Method Article

Akut Solunum Sıkıntısı Sendromu İçin Hazırlanmış Anchorage-Bağımlı Mesenkimal Stromal Hücrelerin Mikrobiyoreaktor Tabanlı Üretimi

DOI:

10.3791/68650

⸱

December 12th, 2025

 ,  ,  , 
1Harvard-MIT Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 2Departments of Materials Science & Engineering and Biomedical Engineering, Cornell University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ankraj bağımlı hücrelerin mikrotaşıyıcı-mikrobiyoreaktör üretimi için bir protokol, potansiyel hücre tabanlı tedaviler olarak tanımlanır. Akut solunum sıkıntısı sendromunun kullanım durumunu hedefleyen bir durum, karşılaştırılabilir hücre verimi ve flask bazlı süreç koşullarına göre olumlu gen ekspresyonu gösterilmiştir. Bu protokol, diğer demirleme bağımlı hücrelere ve hedef endikasyonlarına genişletilebilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre tabanlı terapi, çeşitli sağlık sorunları için ortaya çıkan bir terapötik yaklaşımdır. Ancak, yeterli miktarda kaliteli hücre üretmek hâlâ aktif bir bilimsel ve teknik zorluk olarak kalmaktadır. Son hücre ürünü sterilize edilemez; bu nedenle, sterillik ve tasarım açısından kalite öncelikleri çok önemlidir. Ankraj bağımlısı hücreler için, şişe tabanlı genişleme geliştirme ve endüstriyel ölçeklerde hâlâ kullanılmakta, büyük fiziksel ayak izleri gerektirir, biyokimyasal ortamın (pH, CO2 ve O2, besin ve metabolitlerin difüzyon gradyanları) kontrolünü sınırlar ve nihai hücre kalitesini etkileyebilecek fiziksel ipuçları sağlar. Bu zorluklar, biyoreaktor tabanlı üretim yaklaşımlarının benimsenmesini teşvik etmiştir, ancak bu yaklaşımlar genellikle zorluklar doğuran ve keşif amaçlı tezgah araştırması veya süreç geliştirme için maliyet açığa çıkarabilecek hacimsel ölçeklerde ilerler. Mikrobiyoreaktör-mikrotaşıyıcı hücre tedavisi üretiminin, hücre kaynak tipi mezenkimal stromal hücreler için kültür sırasında biyokimyasal kontrol sağladığı bildirilmiştir. Hücre kalitesinin in vitro ilk değerlendirmesi için, akut respirator sıkıntı sendromu potansiyel bir kullanım durumu olarak değerlendirildi. Burada gösterilen yaklaşım, mikrobiyoreaktördeki küçük (2 mL) hacim ve sıkı biyokimyasal kontrol sayesinde tezgah ölçeğinde hızlı süreç geliştirmeyi mümkün kılar. Bunu mezenkimal stromal hücreler gibi ankraj bağımlı hücre tipi için gerçekleştirmek için mikrobiyoreaktör sürecinde önemli değişiklikler yapılması ve mikrofluidik süreçle kendi içinde üretilen jelatin mikrotaşıyıcı platformu kullanılması gerekti. Burada, mikrobiyoreaktörde bu tür ankraj bağımlı hücrelerin kültürlenmesinde kullanılan yöntem ve süreç parametreleri için ek detaylar gösterilmiştir; bu da diğer araştırmacıların bu uygulamaları kendi kullanım senaryolarına ve hücre kaynak tiplerine uyarlamasını sağlamaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canlı hücrelerin terapötik ürün olarak kullanımı, son zamanlarda çeşitli sağlık sorunları için umut vaat eden yeni bir tedavi seçeneği olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin, kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri, daha önce mevcut tüm tedavilere dirençli olan sözde sıvı kanserleri olan lösemi, lenfoma ve multipl miyeloma olan kişilere kalıcı bir remisyonsağlamıştır 1. Daha yakın zamanda, mezenkimal kök/stromal hücre (MSC) ürünü (Ryoncil), steroid dirençli akut greft-konak hastalığı (SR-aGvHD) tedavisinde onaylandı; bu hastalık %50 ölüm >oranına sahip2. Ancak karşılanmamış diğer klinik ihtiyaçlara genişletilmek, hem terapinin hem de o ürünün geliştirilmesi ve üretimi için yoğun bir şekilde geliştirilmesini gerektirir.

Karşılanmamış klinik ihtiyaçlardan biri, akut respirator sıkıntı sendromu (ARDS) yaşayan bireylerde bulunabilir. ARDS, yöntemi, sonuçları ve diğer hastalık hedeflerine olası uzantıların tartışılmasını göstermek için özel bir kullanım durumu sunmak amacıyla burada tartışılır. Kritik (saatler ile günler arasında ilerleme), yaygın (ABD'de yıllık 200.000 vaka >) ve ölümcül bir gösteri (%27-%46, arımanın şiddetine bağlı olarak), ARDS, COVID-19 Pandemisi sırasında SARS-CoV-2 enfekte olan hastaların tipik ölüm mekanizması olarak yeniden ve geniş çapta ilgi gördü 3,4. ARDS, akciğer damar geçirgenliğinin artmasıyla karakterize edilir; bu da interstisyel ödem, alveolar su basması ve nötrofiller ile kırmızı kan hücreleri dahil hücresel bileşenlerin alveolarkompartmana sızmasına yol açar. ARDS'nin ilk süsütif evresinde, doğuştan gelen bağışıklık hücresi aracılı iltihaplanma, endotel ve epitel bariyer bütünlüğüne zarar vererek ve pro-inflamatuar sitokinlerin salgılanması yoluyla bağışıklık hücresinin toplanım ve aktivasyonunu teşvik ederek bu patojenik sonuçları tetikler; İltihabi yanıtın başarılı şekilde çözülmesi, bariyer bütünlüğünün onarımı ve aşırı fibrozdan kaçınmak hayatta kalma için kritiköneme sahiptir 3. Remdesivir gibi antiviral tedaviler, SARS-CoV-2 aracılı ARDS ile mücadelede umut vaat eden olsa da, diğer etiyolojiler için şu anda ölümleri azaltan onaylanmış farmakolojik müdahalelermevcut değildir 5.

