Burada, oksidatif stres ve apoptotik sinyal yolaklarını değerlendirerek iskemi-reperfüzyon hasarının sıçan modelinde NRG1/ErbB4 sinyalinin kardiyoprotektif etkilerini değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Araştırma makalesi
* These authors contributed equally
Burada, oksidatif stres ve apoptotik sinyal yolaklarını değerlendirerek iskemi-reperfüzyon hasarının sıçan modelinde NRG1/ErbB4 sinyalinin kardiyoprotektif etkilerini değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz.
Miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarı (MIRI) kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde önemli bir engel olarak varlığını sürdürmektedir. MIRI'nin patofizyolojisi karmaşıktır ve oksidatif stres, aşırı kalsiyum yükü, inflamasyon ve apoptozu içerir. NRG1 / ErbB4 sinyal yolu, kalpteki oksidatif stres tepkilerinin modüle edilmesinde rol oynamıştır ve potansiyel olarak serbest radikallerin neden olduğu hücresel hasarı azaltır. Bu çalışma, miyokardiyal iskemi-reperfüzyon (MIRI) hasarının bir sıçan modelinde NRG1/ErbB4 yolağının koruma sağladığı moleküler mekanizmaları aydınlatmayı amaçladı. Kontrol, sahte operasyon, MIRI, rekombinant NRG1 ve AG1478 olmak üzere rastgele beş gruba atanan 30 yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanını içeren bir sıçan MIRI modeli kuruldu. Kalp dokularındaki NRG1 konsantrasyonları ELISA ile ölçülürken, p-ErbB4 ve total ErbB4 protein düzeyleri Western blot ile değerlendirildi. Kardiyomiyosit apoptozu ve reaktif oksijen türleri (ROS) düzeyleri akım sitometrisi ile değerlendirildi. MIRI grubunda, NRG1 düzeyleri kontrol ve sham operasyon gruplarına göre anlamlı olarak azaldı (p < 0.05). Rekombinant NRG1 tedavisi, kalp dokusunda NRG1 seviyelerinde belirgin bir artışa ve artmış bir p-ErbB4/ErbB4 ekspresyon oranına yol açtı (p < 0.05). AG1478 grubu, rekombinant NRG1 grubuna kıyasla daha düşük NRG1 seviyeleri ve düşük p-ErbB4/ErbB4 oranı sergiledi (p < 0.05). Apoptoz ve ROS düzeyleri açısından MIRI grubu, kontrol ve sham operasyon gruplarına göre anlamlı olarak daha yüksek oranlar gösterdi (p < 0.05). Rekombinant NRG1 tedavisi, miyokardiyal hücre apoptozu ve ROS seviyelerini önemli ölçüde azaltırken (p < 0.05), AG1478 de bu etkileri daha az ölçüde azalttı. NRG1/ErbB4 sinyal yolu, sıçanlarda MIRI'de çok önemli bir koruyucu rol oynar. Ekzojen NRG1 takviyesi, kalpteki NRG1 seviyelerini etkili bir şekilde yükseltir, ErbB4 sinyal yolunu aktive eder, miyokard hücre apoptozunu azaltır ve ROS seviyelerini düşürür, böylece MIRI'nin neden olduğu hasarı hafifletir.
Miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarı (MIRI), kardiyovasküler hastalıkların yönetiminde kritik bir zorluğu temsil etmektedir1. Miyokard enfarktüsünü tedavi etmek için iskemik miyokarda kan akışının yeniden sağlanması gerekli olsa da, reperfüzyonun kendisi kardiyak doku hasarını şiddetlendirebilir ve böylece terapötik etkiyi sınırlayabilir. MIRI'nin altında yatan mekanizmalar karmaşıktır ve aralarında oksidatif stres, aşırı kalsiyum yükü, inflamatuar yanıtlar ve apoptoz 2,3,4 gibi çeşitli patofizyolojik süreçleri içerir.
Sinir büyüme faktörü 1 (NRG1) ve reseptörü Erb-B2 Reseptörü Tirozin Kinaz 4 (ERBB4) kardiyak fizyoloji ve patolojide önemli roller oynar. Hücre dışı bir ligand olan NRG1, kalp gelişimi, yapısal bütünlüğün korunması ve kalp yaralanmalarına yanıt verilmesi için çok önemli olan bir dizi sinyal yolunu aktive etmek için ErbB4 reseptörü ile etkileşime girer5. Ortaya çıkan kanıtlar, NRG1 / ErbB4 sinyal yolunun kalp hastalıklarında oynadığı rolü vurgulamaktadır. Miyokardiyal iskemi-reperfüzyon koşulları altında, NRG1'in ekspresyonu ve fonksiyonu değiştirilebilir6. Önceki çalışmalar, NRG1'in miyokard hücre sağkalımını desteklediğini ve ErbB4'ü aktive ederek aşırı apoptozu inhibe ettiğini öne sürmüştür. Ek olarak, NRG1/ErbB4 sinyal yolu, kalpteki oksidatif stres tepkisini düzenleyebilir ve serbest radikallerin neden olduğu hücre hasarını azaltabilir. Bu nedenle, MIRI'deki NRG1/ErbB4 sinyal yolunun işlevinin aydınlatılması, bu yaralanmanın biyolojik temelini anlamak ve yeni terapötik stratejiler geliştirmek için hayati önem taşımaktadır 7,8.
Bu çalışma, NRG1/ErbB4 sinyal yolunun MIRI'de koruyucu bir rol oynadığını tahmin etmektedir. Bu nedenle, bu çalışmada, MIRI'deki NRG1/ErbB4 sinyal yolunun mekanizmasını sistematik olarak araştırmak için bir sıçan miyokardiyal iskemi-reperfüzyon modeli oluşturulmuştur. NRG1 konsantrasyonunu düzenleyerek ve ErbB4 aktivasyon durumu, miyokard hücre apoptoz hızı ve oksidatif stres seviyesindeki değişiklikleri gözlemleyerek. Bu çalışma, NRG1/ErbB4 sinyal yolunun MIRI'de koruyucu bir etki gösterdiği moleküler mekanizmayı ortaya çıkarmaya çalışmaktadır. Bu çalışmanın yeniliği, miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarında NRG1/ErbB4 sinyal yolağının önemini ortaya koyması ve bu yola dayalı kalp hastalıklarının tedavi stratejileri için yeni bir bakış açısı sunmasıdır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Deney hayvanları
8 haftalık ve 180-200 g ağırlığında otuz yetişkin erkek Sprague-Dawley (SD) sıçanı, ticari bir satıcıdan elde edildi. Bu sıçanlar, deneylerden önce 1 hafta boyunca belirli patojen içermeyen koşullar altında barındırıldı. Deneyler, Nanping First Hospital (NO. NPSY202208010) Etik Komitesi'nden onay aldı.
Miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarının hayvan modelleri
Sıçanlar, 50 mg / kg'lık bir dozda% 3 pentobarbital sodyumun intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezi altına alındı. Reflekslerin olmadığı doğrulandıktan sonra, hayvanlar sırtüstü pozisyona getirildi ve boyun ve göğüs bölgeleri traş edildi ve %75 etanol ile dezenfekte edildi. Trakeayı ortaya çıkarmak için orta hat servikal insizyon (~2 cm) yapıldı, ardından cerrahi sırasında hava yolu açıklığını korumak için 16 G kateter kullanılarak oral entübasyon yapıldı. Daha sonra, sol pektoralis majör kası, üçüncü ve dördüncü interkostal boşlukları ortaya çıkarmak için dikkatlice diseke edildi. Bu boşluklar arasında bir kesi yapılarak torakotomi yapıldı ve kalp zarı kalbi tam olarak ortaya çıkaracak şekilde açıldı. İskemiyi indüklemek için sol ön inen koroner arter (LAD) 8-0 naylon sütür. Geri dönüşümlü oklüzyonu sağlamak için LAD ile bağ arasına bir polietilen boru (PE-10) yerleştirildi. İskemi 45 dakika boyunca devam etti, miyokardiyal ağartma ve EKG değişiklikleri ile görsel olarak doğrulandı. Reperfüzyon, bağın serbest bırakılmasıyla başlatıldı ve kan akışının 3 saat boyunca devam etmesine izin verildi. Ligasyon 45 dakika sonra kaldırıldı.
Deneysel gruplandırma
Sıçanlar rastgele beş gruba ayrıldı (her biri n = 6). (1) Kontrol grubu: sıçanlara herhangi bir cerrahi müdahale veya tedavi olmaksızın standart bakım verildi. (2) Sahte operasyon grubu: Sıçanlara torakotomi ve sol ön inen koroner arterin (LAD) ligasyon olmaksızın diş açılması uygulandı ve cerrahi kontrol olarak görev yaptı. (3) MIRI grubu: sıçanlara miyokardiyal iskemi-reperfüzyon yaralanması indüksiyonu uygulandı ve araç kontrolü olarak intragastrik olarak normal salin uygulandı. (4) Rekombinant NRG1 grubu: sıçanlara, torakotomiden 30 dakika önce 5 mg / kg'lık bir dozda intravenöz rekombinant insan NRG1 (rh-NRG1) enjeksiyonu yapıldı ve ardından MIRI prosedürü uygulandı. (5) AG1478 grubu: sıçanlara torakotomiden 30 dakika önce intravenöz rh-NRG1 (5 mg / kg), bir ErbB reseptör kinaz inhibitörü olan AG1478 (20 mg / kg) uygulandı ve daha sonra MIRI prosedürü uygulandı.
Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA)
Hayvanlara intraperitoneal pentobarbital sodyum (150 mg / kg) enjeksiyonu ile ötenazi yapıldı. Kalp dokuları reperfüzyondan hemen sonra toplandı ve uygun hacimde buz gibi soğuk PBS'de buz üzerinde homojenize edildi. Homojenatlar daha sonra süpernatanı ayırmak için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1200 x g'da santrifüjlendi. Süpernatanttaki NRG1 konsantrasyonu, üreticinin talimatlarına tam olarak uyularak, ticari olarak temin edilebilen bir NRG1 ELISA kiti kullanılarak ölçüldü. Kısaca, numuneler ve standartlar ELISA plaka kuyucuklarına eklenmiş, önerilen süre boyunca oda sıcaklığında inkübe edilmiş, ardından yıkama ve tespit antikorlarının eklenmesi gerçekleştirilmiştir. Absorbans, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak belirtilen dalga boyunda ölçüldü ve NRG1 seviyeleri standart eğriye göre hesaplandı. Numune hacmi 100 μL idi, antikorun seyreltilmesi 1:100 idi ve absorbansı ölçmek için dalga boyu 450 nm'ye ayarlandı.
Batı lekesi analizi
Kardiyak dokular anestezi uygulanmış sıçanlardan eksize edildi ve kalan kanı çıkarmak için buz gibi soğuk PBS'de durulandı. Her kalp için yaklaşık 0.5 g sol ventrikül dokusu tartıldı ve 500 μL taze hazırlanmış RIPA lizis tamponuna yerleştirildi. Doku daha sonra tamamen parçalanana kadar mekanik bir doku öğütücü kullanılarak buz üzerinde homojenize edildi, ardından tam protein ekstraksiyonunu sağlamak için 30 dakika buz üzerinde inkübe edildi. Lizatlar, kalıntıları gidermek için 4 ° C'de 15 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüjlendi. Protein konsantrasyonları bir BCA test kiti kullanılarak belirlendi. Eşit miktarda toplam protein (ör., şerit başına 30 μg) SDS-PAGE ile yüklendi ve ayrıldı. Proteinler daha sonra 90 dakika boyunca 100 V'ta ıslak bir transfer sistemi kullanılarak poliviniliden florür (PVDF) membranlarına aktarıldı. Membranlar, oda sıcaklığında 1 saat süreyle %0.1 Tween-20 (TBST) içeren Tris tamponlu salin içinde %5 yağsız kuru süt ile bloke edildi. Daha sonra, membranlar, her biri 1:1000 seyreltilmiş fosforile ErbB4 (p-ErbB4) ve toplam ErbB4'e karşı birincil antikorlarla 4 ° C'de gece boyunca inkübe edildi. Yıkandıktan sonra, membranlar yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge ikincil antikorları ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildi. Protein bantları, gelişmiş kemilüminesans (ECL) substratı kullanılarak görselleştirildi ve bir jel görüntüleme sistemi kullanılarak yakalandı. Bant yoğunlukları ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü ve fosforilasyon seviyelerini değerlendirmek için p-ErbB4'ün toplam ErbB4'e oranı hesaplandı.
