Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Transdermal İletim için CAGE Bazlı İyonik Sıvı Sistemlerinin Geliştirilmesi, Karakterizasyonu ve Değerlendirilmesi

1.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/68658

⸱

26 Eylül 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1LEO Foundation Center for Cutaneous Drug Delivery, Department of Pharmacy, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

Bu makalede

Özet

Bu protokol, tekrarlanabilirliği sağlamak ve farklı bilimsel laboratuvarlarda genel iş akışını kolaylaştırmak için CAGE bazlı iyonik sıvı sistemlerinin hazırlanmasına yönelik standardizasyonu tartışmaktadır.

Özet

İyonik sıvılar, son zamanlarda ilaç dağıtımındaki uygulamaları, özellikle de kutanöz ilaç penetrasyonunu sağlama ve ilaç geçirgenliğini artırma potansiyelleri nedeniyle dikkate değer bir tanınma kazanmıştır. İyonik sıvılar, bariyer geçirgenliğini arttırmanın yanı sıra, az çözünen ilaçların çözülmesi zorluğunu ortadan kaldıran mükemmel çözme özelliklerine sahiptir. Organik katyonlar ve anyonlar arasındaki büyük asimetri nedeniyle, bu fonksiyonel tuzlar oda sıcaklığında sıvı kalır. Uygulama açısından bakıldığında iyonik sıvılar, birden fazla terapötik alana hizmet etmek için umut verici ve oldukça ayarlanabilir bir yaklaşım sağlar. Kolin ve geranik asitten (CAGE) oluşan, 1:2 stokiyometrik iyon oranına sahip biyouyumlu bir iyonik sıvı, küçük moleküller, peptitler, proteinler ve nükleik asitler dahil olmak üzere çok çeşitli aktif farmasötik bileşenlerin transdermal iletimi için muazzam bir potansiyele sahiptir. Bunun cilt bariyeri işlevi üzerinde minimum etkisi vardır. Burada, CAGE'nin hazırlanması, karakterizasyonu ve değerlendirilmesi için yöntemlerimizi paylaşıyoruz. NMR spektroskopisi, diferansiyel taramalı kalorimetri, su içeriği analizi için Karl-Fischer titrasyonu ve domuz derisi üzerinde ex vivo bariyer etkileşimi çalışmaları kullanılarak CAGE karakterizasyonu için temsili sonuçlar gösterilmiştir.

Giriş

Cilt, vücudun en büyük ve en hayati organıdır ve zararlı maddelere karşı koruyucu bir bariyer görevi görürken aynı zamanda su kaybını da önler1. Aynı zamanda ilaçların cilde ve deri yoluyla uygulanması çok çeşitli avantajlar sunar. Enjekte edilebilir ilaçlar ve oral uygulama ile karşılaştırıldığında, kutanöz uygulama hasta uyumunu artırır ve karaciğerde ilk geçiş metabolizmasını önler2. Özellikle cilt rahatsızlıkları için, kutanöz olarak uygulanan formülasyonlar, sistemik maruziyeti azaltarak lokalize bir etki sağlamada mükemmeldir3. Bununla birlikte, cildin neredeyse geçirimsiz doğası, başarılı kutanöz doğumu önemli ölçüde zorlar4. İnsan derisi üç farklı katmandan oluşur: epidermis, dermis ve hipodermis4. Epidermis cildin dış tabakasıdır ve ayrıca farklı alt katmanlara ayrılabilir, stratum corneum esas olarak keratinositlerden oluşan en dış katmandır. Stratum corneum, moleküllerin çoğu için belirgin bir geçirgenlik bariyeri görevi görür ve cildin daha derin katmanlarına taşınmalarını engeller5. Bu bariyer işlevi, genellikle tuğla ve harç yapısı6 olarak adlandırılan, esas olarak fosfolipidler, steroller ve seramidlerden oluşan, sıkıca paketlenmiş bir lipid düzenlemesine gömülü korneositlerin varlığından kaynaklanır. Bu cilt bariyerinin üstesinden gelmek için, içinde bulunan lipitler ve proteinlerle etkileşime girerek stratum corneum'un yapısını bozdukları için makromolekülleri iletmek için kimyasal geçirgenlik arttırıcılar (CPE'ler) konuşlandırılmıştır7.

