HEK293T	ATCC, Manassas, Virginia, ABD	CRL-3216 (İngilizce)	rAAV üretimi için kullanılan adeherent hücre kültürü (yalnızca araştırma amaçlı kullanım)
HEPES çözümü, 1M	Merck, Darmstadt, Almanya	#H0887	Yapışık hücre ortamı için takviye
HL-Salt Aktif Nükleaz, SAN (25 U/µ L)	ArcticZymes Technologies, Tromsø, Norveç	70910-202	ddPCR/dPCR
HydroSpeed Mikroplaka Yıkayıcı	Tecan, Mä nnedorf, İsviçre	30190101	ELİSA
iCell Astrositler Kiti, 01434	FUJIFILM Hücresel Dinamikler, Inc., Madison, WI, ABD	R1092 Serisi	Transdüksiyon testleri
iCell Motor Nöron Kiti, 01279	FUJIFILM Hücresel Dinamikler, Inc., Madison, WI, ABD	R1051 Serisi	Transdüksiyon testleri
Sonsuz 200 PRO	Tecan, Mä nnedorf, İsviçre	30213617	ELİSA
JEM-1400Plus bir transmisyon elektron mikroskobudur	JEOL Ltd., Akishima, Tokyo, Japonya	JEM-1400Artı	transmisyon elektron mikroskobu
Pimli düşük buharlaşmalı sandviç kapak	Enzyscreen, Heemstede, Hollanda	CR1224c	Süspansiyon kültürü ekipmanı
Mikroplaka Okuyucu SpectraMax i3	Moleküler Cihazlar, San Jose, CA, ABD	i3x	ELİSA
Fare anit-AAV2 VP1/VP2/VP3 monoklonal antikoru	PROGEN, Heidelberg Almanya	690058	Wes reaktifi
Nükleaz içermeyen su	Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Almanya	3036430103	ddPCR/dPCR
Opti-MEM, Azaltılmış Serum Orta	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	#31985070	PEI-DNA kompleksi oluşumu için ortam
PBS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	#10010023	Yıkama tamponu
PEI-MAX, polietilenimin, 1mg/ml stok	Polysciences Europe, Hirschberg an der Bergstraß e, Almanya	24765 veya 24765	Transfeksiyon reaktifi
PEIpro	Polyplus, Illkirch-Graffenstaden, Fransa	101000033/10 mL	Transfeksiyon reaktifi
Pierce Mikrodiyaliz Plakası, 96 oyuk, 0,3 mL, 20K MWCO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	A50472 Serisi	Arıtma ekipmanı
Poloksamer 188	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	P5556-100 mL	Hücre kültürü reaktifi; DİKKAT
Poli-L-Ornitin Solüsyonu (%0,01)	Sigma-Aldrich	A-004-M	Transdüksiyon testleri
Proteinaz K Çözeltisi (20 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	25530049	ddPCR/dPCR
Protein Basit " Wes"	BioTechne, Minneapolis, MN, ABD	004-600	Otlatılmış Western Blot için cihaz
QIAcuity Sekiz Platformlu Sistem	Qiagen, Hilden, Almanya	911052	dPCR
QIAcuity Nanoplaka 8.5k 96-kuyucuk	Qiagen, Hilden, Almanya	250021	ddPCR/dPCR
QIAcuity Probu PCR Kiti	Qiagen, Hilden, Almanya	250101, 250102 veya 250103	ddPCR/dPCR
QIAcuity Yazılım Paketi 1.2	Qiagen, Hilden, Almanya		dPCR Yazılımı
QX yöneticisi	Bio-Rad Laboratuvarları, Herkül, ABD		ddPCR Yazılımı
QX200 Damlacık Okuyucu	Bio-Rad Laboratuvarları, Herkül, ABD	1864003	ddPCR
Vidalı kapaklı mikro tüp, 1,5 ml, PCR Performansı Test Edildi	Sarstedt, Nü mbrecht, Almanya	72.703.416	Süspansiyon kültürü ekipmanı
Vidalı kapak, DNA LoBind, 5,0 mL	Eppendorf, Hamburg, Almanya	30122348	Süspansiyon kültürü ekipmanı
Çalkalayıcı İnkübatör	Infors AG, Bottmingen, İsviçre	Çoklu tron	Süspansiyon kültürü ekipmanı
Sodyum Piruvat (100 mM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	11360070	Yapışık hücre kültürü için ortam
Sonikatör Mikroplaka Korna Sistemi	QSonica, Newtown, CT, ABD	Q700MPXC	Ham lizat üretimi için kullanılan sonikatör
RUH			SPIRIT veritabanına bağlantı: https://spirit.cladiac.com/aav.html
Steriflip-GP Steril Santrifüj Tüp Üst Filtre Ünitesi	Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, ABD	SCGP00525	Tampon hazırlama ekipmanı
T-175, HÜCRE KÜLTÜRÜ ŞIŞESI, 550 ML, 175 CM²	Greiner Bio-One, Kremsmü nster, Avusturya	660175	Adeherent hücre kültürü ekipmanı
Tripsin/EDTA %0,025	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	R001100	Hücre kültürü reaktifi
Virüs Üretim Hücreleri 2.0 (VPC2.0)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD	A49784 veya A51218	rAAV üretimi
		J63596. K2	PBST çalışma çözümü için 1:10 oranında seyreltin

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Singh, N. Drug discovery and development: Introduction to the general public and patient groups. Front. Drug Discov. 3, 1201419(2023).
