Nöroetolojik Yerleştirmeden Doğal Davranışın Kodunu Çözmek

Summary

Bu protokol, beyin kodlamasını doğal bağlamlarda anlamak için gelişmiş hesaplamalı nöroetolojik yöntemlere dayanan entegre bir çerçeve sunar.

Abstract

Hayvanlar, zengin ve dinamik beyin aktivitesi yoluyla doğal çevreleriyle etkileşime girerler. Nöral popülasyon dinamiklerinin doğal davranışı nasıl kodladığını anlamak, sistem sinirbiliminde temel bir zorluk olmaya devam ediyor. Derin öğrenmeye dayalı davranış analizi ve minyatür floresan görüntülemedeki son gelişmeler, beynin doğal davranışı nasıl kodladığını araştırmak için yeni yollar açmıştır. Burada, bu çalışma, beyin dinamiklerinden karmaşık davranışların kodunu çözmek için Sosyal Davranış Atlası (SBeA), minyatür İki Foton Mikroskobu (mTPM) ve Yardımcı değişkenler (CEBRA) kullanan yüksek boyutlu Kayıtların Tutarlı Yerleştirmelerini birleştiren entegre bir deneysel ve hesaplamalı çerçeve sunmaktadır. Bu çalışma, serbestçe hareket eden fareler arasındaki doğal sosyal etkileşimleri bir model sistem olarak kullanarak, eşzamanlı sinirsel görüntülemenin yanı sıra yüksek çözünürlüklü davranışsal açıklamalara olanak tanır. Bu çerçeve, hassas davranışsal poz tahminini, senkronize çift fare izlemeyi, sinirsel yerleştirme hizalamasını ve davranışsal özelliklerin doğrudan sinirsel temel bileşenlerden kodunun çözülmesini içerir. Bu çalışma, bu yaklaşımın 3'lük bir kod çözme hassasiyetine ulaştığını göstermektedir. ± duruş için 1,5 piksel ve hayvanlar arasında motif kod çözme için %89 ± 6 doğruluk, sağlamlığını ve genelleştirilebilirliğini vurguluyor. Bu yöntem, beyin aktivitesinin yapılandırılmış davranış durumlarını nasıl yansıttığını keşfetmek için güçlü bir araç sağlar ve doğal sinirsel kodlama ilkelerine ilişkin gelecekteki çalışmalar için zemin hazırlar.

Introduction

Bu çerçeve, doğal deney ortamlarında serbestçe hareket eden hayvanlardan davranışsal ve nörogörüntüleme verilerini yakalamak ve kodunu çözmek için tasarlanmıştır. Üç temel bileşenden oluşur: derin öğrenmeye dayalı poz tahmini ve davranış sınıflandırma yöntemleri, SBeA¹, minyatür floresan görüntüleme teknikleri mTPM² ve karşılaştırmalı öğrenmeye dayalı nöroetolojik gömme algoritması CEBRA³. Son çalışmalar, serbestçe hareket eden hayvanlarda, başa sabitlenmiş deneysel paradigmalarda^{gözlemlenenleri} aşan nöroetolojik süreçlerin karmaşıklığını vurgulamıştır ^4,5. Ancak teknik sınırlamalar ve değişkenlik, bu yaklaşımların doğal davranışlara ilişkin daha geniş araştırmalara yaygın şekilde uygulanmasını engellemiştir. Bu protokol, çok çeşitli araştırma laboratuvarları için doğal bağlamlarda toplanan davranışsal ve sinirsel verilerin erişilebilirliğini sağlayan istikrarlı ve entegre bir çerçeve sunar.

Hayvanların doğal ortamlarda serbestçe hareket ettiği göz önüne alındığında, bu çerçeve, duruşların ^6,7 hassas bir şekilde izlenmesini sağlamak için derin öğrenmeye dayalı poz tahminini içerir. Geleneksel görüntü işleme tabanlı izleme yöntemleri, derin öğrenme tabanlı yaklaşımlara kıyasla uzuv ve pençe dinamikleri gibi ince ölçekli hareketleri yakalamak için yetersizdir⁸. Serbestçe hareket eden hayvanlar tarafından sergilenen çeşitli ve karmaşık davranışlar, önceden tanımlanmış davranış kategorileri genellikle doğal davranışsal fenotiplerin¹⁰ tamamını kapsamadığından, denetimli davranış sınıflandırma yöntemleri⁹ için zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Sonuç olarak, denetimsiz öğrenmeye dayalı sınıflandırma yöntemleri, doğal ortamlarda davranışı analiz etmek için daha uygundur¹. Sürekli davranışı, içsel yapısal benzerliklerine göre kapsamlı bir şekilde ayrık saniye altı motiflere ayrıştırabilirler ve daha sonra tutarlı tanımları veriye dayalı kümeler aracılığıyla verilir.

Serbestçe hareket eden hayvanlarda beyin görüntüleme, tek nöron aktivitesinin ^4,5 kapsamlı değişkenliğini yakalamayı gerektirir. Serbestçe hareket eden hayvanlardaki elektrofizyolojik kayıtlar, ağırlıklı olarak eşik altı aktiviteye sahip nöronları tespit etme yeteneklerinde sınırlıdır¹¹. Ek olarak, tek foton mikroskobu düşük çözünürlük ve kontrasttan muzdariptir, bu da görüntüleme seansları boyunca tutarlı nöron kimliklerinin korunmasını zorlaştırır¹². mTPM, tek foton mikroskobuna kıyasla üstün çözünürlük ve kontrast sunarak, onu doğal davranışların^sinirsel kodlamasını araştırmak için daha etkili bir araç haline getirir 2,13,14,15.

Davranış ve sinirsel veriler arasında sağlam bir haritalama oluşturmak, ortak bilgi yapılarını ortaya çıkarabilen yöntemler gerektirir¹⁶. Temel Bileşen Analizi (PCA)¹⁷, t-Dağıtılmış Stokastik Komşu Gömme (t-SNE)¹⁸ ve Tekdüzen Manifold Yaklaşımı ve Projeksiyonu (UMAP)¹⁹ gibi geleneksel boyut azaltma teknikleri, davranışsal ve sinirsel verileri ortak bir özellik alanına etkili bir şekilde yerleştiremez. Buna karşılık, CEBRA gibi derin öğrenme tabanlı gömme yaklaşımları, birden fazla veri modalitesinin hem denetimli hem de kendi kendini denetleyen çerçevelere entegrasyonunu sağlayarak yüksek kaliteli gizli temsiller üretir³. Son yıllarda çeşitli alternatif yöntemler ortaya çıkmış olsa da 20,21,22, önerilen bu çerçeve, ticari olarak mevcut olan veya kapsamlı eğitimlerle desteklenen köklü yöntemleri birleştirerek pratik uygulamalara öncelik vermektedir.

Son çalışmalar ^4,5 ile karşılaştırıldığında, bu çerçeve üç önemli ilerleme sunmaktadır. Birincisi, davranış sınıflandırmasında insan önyargısını ortadan kaldırır. Önceki çalışmalar, özellikle açıklayıcılar yorgunluk yaşadıkça, emek yoğun ve tutarsızlığa eğilimli olan manuel davranış etiketlemesine dayanıyordu 23,24,25. Buna karşılık, bu çerçeve, tanımları atamadan önce davranış motiflerini nesnel olarak ayrıştırarak ve kümeleyerek davranış kalıplarının doğal yapısını koruyan denetimsiz davranış sınıflandırmasını kullanır^26,27. İkincisi, mTPM'nin kullanımı, tek nöron düzeyinde daha karmaşık nöronal dinamiklerin yakalanmasını sağlar. Bu metodolojik avantaj, bu çerçevenin uygulanabilirliğini, eşik altı kodlama^28'de yer alanlar da dahil olmak üzere çeşitli nöral popülasyonlardan karmaşık doğal davranışların kodunu çözmeye genişletir. Üçüncüsü, bu çerçeve, her bir modaliteyi ayrı ayrı gömmek için UMAP kullanmak veya içsel dinamiklerini göz ardı ederek nöral aktivite ve davranış arasında katı bir haritalama empoze etmek için destek vektör makinelerini kullanmak yerine, davranışsal ve nöral verileri birleşik bir temsil alanına entegre eder ^4,5. Bu ortak yerleştirme yaklaşımı, davranış ve beyin aktivitesi arasındaki ilişkinin daha kapsamlı ve biyolojik olarak anlamlı bir temsilini sağlar.

Bu çerçeve, doğal deneysel koşullarda serbestçe hareket eden hayvanlardan elde edilen davranışsal ve sinirsel verilerin kaydedilmesini ve kodunun çözülmesini içeren araştırma projeleri için çok uygundur. Mevcut uygulama fare çalışmaları için optimize edilmiş olsa da, diğer hayvan modellerine uyarlanması ek geliştirme gerektirebilir. Bu çerçevede kullanılan donanım bileşenleri ticari olarak mevcut olduğundan, bir yandan toplam maliyet nispeten yüksek olabilir. Öte yandan, bu ticari kullanılabilirlik, lojistik sorunların giderilmesi için harcanan zamanı önemli ölçüde azaltır ve verimli bir şekilde istikrarlı ve güvenilir sonuçların elde edilmesini sağlar.