MSC'ler, sistemik enjeksiyonda akciğe-spesifik tropizmleri ve çevre mikroçevrelerine immünomodülatör parakrin sinyaller salgılama yetenekleri nedeniyle ARDS tedavisinde umut verici bir yaklaşım sunabilirler 6,7. Mekanistik çalışmalar, interlökin-10 (IL-10)8, indoleamine 2,3-dioksijenaz 1 (IDO1)9, prostaglandin E2 (PGE2)10 ve diğerleri gibi parakrin faktörlerin, akut akciğer hasarı (ALI)/ARDS11 dahil olmak üzere birçok endikasyon için MSC terapötik potentsisini yönlendirmede rol oynadığını göstermiştir; bu nedenle, bu gen ürünlerinin ifade seviyeleri, klinik etkinliği öngörebilecek potansiyel kritik kalite özelliklerini (pCQA) temsil eder ve üretim sırasında nihai hücre ürünü için kontrol edilebilir salınım kriterleri sağlar. Ancak, etkili bir terapötik doza ulaşmak için yeterli miktarda hücre üretmek zordur; Örneğin, Ryoncil, hasta kütlesinin kilogramı için 2 x 106 hücre dozu için endiktir; 4 hafta12 boyunca haftada iki kez uygulanır. 80 kg ağırlığındaki bir hasta için bu, tek bir tedavi tedavisi için > 1,2 milyar MSC anlamına gelir ve bu 2B büyüme durumu için yeterli yüzey alanı barındırmak için büyük bir fiziksel alan gerektirir. Bu canlı hücre ürününün, hasta uygulamasından önce sterilize edilemeyeceği ve hücrelerin terapötik potansiyeline zarar vermeden yapılamayacağı göz önüne alındığında, mevcut İyi Üretim Uygulamaları kılavuzlarının steril üretim için kullanılması çok önemlidir; bu da hücre üretiminin lojistik karmaşıklığını artırır ve dolayısıyla malların maliyetiniartırır 13.

Ayrıca, önceki çalışmalar, doku kültürü polistiren (TCPS) şişelerinde tipik MSC üretiminin popülasyon içi fenotipik heterojenliğin başlangıcına katkıda bulunduğunu göstermiştir. Bazı son kullanımlarda, bu durum partiler arasındaki kalite kontrol çabalarını araştırmada ve klinik çeviridezorlaştırır 14,15,16,17. TCPS termoslarındaki sınırlı biyokimyasal kontrolün, gazlar, besinler ve metabolik atık ürünlerin difüzyon gradyanları, kötü pH düzenlemesi gibi faktörlerin bu zorluklara katkıda bulunduğu varsayımlar yürütülmektedir.

Bu konular, dinamik karıştırma ile kontrollü üç boyutlu büyüme formatında mevcut üstün biyokimyasal düzenleme ve hücre yoğunluğundan yararlanmak için biyoreaktor bazlı kültürün benimsenmesinimotive etmektedir 18. Ancak, biyoreaktor tabanlı işleme veya üretimin kendi zorlukları vardır: ankraj noktasına bağlı bir hücre tipi olan MSC'ler, biyoreaktörde büyümek için bir tür substrat gerektirir ve bu da mikrotaşıyıcıların eklenmesini gerektirir. Ayrıca, ticari olarak sunulan birçok biyoreaktör, ölçülebilir hücre kalitesi göstergelerinin ifadesini etkileyen bilinmeyen işlem parametrelerini belirlemek ve geliştirmek için gereken keşif tezgahı araştırmaları için aşırı kaynak gerektiren hacim ölçeklerinde (> 3 L büyüme ortamı) çalışır. Bu özellikler, potansiyel kritik kalite özellikleri veya pCQA19 olarak tanımlanır.

Krupczak ve ark. daha önce, ARDS için geliştirilmiş pCQA ekspresyonuna sahip MSC'ler üreten mikrotaşıyıcı-mikrobiyoreaktör yaklaşımını bildirmiş, bu yöntem in vitro değerlendirmelerle sınırlı20. Bu yaklaşım, kendi içinde üretilen çözünebilir jelatin mikrotaşıyıcı platformunu, ticari olarak mevcut bir mikrobiyoreaktör platformu olan Mobius Breez mikrobiyoreaktör21 ile birleştirdi. Bu mikrobiyoreaktör, 2 mL tek kullanımlık tek kullanımlık reaktör odaları kullanır ve dinamik olarak karışık, kapalı döngü perfüzyon beslemeli bir sistemde sıcaklık, pH, CO2 ve O2 düzenlemesi gibi daha iyi biyokimyasal kontrol için birçok arzu edilen özelliği içerir; ancak MSC'ler gibi demirleme bağımlı hücreler için tasarlanmamıştır. Gerçekten de, reaktör içeriğini enjekte etmek için kullanılan standart mikrofluidik kanallar mikrotaşıyıcıların geçişine izin vermek için çok küçüktür ve bu platformda MSC'lerin başarılı üretimini sağlamak için önemli adaptasyon gereklidir.