İyonik sıvılar (IL'ler), yeni nesil CPE'ler8 olarak ortaya çıkmıştır. Bunlar, asimetrik bir şekilde düzenlenmiş ve zayıf, yönsüz iyonik etkileşimlerle koordine edilen hacimli organik katyon ve anyonlardan oluşur9. Bu zayıf moleküller arası kuvvetler nedeniyle, IL'ler 100 °C'nin altında sıvılar halinde bulunur ve iyi tanımlanmış bir kristal yapıya10 sığamazlar. IL'ler, etkinlikleri büyük ölçüde katyon veya anyon seçimine ve bu iyonlar arasındaki stokiyometrik orana bağlı olduğundan, oldukça ayarlanabilir. Bu nedenle, çeşitli hidrofobikliklere sahip ilaçlar için yüksek çözündürme ve stabilize etme kapasitesine sahiptirler11. IL'ler, sırasıyla makromoleküllerin sürekli salınımını ve kapsüllenmesini sağlayarak hem lipitlerin hem de polimerlerin benzersiz özelliklerine hizmet eder12.

1:2 stokiyometrik molar oranında bulunan kolin ve geranik asit (CAGE) bazlı biyouyumlu IL'ler, hem hidrofilik hem de hidrofobik bileşiklerin transdermal iletiminde önemli uygulamalara sahiptir. CAGE'nin proteinlerin (insülin13) ve nükleik asitlerin (siRNA14) transdermal iletimini önemli ölçüde arttırdığı bildirilmiştir. CAGE, kolin bikarbonat ve geranik asit arasındaki tuz metatezi reaksiyonu ile COile hazırlanır 2 yan ürünolarak 15 . Tuz metatez reaksiyonu, ılıman koşullar altında doğrudan, hızlı ve oldukça seçici bir şekilde iyon değişimi yoluyla yeni bileşiklerin oluşumunu sağlar. Genel olarak, CAGE IL geliştirme ve değerlendirme için takip edilmesi kolay iş akışları eksikliği vardır. Bu nedenle, burada, farklı geçmişlere sahip araştırmacıların bu araştırma alanına girmelerini sağlamak için CAGE hazırlığının her aşamasını detaylandıran böyle bir iş akışı sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler 2010/63 sayılı Avrupa Birliği Direktifine uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Danimarka Veterinerlik ve Gıda İdaresi tarafından onaylanmıştır (Lisans No. DK-13-oth-931833).