Bu protokol, küçük hayvan görüntüleme ve davranış takibi için donatılmış sinirbilim laboratuvarları tarafından tekrarlanabilir ve erişilebilir olacak şekilde tasarlanmıştır. Sistemin tamamı, ticari olarak temin edilebilen bir mTPM cihazını çok açılı davranışsal edinim kurulumuyla entegre eder. Tipik nöral kayıtlar 4.84 Hz'de 512 × 512 piksel çözünürlükte elde edilir ve davranışsal veriler saniyede 30 kare hızında yakalanır. Veri senkronizasyonu, ön işleme sırasında TTL darbe hizalaması yoluyla sağlanır. Eğitim ve kod çözme, GPU'lu standart bir iş istasyonunda (örneğin, NVIDIA RTX 3090 veya eşdeğeri) gerçekleştirilebilir ve tam ardışık düzen, deney başına yaklaşık 100 GB depolama alanı gerektirir. Mevcut uygulama serbestçe hareket eden fareler için optimize edilmiş olsa da, iş akışının modüler tasarımı, izleme kalibrasyonu ve görüntüleme parametrelerini hayvanın boyutuna ve hareketliliğine göre ayarlayarak diğer türlere adaptasyona olanak tanır. Bu pratik ayrıntılar, protokolün çeşitli deneysel ortamlarda uyarlanabilirliğini ve tekrarlanabilirliğini destekler.

Protocol

Çin Bilimler Akademisi, Shenzhen İleri Teknoloji Enstitüsü'ndeki Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, tüm hayvancılık ve deneysel prosedürleri onayladı.

1. Platform kurulumu

NOT: Platform iki ana bileşenden oluşur: mTPM cihazı ve 3D davranış cihazı (Şekil 1A). mTPM cihazı, mTPM görüntülemenin davranışsal verilerle gerçek zamanlı senkronizasyonunu kolaylaştırır, böylece serbestçe hareket eden hayvanlardan yüksek kaliteli verilerin verimli, istikrarlı ve sürekli olarak elde edilmesini sağlar. 3D davranış cihazı, hayvan davranışının tüm sahnesini yakalamak için dört kamera ve 3D hayvan pozlarını yeniden oluşturmak için otomatik bir kalibrasyon modülü ile donatılmıştır. Her iki cihazın da senkronizasyon modüllerini kendi sürümlerine dahil etmesi gerekir.

1. Cihaz bağlantısı
   1. 3B davranış cihazının dış kabuğunu çıkarın. Dört kamera ve bir otomatik kalibrasyon modülü dahil olmak üzere 3D davranış cihazının geri kalan parçalarını mTPM cihazının davranışsal kayıt odasına yerleştirin.
   2. 3B davranış aygıtının senkronizasyon modülünün Evrensel Seri Veri Yolu (USB) kablosunu 3B davranış aygıtının iş istasyonuna bağlayın.
   3. mTPM cihazının senkronizasyon modülünü bir SubMiniature version A (SMA) kablosuyla mTPM cihazının denetleyicisine bağlayın.
   4. 3D davranış cihazının senkronizasyon modülünün Transistör-Transistör Mantığı (TTL) çıkış portunu, bir SMA-Bayonet Neill-Concelman (BNC) dönüştürme kablosu aracılığıyla mTPM cihazının senkronizasyon modülünün TTL giriş portuna bağlayın.
2. mTPM karelerinin zaman damgası kaydı
   1. mTPM cihazının tüm güç kaynaklarını açın.
   2. mTPM kayıt yazılımını ve mTPM senkronizasyon yazılımını başlatın.
   3. mTPM çerçevelerinin ve senkronizasyon zaman damgalarının kaydetme yollarını ayarlayın.
      NOT: Yolları adlandırmak için İngilizce olmayan harfler ve özel karakterler kullanmayın.
   4. mTPM kayıt yazılımının kayıt karesi sayısını ayarlayın. Önerilen kare sayısı 6000'dir ve bu, senkronizasyon hata ayıklama adımını tamamlamak için yeterlidir.
   5. mTPM senkronizasyon yazılımının her kanalını seçin.
   6. mTPM kayıt yazılımı aracılığıyla mTPM kaydını başlatın. Kayda başlamadan önce, mTPM'yi aşırı ışık yanmasından korumak için odanın içindeki ışıklardan herhangi birini kapatın. Kullanıcı kaydı başlattığında mTPM senkronizasyon yazılımı otomatik olarak çalıştırılacaktır.
   7. mTPM kare zaman damgalarının mTPM senkronizasyon yazılımı tarafından yakalanıp yakalanmadığını kontrol edin.
      NOT: mTPM senkronizasyon yazılımında gösterilen mTPM çerçeve zaman damgaları keskin TTL darbeleridir. Her görüntüleme karesi, varsayılan olarak 4,84 Hz olan keskin bir TTL darbesini tetikler. Yazılım panelinde nabız gösterilmiyorsa 2 normal sorun vardır. Birincisi, mTPM aygıtının denetleyicisinin sürücüsünün zaman damgası yakalamayı desteklememesidir. Zaman damgası yakalamayı desteklemek için sürücü sürümünü geliştirmek ilk sorunu çözebilir. İkincisi, SMA kablosunun kötü bağlantısıdır. SMA konektörlerinin güvenli bir şekilde sıkıldığından emin olun. Zaman damgalarını kontrol etmeden önce 1.1.2'ye dönün ve ardından adım adım deneyin.
   8. Kaydın durmasını bekleyin. mTPM çerçevelerinin .tif dosyasının, bir .tdms dosyasının ve zaman damgalarının bir .tdms_index dosyasının kaydedilip kaydedilmediğini kontrol edin.
3. 3D davranış cihazının dört kamerasının zaman damgası kaydı
   1. Özelleştirilmiş kamera senkronizasyon komut dosyasında videoların kaydetme yolunu ve davranış zaman damgalarını ayarlayın.
      NOT: Özelleştirilmiş kamera senkronizasyon kodu https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/camera_code/mul_camera_save_video_event.py'dadır.
   2. mTPM senkronizasyon yazılımını başlatın. mTPM eşitleme zaman damgalarının kaydetme yollarını ayarlayın.
   3. mTPM senkronizasyon yazılımının kaydını başlatın. Özelleştirilmiş kamera senkronizasyon komut dosyasını çalıştırın.
   4. Davranış zaman damgalarının mTPM senkronizasyon yazılımı tarafından yakalanıp yakalanmadığını kontrol edin.
      NOT: mTPM senkronizasyon yazılımında gösterilen davranış zaman damgaları keskin TTL darbeleridir. Davranış video karesi kaydının her 30 karesi için mTPM senkronizasyon yazılımına bir davranış zaman damgası gönderilir. Davranış zaman damgaları, 3B davranış cihazının iş istasyonuna da kaydedilecektir.
   5. mTPM iş istasyonunda dört .avi davranış videosu dosyasının, 3B davranış cihazında bir .txt davranış zaman damgası dosyasının ve bir .tdms dosyasının ve davranış zaman damgalarının bir .tdms_index dosyasının kaydedilip kaydedilmediğini denetleyin.
4. 3B davranış cihazının kamera kalibrasyonu
   1. Dört kameranın çekim açısını ayarlayın. Dört kamera, açık alanın tüm tabanını kapsamlı bir şekilde kapsamalı ve aynı zamanda farenin şaha kalkma örneklerinin tam olarak yakalanmasını sağlamak için görüş alanlarını açık alanın en uzak sınırının en az 20 cm yukarısına genişletmelidir.
   2. Kalibrasyon modülünü çekim alanlarının ortasına yerleştirin. Kamera kalibrasyon yazılımını çalıştırın. Kamera kalibrasyon yazılımını çalıştırmadan önce tüm ışıkları kapatın.
      NOT: Dört kamera, kalibrasyon ekranı tarafından görüntülenen hareketli onay panosunun çerçevelerini yakalayacaktır. Kamera kalibrasyonu, Zhang'ın kalibrasyon yöntemine²⁹ dayanmaktadır.
   3. Kamera kalibrasyon yazılımını çalıştırdıktan sonra, hayvan 3D poz rekonstrüksiyonu için kamera projeksiyon matrisini içeren bir .mat dosyası kaydedilecektir. Sistem senkronizasyon adımındaki davranış verileri indeksleme kalibrasyon .mat dosyasına dayandığından, kamera kalibrasyon adımının tüm sistemin senkronizasyon adımından önce tamamlandığından emin olun.
5. Tüm sistemin senkronizasyonu
   NOT: Bu adımdan önce, mTPM çerçevelerinden ve 3B davranış cihazından gelen zaman damgalarının mTPM senkronizasyon yazılımı tarafından ayrı ayrı alınabildiğinden emin olun.
   1. mTPM cihazının ve 3D davranış cihazının tüm güç kaynaklarını açın.
   2. mTPM kayıt yazılımını, mTPM senkronizasyon yazılımını ve özelleştirilmiş kamera senkronizasyon komut dosyasını başlatın.
   3. Adım 1.3.1'e göre yollarını ve parametrelerini ayarlayın. mTPM kayıt yazılımı aracılığıyla mTPM kaydını başlatın.
   4. Özelleştirilmiş kamera senkronizasyon komut dosyasını çalıştırın. mTPM senkronizasyon yazılımının 3B davranış cihazından zaman damgalarını alabilmesi için mTPM karelerinin kaydının başlangıcının davranış kaydı komut dosyasını çalıştırmadan önce olduğundan emin olun. mTPM senkronizasyon yazılımının davranış zaman damgalarını kayıpsız yakalayabilmesi için mTPM karelerinin kaydının bitiş zamanını davranış kaydı süresinden daha uzun bir süreye ayarlayın.
      NOT: mTPM karelerinin kayıt süresinin önerisi, davranış kaydının 5 dakikasından daha uzundur. Örneğin, kullanıcı 15 dakikalık davranışı kaydetmek istiyorsa, mTPM karelerinin sayısı 4,84 x (15+5) x 60 = 5808 kare olarak ayarlanmalıdır.
   5. Kaydın durmasını bekleyin. Kayıttan sonra bir mTPM çerçeve .tif dosyası, iki mTPM senkronizasyon .tdms dosyası, iki .tdms_index dosyası, dört davranış video .avi dosyası ve bir davranış zaman damgası .txt dosyası vardır.
   6. mTPM çerçevesini ve davranış videolarını hizalamak için özelleştirilmiş senkronizasyon kodunu çalıştırın. Özelleştirilmiş senkronizasyon kodu https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step1_align_tpm_data.m'da.
      1. Bu betiği çalıştırmadan önce, dosyaları aşağıdaki gibi el ile düzenleyin:
         ----\Kök yolu # Tüm verileri kaydetme yolu
         --------\behavior_all # Davranış verilerini kaydetme yolu
         ------------\A-B-C-D-E-caliParas.mat # Kamera kalibrasyon dosyası
         ------------\A-B-C-D-E-camera-1.avi # kamera 1'den davranış videosu
         ------------\A-B-C-D-E-camera-2.avi # Kamera 2'den davranış videosu
         ------------\A-B-C-D-E-camera-3.avi # kamera 3'ten davranış videosu
         ------------\A-B-C-D-E-camera-4.avi # kamera 4'ten davranış videosu
         ------------\A-B-C-D-E-event.txt # 3B davranış cihazından davranış zaman damgası
         ----\tpm_suite2p # mTPM verilerini kaydetme yolu
         --------\sep # mTPM çerçevelerini ve zaman damgalarını kaydetme yolu
         ------------\A-B-C-D-E-olay # Zaman damgası hizalaması yapmak için yol
         ----------------\beh.tdms # Davranış kanalı .tdms dosyası
         ----------------\beh.tdms_index #The davranış kanalı .tdms_index dosyası
         ----------------\tpm.tdms # mTPM kanalı .tdms dosyası
         ----------------\tpm.tdms_index # mTPM kanalı .tdms_index dosyası
         ------------\A-B-C-D-E-tpm # mTPM çerçevelerini kaydetme yolu
         ----------------\F.tif # Her kaydın mTPM kareleri
         --------\process # Nöral izleri çıkarma yolu
         ------------\C # Her farenin yolu
         ----------------\F.tif # Her farenin mTPM çerçeveleri
         A'dan G'ye kadar olan ad alanlarının tanımlarıdır, burada
         A, deney grupları anlamına gelir, örneğin, ücretsiz,
         B, video dizisi anlamına gelir, örneğin seg1,
         C, hayvanların kimliği anlamına gelir, örneğin 1tpmss,
         D, etkileşim ortakları anlamına gelir, örneğin, 1wt,
         E, deney tarihi anlamına gelir, örneğin 20220226 ve
         F, mTPM kayıt çerçevesi parçası (yığın başına 5000 kare) anlamına gelir, örneğin sosyal 1.
         NOT: 3D davranış izleme sisteminin kare hızı 30 Hz, mTPM'ninki ise 4,84 Hz'dir. Ulaşılabilir maksimum senkronizasyon hassasiyeti en düşük kare hızıyla (4,84 Hz) sınırlı olduğundan, senkronizasyonun zamansal çözünürlüğü yaklaşık 206 ms'dir. Davranışsal zaman damgaları referans görevi görür ve her mTPM çerçevesi en yakın davranışsal zaman noktasına hizalanır. Davranışsal zaman çizelgesine göre ardışık mTPM çerçeveleri arasındaki aralıklar, adım adım bir yaklaşım kullanılarak enterpolasyona tabi tutulur.