Thakur, G., Mink, S., Bak, H., Tustian, A. D. Improving process efficiency to reduce cost-of-goods per dose in manufacturing of recombinant AAVs. Cell Gene Ther. Insights. 10 (3), 479-499 (2024).
Reid, C. A., Hörer, M., Mandegar, M. A. Advancing AAV production with high-throughput screening and transcriptomics. Cell Gene Ther. Insights. 10 (6), 821-840 (2024).
Matsunaga, R., Tsumoto, K. Accelerating antibody discovery and optimization with high-throughput experimentation and machine learning. J. Biomed. Sci. 32 (1), 46(2025).
Pereira, D. A., Williams, J. A. Origin and evolution of high-throughput screening. Br. J. Pharmacol. 152 (1), 53-61 (2007).
Aldewachi, H., Al-Zidan, R. N., Conner, M. T., Salman, M. M. High-throughput screening platforms in the discovery of novel drugs for neurodegenerative diseases. Bioengineering. 8 (2), 30(2021).
Liu, H., et al. Producing high-quantity and high-quality recombinant adeno-associated virus by low-cis triple transfection. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 32 (2), 101230(2024).
Blessing, D., et al. Scalable production of AAV vectors in orbitally shaken HEK293 cells. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 13, 14-26 (2019).
Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol. Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Hum. Gene Ther. Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
Fakhiri, J., Nickl, M., Grimm, D. CRISPR gene editing, methods and protocols. Methods Mol. Biol. 1961, 111-126 (2019).
Strobel, B., et al. Standardized, scalable, and timely flexible adeno-associated virus vector production using frozen high-density HEK-293 cell stocks and CELLdiscs. Hum. Gene Ther. Methods. 30 (1), 23-33 (2019).
Rumachik, N. G., et al. Methods matter: Standard production platforms for recombinant AAV produce chemically and functionally distinct vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 18, 98-118 (2020).
Merten, O. W. AAV vector production: State of the art developments and remaining challenges. Cell Gene Ther. Insights. 2 (5), 521-551 (2016).
Trivedi, P. D., et al. Comparison of highly pure rAAV9 vector stocks produced in suspension by PEI transfection or HSV infection reveals striking quantitative and qualitative differences. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 24, 154-170 (2022).
Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).
Wada, M., et al. Large-scale purification of functional AAV particles packaging the full genome using short-term ultracentrifugation with a zonal rotor. Gene Ther. 30 (7-8), 641-648 (2023).
Kronenberg, S., Böttcher, B., von der Lieth, C. W., Bleker, S., Kleinschmidt, J. A. A conformational change in the adeno-associated virus type 2 capsid leads to the exposure of hidden VP1 N termini. J. Virol. 79 (9), 5296-5303 (2005).
Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Hum. Gene Ther. Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
Shiraishi, Y., Adachi, T., Cacicedo, J. M., Ido, Y. Development of a high-yield, high-quality purification process for adeno-associated virus vectors that can be used in vivo without ultracentrifugation: Application to a lung endothelial cell-targeted adeno-associated virus. FASEB J. 36 (12), e22653(2022).
Fakhiri, J., Nickl, M., Grimm, D. CRISPR gene editing, methods and protocols. Methods Mol. Biol. 1961, 111-126 (2019).
Grosse, S., et al. Relevance of assembly-activating protein for adeno-associated virus vector production and capsid protein stability in mammalian and insect cells. J. Virol. 91 (20), (2017).
Drittanti, L., Rivet, C., Manceau, P., Danos, O., Vega, M. High throughput production, screening and analysis of adeno-associated viral vectors. Gene Ther. 7 (11), 924-929 (2000).
Quan, D. N., Shiloach, J. rAAV production and titration at the microscale for high-throughput screening. Hum. Gene Ther. 33 (1-2), 94-102 (2022).