Burada, bu mikrobiyoreaktörün MSC'lerin ankraj bağımlı kültürüne uyarlanması amacıyla ayrıntılı bir protokol tanımlanır ve gösterilir. Burada bildirilen süreç parametreleri, ARDS için terapötik etkinliğin klinik öncesi, in vitro değerlendirmesi için MSC'lerin süreç geliştirme ve üretimini bilgilendirmek amacıyla belirlenmiştir. Ancak prensipte, bu protokol diğer son kullanıcı uygulamaları, diğer inflamatuar veya immünomodülatör ile ilgili durumlar ve benchtop ölçekli bir ortamda geliştirilmiş biyokimyasal kontrolden faydalanabilecek diğer ankraj bağımlı hücre tipleri için uyarlanabilir. Şekil 1, eşlik eden videoda tanımlanan protokolü şematize eder ve Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4 temel sonuçları gösterir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mikrobiyoreaktör kurulumu ve hazırlığı

  1. Gerekli sayıda mikrobiyoreaktör tüketici malzemesinin hazırlanması
    1. Biyogüvenlik kabininin (BSC) açık ve steril olduğundan emin olun. Yeni tüketim malzemesini örten folyo torbasını poşetin üst kısmını delerek çıkarın ve bu deneyin sonuna kadar folyo torbasını tutun (kusur durumunda lot# detaylarını kaydetmek için). Dış su kaplanmasını açın ve içindeki nemlendirme paketini atın. Dış blister ambalajı at.
    2. İç kabarcıklı ambalajı %70 etanol ile sprey ile BSC'ye getirin. İç kabarma ambalajını açın ve atın.
    3. Steril bir şırınga kullanarak pistonu çıkarın ve nozulu 0,22 μm steril filtreye bağlayın. Şırınganın namlusuna 50 ml steril olmayan ultrasaf su dök. Şırıngayı bekleyen, steril 50 mL bir tüpün üzerinde tutarken, pistonu şırıngaya tekrar yerleştirin ve steril filtrelenmiş suyu bekleyen toplama tüpüne enjekte edin.
    4. Şişe rafındaki Bottle LL'ye bağlanan şeffaf plastik kapağı çıkarın. Yeni steril 50 mL bir şırınga kullanarak pistonu çıkarın ve nozulu şişe LL'ye bağlayın. Steril filtrelenmiş suyu şırınga namlusuna dökün ve şişe LL'ye enjekte edin.
      NOT: İğnesiz bağlantı portları üreticinin sterilizasyon işlemi sırasında takılabilir, bu yüzden şişenin mühürünü kırmak ve içeriği başarıyla enjekte etmek için şırıngayı birkaç kez bağlayıp söndürmeniz gerekebilir. Alternatif olarak, kaynak şişesini kaynak borusuna steril bir şekilde bağlamak için tüp kaynakçısı kullanabilirsiniz.
    5. Aynı prosedürü uygulayarak, şişe L'yi 25 mL FBS takviyesi olmayan düşük glikozlu DMEM, şişe R'yi 25 mL steril PBS ile ve şişe RR'yi 8 mL anti-yapışma durula solüsyonuyla doldurun. Her sıvı için yeni bir steril şırınga kullanın.
    6. Bu prosedür, deneyde ihtiyaç duyulan kadar çok tüketim malzemesi için tekrarlayın.
  2. Bu deney için kullanılan her POD'da bir POD kendi testi yapın.
    NOT: Kendi kendine test sorunsuz tamamlanmalıdır; Kendi testinin bir bileşeni başarısız olursa, devam etmeden önce arızayı ele alın.
  3. Kendi kendine test kasetlerini ışık korumalı saklama torbalarına çıkarın.
  4. Tüketici malzemeyi aşağıda tarif edildiği gibi biyoreaktöre monte edin.
    1. Yeşil bandı tüketici malzemenin valflerinden çıkarın ve POD'a yerine takın. Kelepçeleri yeniden takın ve dışarı çıkarken gaz/hava tıslama duyulmadığından emin olun.
    2. Beyaz şişe raf basınç sensörü hattını, kırmızı hava basınç hattını ve mavi vakum hattını tüketim malzemeleri ile baz istasyonu/POD arasında bağlayın. Yan enjeksiyon portunun beyaz damla kelepçesiyle sıkıştırıldığından emin olun.
    3. Yeni bir deney başlatmak için yazılım adımlarını takip edin. Bunlar, ~4-5 saat süren ve gece boyunca çalışabilen otomatik prime ve kalibrasyon özelliğiyle sonuçlanır.
  5. Her şişe rafını POD konumuyla etiketleyin ki tüketim malzemesi biyoreaktörden çıkarıldıktan sonra hangi POD'a geri döneceğinizi kolayca ayırt etmek kolay olsun. Konumu belirtmek için renkli bant kullanın: Pod0 = kırmızı, Pod1 = turuncu, Pod2 = sarı, Pod3 = yeşil. Deneyin adını ve tarihi kasete yaz.
  6. Tüketilebilir malzemeleri gece boyunca kalibrasyona bırakın. Medyanın reaktöre girip atık hattına çıkabildiğinden emin olun.
  7. Sıvı azotta depolanan hücreleri kullanmayı planlıyorsanız, onları eritin ve enjeksiyondan önce 24 saat boyunca 2>4 saat kazanmaları için onları eritin ve kaplamak.