2. Nöroetolojik veri kaydı

NOT: Nöroetolojik veri kayıt süreci dört temel adımdan oluşur (Şekil 1B).

1. mTPM'nin montajı
   NOT: mTPM montajının ayrıntıları mTPM eğitiminde yer aldığından, burada yalnızca önemli adımlar tanıtılmaktadır.
   1. Kraniyal pencereyi hazırlayın.
      NOT: Kraniyal pencerenin hazırlanması esas olarak virüsün enjeksiyonunu, kapak camının implantasyonunu ve metal plakanın sabitlenmesini içerir. Çeşitli araştırmalarda görüntüleme yerleri farklı olduğu için kraniyal pencerenin hazırlanmasının detayları farklıdır. Bu durumda, kraniyal pencerenin hazırlanması bir dış kaynak hizmeti tarafından gerçekleştirilir. Örnek verilerdeki görüntüleme beyin alanı, birincil somatosensoriyel kortekstir (S1).
   2. Fare sınırlayıcıyı mTPM mikromanipülatörüne sabitleyin. Farenin kafasını metal plaka aracılığıyla sınırlayıcıya sabitleyin.
   3. mTPM aracılığıyla floresansı bulun. mTPM görüntülemeyi açmadan önce tüm ışıkları kapatın. Aşağıdaki adımlardan önce mTPM'yi tutucuya sabitleyin.
      1. Kafatası penceresinin üstüne bir damla Carbomer göz jeli ekleyin. Kraniyal pencere mTPM hedefinin altına hizalandığında fareyi hareket platformunda hareket ettirin.
      2. Görüntüleme düzlemini bulmak için mikromanipülatörü dikey olarak hareket ettirin. Görüntüleme düzlemini ortalamak için mikromanipülatörü düzlem içinde hareket ettirin.
   4. Üst tabanı mTPM'ye sabitleyin. Alt tabanı üst tabana ve kraniyal pencereye yapıştırın.
      1. Yapısal stabiliteyi sağlamak için, iki taban ile farenin kafasına takılan metal plaka braketi arasındaki boşluğu doldurun ve bunu yüksek performanslı akrilik yapısal yapıştırıcıyla yapıştırın. Tabanı cımbızla hafifçe delerek bağın stabilitesini değerlendirmeden önce yapıştırıcıyı 30 dakika kürleyin. Gerekirse, güvenli bir sabitleme sağlanana kadar ek yapıştırıcı uygulanır.
         NOT: Taban ile mTPM'nin kendisi arasında herhangi bir doğrudan yapışmayı önlemek önemlidir. Üst ve alt tabanlar küçük alüminyum çerçevelerdir. Üst taban, mTPM muhafazasının alt konturuna tam oturacak şekilde özel olarak üretilmiştir. Üst taban ile kraniyal pencere arasındaki boşluğu kapatmak için birden fazla yükseklik seçeneğine sahip alt tabanlar kullanılır. Tüm alt tabanlar, mekanik uyumluluğu sağlamak için üst tabanla aynı düzlemsel boyutlara sahiptir ve değişen kafatası ile üst taban mesafelerine uyum sağlamak için yalnızca yükseklikleri farklıdır.
   5. Taban haznesinin içine bir damla Carbomer göz jeli ekleyin. mTPM aracılığıyla nöronal floresansı kontrol edin. Nöronal floresan açıkça görülemiyorsa, yapıştırıcıyı bir kraniyal matkap kullanarak çıkarın, tabanın ayrılmasına izin verin, ardından floresan berraklığı elde edilene kadar yukarıdaki prosedür tekrarlanır.
   6. Alüminyum folyoyu mTPM lifi ile kraniyal pencere arasına bantla sabitleyin.
      NOT: Bu adım, kayıt işlemi boyunca uygun ışık korumasını sağlamak içindir. Toplam ağırlığı azaltmak için alüminyum folyo ve yapışkan bant kullanımı en aza indirildi.
   7. Oda ışığını açın ve mTPM çerçevelerinin netliğini test edin.
2. Fareyi açık bir alana koyma
   NOT: Bu adım, fiber ve mTPM için uygun ağırlık dengesini sağlarken fareyi açık alana yerleştirmeyi içerir.
   1. En az 10 helyum balonunu şişirin ve ayrı ayrı pamuklu sicim ile bağlayın. Metal plakayı fare tutucusundan ayırın.
   2. Bir elinizi kullanarak fareyi kuyruğundan tutun. Diğer elinizi kullanarak mTPM fiberini destekleyin.
   3. Fareyi yavaşça açık alana konumlandırın. Helyum balonlarını pamuk sicim kullanarak elyafa asın. Fare serbestçe hareket edebilene ve açık alanı kısıtlama olmadan keşfedene kadar balon sayısını ayarlayın.
      NOT: Optimal balon sayısı, fare, hayvanın doğal bir baş duruşunu korumasına ve kendiliğinden dik durmasına izin vermek için mTPM'nin ağırlığını yeterince dengelerken, ön ayakları yukarı doğru kaldırma kuvveti ile kaldırılmadan yerde kaldığında belirlenir. Farenin sınırsız hareketi için yeterli lif uzunluğunu sağlamak amacıyla pamuklu sicim açık alanın üzerinde bir yükseklikte bağlanmalıdır. Pamuk sicim, açık alan odasının üst kenarı ile yaklaşık olarak hizalanan optik fiberin yüksekliğine bağlandı. Verilen örnekte, bu adım tamamlandıktan sonra, ücretsiz sosyal etkileşimi sağlamak için işlenmemiş bir fare açık alana sokulur.
   4. Dış etkenleri en aza indirmek için mTPM muhafazasının kapağını kapatın.
3. mTPM kaydını açma.
   1. mTPM kayıt yazılımını ve mTPM senkronizasyon yazılımını başlatın. Platform kurulum adımına göre yollarını ve parametrelerini ayarlayın.
   2. mTPM kayıt yazılımı aracılığıyla mTPM kaydını başlatın. Senkronizasyon yazılımındaki her iki fotonlu kareye karşılık gelen zaman işaretleyicilerinin varlığını doğrulayın.
   3. İki fotonlu görüntülerin kontrastının etkilenmeden kalıp kalmadığını değerlendirin ve farenin hareketinin kaydedilen karelerin stabilitesinden ödün vermediğini doğrulayın. Herhangi bir sorun tespit edilirse, iki fotonlu görüntüleme doğru şekilde hizalanmış zaman işaretlerine sahip net çerçeveler üretene kadar senkronizasyon prosedürünü ve mTPM montaj işlemini tekrarlayın.
4. Davranış kaydını açma
   1. Özelleştirilmiş kamera senkronizasyon komut dosyasını başlatın.
      NOT: Özelleştirilmiş kamera senkronizasyon kodu https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/camera_code/mul_camera_save_video_event.py'dadır.
   2. Platform kurulum adımına ilişkin yolu ve parametreleri ayarlayın.
   3. Özelleştirilmiş kamera senkronizasyon komut dosyası aracılığıyla davranış kaydını başlatın. mTPM senkronizasyon yazılımındaki her 30 davranış çerçevesine karşılık gelen zaman işaretlerinin varlığını doğrulayın.
   4. Kameralardan gelen dört video akışının düzgün şekilde senkronize edilip edilmediğini kontrol edin ve 3D davranış izleme sisteminin video yakalama parametrelerini kontrol edin.
      NOT: Yukarıdaki kurulumda, kameralar 640 × 480 piksel kare çözünürlüğü, saniyede 30 kare kare hızı, RGB çerçeveler ve otomatik pozlama kullanır. Otomatik pozlama, kameranın ortam aydınlatma koşullarına göre parlaklığı dinamik olarak ayarlamasına olanak tanır. Pozlama süresi, özellikle daha uzun pozlamaların gerekli olduğu düşük ışık koşullarında ulaşılabilir kare hızını doğrudan etkilediğinden, kare hızı düşebilir. 30 Hz'de sabit çerçeve alımı sağlamak için, pozlama süresini en aza indirecek şekilde arka plan aydınlatmasını kontrol etmek önemlidir. Kamera kazancı ve gruplama ayarları, kayıt boyunca varsayılan değerlerinde tutulur.
   5. Davranışsal kayıt, önceden tanımlanmış süreye ulaşıldığında otomatik olarak duracaktır. Davranışsal kaydı tamamladıktan sonra, mTPM kaydını ve senkronizasyonunu manuel olarak kapatın. Bu adımları izleyerek, eşzamanlı sinirsel ve davranışsal veri toplamanın tek bir denemesi tamamlanır.

