Yöntem makalesi

Protein-Glikan Etkileşimlerini Keşfetmek: Nükleer Manyetik Rezonanstaki Gelişmeler

853 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/68674

⸱

26 Ağustos 2025

 ,  , 
1Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis (IBqM), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2National Center for Structural Biology and Bioimaging (CENABIO), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 3Laboratory of Connective Tissue, Clementino Fraga Filho University Hospital

Bu makalede

Özet

Bu NMR tabanlı protokol, siyanovirin-N ve D-mannoz kullanarak zayıf protein-glikan etkileşimlerini araştırır. Ligand ve protein tarafından tespit edilen yöntemleri birleştirerek, bağlanma bölgelerini haritalandırır, allosterik etkileri tespit eder ve karşılaşma komplekslerini tanımlar. Yaklaşım, glikana özgü teşhis ve tanıma mekanizmaları için değerli yapısal ve dinamik bilgiler sunarak numune hazırlama ve veri analizini ana hatlarıyla belirtir.

Özet

Protein-glikan etkileşimleri birçok biyolojik sürecin merkezinde yer alır ve bulaşıcı, inflamatuar ve neoplastik hastalıklarda tanısal stratejiler için umut verici hedefler olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir. Bununla birlikte, bu etkileşimleri, özellikle zayıf ve geçici olduklarında, karakterize etmek teknik olarak zor olmaya devam etmektedir. Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, hem yapısal hem de dinamik yönlere atomik çözünürlüklü içgörüler sağlayarak, yakın fizyolojik koşullar altında bu tür etkileşimleri incelemek için benzersiz avantajlar sunar. Bu çalışmada, mannoza özgü lektin siyanovirin-N ve monosakkarit D-mannozu model sistem olarak kullanarak düşük afiniteli protein-glikan etkileşimlerini araştırmak için tasarlanmış entegre bir NMR protokolü sunuyoruz. Protokol, bağlanma bölgelerini kapsamlı bir şekilde haritalamak ve potansiyel allosterik etkiler veya karşılaşma kompleksleri dahil olmak üzere ince bağlanma olaylarını tespit etmek için ligand ve protein bazlı NMR yaklaşımlarını birleştirir. Protokolün kritik adımları, verilerin tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini sağlamak için dikkatli numune hazırlama, konsantrasyonların hassas kontrolü ve spektral standardizasyonu içerir. Çözeltideki NMR, genellikle diğer teknikler tarafından erişilemeyen geçici etkileşimlerin tespit edilmesini sağlar. Zayıf etkileşimler yaşam için gerekli olmasına rağmen, düşük afiniteli kompleksler sinyal iletimi ve hücre-hücre iletişimi gibi birçok önemli biyolojik fonksiyonla ilgili olsa da, literatürde daha yüksek afiniteli komplekslere karşı bir önyargı vardır. Bu teknik, protein-glikan tanımayı araştırmak için güçlü bir platform sağlar ve glikan-spesifik etkileşimler temelinde yeni tanı belirteçlerini tanımlamak için değerli bir araç olarak hizmet edebilir.

Giriş

Protein-glikan etkileşimleri, hücre-hücre tanıma, immün yanıt modülasyonu ve patojen-konak etkileşimleri dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik süreçler için temeldir 1,2. Bu moleküler etkileşimler oldukça spesifik ve dinamiktir ve hem fizyolojik hem de patolojik mekanizmalarda çok önemli roller oynar 3,4,5. Bu tür etkileşimlerin klasik bir örneği, glikanları spesifik olarak tanıyan ve onlara bağlanan proteinler olan lektinlerle ortaya çıkar. Örneğin Siyanovirin-N (CVN), yüksek mannoz oligosakkaritleri 5,6,7 ile yüksek afinitede etkileşime girme kabiliyeti nedeniyle deneysel bir model olarak geniş çapta incelenmiştir.

Lektinlere ek olarak, integrinler gibi birçok glikosile protein de tanıma ve hücresel sinyallemede önemli roller oynar. İntegrinler, sıklıkla alt birimlerinin glikozilasyonuna uğrayan, glikanlar 5,8,9,10 dahil olmak üzere ligandlara olan stabilitelerini ve afinitelerini etkileyen transmembran reseptörleridir. Bununla birlikte, bu etkileşimlerin yapısal karakterizasyonu, geleneksel yapısal biyoloji yaklaşımlarını karmaşıklaştıran glikanların içsel heterojenliği ve esnekliği nedeniyle zor olmaya devam etmektedir. Bu bağlamda, bu etkileşimleri çözelti halinde yakalayabilen ileri metodolojilerin geliştirilmesi, bu alan için, özellikle glikobiyoloji için büyük değer taşımaktadır11,12.

Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, atomik düzeyde protein-ligand etkileşimlerini araştırmak için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. X-ışını kristalografisi ve kriyo-elektron mikroskobu gibi diğer tekniklerin aksine, NMR, fizyolojik koşullar altında biyomoleküler etkileşimlerin incelenmesine izin vererek hem yapı hem de dinamikler hakkında bilgi sağlar. Bu esneklik, araştırmacıların pH (tipik olarak 4.0-8.0 arasında), iyonik kuvvet (örneğin, 0-500 mM NaCl) ve sıcaklık (genellikle 273-330 K) gibi çevresel parametreleri modüle etmelerini ve böylece koşulları protein-glikan komplekslerinin özgüllüklerine göre uyarlamalarını sağlar. Ek olarak, NMR, genellikle protein-glikan tanıma olaylarının13,14 karakteristiği olan geçici ve zayıf etkileşimleri analiz etmek için özellikle avantajlıdır.