2. Yeniden kalibrasyon ve mikrotaşıyıcı hazırlığı

  1. Otomatik astar ve kalibrasyon adımlarının başarıyla tamamlandığından emin olun.
    1. Kalibrasyon başarılı bir şekilde tamamlanmadıysa, temel nedenleri tespit edip düzeltin ve ardından yeniden kalibrasyon deneyin. Yaygın sorunlar arasında beyaz şişe raf kelepçesini çıkarmayı ihmal etmek, tüketici malzemeden yeşil bandı POD'a koymadan önce çıkarmayı ihmal etmek ve medya şişeyinde yeterli medya hacminin olmaması yer alır.
  2. Çözünmüş oksijen sensörlerinin stabil olduğundan emin olun.
    1. Tüketim malzemelerinin neredeyse %10'u kalibrasyondan sonra DO sensöründe sensör kayması gösterecektir. Tercih edilen düzeltici işlemi gerçekleştirin, yani tam kalibrasyonu tekrar yapmaktır. Gerekirse, aşağıdakilerden birini uygulayın.
      1. Kasette hava olmadığından emin olun, ardından kontrolleri göstermek için Display plots kontrol kutusunu işaretinden kaldırın, ardından DO ve pH Otomatik Kalibrasyonuna tıklayın.
        1. Yeniden kalibrasyon gerektiğinde reaktörde hava varsa, ilgili POD için pencerenin sol üst köşesindeki Mavi sol oku tıklayarak MBS gösterge panelinin ilk sayfasına geri dönebilirsiniz. Manuel işlemleri başlatmak için Butona tıklayın. Atık tüpü hazır kutusunu işaret edin ve atık şişesini seçmek için metin kutusuna W yazın. Eject-wash butonuna tıklayın, ardından açılır pencerede Evet'e tıklayın. Bu, reaktör odalarını boşaltacak ve medya kaynağı şişesinden gelen medyayla dolduracak.
  3. Her durum için bir tane olmak üzere 15 mL'lik konik tüplerde doğru sayıda mikrotaşıyıcı hazırlayın.
    NOT: Mikrotaşıyıcı sayısı, toplam yüzey alanı ve hücre tohumlama yoğunluğu uygulamanıza bağlı olacaktır. Bu protokol için, T75 şişesine kıyasla 75 cm2 mikrotaşıyıcı büyüme alanına ulaşan mutlak sayıda mikrotaşıyıcı enjekte edilmesi önerilir.
  4. Mikrotaşıyıcıların tüpte yerleşmesine izin verin; Mikrotaşıyıcıları çıkarmadan mümkün olduğunca çok süpernatantı aspire ederek hücreler ve taze ortam için yer açın.