3. Nöroetolojik veri ön işleme

NOT: Önceki tüm adımlar başarıyla tamamlanırsa, üç kategoride veri dosyası elde edilmelidir: iki fotonlu görüntüleme çerçeveleri (.tif), bir kamera kalibrasyon dosyası (.mat) ile birlikte dört davranışsal video kaydı (.avi) ve sonraki veri ön işleme için iki senkronizasyon zaman damgası dosyası (.tdms) (Şekil 1C). Bu veriler manuel olarak yeniden adlandırılmalı ve adım 1.5.7'ye atıfta bulunan klasörlere yerleştirilmelidir.

1. mTPM verilerini önceden işleme
   1. suite2p³⁰ aracılığıyla mTPM çerçevelerinden nöral sinyal yörüngelerini çıkarın. Tekrarlanabilirliği sağlamak için suite2p parametrelerini varsayılan değerlerinde tutun. Kare hızını yalnızca mTPM alım ayarlarıyla eşleşecek şekilde ayarlayın.
      NOT: Sonraki adımlar sinyal işleme ve kalite kontrolünü içerdiğinden, bu aşamada suite2p parametrelerinde kapsamlı ince ayar yapmaya gerek yoktur. Veri kümeleri arasında tutarlılığın korunması daha büyük önem taşımaktadır.
   2. mTPM çerçeveleri ve davranış videoları arasındaki zaman damgalarını hizalamak için özelleştirilmiş kodu çalıştırın.
      NOT: Bu komut dosyası, davranışsal olay zaman damgalarını karşılık gelen mTPM edinme süreleriyle hizalar. Her kayıt için dizin eşlemeleri oluşturup kaydederek davranış ve sinirsel verilerin senkronize analizini sağlar. Bu özelleştirilmiş kod https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step1_align_tpm_data.m.
   3. Veri formatını suite2p çıktısından dönüştürmek için özelleştirilmiş kodu çalıştırın.
      NOT: Bu komut dosyası, ilgili çerçeve indekslerini tanımlayarak ve eşleyerek bireysel hayvanlar için mTPM verilerini çıkarır ve yeniden düzenler. Karşılık gelen sinirsel aktivite izlerini seçer ve bunları standartlaştırılmış bir veri formatında yeniden yapılandırarak bölümlere ayrılmış kayıtların aşağı yönde akıcı analizini sağlar. Bu özelleştirilmiş kod https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step2_separate_tpm_data.m.
   4. Davranış çerçeveleriyle hizalamak üzere nöral sinyalleri yeniden örneklemek için özelleştirilmiş kodu çalıştırın.
      NOT: Bu komut dosyası, nöral etkinlik izlerini davranışsal zaman damgalarıyla hizalamak için mTPM verilerinin zamansal yeniden örneklemesini gerçekleştirir. Önceden segmentlere ayrılmış sinirsel verileri ve senkronizasyon indekslerini yükler, buna göre yeniden örneklenen izleri çıkarır ve çıktıyı daha fazla sinyal işleme için standartlaştırılmış bir formatta kaydeder. Zamansal yeniden örnekleme yöntemi, kademeli enterpolasyondur. Bu özelleştirilmiş kod https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step3_resample_tpm_data.m.
   5. Sinir yörüngelerini iyileştirmek için özelleştirilmiş kodu çalıştırın.
      1. Kademeli enterpolasyon, çınlama artefaktlarına ve yüksek frekanslı gürültüye neden olabileceğinden, bu artefaktları azaltmak için 2 Hz geçiş bandı frekansına ve 2.2 Hz durdurma bandı frekansına sahip eşdalgalı bir alçak geçiren filtre tasarlayın. Filtrenin sırası 61'dir.
      2. Bundan sonra, yeniden örneklenmiş mTPM kalsiyum izlerini¹³ rafine etmek için Weijian Zong'un gürültü giderme yöntemini kullanın. Yüzdelik ve yerel varyans kriterlerini kullanarak yerel taban çizgilerini tahmin eder ve ΔF/F sinyallerini hesaplar. ΔF/F, kalsiyum görüntülemede nöral aktiviteyi ölçmek için yaygın olarak kullanılan, floresan yoğunluğundaki taban çizgisine göre nispi değişimi temsil eden boyutsuz bir ölçüdür. Hem pay (ΔF) hem de payda (F) rastgele floresan birimlerinde olduğundan, ortaya çıkan ΔF/F değerinin fiziksel birimi yoktur ve oran veya yüzde olarak ifade edilir. Son derece düz veya doymuş sinyallere sahip hücreler, sinyal aralığı eşiklerine göre hariç tutulur. Ortaya çıkan yüksek kaliteli nöral aktivite izleri, aşağı akış analizi için kaydedilir ( Şekil 2A, Şekil 3A ve Şekil 4A).
         NOT: Özelleştirilmiş kod https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step4_filter_tpm_data.m'da mevcuttur.
2. Davranış verilerini önceden işleme
   1. Sürüklenme önleyici poz izleyici (ADPT)⁷ kullanarak video kayıtlarından davranışsal pozları çıkarın.
      NOT: ADPT, DeepLabCut⁶ ve SLEAP²² gibi evrişimli sinir ağı tabanlı yöntemlerde gözlemlenen sık nokta kayması sorununu ele alır. ADPT, fiber hareketinin neden olduğu nokta kaymasını etkili bir şekilde azalttığından, serbestçe hareket eden hayvanlarda mTPM görüntüleme gibi sinirsel kayıt cihazlarını içeren senaryolar için özellikle uygundur. ADPT'nin deposu https://github.com/tangguoling/ADPT'da.
      1. Deney düzeneğinin iki fare içerdiği ve mTPM'nin bunlardan biri için tanımlayıcı görevi gördüğü göz önüne alındığında, her farenin pozlarını ayrı ayrı tahmin etmek için iki bağımsız tek fare ADPT modelini eğitin.
      2. Her model için, burun, sol kulak, sağ kulak, boyun, sol ve sağ ön uzuvlar, sol ve sağ arka uzuvlar, sol ve sağ ön patiler, sol ve sağ arka patiler, sırt, kuyruk tabanı, orta kuyruk ve kuyruk ucu dahil olmak üzere 16 önemli noktaya ^1,10,15,31 manuel olarak açıklama ekleyin - yaklaşık 600 kare için, 150 kare 15 dakikalık bir video için kamera görünümü başına manuel olarak etiketlenir.
      3. Varsayılan parametreleri kullanarak ADPT modellerini eğitin. Eğitim ve tahmin parametrelerinin detayları https://github.com/tangguoling/ADPT/blob/main/code/config.yaml ve https://github.com/tangguoling/ADPT/blob/main/code/config_predict.yaml.
   2. 3D hayvan pozlarını yeniden yapılandırma. Eğitildikten sonra, farklı kameralar tarafından çekilen videoların her birinden her bir farenin pozlarını tahmin etmek için iki modeli bağımsız olarak uygulayın. Elde edilen verileri daha fazla işlem için tek bir tablo dosyasında birleştirin.
   3. Kamera kalibrasyon dosyası³² ile birlikte üçgenleme kullanarak davranışsal yörüngelerin 3B rekonstrüksiyonunu gerçekleştirin. Yeniden yapılandırmayı takiben, sonraki analiz için denek farenin (mTPM'yi taşıyan, Şekil 2B, Şekil 3B, Şekil 4B) ve nesne faresinin (etkileşimli türdeş, Şekil 2C, Şekil 3C, Şekil 4C) hareket yörüngelerini elde edin.
   4. Sosyal etkileşim çalışmalarında, bireyler arası mesafeler sosyal dinamiklerin kritik göstergeleri olarak hizmet eder³³. Karşılık gelen vücut noktaları arasındaki ikili Öklid mesafelerini kullanarak iki fare arasındaki nispi vücut mesafelerini hesaplayın ve daha fazla sosyal davranış analizi için nicel ölçümler sağlayın ( Şekil 2D, Şekil 3D, Şekil 4D).
   5. Davranış motiflerini ayrıştırın ve sınıflandırın.
      NOT: Önceki adımlar ince taneli poz yörüngeleri verse de, bize henüz hayvanın ne yaptığını söylemezler. Davranış, bir hayvanın belirli bir süre boyunca nasıl hareket ettiğini ifade eder ve davranış atamak, bu tür dönemlerin her birine anlamlı, insan tarafından yorumlanabilir bir etiket vermeyi içerir. Normal yol, insan açıklamalarını kullanmaktır.
      1. Davranışsal kayıtlar genellikle bütünüyle manuel olarak etiketlenemeyecek kadar uzun olduğundan, makine öğrenimi yöntemlerini kullanın.
         NOT: Denetimli öğrenme, önceden tanımlanmış etiketleme kurallarına uyar: insan açıklayıcılar, seçilen davranış segmentlerine etiketler atar ve bunlar daha sonra tüm veri kümesindeki etiketleri tahmin etmek için makine öğrenimi veya yapay zeka modellerini eğitmek için kullanılır. Bu yaklaşım, davranış sınıflandırmasının verimliliğini artırırken, karmaşık, doğal davranışlarla uğraşırken özellikle önemli bir sınırlama olan, insan tarafından yorumlanabilen etiketlerin sınırlı kümesi tarafından kısıtlanmaya devam etmektedir. Doğal davranışların zengin değişkenliğini yakalamak için denetimsiz davranış sınıflandırma yöntemleri geliştirilmiştir. Bu yaklaşımlar, zaman içinde davranışsal motifler arasındaki içsel benzerlikleri tespit eder ve bunları düşük boyutlu özellik uzayları içinde kümeleyerek daha verimli ve tarafsız insan yorumuna olanak tanır. Temelde, denetimli sınıflandırma, davranış tanımaya rehberlik etmek için önceden tanımlanmış insan etiketlerine dayanırken, denetimsiz sınıflandırma, önceden etiketleme olmaksızın gizli davranış yapılarını ortaya çıkararak karmaşık doğal dinamikleri yakalamada daha fazla esneklik sunar.
      2. Doğal davranış çerçevesinde, her ikisi de davranışsal segmentasyon için tasarlanmış denetimsiz kümeleme yöntemleri olan Davranış Atlası (BeA)¹⁰ ve Sosyal Davranış Atlası (SBeA)¹ ( Şekil 2E, Şekil 3E, Şekil 4E) kullanarak iki farenin davranışsal motiflerini tanımlayın. Bu yöntemler, hayvan davranışlarını, içsel dinamik ve hiyerarşik yapılarına³⁴ dayalı olarak saniyenin altında motiflere ayrıştırır ve kümeler, ardından bunları tanımlanmış davranış kategorileriyle ilişkilendirir.
   6. BeA kullanarak bireysel farelerin davranışsal motiflerini çıkarın.
      1. Gürültüyü azaltmak için 500 ms zaman penceresine sahip bir medyan filtre uygulayın. Lokomotor olmayan hareketlerin ayrıştırılmasını kolaylaştırmak için sırt ve kuyruk tabanı kilit noktalarını kullanarak vücut hizalamasını gerçekleştirirken, vücut boyutunun normalleştirilmesi için sağ ön ekstremite, sol ön ekstremite, sağ arka ekstremite ve sol arka ekstremite kilit noktaları kullanılır.
      2. Davranış ayrıştırması için, aşağıdakiler dahil olmak üzere 39 hizalanmış vücut koordinatı kullanın: burun (x, y, z), sol kulak (x, y, z), sağ kulak (x, y, z), boyun (x, y, z), sol ön uzuv (x, y, z), sağ ön uzuv (x, y, z), sol arka bacak (x, y, z), sağ arka bacak (x, y, z), sol ön pençe (x, y, z), sağ ön pençe (x, y, z), sol arka pençe (x, y, z), sağ arka pençe (x, y, z), sırt (z) ve kuyruk tabanı (x, z).
      3. Zamansal azaltma indeksini kümeleme çözünürlüğü 3 olacak şekilde 5 olarak ayarlayın. Bant genişliği sigması 30 olan bir Gauss çekirdeği kullanarak başlatma için spektral kümelemeyi kullanın. Minimum ve maksimum segmentasyon uzunluklarını sırasıyla 500 ms ve 2000 ms olarak ayarlayın.
      4. Davranış motifi gömme için, UMAP'yi en yakın 30 komşu ve minimum 0,05 mesafe ile uygulayın. Sınıflandırmanın kararlılığını artırmak için Ward'ın bağlantısını ve Öklid ikili mesafesini kullanarak motifleri hiyerarşik kümeleme yoluyla kümeleyin. BeA'nın deposu şu adrestedir:
      5. SBeA'yı kullanarak sosyal davranış motiflerini tanımlayın. SBeA için başlatma parametrelerini, aşağıdaki değişikliklerle BeA'da kullanılanlarla tutarlı olacak şekilde ayarlayın: medyan filtre penceresi boyutu 1000 ms'ye ayarlanır, minimum segmentasyon uzunluğu 2000 ms'ye çıkarılır ve sosyal davranış ayrıştırması için maksimum segmentasyon uzunluğu 5000 ms'ye uzatılır.
      6. Motif gömme için, bant genişliği sigması 2 olan bir Gauss çekirdeği uygulayın. Sosyal davranış kümelerinin nihai sayısı 16 (alt sınır) ile 280 (üst sınır) arasında değişmektedir. Sunulan örneklerde, gösteri amacıyla yalnızca en büyük 16 küme kullanılmıştır. SBeA'nın deposu https://github.com/YNCris/SBeA_release/blob/main/README_SBeA_mapper.md'da.

4. Nöroetolojik veri haritalama

1. Eşleme veri kümelerini hazırlayın. Yukarıda belirtilen hazırlıkların ardından, nöronal aktiviteler, özne pozları, nesne pozları, vücut mesafeleri, özne davranış motifleri, nesne davranış motifleri ve sosyal davranış motifleri dahil olmak üzere nöroetolojik haritalama için yedi veri seti mevcuttur. Bu dosyaları aşağıdaki gibi manuel olarak düzenleyin:
   Veri yolu # Tüm verilerin kaydedileceği yol
   ----\A-B-C-D-E-neu.mat # Nöronal aktiviteler
   ----\A-B-C-D-E-pose-tpm.mat # Konu pozları
   ----\A-B-C-D-E-pose-free.mat # Nesne pozları
   ----\A-B-C-D-E-rel_dist.mat # Vücut mesafeleri
   ----\A-B-C-D-E-mov-tpm.mat # Özne davranış motifleri
   ----\A-B-C-D-E-mov-free.mat # Nesne davranışı motifleri
   ----\A-B-C-D-E-sbea.mat # Sosyal davranış motifleri
   A, B, C, D ve E alanlarının tanımları 1.5.7 ile aynıdır. Üreme için demo verileri https://doi.org/10.6084/m9.figshare.29606795.v1'dadır.
2. CEBRA kullanarak eşlemenin katıştırmalarını oluşturun.
   NOT: CEBRA'nın yerleştirmeler oluşturmak için hem hipotez odaklı hem de keşif odaklı yaklaşımları entegre ettiği göz önüne alındığında, çeşitli yardımcı değişkenlerle ilişkili nöral temsilleri ortaya çıkarmak için çok uygundur (Şekil 5A).
   1. Farklı modaliteler arasında yerleştirmelerin sistematik bir şekilde karşılaştırılmasını sağlamak için CEBRA modellerinin parametrelerini standartlaştırın. Model mimarisi, toplu iş boyutu 1024, öğrenme hızı 0,0001 ve sıcaklık parametresi 1 olan 10 ofset kullanır.
   2. Çıkış boyutunu 3 olarak ayarlayın ve en fazla 15.000 yineleme için eğitim gerçekleştirin. Benzerlik metriği olarak kosinüs mesafesini kullanın, koşullu değişken ise zaman farkı 10 olan zaman deltası olarak tanımlanır. Ortak yerleştirmeler oluşturmak için nöronal aktivite verilerini girdi olarak ve yardımcı değişkenleri etiket olarak kullanın.
3. Nöronal aktivitelerin kendi kendine gömülmesi için aynı CEBRA parametrelerini uygulayın, ancak girdi olarak yalnızca nöronal aktivite verilerini kullanın.

Results

Doğal davranışın incelenmesi, denemeye dayalı deneylere kıyasla daha fazla karmaşıklık sunar. İlk olarak, doğal koşullarda, hem sinirsel aktivite hem de davranış sabit bir temelden yoksundur. Bu aktiviteler tekrarlayıcıdır, yani önceki durumlardan etkilenirler ve bu nedenle, nöral aktivitenin karşılaştırılması için belirli davranışların başlangıcını hizalamak, önceki nöroetolojik durumların etkilerini çözmede başarısız olur. İkincisi, doğal davranışta nöral kodlama öncelikle popülasyon düzeyinde^{gerçekleşir 4,5}. Tek nöronlarda gözlenen değişkenlik, gürültü olarak kabul edilecek kadar önemlidir. Bunu doğrulamak için, bu bölüm nöral aktivite ile doğal davranışsal pozlar arasında bir korelasyon analizi yaptı (Şekil 2F, Şekil 3F, Şekil 4F). Ortaya çıkan korelasyon katsayısı matrisleri, poz izleriyle nörona özgü bir yazışma ortaya çıkarmadı. Spesifik olarak, nöral sinyaller ile denek pozları, nesne pozları veya vücutlar arası mesafeler arasındaki korelasyon katsayılarının tümü, genellikle zayıf korelasyonlar¹⁵ olarak kabul edilen -0,3 ila +0,3 aralığına düşmüştür (Şekil 2G, Şekil 3G, Şekil 4G). Bu bulgular, doğal koşullar altında, pozla ilgili bilgilerin nörona özgü bir şekilde kodlanmadığını göstermektedir.

Bu faktörler göz önüne alındığında, bu çerçeve, nöroetolojik verileri nöral popülasyon düzeyinde yakalamak ve haritalamak için objektif bir yaklaşım sunar. mTPM görüntüleme, bireysel nöronların değişkenliğinin mümkün olan en büyük ölçüde korunmasını sağlar. Ek olarak, ADPT tarafından derin öğrenmeye dayalı poz tahmininin ve BeA ve SBeA gibi denetimsiz davranış ayrıştırma yöntemlerinin kullanılması, CEBRA'nın sinir popülasyonları içindeki değişkenliği etkili bir şekilde yorumlamasına olanak tanıyan zengin yardımcı değişkenler üretir.

Bu örnekler, ortak CEBRA yerleştirmelerinin özne pozları, nesne pozları, vücut mesafeleri, özne davranış motifleri, nesne davranış motifleri ve sosyal davranış motifleri dahil olmak üzere tüm yardımcı değişkenlerde mevcut olduğunu göstermektedir (Şekil 5A). Oturumlar veya denekler arasında davranışsal motiflerin ve nöral yerleştirmelerin tutarlılığını doğrulamak için, üç fare çiftinde Procrustes analizi³⁵ kullanılır (Şekil 5B). CEBRA gömmelerinin bir birim küre üzerinde dağıtıldığı göz önüne alındığında, yalnızca Procrustes analizindeki döndürme parametresi etkinleştirildi. Doğal davranışlı CEBRA yerleştirmeleri net bir temelden yoksun olduğundan, bu bölüm ilk olarak hizalamak için yerleştirmeler üzerinde etiket kılavuzlu hizalama örneklemesi gerçekleştirdi ve Procrustes analizini uygulamadan önce tutarlı bağlantı noktaları sağladı. Görsel olarak, bu CEBRA gömmeleri, vücut mesafesi ve sosyal motiflerin en yüksek hizalamayı göstermesiyle bir dereceye kadar içsel tutarlılık sergiler. Procrustes hizalamasından önce ve sonra RMSE'nin nicelleştirilmesine uyar (Şekil 5C). Daha sonra, gömme kod çözme doğruluğu pozlar (Şekil 5D) ve motifler (Şekil 5E) için karşılaştırılır. Temsilleri farklı olsa da, her biri yüksek doğrulukla çözülebilir. Vücut mesafesinin RMSE'sinin kod çözmesi, özne ve nesne pozlarından önemli ölçüde daha yüksek olmasına rağmen, ADPT^7'nin izleme doğruluğundan daha fazla değildir.

Bu hipoteze dayalı yerleştirmelerin kökenlerini araştırmak için, CEBRA aracılığıyla kendi kendini organize eden bir nöral aktivite gömülmesi oluşturuldu (Şekil 5A, sağ sütun). Nöral gömmenin şekli, çeşitli eklem gömmelerinden gelen desenleri içeren diğer eklem gömmelerinden daha karmaşıktır. Ek olarak, nöral gömmeler ve eklem gömmeleri arasındaki benzerlikler Procrustes dönüşümü kullanılarak karşılaştırıldı ve daha sonra kosinüs benzerlikleri karşılaştırıldı (Şekil 5F). Kosinüs benzerliği, karşılık gelen zaman noktalarında hizalanmış yerleştirmeler arasında dakika başına elde edilir.

S1 denek pozu eklem gömme, S1'in kendi kendine organize olan somatosensoriyel girdileri kodlamadaki köklü rolüne dayanan benzerlik karşılaştırmaları için temel olarak seçilmiştir³⁶. Bu yerleştirme, nesneyle ilgili motifler gibi diğer değişkenlerin aynı sinirsel alan içinde nasıl temsil edildiğini değerlendirmek için biyolojik olarak anlamlı bir referans noktası görevi görür. Bu tür karşılaştırmalar, kendiyle ilgili bir somatosensoriyel temele göre farklı davranışsal boyutlar için kodlamanın göreceli gücünü değerlendirmemizi sağlar.

Nöral gömmelerin kosinüs benzerliğini, temel olarak S1 denek pozları eklem gömme ile karşılaştırırken, bu çalışma, nesne motifleri için eklem gömmelerinin önemli ölçüde daha düşük olduğunu bulmuştur. Bu, bu örnekte 15 dakikalık serbest sosyal etkileşim süresi boyunca, denek farenin S1 sinirsel aktivitelerinin öncelikle hem davranışını hem de devam eden sosyal etkileşimleri kodladığını göstermektedir. Bu analiz açıklayıcı bir vaka olarak hizmet etse de, aynı metodolojik çerçeve, örneğin nöral kodlamadaki dinamik değişimleri ortaya çıkarmak için farklı zamansal dönemler boyunca gömme yapılarını karşılaştırarak daha ayrıntılı araştırmalara kolayca uygulanabilir.

Şekil 1: Nöroetolojik veri toplama prosedürü. (A) Cihazların entegrasyonu. (B) Veri kaydının işlemi. (C) Kayıttan sonra nöral sinyal çıkarma, 2D poz tahmini ve 3D vücut yörüngesi rekonstrüksiyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Daha fazla analiz için fare 1'in önceden işlenmiş verileri. (A) Nöronal aktiviteler. (B) Konu pozları. (C) Nesne pozları. (D) Vücut mesafesi. (E) Davranış motifleri. Yukarıdan aşağıya özne, nesne ve sosyal davranış motifleri yer alır. (F) Nöral aktivite ve pozlar arasındaki korelasyon katsayısı matrisleri. Solda: sinirsel aktivite ve denek pozları arasındaki korelasyon katsayıları. Merkez: sinirsel aktivite ve nesne pozları arasındaki korelasyon katsayıları. Sağda: sinirsel aktivite ile vücut mesafesi arasındaki korelasyon katsayıları. Korelasyon katsayıları, her nöron izi ile her poz boyutu arasındadır. (G) F'nin korelasyon katsayılarının dağılımları. Nöron indeksleri, nöral aktivite ve denek pozları arasındaki korelasyon katsayılarına göre sıralanır. Kısaltmalar: N & S = nöral aktivite ve konu pozları, N & O = nöral aktivite ve nesne pozları, N & B = nöral aktivite ve vücut mesafeleri, CC = korelasyon katsayıları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Daha fazla analiz için fare 2'nin önceden işlenmiş verileri. (A) Nöronal aktiviteler. (B) Konu pozları. (C) Nesne pozları. (D) Vücut mesafesi. (E) Davranış motifleri. Yukarıdan aşağıya özne, nesne ve sosyal davranış motifleri yer alır. (F) Nöral aktivite ve pozlar arasındaki korelasyon katsayısı matrisleri. Solda: sinirsel aktivite ve denek pozları arasındaki korelasyon katsayıları. Merkez: sinirsel aktivite ve nesne pozları arasındaki korelasyon katsayıları. Sağda: sinirsel aktivite ile vücut mesafesi arasındaki korelasyon katsayıları. Korelasyon katsayıları, her nöron izi ile her poz boyutu arasındadır. (G) F'nin korelasyon katsayılarının dağılımları. Nöron indeksleri, nöral aktivite ve denek pozları arasındaki korelasyon katsayılarına göre sıralanır. Kısaltmalar: N & S = nöral aktivite ve konu pozları, N & O = nöral aktivite ve nesne pozları, N & B = nöral aktivite ve vücut mesafeleri, CC = korelasyon katsayıları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Daha fazla analiz için fare 3'ün önceden işlenmiş verileri. (A) Nöronal aktiviteler. (B) Konu pozları. (C) Nesne pozları. (D) Vücut mesafesi. (E) Davranış motifleri. Yukarıdan aşağıya özne, nesne ve sosyal davranış motifleri yer alır. (F) Nöral aktivite ve pozlar arasındaki korelasyon katsayısı matrisleri. Solda: sinirsel aktivite ve denek pozları arasındaki korelasyon katsayıları. Merkez: sinirsel aktivite ve nesne pozları arasındaki korelasyon katsayıları. Sağda: sinirsel aktivite ile vücut mesafesi arasındaki korelasyon katsayıları. Korelasyon katsayıları, her nöron izi ile her poz boyutu arasındadır. (G) F'nin korelasyon katsayılarının dağılımları. Nöron indeksleri, nöral aktivite ve denek pozları arasındaki korelasyon katsayılarına göre sıralanır. Kısaltmalar: N & S = nöral aktivite ve konu pozları, N & O = nöral aktivite ve nesne pozları, N & B = nöral aktivite ve vücut mesafeleri, CC = korelasyon katsayıları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Nöroetolojik verilerin CEBRA yerleştirmelerinin analizi. (A) CEBRA yerleştirmeleri. Soldan sağa, S1 nöral aktivite ve özne pozlarının ortak gömülmesi, S1 nöral aktivite ve nesne pozlarının ortak gömülmesi, S1 nöral aktivitenin ve iki hayvan arasındaki vücut mesafelerinin ortak gömülmesi, S1 nöral aktivite ve özne davranış motiflerinin ortak gömülmesi, S1 nöral aktivite ve nesne davranış motiflerinin ortak gömülmesi, S1 nöral aktivitesi ve sosyal davranış motiflerinin ortak gömülmesi ve S1'in nöral gömülmesi. (B) Procrustes analizi, yukarıdaki yerleştirmeleri hizalar. Gri daireler, referans yerleştirme görevi gören fare çiftini 1 temsil eder. Yeşil artı işaretleri fare çifti 2'yi, turuncu çarpılar ise fare çifti 3'ü temsil eder ve her ikisi de fare çifti 1'e hizalanır. (C) Procrustes hizalamasından önce (solda) ve sonra (sağda) ortalama karekök hatası (RMSE) (Eşleştirilmiş t-testi, n=3, ortalama ± SEM). (D) CEBRA yerleştirmelerinden poz rekonstrüksiyonunun RMSE'si (tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey'in çoklu karşılaştırma testi, n=3, ortalama ± SEM). (E) CEBRA yerleştirmelerinden motif rekonstrüksiyonunun doğruluğu (tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey'in çoklu karşılaştırma testi, n=3, ortalama ± SEM). (F) Eklem gömülmeleri ile S1'in nöral gömülmesi arasındaki kosinüs benzerlikleri (tek yönlü ANOVA ve ardından Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi, n=45, ortalama ± SEM). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hayır.	Gözlemlenen sorun	Muhtemel neden	Muhtemel çözümler
1	Davranış zaman damgası yok	(1) Arızalı SMA veya BNC kabloları	(1) SMA ve BNC kablolarını değiştirin
		(2) Eksik USB'den TTL'ye sürücü	(2) Prolific PL2303 USB sürücüsünü yükleyin
		(3) Yanlış COM bağlantı noktası seçimi	(3) Aygıt Yöneticisi'nde COM bağlantı noktası numarasını doğrulayın ve hem mTPM yazılımında hem de davranış kamerası komut dosyasında güncelleyin.
2	mTPM montajı sırasında görünür floresan yok	(1) Viral ekspresyon eksikliği	(1) Farklı bir fare kullanın
		(2) Yanlış görüş alanı	(2) Görüş alanını yeniden ayarlayın
		(3) Yetersiz lazer gücü	(3) Lazer gücünü kademeli olarak artırın
		(4) Kurutulmuş Karbomer jeli	(4) Taze Karbomer jeli tekrar uygulayın
3	mTPM görüntüleme tamamen beyaz bir ekran gösteriyor	(1) Işık sızıntısı	(1) Uygun koruma için alüminyum folyoyu yeniden sarın
		(2) Yetersiz lazer gücü	(2) Lazer gücünü kademeli olarak artırın
		(3) mTPM kafasından ayrılmış fiber	(3) Fiberi mTPM'ye yeniden yerleştirin ve sabitleme vidasını sıkın
4	Davranışsal videoda atlanan kareler	(1) Düşük ortam aydınlatması	(1) Arka plan aydınlatmasını artırın
		(2) Yanlış USB bağlantı noktası	(2) En az USB 3.0 bağlantı noktası kullanın
		(3) Yetersiz bilgisayar performansı	(3) Intel i7-9700K veya üzeri, çift kanallı RAM ve SSD depolama alanına sahip bir makine kullanın.
5	mTPM'ye monte edilmiş farelerde hareket yok	(1) Aynı farenin tekrar tekrar kullanılması	(1) Fareleri 3 gün içinde tekrar kullanmaktan kaçının
		(2) Aşırı alüminyum folyo kullanımı	(2) Işık koruması için gereken minimum folyoyu kullanın
		(3) Yetersiz sayıda veya hacimde helyum balonu	(3) Farelerin doğal duruşuna ve hareketine izin verirken mTPM lifini desteklemek için balonların sayısını ve şişirilmesini ayarlayın.
6	Yanlış 2D poz tahmini	(1) Manuel olarak etiketlenmiş çerçeve sayısının yetersiz olması	(1) En az 200 kareye artımlı olarak açıklama ekleyin
		(2) Yetersiz eğitimli ADPT modeli	(2) ADPT'nin config.yaml dosyasındaki eğitim dönemlerini artırın
7	Anormal 3D poz rekonstrüksiyonu	(1) Yanlış kamera kalibrasyonu	(1) Kalibrasyon kontrastını ve eğim açısını iyileştirin
		(2) Hatalı 2D poz girişi	(2) Yakalanan kontrol panosu çerçevelerinin sayısını artırın
			(3) Önce 2B poz sorunlarını çözün (bkz. Sorun 6)
8	Sinirsel ve davranışsal veriler arasındaki uyumsuzluk	(1) Yanlış yazılım başlatma sırası	(1) mTPM kaydını her zaman davranış kamerasından önce başlatın
		(2) Bırakılan davranış çerçeveleri	(2) Kare düşmesi sorunlarını giderin (bkz. Sorun 4)
			(3) Yeterli disk alanının mevcut olduğundan emin olun
9	BeA/SBeA işleme sırasında bellek taşması	(1) Aşırı kayıt süresi	(1) Kayıtları daha kısa bölümlere ayırın (5-60 dakika), ardından BeA/SBeA'yı çalıştırın
		(2) Sınırlı sistem RAM'i	(2) BeA'da zamansal indirgeme faktörünü (örneğin 5'ten 10'a) artırın
			(3) RAM'i en az 64 GB'a yükseltin
10	CEBRA GPU'da çalışmıyor	(1) CUDA ve GPU sürücüsü arasındaki uyumsuzluk	(1) CUDA 11.3'ü yüklemek için öğreticiyi doğrudan takip etmeyin
		(2) Uyumsuz PyTorch sürümü	(2) GPU modelinizi ve sürücü sürümünüzü kontrol edin (nvidia-smi)
			(3) Doğru CUDA ve PyTorch sürümlerini uygun şekilde kurun ve ardından CEBRA'yı pip aracılığıyla kurun

Tablo 1: Sorun giderme listesi. Aşağıda, daha önce karşılaşılan önemsiz olmayan 10 sorunun ve olası çözümlerin bir listesi bulunmaktadır.

Discussion

Bu nöroetolojik kayıt ve kod çözme çerçevesi, ticari olarak temin edilebilen cihazlar üzerine inşa edilmiştir ve çoğu sorun giderme sorununun ilgili şirketler tarafından çözülebilmesini sağlar. Buna rağmen, bu çalışma, referansı kolaylaştırmak ve sorun gidermeyi kolaylaştırmak için sık karşılaşılan sorunların bir listesini sağlar (Tablo 1). Bu erişilebilirlik, çerçeveyi yeni gelenler için daha kullanıcı dostu hale getirir. Ek olarak çerçeve, standart TTL sinyallerine dayanan sinirsel ve davranışsal kayıtlar arasındaki senkronizasyonla oldukça esnektir. Sonuç olarak, gerekirse diğer fizyolojik kayıt cihazlarını çerçeveye entegre etmek kolaydır. Sonraki analiz prosedürleri de tamamen özelleştirilmiş sinirsel ve davranışsal kayıt sistemlerini desteklemek için yeterince geneldir.

Ticarileştirilmiş cihazlara dayanan bu çerçevenin maliyeti nispeten yüksektir (~500,000 ABD Doları), dolayısıyla laboratuvara ek bir mali yük getirmektedir. MINI2P¹³ ve Anipose³⁷ gibi yeni açık kaynaklı araçlar malzeme maliyetlerini düşürmeye yardımcı olabilirken, bu deneyim, hata ayıklamayla ilgili insan kaynakları maliyetleri hesaba katıldığında genel giderlerin benzer kalacağını göstermektedir. Bu çerçevenin bir başka sınırlaması, CEBRA yerleştirmelerinin yorumlanabilirliğinde yatmaktadır. Yapay sinir ağlarına dayalı bir yöntem olarak yorumlanması doğası gereği zordur. Bu örnek, yerleştirmeleri açıklamak için basit bir yaklaşım sağlarken, farklı projeler için duruma göre daha fazla yöntemin geliştirilmesi gerekecektir. CEBRA gömülmelerinin daha fazla yorumlanması için potansiyel bir çözüm, dinamik sistemlerin³⁸ uygulanmasıdır. Ek olarak, doğal davranış, iki farenin uzakta veya yakın olduğu etkileşimler gibi farklı aşamalara ayrılabilir. Farklı bilimsel sorular, özelleştirilmiş veri analizi iş akışlarının geliştirilmesini gerektirebilir.