1. Tuz metatez reaksiyonu ile KAFES hazırlama

  1. Geranik asidin yeniden kristalleştirilmesi (%85 saflık, mol ağırlık 168,23 g/mol)
    1. 500 mL'lik yuvarlak tabanlı bir şişe alın ve ağırlığını ölçün.
    2. Şişede 40.0 g sardunik asit tartın. Bu, 0,2 mol sardunya asidine karşılık gelir.
    3. Geranik asidi %70:30 (a/a) sart asit:aseton içinde yeniden kristalleştirin: Yuvarlak tabanlı şişeye (40 g*0,85*0,30)/(0,70*0,784 g/mL) = 18,42 mL aseton ekleyin.
    4. 5 L'lik bir beher alın ve yaklaşık 0,5 L kuru buz ve etanol hazırlayın.
    5. Yuvarlak tabanlı şişeyi, harici soğutmaya izin vermek için döndürmeden kuru buz-etanol soğuk karışımına yerleştirin. Kristalleşme dengeye ulaştığında katı/yeniden kristalize sart asitteki aseton ve safsızlıkları boşaltın (tipik olarak 0,5-2 saat içinde yaklaşık olarak eklenen asetonun hacmine karşılık gelir). Yeterli saflığı sağlamak için bu adımı 5-6 kez tekrarlayın.
    6. Kalan asetonu vakum altında 40 rpm'de en az 20 dakika veya yuvarlak tabanlı şişe dokunulduğunda artık soğuk hissetmeyene kadar döndürerek buharlaştırma yoluyla çıkarın (aseton 20 °C'de 240 mbar buhar basıncına sahiptir).
    7. Şişenin ve yeniden kristalize sart asidinin kütlesini tartın ve not edin. Verimi başlangıçtaki boş şişe ağırlığına göre hesaplayın. Beklenen verim aralığı %60-80'dir.
  2. Tuz metatezi reaksiyonu
    1. 2:1 molar sardan asit:kolin oranı için, geranik asit yeniden kristalleşmesinin verimini hesaba katarak kolinin mol sayısını hesaplayın. Örneğin, %70 verimle 0,07 mol kolin eklenmelidir (0,2*70/100=0,14, 0,14/2 = 0,07).
    2. Kolin bikarbonat %80 saflığa ve 165,19 g/mol molekül ağırlığına sahiptir. Buna göre, yayılmayı önlemek için damla damla 14,45 g (0,07*165,19 = 11,56 g; 100/80*11,56 g = 14,45 g) kolin bikarbonat ekleyin.
    3. Numuneyi gece boyunca oda sıcaklığında (18 ± 3 saat) veya CO2 buharlaşması durana kadar 300 rpm (veya uygun) hızda karıştırın.
    4. Numuneyi 60 °C, 30 mbar'da 40 dakika boyunca döndürücü buharlaştırma ile kurutun. Önce sıcaklığı artırın, ardından köpürmeyi önlemek için basıncı yavaşça azaltın.
    5. CAGE'i amaçlanan uygulamaya uygun hacimlerde cam şişelere ayırın (örneğin, 4 mL'lik cam şişelerde 2 mL CAGE).
    6. Şişeleri vakum altında 60 °C'de 48 saat kurutun.

2. CAGE'nin karakterizasyonu

  1. Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi
    1. CAGE'i döteryumlu dimetil sülfoksit (d-DMSO) içinde 25 mg/mL'lik bir konsantrasyona kadar çözün ve en az 500 μL'lik bir nihai hacim sağlayın.
      NOT: Çözücüdeki hidrojen atomlarının girişimini önlemek için NMR'de döteryumlu çözücüler gereklidir.
    2. Hazırlanan çözeltinin 500 μL'sini temiz, kuru bir NMR tüpüne (cihaza bağlı olarak tipik olarak 5 mm çapında) aktarın. Buharlaşmayı ve kirlenmeyi önlemek için tüpü bir kapakla kapatın.
      NOT: Manyetik alan homojenliğini etkileyebileceğinden hava kabarcıkları çıkarmaktan kaçının.
    3. Aşağıdaki parametrelere sahip bir NMR spektrometresi (örn. 400 MHz) kullanın:
      -Tarama sayısı: 1 H NMR için 8-16; 13C NMR için 1.000-5.000 (konsantrasyona ve istenen sinyal-gürültü (S/N) oranına bağlı olarak.
      -Gevşeme gecikmesi (D1): 1 H ve 13C NMR için 1-2sn.
    4. Verileri uygun yazılım kullanarak işleyin.
      1. Faz ve taban çizgisi düzeltmesi yoluyla optimum tepe şekilleri için ayarlayın.
        NOT: Bu genellikle NMR yazılımında, faz ayarı ve taban çizgisi düzeltmesi için otomatik araçların mevcut olduğu İşleme veya Düzeltme sekmesindeki (kullanılan yazılıma bağlı olarak) gerçekleştirilir.
      2. Artık çözücü tepe noktasını (d-DMSO) referans olarak kullanın: ~ 1Saat için yaklaşık 2,50 ppm, ~ 13C NMR için yaklaşık 39,52 ppm. Safsızlık referansları için Fulmer ve ark.15'ebakınız.
    5. Tepe noktalarını entegre edin ve bunları yapıdaki protonlara atayın (bkz. Şekil 1).
  2. Karl Fischer titrasyonu ile belirlenen su içeriği
    1. 300 mg CAGE'yi 300 μL metanol içinde çözün. 1 mL'lik bir şırıngaya yükleyin ve enjeksiyondan önce ve sonra tartın.
    2. Üreticinin talimatlarına göre kulometrik bir Karl Fischer titratörü kullanarak su içeriğini belirleyin.
      1. Numuneyi bir şırınga kullanarak septum yoluyla titrasyon hücresine enjekte edin, boş şırınga ağırlığını girin ve Enter tuşuna basın. Sonuç % w/w olarak görünecektir.
      2. CAGE'deki gerçek su içeriğini (tipik olarak %1-2 a/a) elde etmek için metanolün su içeriğini ayarlayın. (Wnumunesi = Wnumunesi+seyreltici*(mnumunesi+mseyreltici) - (Wseyreltici*mseyreltici)/mnumunesi).
  3. Diferansiyel Taramalı Kalorimetri (DSC) ile CAGE'nin termal kararlılığı
    1. Her numuneden 3-5 mg'ı alüminyum Tzero tavalara yerleştirin ve hermetik bir kapakla kapatın.
    2. Numuneleri 80 °C ila - 80 °C sıcaklık aralığında, -80°C'ye soğutmadan önce 10 dakikalık izotermal periyotla bir DSC kullanarak analiz edin.
    3. 5 °C/dk'lık sabit bir ısıtma/soğutma hızı ve 50 mL/dk'lık bir nitrojen tahliyesi kullanın.
    4. Verileri uygun yazılımı kullanarak işleyin.

3. Cilt bariyeri etkileşiminin ex vivo değerlendirmesi

  1. Domuz derisinin dermatom işlenmesi
    1. Dermatom bıçağına uyacak şekilde genleşmiş polistireni (EPS) kesin ve aşılama bandı ile sarın. Domuzların bel bölgesinden toplanan deriyi neşter kullanarak kullanın. Burada 3,5 aylık dişi Danimarka Landrace veya Yorkshire domuzlarından (30-40 kg) deri elde edildi.
    2. Kas ve yağ dokusunu çıkarın. Dokunun dermatomunu kolaylaştırmak için düz ve eşit bir bazolateral taraf sağlamak önemlidir.
    3. Bir saç düzeltici kullanarak ciltten mümkün olduğunca fazla tüy alın.
    4. Kanı ve gevşek tüyleri çıkarmak için cildi fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) ile durulayın.
    5. EPS bloklarına uyacak şekilde bir bıçak kullanarak deriyi daha küçük parçalara (5 cm x 15 cm) kesin.
    6. Cildi iğnelerle EPS bloğuna tutturun.
    7. Dermatomu 0,5 mm kalınlığa ayarlayın ve cildi bölümlere ayırın.
    8. Dermatomlu cildi iki kat greftleme bandı arasında saklayın ve -70 °C'de saklayın.
  2. Trans-epidermal su kaybı (TEWL)
    1. 1 tableti 200 mL ultra saf suda çözerek PBS'yi (pH 7.4) hazırlayın. Ultrasonik banyoda 20 dakika gaz giderin.
    2. Franz difüzyon hücrelerine bağlı su banyosunu açın. Her hücreye yaklaşık 12 mL gazdan arındırılmış PBS ve bir manyetik boncuk ekleyin. Manyetik karıştırmayı açın (örneğin 600 RPM'de), türbülans yaratmadan reseptör ortamında düzgün bir dağılım sağlayın. Tüm Franz hücre kurulumlarının karıştırma hızının hassas kontrolüne izin vermediğini unutmayın. Isıtma kaynağını, reseptör ortamında 37 °C'lik bir sıcaklığa ulaşacak şekilde ayarlayın.
    3. Dermatomlu cildi bir neşter kullanarak yaklaşık 3 cm çapında (veya uygun boyutta) parçalar halinde kesin ve dermatomlu cildi, stratum corneum yukarı bakacak şekilde kelepçeler ve sızdırmazlık halkaları kullanarak Franz difüzyon hücrelerine dikkatlice monte edin.
    4. Daha sonra, bir cam Pasteur pipeti kullanarak reseptör odalarını tamamen PBS ile doldurun ve bunların bilinen reseptör ortamı hacmini gösteren işarete kadar doldurulduğundan emin olun. Hücreleri dikkatlice ters çevirerek hava kabarcıklarını giderin. 30 dakika nemlendirin.
    5. TEWL cihazını açın ve üreticinin yönergelerine göre stabil hale gelene kadar 20 dakika dengeleyin.
    6. TEWL probunu her bir Franz hücresine yerleştirin ve yazılımda Başlat'a basın. Bir okuma görüntülenene kadar basılı tutun.
    7. Derinin üstüne 300 μL numune ekleyin (üç kopya halinde, n=3) ve Franz hücresinin üzerine aşılama bandı yerleştirerek kapatın. 37 °C'de (reseptör ortam sıcaklığı) 24 saat inkübe edin.
    8. Dokuyu tüy bırakmayan mendillerle silerek numuneyi çıkarın. 30 dakika bekletin.
    9. Numunelerin cilt bariyeri üzerindeki etkisini incelemek için her hücre için TEWL ölçün. TEWL değerlerini pozlama öncesi değerlere göre hesaplayın ve PBS kontrolüne göre ayarlayın (Göreceli TEWL = (TEWL sonrası-TEWL-pre/TEWL pre)/(TEWL(PBS)post-TEWL(PBS)pre/TEWL(PBS)pre))*100.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