3. Hücre ve mikrotaşıyıcı enjeksiyonu

  1. Otomatik prime ve kalibrasyon özelliklerinin başarıyla tamamlandığından emin olun.
  2. Reaktör standart askı hücresi iş akışına göre aşılanıyormuş gibi yazılım penceresinden geçin.
  3. Bu aşamada hücre enjeksiyonu yapılmadığını belirtmek için açılır pencereye bir not ekleyin.
  4. Reaktör karıştırıcısını durdurmak için manuel işlemleri başlatın ve şişe raf hatlarına beyaz bir C-kelepçesi ekleyin.
  5. Her tüketim malzemesini çıkarın ve BSC'ye aktarın. İstaçlanmış malzemeyi atık ve perfüzyon şişelerinden çıkarın ve atın.
    1. Çalışmanın herhangi bir noktasında koşullu ortamı hasat etmeyi planlıyorsanız, büyük perfüzyon şişesinden ve içindeki küçük 1.5 mL tüpten tüm atıkları çıkardığınızdan emin olun.
  6. Serum takviyesi olmayan büyüme ortamını şişe L'den çıkarın ve atın. Şişe L'yi ~20 mL steril PBS ile durulayın ve atın. Şişe L'ye 25 ml serumla takviyeli büyüme ortamı ekleyin.
  7. Tüketim malzemelerini ilgili POD'larına geri gönderin. Medya kaynaklı şişeleri deneyin kalan süresi boyunca buz üzerine koyun. Buzu her gün tazeleyin.
    NOT: Islak buz, sıcaklık kontrolünün süresini uzatmak için dondurucu paketleriyle desteklenebilir.
  8. Reaktörleri PBS ile yıkayın ve hatları alçaltın.
    1. Şişeleri Yıkama butonuna tıklayın, Şişe L için Radyo butonunu etkinleştirin, Output to Waste seçeneğini seçin, ardından Start Flush MSCserum'a tıklayın.
      NOT: Bu, yeni eklenen hMSC medyasını hattın içinden geçirerek FBS takviyesi olmayan medyanın reaktöre girmemesini sağlayacak.
    2. Şişeleri Atma düğmesine tekrar tıklayın, Şişe RR için Radyo butonunu seçin ve sifileye başlayın. Bu, anti-yapışma yıkama çözeltisini hattın içinden geçirir ve reaktöre giriş için hazır olmasını sağlar.
    3. Şişe İçerikleri penceresinde, yazılımda MSC serum'un aslında PBS içeren Şişe R'de yer aldığını belirtin.
    4. Manuel işlemlere geçin ve atık şişesinde üç fırlat-yıkama döngüsü yapın.
  9. Reaktöre anti-yapışma durulama çözeltisi ekleyin.
    1. Şişe İçeriği penceresine geri dönüp MSC serum'un aslında yapışma önleyici durula solüsyolu içerdiği Şişe RR'de olduğunu belirtin.
    2. Manuel işlemlere geçin ve atık şişesinde bir çıkarma-yıkama döngüsü yapın.
      NOT: Önceki PBS yıkaması, DMEM'deki herhangi bir bileşenin anti-yapışma yıkamaya müdahale etmesini önlemek içindi; Şimdi, reaktör izli PBS ile anti-yapışma durulama çözeltisi ile dolu olmalı.
  10. 30 dakika geçtikten sonra, anti-yapışma çözeltisi varken tüketim malzemesini PBS ile durulayın.
    1. Şişe İçerikleri penceresinde, yazılımda MSC serum'un aslında PBS içeren Şişe R'de yer aldığını belirtin.
    2. Manuel işlemlere geçin ve atık şişesinde üç fırlat-yıkama döngüsü yapın.
    3. Şişe İçeriği penceresine geri dönüp yazılımda MSC serumunun hMSC medyasını içeren Şişe L'de olduğunu belirtin.
  11. Reaktörü boşaltarak hücre ve mikrotaşıyıcı enjeksiyonunu bekleyin. Manuel operasyonlar panelinde, Reinoculate tuşuna tıklayın ve sistemi gösterge panelinin reaktöre aşı yapılacağını gösterdiği aşamada bırakın.
    NOT: Burada aşı terimi, mikrobiyoreaktörde genleşmesi amaçlanan hücrelerin enjeksiyonu anlamına gelir.
  12. Karışım hızını varsayılan R0 dirençle uyumlu şekilde modüle etmek için ek dirençler ekleyin.
  13. Termosundan hücreleri kaldırıp hemositometrede say. Sterilliği sağlamak için tüm açık işlemleri bir BSC'de gerçekleştirin.
    1. Ortamı aspire edin, ardından 5-10 ml önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve şişeye 5 mL tripsin + EDTA ekleyin.
    2. 37 °C'de 5 dakika veya tüm hücreler şişe yüzeyinden görünür şekilde kalkana kadar kuluçka yapın.
    3. Tripsin aktivitesini nötralize etmek için önceden ısıtılmış 10 mL hMSC ortamı ekleyin. Sıvı içeriği çekip 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
    4. Hücreleri 300 x g ile 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve hücre pelletini saymak için uygun bir hMSC ortam hacminde yeniden askıya alın. Tam birleşen bir T75 şişesi için uygun bir hacim genellikle 2-4 mL olur ve bu da hücre konsantrasyonu ~1-2E6 hücre başına mL sağlar.
    5. Yeniden askıya alınmış hücrelerden bir örnek eşit miktarda Trypan Blue canlılık boyası ile karıştırın ve karışımı saymak üzere hemositometreye yükleyin. Hücreleri üreticinin talimatlarına göre say.
  14. 150.000 hücreye ulaşmak için gereken hücre çözeltisi hacmini hesaplayın ve bu miktarı her durum için mikrotaşıyıcılar içeren bekleyen 15 mL konik tüpe içine pipetleyin. Tüpteki hacmi 2.2 - 2.5 mL arasında taze, sıcak hMSC ortamıyla doldurun.
    NOT: Her 15 mL'lik konikteki hacm, enjeksiyonun biraz fazla dolu bir reaktör durumuna yol açması ve kabarcıkların oluşmasını önlemek için 2 mL'den biraz fazla olması gerekir; bu durum daha sonraki adımda eşitlenecektir.
  15. T75 şişe kontrolüne uygun hücre hacmini ekleyin.
  16. Bir veya iki tüketim malzemesi ile aynı anda çalışırken, POD'dan sarf malzemelerini çıkarıp BSC'ye getirin.
  17. Yeşil 4 inçlik küt iğnelerle 5 mL'lik bir şırıngada hücreleri ve mikrotaşıyıcıları çekin. Hücreleri ve mikrotaşıyıcıları reaktöre enjekte edin.
  18. Tüketim malzemesini baz istasyonuna geri gönderin ve tüm tüketim malzemeleri enjekte edilene kadar tekrarlayın.
  19. Aşının gerçekleştiğini göstermek için Yazılım Pencerelerine tıklayın. Yazılım normal ana sayfaya döndüğünde, tüketilebilir çıkış hatlarından beyaz kelepçeyi çıkarın.
  20. Manuel işlemlere girin ve perfüzyon için çıkış portu P'ye ayarlanmış Ekstra Çıkarma fonksiyonunu gerçekleştirin. 1680 s açık ve 120 s kapalı olarak statik karıştırma modunu açın. Statik miksaj için miksleme frekansını 5 Hz'de tutun.
  21. Optik yoğunluk referans ölçümünü kapatın.
    1. MBS istemcisini açın ve Bağla'na tıklayın. Alıntılar içinde yer alan şu komutu girin: "dmem_write 0,1,2,3 F_measure_ODref_skip 1"
    2. Gönder tuşuna tıklayın, komutun başarılı gönderildiğinin onayını bekleyin ve MBS İstemcisini kapatın.
  22. 24 saat sonra statik karıştırma modunu devre dışı bırakın ve normal karıştırmayı yeniden etkinleştirin. Karıştırma frekansını 1.5 Hz'e düşür.

4. Mikrobiyoreaktör çalışması

  1. Mikrobiyoreaktörü her gün izleyin ki herhangi bir sorun deneyi bozmasın. Medya kaynağı şişelerinin reaktörü sorunsuz bir şekilde perfüze etmek için >5 mL madde bulundurduğundan emin olun.
  2. Medya kaynağı şişesinin sıcaklık kontrolünü sağlamak için buz kovalarını gerektiğinde değiştirin. Mikrobiyoreaktörün ön kısmının üzerinde ışık koruma örtüsünü tutarak uçucu ortam bileşenlerinin ışık bazlı bozulmasını önleyin.
  3. Reaktöre baloncuk getirilmediğinden emin olun. TCPS şişe kontrolündeki medyayı periyodik olarak değiştirmeyi unutmayın.

5. Mikrobiyoreaktör hasadı

  1. BSC'nin steril ve çalışmaya hazır olduğundan emin olun.
    1. Aşağıdaki gerekli reaktifleri boncuk veya su banyosunda 37 °C'ye kadar ısıtın: ~25 mL sıcak hMSC ortamı, 10 mL sıcak PBS ve hasat için gereken 1,5 mL 10 mg/mL Pronaz.
  2. Şişe rafını hasat için hazırlayın.
    1. Yazılımdaki her POD için manuel operasyon modunu açın.
    2. Tüketilebilir giriş hatlarını beyaz bir C-kelepçeyle hattın şeffaf kısmı boyunca sıkıştırın.
    3. Tüketim malzemelerini BSC'ye çıkarın. Atık şişesindeki içeriği çıkarın ve atın.
    4. Atık şişesini ~20 mL PBS ile yıkayın ve atın. Medya şişesindeki kalan hacmi değerlendirin ve gerekirse taze (soğuk) hMSC malzeme ile doldurun.
      NOT: Burada, hasat için üç gerekli eplasman yıkama döngüsünü tamamlamak için > 4 mL ortam gereklidir.
    5. Çöp şişesini ~5 mL soğuk hMSC ortamıyla kaplayın, böylece hasat edilen sıvı yumuşatılır.
  3. Mikrobiyoreaktörden hücreleri alın.
    1. 1 mL bir şırınga kullanarak, şırıngaya 200 μL 10 mg/mL Pronase ve ~300-400 μL hava çekin.
    2. Yan port enjeksiyon hattı kapağını çıkarın ve iğnesiz valf konnektörünü %70 etanol ile sprey yapın. Düğümlü yan port enjeksiyon hattını sabitleyen bandı çıkarın ve düğümü açın. Beyaz damla kelepçesini açın.
    3. 1 mL şırıngayı bağlayın ve Pronaz'ı nazikçe reaktöre enjekte edin. Tüm sıvı içeriğin reaktöre ulaştığından emin olmak için sıvıyı enjeksiyon hattı boyunca hava ile takip edin.
    4. Damla kelepçesini tekrar takın ve yan port enjeksiyon hattını tekrar kapatın. Tüketici malzemeyi POD'una geri döndür, tüm hatları yeniden bağla, beyaz C-kelepçesini çıkar ve karıştırmaya devam et.
    5. Atık şişesi ve medya kaynağı şişesinin buz üzerinde tutulduğundan emin olun. 5 dakikalık bir zamanlayıcı başlatın ve Pronase'ın reaktör içindeki mikrotaşıyıcıları sindirmesine izin verin.
    6. 5 dakika sonra, mikrotaşıyıcıların artık reaktörde görünmediklerini doğrulayarak bozulmadığını kontrol edin. Mikrotaşıyıcılar hâlâ görünürse, sindirim için bir dakika daha bekleyin. Eğer mikrotaşıyıcı görünmüyorsa, devam edin.
    7. Hücreleri topla. Manuel işlem modunu açın, döngülerin # sayısını 3'e ayarlayın, çıkış portunu israf için W olarak ayarlayın ve Eject Wash'a tıklayın.
    8. Eplasman yıkama döngüleri tamamlandıktan sonra, tüketim malzemesini tekrar BSC'ye çıkarın ve atık şişesindeki içeriği 10 veya 20 mL bir şırınga ile çekin.
    9. Atık şişesindeki içeriği 15 mL'lik konik santrifüj tüpüne dağıtın. Hücreleri 300 x g ile 5 dakika boyunca santrifüjlen, süpernatı aspire edin ve hücre pelletinin boyutunu değerlendirin.
    10. Hücre pelletini 1-5 mL büyüme ortamı (PBS) içinde yeniden süspansiyona alın ve hücreleri hemositometrede sayın. Tüm tüketim malzemeleri için bu adımı tekrarlayın.
  4. Şişe koşullarını normal hücre kültürü protokollerinizle alın. MSC'ler için tipik bir protokol 3.13'te tanımlanmıştır.

6. Mikrobiyoreaktör koşullarından ve sonraki uygulama için termos koşullarından hücreleri analiz etmek

NOT: Öne çıkan sonuçların üremesinde kullanılan analitik yöntemler aşağıda kısaca verilmekte ve Krupczak, Farruggio ve Van Vliet (2024)20'de daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

  1. Çevresel kontrol: Bir kültür dönemi boyunca tüketim malzemesinin entegre sensörlerinden gelen verilere erişmek ve görüntülemek için mikrobiyoreaktör tarafından sağlanan grafik kullanıcı arayüzünü kullanır. Bu veriler, mikrobiyoreaktorla birlikte gelen dizüstü bilgisayara yüklenen Breez Explorer yazılımında sağlanmaktadır.
  2. Hücre Verimi: Yukarıda tarif edildiği gibi MSC'leri toplayıp hücreleri 300 x g olarak 5 dakika boyunca pellet edin. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücre pelletini uygun bir hacimde PBS veya hMSC ortamında (1-2 mL) iyice yeniden süspansiyona yerleştirin. Yeniden askılanmış hücre karışımından bir örnek alın ve eşit hacimde Trypan Blue boyası ile karıştırın. Boyalı örnek karışımını hemositometre çipine mikropipet ile otomatik veya manuel hemositometrede hücre sayısı ile canlılığı ölçür.
  3. Aşağıda açıklandığı gibi iki aşamalı ters transkripsiyon niceliksel polimeraz zincir reaksiyonu ile gen ifadesini kontrol edin.
    1. RNA arıtma: Üreticinin talimatlarına uygun olarak her örnekten RNA'yı izole etmek ve arındırmak için bir RNeasy Mini kiti kullanın. Kısaca, hücreleri lizle yapın, hücre içeriğini bir arıtma spin tüpüne aktarın ve örnekleri her tampon ile yıkayarak gereksiz hücresel bileşenleri, nüklein asitleri ve sonraki PCR'yi engelleyebilecek proteinleri çıkarabilirsiniz.
    2. cDNA dönüşümü: Üreticinin talimatlarına göre saflaştırılmış RNA'yı tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) dönüştürmek için Yüksek Kapasiteli Ters Transkripsiyon Kiti ve termal döngüleyici kullanın. Kısaca, kit bileşenlerini eritin ve örnekleriniz için uygun hacimlerde bileşenleri birleştirerek master mix oluşturun. Her bir PCR plakasının her kuyusuna eşit miktarda saflaştırılmış RNA ve hazırlanmış master karışımı (her biri 10 μL) yükleyin, her örnek kimliğinin konumlarını takip etmeye özen gösterin. Ters transkripsiyon reaksiyonunu tamamlamak için termal döngücü üretici protokolünü takip edin.
    3. qPCR: Primer dimer'i önlemek için doğrulanmış ekzon yayıcı, diziye özgü primerler kullanılarak, 384 kuyruklu bir qPCR plakasına ön primer, ters primer, şablon cDNA, nükleaz içermeyen su ve uygun hacimlerde (genellikle 1 μL, 1 μL, 1 μL, 7 μL, 10 μL) master karışım yükleyin; her gen ve örnek için birden fazla teknik replikasyon kuyusu kullanılır. Gerekirse tüm gen hedeflerini yakalamak için içeriği birden fazla plakaya bölebilirsiniz. Belirli bir gen hedefi için tüm örneklerin aynı plakaya yüklendiğinden emin olun; böylece sonuçlarda plakadan plakaya değişkenlik oluşmaması ve her plakanın uygun bir temizlik geni ile şablonsuz kontroller bulunmasıdır. Uygun bir qPCR makinesinde floresans yoğunluğunu ölçün ve gen ifadesini hesaplamak için göreceli nicelik için ΔΔCt yöntemini kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiyoreaktör, kültürde yaklaşık 10 gün boyunca çevresel faktörlerin izlenmesini ve düzenlenmesini sağladı. pH (Şekil 2A), sıcaklık (Şekil 2B), çözünmüş oksijen (Şekil 2C) ve karbondioksit (Şekil 2D) gibi çevresel faktörler, kültür dönemi boyunca mikrobiyoreaktör koşullarında hassas şekilde ölçülüp korunmuştur, ancak şişe koşullarında...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, mikrotaşıyıcı-mikrobiyoreaktör yaklaşımıyla hücreleri genişletme, astarlama ve hasat yöntemi tanımlanır. Bu süreç, MSC'ler gibi ankraj-bağımlı hücrelerin, hızlı süreç geliştirme için uygun olan bir biyoreaktör platformunun üstün biyokimyasal kontrolü altında (geleneksel TCPS şişelerine kıyasla) hücre sayısını artırmasını sağlar. Ayrıca, MSC'lerin mikrotaşıyıcı-mikrobiyoreaktör üretiminin, ARDS tedavisinde gelişmiş terapötik potansiyel gösterebilecek primed hücre fenotipine...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, mikrobiyoreaktör üreticisi MilliporeSigma ile bir iş birliği anlaşması açıklıyor.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

QPCR analizi ve sorun giderme konusundaki Genomics Core tesisine (Weill Cornell Medicine) danışmanlık yaptıkları için teşekkür ederiz. Evan Gates ve Eric Shiue'nin (MilliporeSigma) mikrobiyoreaktör için teknik desteği memnuniyetle karşılıyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-yapışma yıkama çözeltisiKök Hücre Teknolojileri7010
Biyogüvenlik kabini
Breez MikrobiyoreaktoruMilliporeSigma
Santrifüj
Konik tüp, 15 mL
Konik tüp, 50 mL
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı, düşük glikozGibco11885084
Etanol
Fetal Sığır SerumuGibcoA5670701
Hemositometre
Laboratuvar Bandı
Mikrotaşıyıcılar
Mikrosantrifüj tüpü, 1.5 mL
Mikroskop
İğne, kör, 4", 18 kalibreAmazonB0D663ZR6D
Fosfat tamponlu tuzlu suCorning21-040-CM
Pronase, Streptomyces griseus'tanMilliporeSigma10165921001
Serolojik Pipet, 10 mLVWR75816-100
Steril deyonize su
Şırınga filtresi, 0.22 um, sterilCelltreat Bilimsel Ürünleri229762
Şırınga, 1 mLBD309628
Şırınga, 20 mLBD302830
Şırınga, 5 mLBD309646
Şırınga, 50 mLBD309653
Doku Kültürü Polistiren Şişesi, T75Thermo Fisher Scientific130190
Trypan MavisiSigmaAldrichT8154-100ML

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sin, W. X., et al. A high-density microfluidic bioreactor for the automated manufacturing of CAR T cells. Nat Biomed Eng. 8 (12), 1571-1591 (2024).
  2. US Food and Drug Administration. FDA Approves First Mesenchymal Stromal Cell Therapy to Treat Steroid-refractory Acute Graft-versus-host Disease. , (2024).
  3. Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. N Engl J Med. 377 (6), 562-572 (2017).
  4. Torres Acosta, M. A., Singer, B. D. Pathogenesis of COVID-19-induced ARDS: implications for an ageing population. Eur Respir J. 56 (3), 200249(2020).
  5. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 18(2019).
  6. Kidd, S., et al. Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging. Stem Cells. 27 (10), 2614-2623 (2009).
  7. Gnecchi, M., et al. Evidence supporting paracrine hypothesis for Akt-modified mesenchymal stem cell-mediated cardiac protection and functional improvement. FASEB J. 20 (6), 661-669 (2006).
  8. Doron, G., Temenoff, J. S. Culture Substrates for Improved Manufacture of Mesenchymal Stromal Cell Therapies. Adv Healthc Mater. 10 (15), e2100016(2021).
  9. Noronha, N. C., et al. Priming approaches to improve the efficacy of mesenchymal stromal cell-based therapies. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 131(2019).
  10. Hezam, K., et al. Superior protective effects of PGE2 priming mesenchymal stem cells against LPS-induced acute lung injury (ALI) through macrophage immunomodulation. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 48(2023).
  11. Zhang, X., et al. Mesenchymal stromal cells alleviate acute respiratory distress syndrome through the cholinergic anti-inflammatory pathway. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 307(2022).
  12. Full Prescribing Information - Ryoncil. , https://www.ryoncil.com/pdfs/prescribing-information.pdf (2024).
  13. Kumar, A., Starly, B. Large scale industrialized cell expansion: producing the critical raw material for biofabrication processes. Biofabrication. 7 (4), 044103(2015).
  14. Rennerfeldt, D. A., Raminhos, J. S., Leff, S. M., Manning, P., Van Vliet, K. J. Emergent heterogeneity in putative mesenchymal stem cell colonies: Single-cell time lapsed analysis. PLoS One. 14 (4), e0213452(2019).
  15. Mets, T., Verdonk, G. In Vitro Aging of Human Bone Marrow Derived Stromal Cells. Mech Ageing Dev. 16, 81-89 (1981).
  16. Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (14), 7841-7845 (2001).
  17. Tremain, N., et al. MicroSAGE Analysis of 2,353 Expressed Genes in a Single Cell-Derived Colony of Undifferentiated Human Mesenchymal Stem Cells Reveals mRNAs of Multiple Lineages. Stem Cells. 19 (5), 408-418 (2001).
  18. Klein, S. G., et al. A prevalent neglect of environmental control in mammalian cell culture calls for best practices. Nat Biomed Eng. 5 (8), 787-792 (2021).
  19. Bellani, C. F., et al. Scale-Up Technologies for the Manufacture of Adherent Cells. Front Nutr. 7, 575146(2020).
  20. Krupczak, B., Farruggio, C., Van Vliet, K. J. Manufacturing mesenchymal stromal cells in a microcarrier-microbioreactor platform can enhance cell yield and quality attributes: case study for acute respiratory distress syndrome. J Transl Med. 22 (1), 614(2024).
  21. Ng, E. X., et al. Dissolvable Gelatin-Based Microcarriers Generated through Droplet Microfluidics for Expansion and Culture of Mesenchymal Stromal Cells. Biotechnol J. 16 (3), e2000048(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbioreactor ProductionMesenchymal Stromal CellsAnchorage Dependent CellsCell Therapy ManufacturingGelatin MicrocarriersAcute Respiratory DistressEnvironmental MonitoringCell HarvestingCell Quality ControlBiochemical Environment Control

Related Articles