Akış sitometrisi
Kardiyak miyosit apoptozu akım sitometrisi ile değerlendirildi. Kalp dokuları ince bir şekilde kıyıldı ve kollajenaz tip II (1 mg / mL) ve proteaz (ör., tripsin,% 0.25) kullanılarak 37 ° C'de 20-30 dakika boyunca hafif ajitasyon ile enzimatik olarak sindirildi. Eşit hacimde fetal sığır serumu (FBS) eklenerek enzimatik sindirim sonlandırıldı. Hücre süspansiyonu, 70 μm'lik bir naylon ağdan süzüldü ve hücreleri toplamak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjlendi. Hücre peleti, bağlayıcı tampon içinde yeniden süspanse edildi, daha sonra üreticinin protokolüne göre Annexin V-FITC ve propidyum iyodür (PI) ile inkübe edildi. Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edildikten sonra, numuneler hemen akış sitometrisi ile analiz edildi. Erken apoptotik hücreler Annexin V-pozitif ve PI-negatif olarak tanımlanırken, geç apoptotik veya nekrotik hücreler her iki belirteç için pozitifti. Apoptoz oranları ölçüldü ve deney grupları arasında karşılaştırıldı. Geçit stratejisi, çapraz geçit/dikdörtgen kapı ayarını benimser. Makine üzerinde algılama yapılırken, çapraz geçit noktalı bir çizgi olarak ayarlandı ve veri taramasının tutarlılığını sağlamak için tüm parametreler uygulandı. Akış hızı, hücre konsantrasyonuna göre ayarlandı (1000 hücre/sn'de tutuldu) ve düşük hızlı numune yükleme, nozülün tıkanmasını önleyebilir.
Reaktif oksijen türleri (ROS) seviyelerinin tespiti
Kardiyomiyositler kalp dokularından izole edildi, ardından 300 × g'da 5 dakika süreyle santrifüj edildi ve iki kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkandı. Hücreler daha sonra üreticinin talimatlarına uygun olarak karanlıkta 30 dakika boyunca 37 ° C'de 10 μM 2 ',7'-diklorofloresein diasetat (DCFDA) boyası ile inkübe edildi. Boyamadan sonra, fazla bağlanmamış boyayı çıkarmak için hücreler PBS ile iki kez yıkandı. Hücre içi ROS seviyeleri, DCFDA'nın oksidasyonu üzerine yayılan floresan yoğunluğunu tespit eden akış sitometrisi ile hemen ölçüldü. Her bir numunenin ortalama floresan yoğunluğu (MFI), deney grupları arasında ROS seviyelerini karşılaştırmak için FlowJo yazılımı kullanılarak ölçüldü. Geçit stratejisi yukarıda açıklandığı gibidir (akış sitometrisi bölümü).
İstatistiksel analiz
Verilerin analizi, ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulan SPSS paket programı kullanılarak yapılmıştır. Birden fazla grubu karşılaştırmak için Tukey'in post hoc testi ile tek yönlü varyans analizi yapıldı ve ikili karşılaştırmalar için Student t-testi kullanıldı. p değerinin < 0.05 olması istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
NRG1, MIRI'nin neden olduğu kardiyomiyosit apoptozuna karşı koruyucu bir etki gösterir
Flow sitometrik analiz, hem kontrol hem de sham gruplarına kıyasla MIRI grubunda apoptoz oranlarında kayda değer bir artış olduğunu gösterdi (P < 0.05). Hem rekombinant NRG1 hem de AG1478 grupları, MIRI grubuna kıyasla önemli ölçüde azalmış apoptoz oranları sergiledi (P < 0.05). Buna karşılık, rekombinant NRG1 grubu, AG1478 grubuna kıyasla daha düşük bir apoptoz oranı sergiledi (P < 0.05) (
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
ISKEMIK kardiyak dokuya perfüzyonun yeniden kurulmasının paradoksal olarak miyokard hasarını yoğunlaştırabileceği göz önüne alındığında, MIRI kardiyovasküler hastalık yönetiminde önemli bir engel oluşturmaya devam etmektedir. MIRI'nin oluşumu, oksidatif stres, aşırı kalsiyum yükü, inflamatuar reaksiyonlar ve mitokondriyal disfonksiyonu içeren çok faktörlüdür 9,10.
Hücre dışı bir ligand olan NRG1, miyok...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Bu çalışma, Fujian Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numarası.2024J011604,2023J011877) ve Fujian İl Ocak Komisyonu Gençlik Araştırma Projesi (hibe numarası.2019-9-25) tarafından desteklenmiştir.
YAZAR KATKISI:
Maozhi Huang, araştırma projesinin konseptini ve tasarımını yönetti, deney protokolünü planladı ve detaylandırdı, önemli deneylere katıldı ve el yazmasının ilk taslağını yazdı. Jianping Zheng, tasarım, veri toplama ve el yazması taslağı hazırlama dahil olmak üzere genel araştırmaya eşit olarak katkıda bulundu. Xianlu Cheng araştırma tasarımına katkıda bulundu, örnekler topladı ve verileri analiz etti. Chaoqun: El yazmasının yazılmasına ve yapılandırılmasına yardımcı oldun. Ziguo Chen verileri kontrol etti ve yöntemler ve malzemeler bölümünün iyileştirilmesine yardımcı oldu. Ling Jiang, araştırma süreci boyunca akademik kontrol ve rehberlik sağladı. Shanghua Xu, projenin genel yönüne rehberlik etti, kaynakları koordine etti ve son el yazmasını gözden geçirdi ve revize etti.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| AG1478 Serisi | BioLab Teknolojisi | WD102925 | Müdahale ilacı AG1478 |
| Annexin V-FITC/PI Apoptoz Tespit Kiti | Meilune | MA0220 (İngilizce) | Akış sitometrisi apoptozu |
| BCA Protein Test Kiti | Meilunbio Hakkında | MA0082-2 (İngilizce) | WB protein ölçümü |
| Kemilüminesans Görüntüleme Sistemi | Bio-Rad (ABD) | ChemiDoc Dokunmatik | Western blot görüntüleme |
| Siyamemazin Hidroklorür | Huamu Hayvan Sağlığı | 20220601 | Hayvan modelleme için anestezik |
| ECL Algılama Kiti | Meilunbio Hakkında | MA0186-1 | WB kemilüminesans |
| ERbB4 | Protein teknolojisi | 19943-1-AP | WB birincil antikoru |
| Akış Sitometresi | BD | FACSCalibur | Akış sitometrisi apoptoz tespiti |
| GAPDH | Protein teknolojisi | 60004-1-IG | WB yükleme kontrol antikoru |
| HRP konjuge Keçi Anti-Fare IgG(H+L) | Protein teknolojisi | SA00001-1 | İmmünohistokimya |
| HRP konjuge Keçi Anti-Tavşan IgG(H+L) | Protein teknolojisi | SA00001-2 | İmmünohistokimya |
| Mikroplaka Okuyucu | Termo | K3 | ELISA algılama |
| PAGE Jel Hazırlama Kiti %15 | Meilunbio Hakkında | MA0384 | WB elektroforezi |
| p-ERbB4 | İlgi | AF3445 Serisi | WB birincil antikoru |
| Önceden Boyanmış Protein İşaretleyici | Meilunbio Hakkında | MA0342 (İngilizce) | WB elektroforezi |
| Sıçan Neuregulin-1 (NRG-1) ELISA Kiti | Meimian Dili | MM-61434R2 (İngilizce) | ELISA algılama |
| Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Test Kiti | Meilune | MA0219 (İngilizce) | WB testi |
| rhNRG1 | BioLab Teknolojisi | WD091127 | Müdahale ilacı NRG1 |
| RIPA lizis tamponu | Meilunbio Hakkında | MA0151 | Western blot için protein ekstraksiyonu |
| SDS-PAGE Yükleme Arabelleği (5x) | Beyotime | P0015L | WB elektroforezi |
| Sodyum Dodesil Sülfat | Sigma | 151-21-3 | WB elektroforezi |
| Su Tai 50 | Virbac (Fransa) | 8X22A | Hayvan modelleme için anestezik |
| Dikey Protein Elektroforez Sistemi | Bio-Rad (ABD) | GÜÇ PAC 200 | Western blot elektroforezi |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu makale yayımlandı
Video yakında