NMR spektrumları
Bu tekniğin amacı, 1 H ve 13C NMR spektroskopisi kullanarak hidrojen ve karbon atomlarının kimyasal ortamlarını analiz ederek CAGE'nin başarılı oluşumunu doğrulamaktır. Ortaya çıkan spektrumlar, sentezlenen IL'nin moleküler yapısını ve bileşimini yansıtan karakteristik kimyasal kaymalar, bölünme modelleri ve entegrasyon değerleri sağlar. Şekil 1'deki proton NMR spektrumu, geranik asidin koline 2:1 molar oranını doğrular. Bu, sardunya...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada açıklanan CAGE hazırlama yöntemi literatürdenalınmıştır 15. Ancak sentez sürecinin, nihai ürünün özelliklerini etkileyebilecek çeşitli dış faktörlere duyarlı olduğunu kabul etmek önemlidir. Bu nedenle, bir kez hazırlandıktan sonra, CAGE sistemi, CAGE oluşumunu doğrulamak için NMR spektroskopisi gibi teknikler kullanılarak karakterize edilmelidir.

Şekil 1'de gösterildiği gibi, CAGE'nin proton sp...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma LEO Vakfı hibe no. LF15007 ve LF-FE-23-700013.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
5 mm NMR tüpleriSigma Aldrich41121705
AsetonVWR23L064039
Alüminyum Tzero TavalarıTA Instruments90,16,83,901
Aqua Flux CihazıBiox Systems
Bruker Avance III NMRBrukerNMR spektroskopisi için alet
Kolin BikarbonatSigma AldrichC7519
DermatomZimmer Biomet
Diferansiyel Taramalı KalorimetreTA Instruments
EtanolVWR23J314009
Genişletilmiş PolistirenStrafor
Franz Diffüzyon HücreleriPermeGear
Saranik AsidiSigma Aldrich427764
Saplama BandıParafilm
Karl Fischer TitratorMettler Toledo30252662
MetanolVWR85681.32
PBSFischer Scientific10388739
TA evrensel analiz 2000 yazılımıTA InstrumentsDSC veri analizi için yazılım
TopSpin YazılımıBrukerNMR veri analizi için yazılım