Hem protein hem de ligand bazlı yaklaşımları kullanarak protein-glikan etkileşimlerini araştırmak için çeşitli NMR teknikleri kullanılmıştır. Protein perspektifinden bakıldığında, heteronükleer tek kuantum tutarlılık (HSQC) titrasyonu, ligand ilavesi üzerine kimyasal kayma bozulmalarını izleyerek bağlanma bölgelerini haritalamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Gevşeme dağılım deneyleri, mikro-milisaniye zaman ölçeğinde meydana gelen konformasyonel ve kimyasal değişim süreçlerinin tespit edilmesini sağlayarak, glikan tanımanın dinamik yönleri hakkında bilgi sağlar15,16. Bu protein bazlı teknikler, protein stabilitesine ve etiketleme verimliliğine bağlı olarak tipik olarak 50 μM ila 2 mM aralığında numune konsantrasyonları gerektirir17,18.

Ligand tabanlı NMR teknikleri, bağlanma sırasında glikan değişikliklerine odaklanarak tamamlayıcı bilgiler sunar. Doygunluk transfer farkı (STD-NMR), protein19,20 ile yakın temas halinde ligand bölgelerinin NMR sinyallerini seçici olarak doyurduğundan, tanımada yer alan glikan epitoplarının tanımlanması için özellikle yararlıdır. Gradyan Spektroskopisi (WaterLOGSY)21,22 ile Gözlemlenen Su Ligandları ve Transfer Edilen Nükleer Aşırı Etki Spektroskopisi (Tr-NOESY), etkileşimler sırasında ligand bağlanmasını ve konformasyonel değişiklikleri değerlendirmek için ek araçlar sağlar23. Ayrıca, Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) gevşeme deneyleri, geleneksel yöntemlerle tespit edilmesi zor olan zayıf ve geçici etkileşimlerin belirlenmesine yardımcı olur24. Ligand bazlı deneyler genellikle 10-50 μM protein konsantrasyonlarında gerçekleştirilir ve karıştırma sürelerinin ve doyma parametrelerinin25 optimizasyonunu gerektirebilir. Özellikle, bu yöntemler, küçük ligandlarla çalışırken glikanların düşük çözünürlüğü veya zayıf sinyal-gürültü oranı ile sınırlandırılabilir.

Birlikte, bu NMR yöntemleri, protein-glikan etkileşimlerinin yapısal ve dinamik özelliklerini aydınlatmak için kapsamlı bir çerçeve sağlar. Duyarlılık ve izotopik etiketleme stratejilerinde devam eden ilerlemelerle birlikte, bu teknik glikobiyolojide giderek daha önemli hale gelmekte ve ilaç geliştirme ve biyobelirteç keşfinde potansiyel uygulamalarla moleküler tanıma mekanizmaları hakkında yeni bakış açıları sunmaktadır. Bununla birlikte, bu yaklaşımların başarısı, numune homojenliği, glikan karmaşıklığı ve NMR sinyallerini genişletebilecek veya yorumlamayı engelleyebilecek esnek veya düzensiz bölgelerin varlığı gibi faktörlere bağlıdır26. NMR, yapısal biyolojide büyük bir zorluk olan geçici olayları incelemek için güçlü bir yöntemdir.

CVN, nanomolar afinitlere sahip yüksek mannoz oligosakkaritlerde bulunan α(1,2)'ye bağlı mannosil kalıntılarınıtanır 27,28,29. Bununla birlikte, monosakkarit D-mannozu zayıf bir şekilde tanır. Bu çalışmada, NMR'nin geçici etkileşimleri anlamada ne kadar güçlü olduğunu göstermenin bir yolu olarak CVN'nin D-mannoz ile etkileşimini inceledik.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Bakteri kültürleri ve tampon preparatları içeren tüm adımları kurumsal biyogüvenlik protokollerine uygun olarak gerçekleştirin. Kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın ve açık kültürleri veya kimyasalları tutarken, gerekirse bir biyogüvenlik kabininde veya kimyasal davlumbazda çalışın.

1. Siyanovirin-N'nin İfadesi

  1. E. coli BL21 hücrelerini, pET26a vektörüne yerleştirilen CVN genini kodlayan bir plazmid ile dönüştürün.
  2. Hücreleri 1 L Süper Et Suyu (32 g tripton, 20 g maya özütü, L başına 5 g NaCl), kanamisin (50 μg / mL),% 0.5 (a / h) glikoz ve 1.6 mMMgS04 ile desteklenmiş olarak yetiştirin. 37 ° C'de ~ 250 rpm'de sürekli çalkalama altında inkübe edin.
  3. 15N etiketli CVN üretimi için, hücreleri tek nitrojen kaynağı olarak 15NH4Cl kullanarak modifiye M9 minimal ortamında büyütün.
    1. 64 g / L Na2HPO4, 15 g / L KH2PO4, 2.5 g / L NaCl, 5 g / L NH4içeren 200 mL steril 5x M9 tuz çözeltisini karıştırarak 1 L M9 minimal ortamı hazırlayın.
    2. 2 mL 1 M MgS04 (0.22 μm filtre ile sterilize edilmiş), 0.1 mL 1 M CaCl2 (0.22 μm filtre ile sterilize edilmiş) ve 4 g glikoz (nihai konsantrasyon% 0.4, steril damıtılmış suda çözülür ve 0.22 μm filtre ile sterilize edilir) ekleyin.
    3. Son hacmi steril damıtılmış su ile 1 L'ye getirin.
      NOT: Gerektiğinde amino asitler veya vitaminler gibi takviyeler eklenebilir.
  4. Kültürü, yaklaşık1.2'lik bir optik yoğunluğa (OD 600) ulaşana kadar izleyin. Daha sonra, protein ekspresyonunu indüklemek için 1.0 mM'lik bir nihai konsantrasyona izopropil-beta-D-tiyokalaktopiranosit (IPTG) ekleyin.
  5. İndüksiyondan sonra 37 ° C'de 20 saat inkübe edin.
  6. Hücreleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 7.000 × g'da santrifüjleme ile hasat edin.
  7. Periplazmik fraksiyonu aşağıdaki gibi izole edin:
    1. Hücre peletlerini% 20 sükroz ve 1 mM EDTA içeren 0.4 hacim 30 mM Tris-HCl tamponunda (pH 8.0) yeniden süspanse edin ve 10 dakika çalkalayarak oda sıcaklığında inkübe edin.
    2. 10.000 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
    3. Elde edilen peletleri 0.4 hacim buz gibi soğuk damıtılmış suda yeniden süspanse edin ve 10 dakika çalkalayarak buz üzerinde inkübe edin.
    4. 10.000 × g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
    5. Protein ekstraksiyonu için periplazmik fraksiyona karşılık gelen süpernatanı toplayın.
      NOT: Protein bozulmasını önlemek için tüm tamponlar bir proteaz inhibitör kokteyli içermelidir.