Mevcut mTPM + 3D kamera sistemi açık alan alanında konuşlandırılırken, uygulaması bu özel davranışsal bağlamla sınırlı değildir. Ana kısıtlamalar, hayvan hareketliliğinin kapsamını sınırlayan görüntüleme sisteminin fiziksel olarak bağlanmasından ve izlenebilir hacmi kısıtlayan 3D kameranın görüş alanından kaynaklanmaktadır. Bu faktörler, daha karmaşık ve doğal davranışsal paradigmaları mümkün kılmak için kablosuz görüntüleme modülleri³⁹ veya tuzak kamera dizileri⁴⁰ dahil edilerek gelecekteki yinelemelerde ele alınabilir. Özellikle, hem mTPM sistemi hem de 3D kamera kurulumu, 24 saat sürekli veri toplama^10,41 yeteneğine sahiptir ve bu da tüm boru hattını uzun zaman ölçekli davranışsal ve sinirsel kayıt çalışmaları için çok uygun hale getirir.

Bu çalışma, spontan davranışın sinirsel kodlamasını araştırmak için tamamen veriye dayalı bir yaklaşım benimsiyor ve bu nedenle, kümelenmiş davranışsal motiflere önceden tanımlanmış anlamsal etiketler atamaktan kasıtlı olarak kaçınıyor. Bu karar, sinirsel davranış haritalama çerçevesinin genelleştirilebilirliğini koruma ve deneyci tarafından empoze edilen davranış kategorilerinden bağımsız olarak çalışmasına izin verme amacına dayanmaktadır. Davranışsal motiflerin biyolojik yorumlanabilirliği ve denetimli sınıflandırması ile ilgilenen okuyucular, önceki çalışmalara ^1,10'a ve aynı temel Davranış Atlası çerçevesini kullanarak denetimsiz motif kümelemesini manuel olarak etiketlenmiş davranışlarla sistematik olarak karşılaştıran yakın tarihli bir çalışmaya⁴² başvurabilirler. Bu çalışmalar aynı zamanda halka açık depolar aracılığıyla erişilebilen 3 boyutlu poz dizileri, yörüngeler ve motif düzeyinde yerleştirmeler dahil olmak üzere kapsamlı görselleştirmeler de sağlar. Birlikte, bu kaynaklar, burada benimsenen esnek, genelleştirilebilir nöral kod çözme yaklaşımını desteklerken, davranışın anlamsal yapısına ilişkin tamamlayıcı bilgiler sunar.

Bu veri işleme hattı, modülerlik ve esneklik göz önünde bulundurularak tasarlanmış olup, çeşitli deneysel ortamlara ve kullanıcı tercihlerine uyum sağlanmasına olanak sağlamıştır. 3B poz tahmini, denetimsiz davranışsal motif kümeleme, nöral sinyal ön işlemeden ortak nöroetolojik yerleştirmeye kadar boru hattının her bir ana bileşeni, açıkça tanımlanmış giriş ve çıkış arayüzlerine sahip bağımsız bir modül olarak uygulanır. Bu mimari, kullanıcıların genel iş akışını bozmadan her aşamada alternatif araçları veya algoritmaları (örneğin, farklı poz tahmin çerçeveleri ^6,22, davranış kümeleme algoritmaları^43,44 veya nöral kod çözücüler^45,46) değiştirmesine olanak tanır. Bu bileşenler birlikte çalışabilecek şekilde tasarlanmış olsa da, bu çalışma alternatif yöntemlerin tüm olası kombinasyonlarını kapsamlı bir şekilde test etmemiştir ve kullanıcıların kendi özel uygulamalarında uyumluluğu sağlamak için ek ayarlamalar yapması gerekebilir. Bu tür bir modülerlik, hem tekrarlanabilirliği hem de genişletilebilirliği kolaylaştırır ve çerçevenin burada gösterilenlerin ötesinde türlere, kayıt yöntemlerine veya davranışsal paradigmalara göre uyarlanmasına izin verir. Daha geniş topluluk kullanımını desteklemek için bu çalışma şematik bir genel bakış ve bir özet tablo sunmaktadır (Şekil 1, Malzeme Tablosu).

Bu boru hattında SBeA ve CEBRA için kullanılan parametre ayarları, doğal sosyal etkileşim altında serbestçe hareket eden fareleri bu deneysel bağlama özgü varsayılan değerlerin ve ampirik ayarlamanın bir kombinasyonuna dayanmaktadır. Bu parametreler, bu çalışmada sunulan tüm sonuçları daha fazla ayarlama gerektirmeden yeniden üretmek için doğrulanmıştır. Kullanıcılar, farklı kayıt kurulumlarına veya davranışsal görevlere uyum sağlamak için belirli parametrelere ince ayar yapmak isteyebilirken, bu tür değişiklikler bu işlem hattını kopyalamak için gerekli değildir. Diğer bağlamlarda çalışan kullanıcılar için, parametre aralıklarının ve göreve özel rehberliğin sağlandığı SBeA ve CEBRA için orijinal belgelere ve literatüre başvurulması önerilir. Bu uygulama, gerektiğinde doğrudan uygulanabilen veya uyarlanabilen sağlam bir referans yapılandırması görevi görür.

Bu çerçevenin birincil ilerlemesi, serbestçe hareket eden hayvanlara uygulanmasında yatmaktadır. Kafası sabitlenmiş hayvanlarla daha önce yapılan çalışmalar bu çerçevede serbest hareket koşullarına uyarlanabilir. Örneğin, Git/Gitme Görevi⁴⁷ ve İki Alternatif Zorunlu Seçim⁴⁸ gibi görevler, doğal davranış paradigmalarına dayalı olarak değiştirilebilir ve bu çerçeveye entegre edilebilir. Bu yaklaşım, kafa kısıtlamasının neden olduğu artefaktları ortadan kaldırarak görev ve doğal davranış durumları arasındaki ilişkinin incelenmesini sağlar. Bu çerçeve hayvanlara karar vermede daha fazla özerklik sağlar. Ayrıca, mTPM omurilik kayıt yöntemini⁴⁹ birleştirerek omurilik çalışmalarını natüralist bağlamlarda destekler. Ek olarak, kafaya sabitlenmiş kurulumlarda mümkün olmayan bir olgu olan serbest grup davranışının incelenmesini kolaylaştırır. Veri analizi iş akışı, nöral popülasyonların arkasındaki beyin fonksiyonunun karmaşıklığını ortaya çıkarmak için yerleştirmeler kullanarak birden fazla değişken genelinde nöral popülasyon aktivitesinin yorumlanmasına olanak tanır.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D davranış kayıt sistemi	BayONE Bilimsel	BA-3D-Fare	Entegre senkronizasyon modülü
Balon	AliExpress Hakkında	Erişim adresi: https://tinyurl.com/3uex669s	Helyumla doldurulduğunda uçabilecek kadar hafif olan herhangi bir balon. Balonlar, yaklaşık 45 cm çapında küresel folyo balonlardır ve kendinden sızdırmaz valflere sahiptir. URL, balonların bir örneğini sağlar.
Karbomer göz jeli	Vidisic	Carbomer 980 bazlı kayganlaştırıcı göz jeli	10g
Pamuk sicim	AliExpress Hakkında	Erişim adresi: https://tinyurl.com/ywu7u754	Kalın ve hafif, 1-2 mm çapında. URL, pamuklu sicimin bir örneğini sağlar.
Kafatası matkabı	Geri sar	78001	0,8, 1,4 ve 2,1 mm matkap
Özel kamera modülü yapılandırılabilir	Intel	Gerçek Duyu D435	/
Yüksek performanslı akrilik yapısal yapıştırıcı	HUITI	1320	490 ml
Görüntüleme için fare	VIVOSCOPE'UN ÖTESİ	Erişim adresi: https://en.tv-scope.com/	C57BL/6J arka plana sahip erkek fare (10 haftalık), 12  h aydınlık-karanlık döngüsü 22&ndash'ta; 25&ince; &derece; C ile %40– %70 nem ve suya ve gıdaya ad libitum erişimine izin verildi. AAV9-CaMKII-GCaMP6s virüsleri, birincil somatosensoriyel korteksine (AP, &eksi; 0,60 mm; ML, & eksi; 2,40 mm; DV, 2,00 mm). Çalışmamızda fareler, profesyonel hayvan hazırlama hizmetlerinin bir parçası olarak TRANSCEND VIVOSCOPE ile hazırlandı. Bu hizmet, minyatür iki fotonlu mikroskopi sistemleri için özel olarak tasarlanmış virüs enjeksiyonu, kraniyal pencere implantasyonu ve taban plakası kurulumunu içerir.
Etkileşim için fare	BayONE LAC	Erişim adresi: https://lac.bayonesci.com/	C57BL/6J arka plana sahip erkek fareler (10 haftalık), 12  h aydınlık-karanlık döngüsü 22&ndash'ta; 25&ince; &derece; C ile 40– %70 nem ve suya ve gıdaya ad libitum erişime izin verildi. Tüm hayvancılık ve deneysel prosedürler, Çin Bilimler Akademisi, Shenzhen İleri Teknoloji Enstitüsü'ndeki Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
mTPM sinirsel kayıt sistemi	VIVOSCOPE'UN ÖTESİ	SÜPERNOVA-600	SUPERNOVA-600, tüm temel optik ve kayıt bileşenleri dahil olmak üzere, ancak harici stimülasyon cihazları hariç, serbestçe hareket eden kemirgenler için tam entegre bir minyatür iki fotonlu görüntüleme sistemidir. Entegre senkronizasyon modülünü içermelidir.