Kaynaklar

  1. Dąbrowska, A. K., et al. The relationship between skin function, barrier properties, and body-dependent factors. Skin Res Technol. 24 (2), 165-174 (2018).
  2. Date, A. A., Naik, B., Nagarsenker, M. S. Novel drug delivery systems: Potential in improving topical delivery of antiacne agents. Skin Pharmacol Physiol. 19 (1), 2-16 (2005).
  3. Phatale, V., Vaiphei, K. K., Jha, S., Patil, D., Agrawal, M., Alexander, A. Overcoming skin barriers through advanced transdermal drug delivery approaches. J Control Release. 351, 361-380 (2022).
  4. Kasting, G. B., Smith, R. L., Cooper, E. R. Effect of lipid solubility and molecular size on percutaneous absorption. Skin Pharmacokinet. 1, 138-153 (1987).
  5. Wickett, R. R., Visscher, M. O. Structure and function of the epidermal barrier. Am J Infect Control. 34 (10), S98-S110 (2006).
  6. Elias, P. M. Epidermal barrier function: intercellular lamellar lipid structures, origin, composition and metabolism. J Control Release. 15 (3), 199-208 (1991).
  7. Moser, K., Kriwet, K., Naik, A., Kalia, Y. N., Guy, R. H. Passive skin penetration enhancement and its quantification in vitro. Eur J Pharm Biopharm. 52 (2), 103-112 (2001).
  8. Lu, Y., Qi, J., Wu, W. Ionic liquids-based drug delivery: A perspective. Pharm Res. 39 (10), 2329-2334 (2022).
  9. Welton, T. Room-temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis. Chem Rev. 99 (8), 2071-2084 (1999).
  10. Lei, Z., Chen, B., Koo, Y. M., MacFarlane, D. R. Introduction: Ionic liquids. Chem Rev. 117 (10), 6633-6635 (2017).
  11. Huang, W., et al. Ionic liquids: Green and tailor-made solvents in drug delivery. Drug Discov Today. 25 (5), 901-908 (2020).
  12. Mitragotri, S. Choline geranate (CAGE): A multifaceted ionic liquid for drug delivery. J. Control. Release. 376, 593-600 (2024).
  13. Banerjee, A., Ibsen, K., Iwao, Y., Zakrewsky, M., Mitragotri, S. Transdermal protein delivery using choline and geranate (CAGE) deep eutectic solvent. Adv Healthc Mater. 6 (15), 1601411(2017).
  14. Edwardson, T. G., Mori, T., Hilvert, D. Rational engineering of a designed protein cage for siRNA delivery. J Am Chem Soc. 140 (33), 10439-10442 (2018).
  15. Fulmer, G. R., et al. NMR chemical shifts of trace impurities: common laboratory solvents, organics, and gases in deuterated solvents relevant to the organometallic chemist. Organometallics. 29 (9), 2176-2179 (2010).
  16. Zakrewsky, M., et al. Ionic liquids as a class of materials for transdermal delivery and pathogen neutralization. Proc Natl Acad Sci. U.S.A. 111 (37), 13313-13318 (2014).
  17. Torres, A. M., Price, W. S. Common problems and artifacts encountered in solution-state NMR experiments. Concepts Magn Reson. A. 45 (2), e21387(2016).
  18. Takeda, J., Iwao, Y., Karashima, M., Yamamoto, K., Ikeda, Y. Structural evaluation of the choline and geranic acid/water complex by SAXS and NMR analyses. ACS Biomater Sci Eng. 7 (2), 595-604 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

CAGE İyonik Sıvıİlaç GeçirgenliğiCilt BariyeriNMR SpektroskopisiDiferansiyel Taramalı KalorimetriKarl-Fischer TitrasyonuEx Vivo Ciltİlaç Çözünürlüğü
Transdermal İletim için CAGE Bazlı İyonik Sıvı Sistemlerinin Geliştirilmesi, Karakterizasyonu ve Değerlendirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.