2. NMR deneyleri

NOT: Tüm deneyler, 298K'da 1H/15N/13C üçlü rezonans ters algılama probu ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak 14.1 T'de elde edilmiştir.

  1. Ligand tabanlı deneyler
    1. Numune hazırlama
      1. İki numune hazırlayın: biri CVN içeren ve diğeri CVN içermeyen (yalnızca ligand kontrolü). Her numune, 50 mM NaCl içeren sodyum fosfat tamponunda (pH 7.4) 600 μL 80 μM CVN içerir.
      2. 4 mM'lik bir son konsantrasyona D-mannoz ekleyin.
      3. Her numuneye %5 (h/h) D2O ekleyin.
      4. Numuneyi 5 mm'lik bir NMR tüpüne aktarın.
      5. Proteine göre ligandın 50 kat fazla molar kısmını kullanın.
        NOT: Tipik olarak 10 kat ila 1000 kat aralığında bir ligand fazlalığı önerilir, küçük proteinler için daha düşük aşırılıklar tercih edilir.
    2. D-mannoz ataması için spektral edinim
      1. Standart darbe dizilerini kullanarak 2D TOCSY ve 2D 1 H-13C HMBC spektrumlarını elde edin:
        2D TOCSY: Su bastırma (DIPSI2ESGPPH) için uyarma şekillendirme ile faza duyarlı toplam korelasyon spektroskopisi (TOCSY).
        2D HMBC: 1 H-13C Gradyan seçimi ve ayrıştırılmamış edinim (HMBCGPNDQF) ile Heteronükleer Çoklu Bağ Korelasyonu.
        NOT: Bu deneyler D-mannoz ataması amacıyla yapılmıştır ancak kimyasal kayma ataması bu çalışmanın kapsamında olmadığı için gösterilmemiştir.
    3. Ligandın kimyasal kayma pertürbasyonu (CSP) yoluyla ligand bağlanmasının haritalanması
      1. Numune hazırlama ve ¹H-¹³C HSQC spektrumlarının elde edilmesi için, sodyum fosfat tamponunda (pH 7.4) 50 mM NaCl ve% 5 D2O içeren 4 mM'lik bir D-mannoz çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi iki numuneye bölün: biri 80 μM CVN'li ve diğeri CVN'siz (yalnızca ligand referansı).
        NOT: Bu spektrumlar, CVN ile etkileşim üzerine D-mannozun CSP'sini belirlemek için kullanılacaktır.
      2. 1 H-13C HSQC edinim parametrelerinin kurulumu için, standart darbe dizisi HSQCETGPSI'yi (gradyan seçimi ve hassasiyeti artırılmış 1 H-13C HSQC) kullanın. Alım için aşağıdaki parametreleri ayarlayın:
        Zaman Alanı (TD): 1024 × 128 karmaşık nokta (¹H × ¹³C boyutlarında)
        Spektral Genişlik (SW): ¹H için 10.0171 ppm (6009.615 Hz), ¹³C için 80 ppm (12069.106 Hz)
        Taşıyıcı Frekansları: ¹H için 4,7 ppm, ¹³C için 75 ppm
        - Tarama sayısı: 448.
      3. Aşağıdaki denklemi kullanarak CSP'yi hesaplayın:
        figure-protocol-1
        burada figure-protocol-2 ve figure-protocol-3 CVN varlığında D-mannoz (Şekil 1A, kırmızı ile etiketlenmiş) ve serbest D-mannoz (Şekil 1B) arasındaki kimyasal kayma farklarını temsil eder.
    4. Doygunluk transfer farkı (STD) yoluyla ligand bağlanmasının haritalanması
      1. Yeni bir veri kümesi oluşturun ve STD-NMR deneyleri için parametreleri yapılandırın. İki deneysel strateji uygulanabilir: (i) sinyal-gürültü oranını optimize etmek için farklı doygunluk frekanslarının taranması; (ii) doygunluk frekansının sabitlenmesi ve birikimin değerlendirilmesi için doygunluk süresinin değiştirilmesi.
      2. zgpr darbe dizisini kullanarak 1D ¹H NMR deneyleri ayarlayın. Spektrometreyi ¹H için ayarlayın, şimleme yapın ve 90°'lik sert bir darbe ölçün (örneğin, -10 dB zayıflamada ~10.6 μs, ~11.482 W'a eşdeğer).
      3. ¹H taşıyıcı frekansını, su sinyaline karşılık gelen yaklaşık 4.7 ppm'de ortalayın.
      4. STDDIFFESGP.3 darbe sırasını seçin ve alım parametrelerini aşağıdaki gibi yapılandırın:
        Spektral genişliği numune gereksinimlerine göre ayarlayın.
        Taramalar arası gecikmeyi (d1) 4 s'ye ayarlayın.
        İstenen deneye göre doygunluk süresini (d20) tanımlayın.
        Yalnızca protein sinyalini doyurmak için rezonans dışı doygunluk frekansını (-40 ppm) ve rezonans frekanslarını içeren FQ2LIST yükleyin.
        NOT: Rezonans frekansları protein protonlarına karşılık gelmeli ve doğrudan doygunluğu önlemek için herhangi bir ligand sinyalinden en az 1000 Hz uzakta olmalıdır.
      5. Optimum koşulları belirlemek için aşağıdaki rezonans doygunluk frekanslarını test edin: -0,59 ppm, 0,73 ppm ve 8,1 ppm (bkz. Şekil 2A).
        NOT: En iyi sinyal-gürültü oranını sağladığı için rezonans doygunluk frekansı olarak 0,73 ppm seçilmiştir. Bu frekans kullanılarak, STD amplifikasyon faktörü (ASTD), doygunluk süresinin bir fonksiyonu olarak ölçüldü. Bu amaçla, STD birikim eğrisini oluşturmak için farklı doygunluk sürelerinde (0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 ve 4 s) STD spektrumları elde edildi (Şekil 2B). Karşılık gelen ASTD değerleri daha sonra doygunluk süresinin bir fonksiyonu olarak çizildi (Şekil 2C), ligand hidrojeninin proteine olan zamanı ve yakınlığı ile orantılı olan doygunluk transferinin verimliliğinin değerlendirilmesine izin verdi. BirSTD faktörü şu şekilde tanımlanır:
        figure-protocol-4
        ISTD , açık ve kapalı rezonans spektrumları arasındaki sinyal yoğunluğu farkıdır, I0, rezonans dışı spektrumdaki sinyal yoğunluğudur, [L]T toplam ligand konsantrasyonudur ve [P] protein konsantrasyonudur. Bu normalleştirme, konsantrasyon etkilerini hesaba katar ve farklı deney koşulları arasında karşılaştırmaya izin verir. STD, doygunluğu proteinden bağlı liganda verimli bir şekilde aktarmak için spin difüzyonuna ve yavaş moleküler yuvarlanmaya dayanır. Daha büyük proteinler (yavaş yuvarlanma), protein 19,30,31,32 içinde daha verimli doygunluğa ve manyetizasyonun yayılmasına izin verir.
      6. Tarama sayısını (ns) 64 olarak ayarlayın ve deney l4 (döngü 4) kez ortalamasını alın.
      7. Toplam tarama sayısını şu şekilde hesaplayın: Toplam tarama = ns × l4. Spektral genişliği (SW) 32,768 ppm (10.0171 Hz) olan doğrudan boyutta (TD) 6,009.615 karmaşık nokta kullanın.
      8. Taramalar arası gecikmeyi (d1) 4 saniyeye ve çekim süresini (AQ) 2,7262976 saniyeye ayarlayın. Toplam gevşeme gecikmesi d1 + AQ'ya eşittir.
      9. Doygunluk darbesini aşağıdaki gibi yapılandırın: süre 50 ms; şekil Gauss (p42); şekillendirilmiş program 9 (SP9) ile kontrol edilir.
      10. Artık protein sinyallerini bastırmak için bir T1ρ filtresi içeren bir STD nabız dizisi varyantı kullanın. Protein moleküler ağırlığına göre döndürme-kilitleme süresini (d29) ayarlayın. Daha büyük proteinler için daha küçük spin-lock süreleri (~ 20 ms) ve daha küçük proteinler için daha büyük (> 40 ms) kullanın.
        NOT: Tüm STD spektrumları 599.93 MHz'de (BF1) elde edilmiştir. D29'un ayarlanması, ligand sinyal bütünlüğünü korurken protein arka planını en aza indirmek için kritik öneme sahiptir. Gerekirse bu parametreyi ampirik olarak optimize edin.
    5. 1HR2 ile ligand bağlanmasının haritalanması
      1. Bruker standart kütüphanesinden CPMG_ESGP2D pulse programını seçin. Bu dizi, su bastırma33 için uyarma şekillendirmesini içeren Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) deneyine dayanmaktadır.
      2. Denemeyi 2D alım olarak ayarlayın.
        NOT: Bu, kimyasal kayma bilgisi için yalnızca doğrudan boyutun kullanıldığı sahte bir 2D deneydir.
      3. Alım parametrelerini aşağıdaki gibi yapılandırın:
        Zaman alanı (TD): Doğrudan ¹H boyutunda 32.768 karmaşık nokta.
        (TD1): 2 puan.
        Spektral genişlik (SW): 7.9932 ppm (4,795.396 Hz).
        Taramalar arası gecikme (d1): 4 sn.
        Taşıyıcı frekansı (o1): 4.7 ppm (su sinyaline odaklanmış).
        Tarama sayısı (ns): 8.
        Sahte tarama sayısı (ds): 4.
        CPMG gecikmesi (d20): ≤1 ms (yani 1/3 J_HH'den kısa).
        Ortalama sayısı (TDav): 200.
      4. Denemeyi her biri 8 taramadan oluşan 200 döngü için çalıştırın ve toplam 1.600 tarama birikimi elde edin. Değişken sayaç listesini (vclist) CPMG döngüsünün istenen toplam süresine (TCPMG) göre ayarlayın. Burada TCPMG=8 ms için 2 döngü ve TCPMG=800 ms için 200 döngü seçildi.
      5. Biri protein içeren numune (4 mM D-mannoz ve 80 μM CVN) ve diğeri serbest D-mannoz (4 mM D-mannoz) için olmak üzere iki adet 1H-CPMG deneyi yapın.
      6. efp (üstel çarpma ve ardından Fourier dönüşümü ve faz düzeltmesi) veya sinm (90° kaydırılan sinüs çarpması, SSB=2) ve ardından fp (Fourier dönüşümü ve faz düzeltmesi) komutu aracılığıyla her TCPMG için 1H spektrumunu çizin. Pencere işlevini en iyi işleme stratejisine göre ayarlayın.
        NOT: Bu deneyde sinm ve fp kullanılmıştır. 1. seri, 8 ms'lik bir TCPMG'ye sahip spektrum olacaktır (vclist'te birinci) ve 2. seri, 800 ms (vclist'te ikinci) olacaktır. İşlenmiş 1H-spektrumu Şekil 3'te çizilmiştir.
      7. Denklem 3 aracılığıyla CPMG bölümünü (Q) hesaplayın.
        ​figure-protocol-5
  2. Protein bazlı deneyler
    1. Numune hazırlama
      1. 50 mM NaCl ve% 5 döteryum oksit (D2O) ile desteklenmiş sodyum fosfat tamponunda (pH 7.4) eşit şekilde 436 μM 15N etiketli CVN içeren 600 μL'lik bir numune hazırlayın. D-mannozu numuneye 60 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar titre edin. Titrasyon için 5 mm'lik bir NMR tüpü kullanın.
    2. Rezonans ataması (isteğe bağlı doğrulama adımı)
      1. Daha önce bildirilen kimyasal kayma değerlerini34 kullanarak çözeltideki serbest CVN atamasını onaylayın. Aşağıdaki üçlü rezonans spektrumlarını edinin: HNCO, HNCA, HNCACB ve CBCACONH 35,36,37.
        NOT: Bu deneyler yalnızca atamayı doğrulamaya yarar ve bu protokolün birincil amacı kimyasal kaydırma ataması olmadığı için gösterilmez.
    3. Proteinin kimyasal kayma pertürbasyonu ile D-mannozun CVN üzerindeki bağlanmasının haritalanması
      1. 298 K'da 15N etiketli CVN'den 1H-15 N HSQC spektrumu elde edin. Aşağıdaki nihai konsantrasyonlara ulaşmak için D-mannoz ekleyerek bir titrasyon gerçekleştirin: 0, 1, 2, 5, 10, 20, 40 ve 60 mM.
      2. Brukerstandart kütüphanesindeki faza duyarlı FHSQCF3GPPH darbe dizisini kullanarak 1 H-15N Fast-HSQC deneyini kurun. Aşağıdaki parametreleri kullanın:
        Zaman alanı (TD): 1 H ve 15 N boyutlarında 1024 × 140karmaşık nokta.
        Spektral genişlik (SW): 1H boyutunda 16.0274 ppm (9615.385 Hz) ve 34 N boyutunda 2067.119 ppm ( 15Hz).
        Taşıyıcı frekansı: 4.7 ppm (1H) ve 119 ppm (15N).
        Tarama sayısı: 128.
      3. Aşağıdaki denklemi kullanarak kimyasal kayma pertürbasyonunu (Δδ) hesaplayın:
        figure-protocol-6
        D-mannozun varlığında ve yokluğunda CVN arasındaki kimyasal kayma farkları nerede figure-protocol-7 ve figure-protocol-8 nelerdir (Şekil 4A).
        NOT: Faktör 10, proton ve nitrojen boyutları arasındaki spektral genişlik farkını açıklar.
      4. D-mannoz konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak her kalıntı için CSP değerlerini çizerek ayrışma sabitini(KD) hesaplayın. Elde edilen verileri, aşağıdaki denklemi (5) kullanarak tek bölgeli bir bağlama izotermine sığdırın.
        figure-protocol-9Denklem 5
        burada [PT] titrasyonda kullanılan protein konsantrasyonudur (CVN), [PT] ligand konsantrasyonudur (D-mannoz) ve CSPmax, ligandın yokluğunda ligand ve CSPmin'in doygunluk konsantrasyonundaki CSP'dir.
    4. Proteinin 15N-R2 pozisyonu aracılığıyla D-mannozun CVN'ye bağlanmasının haritalanması.
      1. 60 mM D-mannozun yokluğunda ve varlığında CVN'nin bireysel kalıntılarının 15N-R2 değerlerini ölçün. Tüm deneyleri 298 K'da gerçekleştirin.
      2. Bruker standart kitaplığından faza duyarlı CPMG tabanlı darbe dizisi HSQCT2ETF3GPSI3D kullanarak 15N-R2 deneyini ayarlayın. Aşağıdaki parametreleri kullanın:
        Zaman alanı (TD): 1 H ve 15 N boyutlarında 1024 × 128karmaşık nokta, sözde boyutta 8 nokta.
        Spektral genişlik (SW): 16.0274 ppm (1H; 9615.385 Hz) ve 34 ppm (15N; 2067.119 Hz).
        Taşıyıcı frekansı: 4.7 ppm (1H) ve 119 ppm (15N).
        Tarama sayısı: 32. (v) Değişken sayaç listesi: 1, 8, 2, 6, 3, 5, 4 ve 7, sırasıyla 16.96, 135.68, 33.92, 101.76, 50.88, 84.96, 67.84 ve 118.72 ms'lik gevşeme gecikmelerine (Tgevşeme) karşılık gelir.
      3. Pseudo3D spektrumlarını, yazılım eğitimini izleyerek NMRPipe38 kullanarak bir dizi HSQC benzeri 1H/15N korelasyon gevşeme spektrumu olarak işleyin (öğreticiye bağlantı için Malzeme Tablosuna bakın).
      4. İşlenmiş spektrumları uygun bir NMR analiz platformuna aktarın (örneğin, CCPNMR39). Tüm spektrumları seçin ve "Yoğunluk Değişikliklerini Takip Et" aracını uygulayın. Her bir çapraz tepe noktasının yoğunluğunu T'nin bir fonksiyonu olarakçizin, gevşeyin ve her kalıntı için 15N-R2 değeri çıkarmak için bozunmayı mono-üstel bir fonksiyona sığdırın.
      5. 67.84 ms'de HSQC benzeri spektrumların sinyal-gürültü oranından deneysel hatayı hesaplayın. Spektrumun yalnızca gürültü içeren bir bölgesini işleyin ve aşağıdaki komutu kullanarak bir metin dosyasına dönüştürün:
        pipe2txt.tcl ./PROCs/ft/R2_67_84.ft2 > noise67_84.txt"
      6. İstatistiksel yazılım kullanarak gürültü bölgesinin standart sapmasını belirleyin (örneğin, Origin(Pro), Sürüm 2021). Bu değeri gürültü yoğunluğu Igürültüsü olarak tanımlayın.
      7. Aşağıdaki denklemi kullanarak her kalıntı için deneysel hatayı hesaplayın:
        figure-protocol-10
        NOT: Montaj hatası yerine deneysel hatayı kullanmak önemlidir. Deneysel hata, D-mannozun yokluğunda ve varlığında 15N-R2'yi karşılaştırırken yorumlama sınırlarını tanımlar.

figure-protocol-11
Şekil 1: CVN varlığında D-mannozun kimyasal kayma pertürbasyonu. (A) CVNvarlığında D-mannozun 1 H-13C-HSQC spektrumu. (B) 1 H-13C-HSQC serbest D-mannoz spektrumu. Spektrumlardaki etiketler, kimyasal kayma atamalarının her birini ve ilgili anomerik konfigürasyonu (α veya β) gösterir. Kırmızı renkli etiketler, bağlı konformasyona atanmış olanlardır ve siyah renkli etiketler, serbest konformasyona atanmış olanlardır. (C) 1 H-13C-HSQC spektrumunun CVN'nin varlığında (yeşil) ve yokluğunda (mavi) süperpozisyonu. (D) Denklem (1)'e göre hesaplanan, gözlemlenen CSP'yi vurgulayan α- ve β-D-mannozun kimyasal yapısı. CSP değerleri yeşil dairelerin altında gösterilir. Kırmızı daire, CVN varlığında kaybolan β-anomerik hidrojeni temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-12
Şekil 2: CVN varlığında D-mannozun doygunluk transfer farkı (STD) spektrumları. (A) Farklı doygunluk frekanslarında elde edilen cinsel yolla bulaşan hastalıklar: -0.59, 0.73 ve 8.1 ppm. (B) Farklı doygunluk sürelerinde elde edilen STD: 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 ve 4 s. (C) Doygunluk süresinin bir fonksiyonu olarak denklem 2'ye göre hesaplanan STD amplifikasyon faktörü (ASTD). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-13
Resim 3: CVNvarlığında ve yokluğunda D-mannozun 1 H-R2'si. (A) CVN'nin yokluğunda (altta) ve varlığında (üstte) 8 ve 800 ms'lik R2 gevşeme süreleri ile elde edilen bir bağlayıcı ve bir bağlayıcı olmayan için beklenen D-mannoz 1H-CPMG spektrumlarının temsili. Q, denklem 3'e göre hesaplandı. Etkileşimin yokluğunda (Q ≈ 1), sinyal yoğunlukları, protein olsun ya da olmasın ligandın her iki gevşeme zamanında da benzer kalır. Bağlanma üzerine (Q < 1), protein içeren numune için artan gevşeme ile sinyal yoğunlukları azalır. (B) D-mannozun serbest ve bağlı durumları arasındaki kimyasal değişimin şematik gösterimi. Kimyasal kayma farkının (Δω) ve döviz kuru sabitinin (kex = kaçık + kkapalı) nispi değerlerine bağlı olarak, sistem yavaş, orta veya hızlı değişim rejimlerine düşer. (C)1CVN varlığında serbest D-mannoz ve D-mannozun H NMR spektrumları, 8 ms ve 800 ms gevşeme sürelerinde sinyal yoğunluklarında farklılıklar gösterir. Spesifik hidrojenler (H6β, H3β, H5α, H4β) için hesaplanan Q faktörleri gösterilir, daha düşük Q değerleri CVN ile daha güçlü etkileşimleri gösterir ve şekerin bağlanmaya dahil olan bölgelerini tanımlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-14
Şekil 4: D-mannoz bağlanmasında yer alan CVN kalıntılarını ortaya çıkaran kimyasal kayma pertürbasyonu (CSP) analizi. (A) 10 mM (üst) ve 60 mM (alt) konsantrasyonlarda D-mannoz ile titrasyon üzerine CVN'nin omurga amid (15 N-1H) CSP'lerini gösteren çubuk grafikleri. Yatay çizgiler, ortalama CSP'yi ve önemli ölçüde bozulmuş kalıntıları tanımlamak için eşik olarak kullanılan bir veya iki standart sapmayı (av + sd, av + 2 sd) gösterir. (B) Disakkarit Manα1-2Manα (PDB ID: 1IIY40) ile komplekslenmiş CVN'nin yapısı üzerine önemli ölçüde bozulmuş kalıntıların haritalanması. CSP'leri av + 2 sd eşiğinin üzerinde olan kalıntılar kırmızı renkle vurgulanır ve av + sd ile av + 2 sd arasındakiler mavi renkle gösterilir. Disakkarit Manα1-2Manα molekülleri, bağlanma konumlarını belirtmek için turuncu renkte gösterilir. (C) D-mannoz konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak CSP'leri temsil eden seçilmiş bağlanma eğrileri. Veriler, denklem 5'e göre, KD'yi tahmin etmek için tek bölgeli bir bağlanma modeli olarak yerleştirildi, bu da bir dizi afinite ortaya çıkardı, D44 en güçlü etkileşimi (KD = 1.1 ± 0.35 mM) ve E41 en zayıf etkileşimi gösterdi (KD = 35 ± 29 mM). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-15
Şekil 5: CVN içermeyen ve D-mannoza bağlı 15N-R2'nin analizi. (A, B) Enine gevşeme oranları (15N-R2) (A) serbest ve (B) D-mannoza bağlı durumlarında CVN'nin her bir kalıntısı için ölçülmüştür. (C) Kalıntı başına çizilen R2 değerlerindeki fark (ΔR2 = R2sınır- R2serbest). Mavi ve kırmızı çizgiler, ortalamadan sırasıyla bir ve iki standart sapmayı (av ± sd ve av ± 2 sd) temsil eder. Önemli ΔR2 değerlerine sahip kalıntılar etiketlenir. (D) Disakkarit Manα1-2Manα ile komplekslenmiş CVN yapısı için ΔR2 değerlerinin eşlenmesi (PDB ID: 1IIY40). ΔR2 av± 2 sd'nin üstünde veya altında olan kalıntılar kırmızı ile gösterilir; AV± SD ve AV± 2 SD arasındakiler mavi renkle gösterilir. D-mannoz molekülleri, bağlanma yerlerini belirtmek için turuncu renkte gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, protein-glikan etkileşimlerini araştırmak için NMR deneyleri sunuldu. Protein-glikan moleküler tanıma, hücre yapışması, göç, proliferasyon ve diğer çeşitli hücresel iletişim biçimlerinin düzenlenmesi dahil olmak üzere hücre dışı matrisi (ECM) içeren çok sayıda biyolojik sürecin temelini oluşturur.

Burada, zayıf bir bağlayıcı olarak tanımlanan monosakkarit D-mannoz ile çalışmayı seçtik. Amaç, geçici etkileşimleri ölçme yöntemlerini tanımlamak ve bağlanma mekanizmalarını aydınlatma...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

NMR spektroskopisi, özellikle CVN ve D-mannoz arasında gözlemlenenler gibi zayıf ve geçici etkileşimleri tespit etme yeteneği nedeniyle, protein-glikan etkileşimlerini araştırmak için çok yönlü bir yaklaşımı temsil eder. Burada açıklanan protokol, ligand ve protein bazlı NMR yöntemlerini birleştirerek etkileşim arayüzünün daha kapsamlı bir karakterizasyonuna izin verir.

Protokolün kritik adımları, protein ve ligand konsantrasyonlarının hassas kontrolü ile dikk...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

NMR spektrometrelerinin kullanımı için Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear Jiri Jonas'a (CNRMN) teşekkür ederiz. Manα1-2Manα ile kompleks halinde CVN'nin kimyasal vardiya atamalarını bizimle paylaştığı için Dr. Carole Bewley'e minnettarız. Ayrıca finansman kuruluşları FAPERJ ve CNPq'ya da teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
13C GlikozKambrij İzotopik Laboratuvarı.CLM-481 Serisi
15N Amonyum KlorürKambrij İzotopik Laboratuvarı.NLM-467
Kalsiyum klorürSigma-AldrichC4901 (İngilizce)
Coquetel proteazı inhibe ederSigma-Aldrich4693159001
D2OKambrij İzotopik Laboratuvarı.DLM-4 Serisi
D-MannozSigma-AldrichM2069-5G
Magnezyum klorürSigma-AldrichM8266 Serisi
NMRPipeYazılım eğitimine bağlantı: https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html
Potasyum Klorür (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786
Potasyum Klorür (KCl)Sigma-AldrichP3911
Potasyum Klorür (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662
Shigemi tüpüBrukerZ1Z10684A
Sodyum klorür (NaCl)Sigma-AldrichS9625 Serisi
Sodyum fosfat (Na2HPO4)Sigma-Aldrich567545
Sodyum fosfat (NaH2PO4)Sigma-AldrichS97263 Serisi
Spektrometre Bruker 600 MHzBruker
Spektrometre Bruker 800 MHzBruker
TiaminSigma-AldrichT1270 Serisi
Üçlü rezonans TXI probuBruker
TriptonSigma-Aldrich93657
Maya özüSigma-AldrichY1625 Serisi

Kaynaklar

  1. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2017).
  2. van Kooyk, Y., Rabinovich, G. A. Protein-glycan interactions in the control of innate and adaptive immune responses. Nat. Immunol. 9 (6), 593-601 (2008).
  3. Gagneux, P., Hennet, T., Varki, A. Biological functions of glycans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2022).
  4. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2017).
  5. He, M., Zhou, X., Wang, X. Glycosylation: Mechanisms, biological functions and clinical implications. Signal Transduct. Target. Ther. 9 (1), 194(2024).
  6. Maier, I., Kontaxis, G., Zimmermann, C., Steininger, C. Cyanovirin-N binding to N-acetyl-d-glucosamine requires carbohydrate-binding sites on two different protomers. Biochemistry. 63 (10), 1270-1277 (2024).
  7. Muñoz-Basagoiti, J., et al. Cyanovirin-N binds to select SARS-CoV-2 spike oligosaccharides outside of the receptor binding domain and blocks infection by SARS-CoV-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 120 (10), e2214561120(2023).
  8. Margraf-Schönfeld, S., Böhm, C., Watzl, C. Glycosylation affects ligand binding and function of the activating natural killer cell receptor 2B4 (CD244) protein. J. Biol. Chem. 286 (27), 24142-24149 (2011).
  9. Thomas, D., Rathinavel, A. K., Radhakrishnan, P. Altered glycosylation in cancer: A promising target for biomarkers and therapeutics. Biochim. Biophys. Acta Rev. Cancer. 1875 (1), 188464(2021).
  10. Vasconcelos, A. A., Estrada, J. C., David, V., Wermelinger, L. S., Almeida, F. C. L., Zingali, R. B. Structure-function relationship of the disintegrin family: Sequence signature and integrin interaction. Front. Mol. Biosci. 8 (December), 1-20 (2021).
  11. Gimeno, A., Valverde, P., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Glycan structures and their interactions with proteins. A NMR view. Curr. Opin. Struct. Biol. 62, 22-30 (2020).
  12. Haslam, S. M., et al. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2022).
  13. Angulo, J., et al. NMR investigations of glycan conformation, dynamics, and interactions. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 144 - 145, 97-152 (2024).
  14. Bewley, C. A., Shahzad-Ul-Hussan, S. Characterizing carbohydrate-protein interactions by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biopolymers. 99 (10), 796-806 (2013).
  15. Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR. Chem. Soc. Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).
  16. Pomin, V. H., Wang, X. Glycosaminoglycan-protein interactions by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Molecules. 23 (9), 2314(2018).
  17. Walinda, E., Morimoto, D., Sugase, K. Overview of relaxation dispersion NMR spectroscopy to study protein dynamics and protein-ligand interactions. Curr. Protoc. Protein Sci. 92 (1), e57(2018).
  18. Altincekic, N., et al. Large-scale recombinant production of the SARS-CoV-2 proteome for high-throughput and structural biology applications. Front. Mol. Biosci. 8, 89(2021).
  19. Mayer, M., Meyer, B. Characterization of ligand binding by saturation transfer difference NMR spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 38 (12), 1784-1788 (1999).
  20. Haselhorst, T., Lamerz, A. C., von Itzstein, M. Saturation transfer difference NMR spectroscopy as a technique to investigate protein-carbohydrate interactions in solution. Methods Mol. Biol. 534, 375-386 (2009).
  21. Dalvit, C., Fogliatto, G. P., Stewart, A., Veronesi, M., Stockman, B. WaterLOGSY as a method for primary NMR screening: Practical aspects and range of applicability. J. Biomol. NMR. 21 (4), 349-359 (2001).
  22. Dalvit, C., Fasolini, M., Flocco, M., Knapp, S., Pevarello, P., Veronesi, M. Spectroscopy experiments: Detection of high-affinity ligands. J. Med. Chem. 45, 2610-2614 (2002).
  23. Lucas, L. H., Yan, J., Larive, C. K., Zartler, E. R., Shapiro, M. J. Transferred nuclear Overhauser effect in nuclear magnetic resonance diffusion measurements of ligand-protein binding. Anal. Chem. 75 (3), 627-634 (2003).
  24. Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 121 (10), 2331-2332 (1999).
  25. Di Carluccio, C., et al. Investigation of protein-ligand complexes by ligand-based NMR methods. Carbohydr. Res. 503, 108313(2021).
  26. Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Structural analysis of glycans. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2009).
  27. Driessen, N. N., et al. Cyanovirin-N inhibits mannose-dependent Mycobacterium-C-type lectin interactions but does not protect against murine tuberculosis. J. Immunol. 189 (7), 3585-3592 (2012).
  28. Botos, I., et al. Structures of the complexes of a potent anti-HIV protein cyanovirin-N and high mannose oligosaccharides. J. Biol. Chem. 277 (37), 34336-34342 (2002).
  29. Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: Calorimetric and NMR characterization. Chem. Biol. 9 (10), 1109-1118 (2002).
  30. Mayer, M., Meyer, B. Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor. J. Am. Chem. Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).
  31. Meyer, B., Peters, T. NMR spectroscopy techniques for screening and identifying ligand binding to protein receptors. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (8), 864-890 (2003).
  32. Marchetti, R., et al. 34;Rules of engagement" of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling. Chem. Open. 5 (4), 274-296 (2016).
  33. Carr, H. Y., Purcell, E. M. Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments. Phys. Rev. 94 (3), 630-638 (1954).
  34. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Manα1-2Manα complex: Structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  35. Weisemann, R., Rüterjans, H., Bermel, W. 3D triple-resonance NMR techniques for the sequential assignment of NH and 15N resonances in 15N- and 13C-labelled proteins. J. Biomol. NMR. 3 (1), 113-120 (1993).
  36. Muhandiram, D. R., Kay, L. E. Gradient-enhanced triple-resonance three-dimensional NMR experiments with improved sensitivity. J. Magn. Reson. B. 103 (3), 203-216 (1994).
  37. Whitehead, B., Craven, C. J., Waltho, J. P. Double and triple resonance NMR methods for protein assignment. Methods Mol. Biol. 60, 29-52 (1997).
  38. Delaglio, F., Grzesiek, S., Vuister, G. W., Zhu, G., Pfeifer, J., Bax, A. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  39. Skinner, S. P., et al. Structure calculation, refinement and validation using CcpNmr Analysis. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 1), 154-161 (2015).
  40. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Manα1-2Manα complex. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  41. Sanches, K., Caruso, I. P., Almeida, F. C. L., Melo, F. A. The dynamics of free and phosphopeptide-bound Grb2-SH2 reveals two dynamically independent subdomains and an encounter complex with fuzzy interactions. Sci. Rep. 10 (1), 1-13 (2020).
  42. Almeida, F. C. L., Sanches, K., Caruso, I. P., Melo, F. A. NMR relaxation dispersion experiments to study phosphopeptide recognition by SH2 domains:the Grb2-SH2-phosphopeptide encounter complex. SH2 Domains. 2705, 135-151 (2023).
  43. Huang, R., Bonnichon, A., Claridge, T. D. W., Leung, I. K. H. Protein-ligand binding affinity determination by the WaterLOGSY method: An optimised approach considering ligand rebinding. Sci. Rep. 7 (March), 1-6 (2017).
  44. Caruso, I. P., et al. Insights into the specificity for the interaction of the promiscuous SARS-CoV-2 nucleocapsid protein N-terminal domain with deoxyribonucleic acids. Int. J. Biol. Macromol. 203 (January), 466-480 (2022).
  45. Luna, R. E., Akabayov, S. R., Ziarek, J. J., Wagner, G. Examining weak protein-protein interactions in start codon recognition via NMR spectroscopy. FEBS J. 281 (8), 1965-1973 (2014).
  46. Qin, J., Gronenborn, A. M. Weak protein complexes: Challenging to study but essential for life. FEBS J. 281 (8), 1948-1949 (2014).
  47. Perkins, J. R., Diboun, I., Dessailly, B. H., Lees, J. G., Orengo, C. Transient protein-protein interactions: Structural, functional, and network properties. Structure. 18 (10), 1233-1243 (2010).
  48. Ross, J. L. The dark matter of biology. Biophys. J. 111 (5), 909-916 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

NMR SpektroskopisiKimyasal Kayma Pert rbasyonuDoygunluk Transfer FarkLigand Ba lanma HaritalamasD Mannoz Ba lanmasCyanovirin NRelaksasyon H z AnaliziYap sal Dinamikler

İlgili makaleler