Steininger, T., et al. Improved recombinant adeno-associated viral vector production via molecular evolution of the viral Rep protein. Int. J. Mol. Sci. 26 (3), 1319(2025).
Fisher, K., et al. Polo-like kinase inhibitors increase AAV production by halting cell cycle progression. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 33 (1), 101412(2025).
Chen, K., et al. Advanced biomanufacturing and evaluation of adeno-associated virus. J. Biol. Eng. 18 (1), 15(2024).
DuBridge, R. B., et al. Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol. Cell. Biol. 7 (1), 379-387 (1987).
Börner, K., et al. Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening. Mol. Ther. 28 (4), 1016-1032 (2020).
Weinmann, J., et al. Identification of broadly applicable adeno-associated virus vectors by systematic comparison of commonly used capsid variants in vitro. Hum. Gene Ther. 33 (21-22), 1197-1212 (2022).
Westhaus, A., et al. High-throughput in vitro, ex vivo, and in vivo screen of adeno-associated virus vectors based on physical and functional transduction. Hum. Gene Ther. 31 (9-10), 575-589 (2020).
Yang, S., Shi, H., Chu, X., Zhou, X., Sun, P. A rapid and efficient polyethylenimine-based transfection method to prepare lentiviral or retroviral vectors:useful for making iPS cells and transduction of primary cells. Biotechnol. Lett. 38 (9), 1631-1641 (2016).
Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. Adeno-associated virus vectors, design and delivery. Methods Mol. Biol. 1950, 51-83 (2019).
Wang, G., et al. Assessment of key factors impacting variability in AAV vector genome titration by digital PCR. Int. J. Mol. Sci. 25 (10), 5149(2024).
Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Front. Microbiol. 10, 1570(2019).
Duong, T., Firmo, M., Li, C. T., Gu, B., Wang, P. Three-dimensional linkage analysis with digital PCR for genome integrity and identity of recombinant adeno-associated virus. Sci. Rep. 15 (1), 2154(2025).
Tereshko, L., et al. A novel method for quantitation of AAV genome integrity using duplex digital PCR. PLOS ONE. 18 (12), e0293277(2023).
Sormunen, A., et al. Comparison of automated and traditional Western blotting methods. Methods Protoc. 6 (2), 43(2023).
Hiemenz, C., et al. Characterization of virus particles and submicron-sized particulate impurities in recombinant adeno-associated virus drug product. J. Pharm. Sci. 112 (8), 2190-2202 (2023).
McIntosh, N. L., et al. Comprehensive characterization and quantification of adeno associated vectors by size exclusion chromatography and multi angle light scattering. Sci. Rep. 11 (1), 3012(2021).
Su, Q., Sena-Esteves, M., Gao, G. Analysis of recombinant adeno-associated virus (rAAV) purity using silver-stained SDS-PAGE. Cold Spring Harb. Protoc. (8), pdb.prot095679(2020).
Capra, E., Gennari, A., Loche, A., Temps, C. Viral-vector therapies at scale: Today's challenges and future opportunities . , McKinsey & Company. https://www.mckinsey.com/industries/life-sciences/our-insights/viral-vector-therapies-at-scale-todays-challenges-and-future-opportunities (2022).
Huang, X., et al. AAV2 production with optimized N/P ratio and PEI-mediated transfection results in low toxicity and high titer for in vitro and in vivo applications. J. Virol. Methods. 193 (2), 270-277 (2013).
Development of a novel cell culture medium for AAV production with multiple HEK293 lineages and process optimization. , Merck. https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/technical-documents/technical-article/pharmaceutical-and-biopharmaceutical-manufacturing/gene-therapy-manufacturing/development-of-novel-cell-culture-medium-aav-production (2025).
Malm, M., et al. Evolution from adherent to suspension: Systems biology of HEK293 cell line development. Sci. Rep. 10 (1), 18996(2020).
Warr, S. R. C. Animal cell biotechnology, methods and protocols. Methods Mol. Biol. 2095, 43-67 (2019).
Manahan, M., et al. Scale-down model qualification of ambr 250 high-throughput mini-bioreactor system for two commercial-scale mAb processes. Biotechnol. Prog. 35 (6), e2870(2019).
Wang, Q., et al. Syngeneic AAV pseudo-particles potentiate gene transduction of AAV vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 4, 149-158 (2017).
Florea, M., et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 28, 146-159 (2023).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Recombinant AAV High Throughput Production Gene Therapy AAV Vector Production Microscale AAV Miniscale AAV HEK 293T Cells Cell Transduction Assay Vector Genome Titration Western Blot

Büyük Etki için Ölçeği Küçültme: Kolaylaştırılmış Yüksek Verimli Rekombinant Adeno-İlişkili Virüs Üretimi

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Kaynaklar

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler