Protein-Glikan Etkileşimlerini Keşfetmek: Nükleer Manyetik Rezonanstaki Gelişmeler

Protein-glikan etkileşimleri, hücre-hücre tanıma, immün yanıt modülasyonu ve patojen-konak etkileşimleri dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik süreçler için temeldir ^1,2. Bu moleküler etkileşimler oldukça spesifik ve dinamiktir ve hem fizyolojik hem de patolojik mekanizmalarda çok önemli roller oynar ^3,4,5. Bu tür etkileşimlerin klasik bir örneği, glikanları spesifik olarak tanıyan ve onlara bağlanan proteinler olan lektinlerle ortaya çıkar. Örneğin Siyanovirin-N (CVN), yüksek mannoz oligosakkaritleri ^5,6,7 ile yüksek afinitede etkileşime girme kabiliyeti nedeniyle deneysel bir model olarak geniş çapta incelenmiştir.

Lektinlere ek olarak, integrinler gibi birçok glikosile protein de tanıma ve hücresel sinyallemede önemli roller oynar. İntegrinler, sıklıkla alt birimlerinin glikozilasyonuna uğrayan, glikanlar ^5,8,9,10 dahil olmak üzere ligandlara olan stabilitelerini ve afinitelerini etkileyen transmembran reseptörleridir. Bununla birlikte, bu etkileşimlerin yapısal karakterizasyonu, geleneksel yapısal biyoloji yaklaşımlarını karmaşıklaştıran glikanların içsel heterojenliği ve esnekliği nedeniyle zor olmaya devam etmektedir. Bu bağlamda, bu etkileşimleri çözelti halinde yakalayabilen ileri metodolojilerin geliştirilmesi, bu alan için, özellikle glikobiyoloji için büyük değer taşımaktadır^11,12.

Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, atomik düzeyde protein-ligand etkileşimlerini araştırmak için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. X-ışını kristalografisi ve kriyo-elektron mikroskobu gibi diğer tekniklerin aksine, NMR, fizyolojik koşullar altında biyomoleküler etkileşimlerin incelenmesine izin vererek hem yapı hem de dinamikler hakkında bilgi sağlar. Bu esneklik, araştırmacıların pH (tipik olarak 4.0-8.0 arasında), iyonik kuvvet (örneğin, 0-500 mM NaCl) ve sıcaklık (genellikle 273-330 K) gibi çevresel parametreleri modüle etmelerini ve böylece koşulları protein-glikan komplekslerinin özgüllüklerine göre uyarlamalarını sağlar. Ek olarak, NMR, genellikle protein-glikan tanıma olaylarının^13,14 karakteristiği olan geçici ve zayıf etkileşimleri analiz etmek için özellikle avantajlıdır.

Hem protein hem de ligand bazlı yaklaşımları kullanarak protein-glikan etkileşimlerini araştırmak için çeşitli NMR teknikleri kullanılmıştır. Protein perspektifinden bakıldığında, heteronükleer tek kuantum tutarlılık (HSQC) titrasyonu, ligand ilavesi üzerine kimyasal kayma bozulmalarını izleyerek bağlanma bölgelerini haritalamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Gevşeme dağılım deneyleri, mikro-milisaniye zaman ölçeğinde meydana gelen konformasyonel ve kimyasal değişim süreçlerinin tespit edilmesini sağlayarak, glikan tanımanın dinamik yönleri hakkında bilgi sağlar^15,16. Bu protein bazlı teknikler, protein stabilitesine ve etiketleme verimliliğine bağlı olarak tipik olarak 50 μM ila 2 mM aralığında numune konsantrasyonları gerektirir^17,18.

Ligand tabanlı NMR teknikleri, bağlanma sırasında glikan değişikliklerine odaklanarak tamamlayıcı bilgiler sunar. Doygunluk transfer farkı (STD-NMR), protein^19,20 ile yakın temas halinde ligand bölgelerinin NMR sinyallerini seçici olarak doyurduğundan, tanımada yer alan glikan epitoplarının tanımlanması için özellikle yararlıdır. Gradyan Spektroskopisi (WaterLOGSY)^21,22 ile Gözlemlenen Su Ligandları ve Transfer Edilen Nükleer Aşırı Etki Spektroskopisi (Tr-NOESY), etkileşimler sırasında ligand bağlanmasını ve konformasyonel değişiklikleri değerlendirmek için ek araçlar sağlar²³. Ayrıca, Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) gevşeme deneyleri, geleneksel yöntemlerle tespit edilmesi zor olan zayıf ve geçici etkileşimlerin belirlenmesine yardımcı olur²⁴. Ligand bazlı deneyler genellikle 10-50 μM protein konsantrasyonlarında gerçekleştirilir ve karıştırma sürelerinin ve doyma parametrelerinin²⁵ optimizasyonunu gerektirebilir. Özellikle, bu yöntemler, küçük ligandlarla çalışırken glikanların düşük çözünürlüğü veya zayıf sinyal-gürültü oranı ile sınırlandırılabilir.

Birlikte, bu NMR yöntemleri, protein-glikan etkileşimlerinin yapısal ve dinamik özelliklerini aydınlatmak için kapsamlı bir çerçeve sağlar. Duyarlılık ve izotopik etiketleme stratejilerinde devam eden ilerlemelerle birlikte, bu teknik glikobiyolojide giderek daha önemli hale gelmekte ve ilaç geliştirme ve biyobelirteç keşfinde potansiyel uygulamalarla moleküler tanıma mekanizmaları hakkında yeni bakış açıları sunmaktadır. Bununla birlikte, bu yaklaşımların başarısı, numune homojenliği, glikan karmaşıklığı ve NMR sinyallerini genişletebilecek veya yorumlamayı engelleyebilecek esnek veya düzensiz bölgelerin varlığı gibi faktörlere bağlıdır²⁶. NMR, yapısal biyolojide büyük bir zorluk olan geçici olayları incelemek için güçlü bir yöntemdir.

CVN, nanomolar afinitlere sahip yüksek mannoz oligosakkaritlerde bulunan α(1,2)'ye bağlı mannosil kalıntılarını^tanır 27,28,29. Bununla birlikte, monosakkarit D-mannozu zayıf bir şekilde tanır. Bu çalışmada, NMR'nin geçici etkileşimleri anlamada ne kadar güçlü olduğunu göstermenin bir yolu olarak CVN'nin D-mannoz ile etkileşimini inceledik.

NOT: Bakteri kültürleri ve tampon preparatları içeren tüm adımları kurumsal biyogüvenlik protokollerine uygun olarak gerçekleştirin. Kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın ve açık kültürleri veya kimyasalları tutarken, gerekirse bir biyogüvenlik kabininde veya kimyasal davlumbazda çalışın.

1. Siyanovirin-N'nin İfadesi

1. E. coli BL21 hücrelerini, pET26a vektörüne yerleştirilen CVN genini kodlayan bir plazmid ile dönüştürün.
2. Hücreleri 1 L Süper Et Suyu (32 g tripton, 20 g maya özütü, L başına 5 g NaCl), kanamisin (50 μg / mL),% 0.5 (a / h) glikoz ve 1.6 mM_MgS04 ile desteklenmiş olarak yetiştirin. 37 ° C'de ~ 250 rpm'de sürekli çalkalama altında inkübe edin.
3. ¹⁵N etiketli CVN üretimi için, hücreleri tek nitrojen kaynağı olarak ¹⁵NH₄Cl kullanarak modifiye M9 minimal ortamında büyütün.
   1. 64 g / L Na₂HPO₄, 15 g / L KH₂PO₄, 2.5 g / L NaCl, 5 g / L NH₄içeren 200 mL steril 5x M9 tuz çözeltisini karıştırarak 1 L M9 minimal ortamı hazırlayın.
   2. 2 mL 1 M MgS04 (0.22 μm filtre ile sterilize edilmiş), 0.1 mL 1 M CaCl₂ (0.22 μm filtre ile sterilize edilmiş) ve 4 g glikoz (nihai konsantrasyon% 0.4, steril damıtılmış suda çözülür ve 0.22 μm filtre ile sterilize edilir) ekleyin.
   3. Son hacmi steril damıtılmış su ile 1 L'ye getirin.
      NOT: Gerektiğinde amino asitler veya vitaminler gibi takviyeler eklenebilir.
4. Kültürü, yaklaşık_1.2'lik bir optik yoğunluğa (OD 600) ulaşana kadar izleyin. Daha sonra, protein ekspresyonunu indüklemek için 1.0 mM'lik bir nihai konsantrasyona izopropil-beta-D-tiyokalaktopiranosit (IPTG) ekleyin.
5. İndüksiyondan sonra 37 ° C'de 20 saat inkübe edin.
6. Hücreleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 7.000 × g'da santrifüjleme ile hasat edin.
7. Periplazmik fraksiyonu aşağıdaki gibi izole edin:
   1. Hücre peletlerini% 20 sükroz ve 1 mM EDTA içeren 0.4 hacim 30 mM Tris-HCl tamponunda (pH 8.0) yeniden süspanse edin ve 10 dakika çalkalayarak oda sıcaklığında inkübe edin.
   2. 10.000 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
   3. Elde edilen peletleri 0.4 hacim buz gibi soğuk damıtılmış suda yeniden süspanse edin ve 10 dakika çalkalayarak buz üzerinde inkübe edin.
   4. 10.000 × g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
   5. Protein ekstraksiyonu için periplazmik fraksiyona karşılık gelen süpernatanı toplayın.
      NOT: Protein bozulmasını önlemek için tüm tamponlar bir proteaz inhibitör kokteyli içermelidir.

2. NMR deneyleri

NOT: Tüm deneyler, 298K'da ¹H/¹⁵N/¹³C üçlü rezonans ters algılama probu ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak 14.1 T'de elde edilmiştir.

1. Ligand tabanlı deneyler
   1. Numune hazırlama
      1. İki numune hazırlayın: biri CVN içeren ve diğeri CVN içermeyen (yalnızca ligand kontrolü). Her numune, 50 mM NaCl içeren sodyum fosfat tamponunda (pH 7.4) 600 μL 80 μM CVN içerir.
      2. 4 mM'lik bir son konsantrasyona D-mannoz ekleyin.
      3. Her numuneye %5 (h/h) D₂O ekleyin.
      4. Numuneyi 5 mm'lik bir NMR tüpüne aktarın.
      5. Proteine göre ligandın 50 kat fazla molar kısmını kullanın.
         NOT: Tipik olarak 10 kat ila 1000 kat aralığında bir ligand fazlalığı önerilir, küçük proteinler için daha düşük aşırılıklar tercih edilir.
   2. D-mannoz ataması için spektral edinim
      1. Standart darbe dizilerini kullanarak 2D TOCSY ve 2D ^{1 H-13}C HMBC spektrumlarını elde edin:
         2D TOCSY: Su bastırma (DIPSI2ESGPPH) için uyarma şekillendirme ile faza duyarlı toplam korelasyon spektroskopisi (TOCSY).
         2D HMBC: ^{1 H-13}C Gradyan seçimi ve ayrıştırılmamış edinim (HMBCGPNDQF) ile Heteronükleer Çoklu Bağ Korelasyonu.
         NOT: Bu deneyler D-mannoz ataması amacıyla yapılmıştır ancak kimyasal kayma ataması bu çalışmanın kapsamında olmadığı için gösterilmemiştir.
   3. Ligandın kimyasal kayma pertürbasyonu (CSP) yoluyla ligand bağlanmasının haritalanması
      1. Numune hazırlama ve ¹H-¹³C HSQC spektrumlarının elde edilmesi için, sodyum fosfat tamponunda (pH 7.4) 50 mM NaCl ve% 5 D₂O içeren 4 mM'lik bir D-mannoz çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi iki numuneye bölün: biri 80 μM CVN'li ve diğeri CVN'siz (yalnızca ligand referansı).
         NOT: Bu spektrumlar, CVN ile etkileşim üzerine D-mannozun CSP'sini belirlemek için kullanılacaktır.
      2. ^{1 H-13}C HSQC edinim parametrelerinin kurulumu için, standart darbe dizisi HSQCETGPSI'yi (gradyan seçimi ve hassasiyeti artırılmış ^{1 H-13}C HSQC) kullanın. Alım için aşağıdaki parametreleri ayarlayın:
         Zaman Alanı (TD): 1024 × 128 karmaşık nokta (¹H × ¹³C boyutlarında)
         Spektral Genişlik (SW): ¹H için 10.0171 ppm (6009.615 Hz), ¹³C için 80 ppm (12069.106 Hz)
         Taşıyıcı Frekansları: ¹H için 4,7 ppm, ¹³C için 75 ppm
         - Tarama sayısı: 448.
      3. Aşağıdaki denklemi kullanarak CSP'yi hesaplayın:
         
         burada ve CVN varlığında D-mannoz (Şekil 1A, kırmızı ile etiketlenmiş) ve serbest D-mannoz (Şekil 1B) arasındaki kimyasal kayma farklarını temsil eder.
   4. Doygunluk transfer farkı (STD) yoluyla ligand bağlanmasının haritalanması
      1. Yeni bir veri kümesi oluşturun ve STD-NMR deneyleri için parametreleri yapılandırın. İki deneysel strateji uygulanabilir: (i) sinyal-gürültü oranını optimize etmek için farklı doygunluk frekanslarının taranması; (ii) doygunluk frekansının sabitlenmesi ve birikimin değerlendirilmesi için doygunluk süresinin değiştirilmesi.
      2. zgpr darbe dizisini kullanarak 1D ¹H NMR deneyleri ayarlayın. Spektrometreyi ¹H için ayarlayın, şimleme yapın ve 90°'lik sert bir darbe ölçün (örneğin, -10 dB zayıflamada ~10.6 μs, ~11.482 W'a eşdeğer).
      3. ¹H taşıyıcı frekansını, su sinyaline karşılık gelen yaklaşık 4.7 ppm'de ortalayın.
      4. STDDIFFESGP.3 darbe sırasını seçin ve alım parametrelerini aşağıdaki gibi yapılandırın:
         Spektral genişliği numune gereksinimlerine göre ayarlayın.
         Taramalar arası gecikmeyi (d1) 4 s'ye ayarlayın.
         İstenen deneye göre doygunluk süresini (d20) tanımlayın.
         Yalnızca protein sinyalini doyurmak için rezonans dışı doygunluk frekansını (-40 ppm) ve rezonans frekanslarını içeren FQ2LIST yükleyin.
         NOT: Rezonans frekansları protein protonlarına karşılık gelmeli ve doğrudan doygunluğu önlemek için herhangi bir ligand sinyalinden en az 1000 Hz uzakta olmalıdır.
      5. Optimum koşulları belirlemek için aşağıdaki rezonans doygunluk frekanslarını test edin: -0,59 ppm, 0,73 ppm ve 8,1 ppm (bkz. Şekil 2A).
         NOT: En iyi sinyal-gürültü oranını sağladığı için rezonans doygunluk frekansı olarak 0,73 ppm seçilmiştir. Bu frekans kullanılarak, STD amplifikasyon faktörü (A_STD), doygunluk süresinin bir fonksiyonu olarak ölçüldü. Bu amaçla, STD birikim eğrisini oluşturmak için farklı doygunluk sürelerinde (0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 ve 4 s) STD spektrumları elde edildi (Şekil 2B). Karşılık gelen A_STD değerleri daha sonra doygunluk süresinin bir fonksiyonu olarak çizildi (Şekil 2C), ligand hidrojeninin proteine olan zamanı ve yakınlığı ile orantılı olan doygunluk transferinin verimliliğinin değerlendirilmesine izin verdi. Bir_STD faktörü şu şekilde tanımlanır:
         
         I_STD , açık ve kapalı rezonans spektrumları arasındaki sinyal yoğunluğu farkıdır, I₀, rezonans dışı spektrumdaki sinyal yoğunluğudur, [L]_T toplam ligand konsantrasyonudur ve [P] protein konsantrasyonudur. Bu normalleştirme, konsantrasyon etkilerini hesaba katar ve farklı deney koşulları arasında karşılaştırmaya izin verir. STD, doygunluğu proteinden bağlı liganda verimli bir şekilde aktarmak için spin difüzyonuna ve yavaş moleküler yuvarlanmaya dayanır. Daha büyük proteinler (yavaş yuvarlanma), protein 19,30,31,32 içinde daha verimli doygunluğa ve manyetizasyonun yayılmasına izin verir.
      6. Tarama sayısını (ns) 64 olarak ayarlayın ve deney l4 (döngü 4) kez ortalamasını alın.
      7. Toplam tarama sayısını şu şekilde hesaplayın: Toplam tarama = ns × l4. Spektral genişliği (SW) 32,768 ppm (10.0171 Hz) olan doğrudan boyutta (TD) 6,009.615 karmaşık nokta kullanın.
      8. Taramalar arası gecikmeyi (d1) 4 saniyeye ve çekim süresini (AQ) 2,7262976 saniyeye ayarlayın. Toplam gevşeme gecikmesi d1 + AQ'ya eşittir.
      9. Doygunluk darbesini aşağıdaki gibi yapılandırın: süre 50 ms; şekil Gauss (p42); şekillendirilmiş program 9 (SP9) ile kontrol edilir.
      10. Artık protein sinyallerini bastırmak için bir T₁ρ filtresi içeren bir STD nabız dizisi varyantı kullanın. Protein moleküler ağırlığına göre döndürme-kilitleme süresini (d29) ayarlayın. Daha büyük proteinler için daha küçük spin-lock süreleri (~ 20 ms) ve daha küçük proteinler için daha büyük (> 40 ms) kullanın.
          NOT: Tüm STD spektrumları 599.93 MHz'de (BF1) elde edilmiştir. D29'un ayarlanması, ligand sinyal bütünlüğünü korurken protein arka planını en aza indirmek için kritik öneme sahiptir. Gerekirse bu parametreyi ampirik olarak optimize edin.
   5. ¹HR₂ ile ligand bağlanmasının haritalanması
      1. Bruker standart kütüphanesinden CPMG_ESGP2D pulse programını seçin. Bu dizi, su bastırma³³ için uyarma şekillendirmesini içeren Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) deneyine dayanmaktadır.
      2. Denemeyi 2D alım olarak ayarlayın.
         NOT: Bu, kimyasal kayma bilgisi için yalnızca doğrudan boyutun kullanıldığı sahte bir 2D deneydir.
      3. Alım parametrelerini aşağıdaki gibi yapılandırın:
         Zaman alanı (TD): Doğrudan ¹H boyutunda 32.768 karmaşık nokta.
         (TD1): 2 puan.
         Spektral genişlik (SW): 7.9932 ppm (4,795.396 Hz).
         Taramalar arası gecikme (d1): 4 sn.
         Taşıyıcı frekansı (o1): 4.7 ppm (su sinyaline odaklanmış).
         Tarama sayısı (ns): 8.
         Sahte tarama sayısı (ds): 4.
         CPMG gecikmesi (d20): ≤1 ms (yani 1/3 J_HH'den kısa).
         Ortalama sayısı (TDav): 200.
      4. Denemeyi her biri 8 taramadan oluşan 200 döngü için çalıştırın ve toplam 1.600 tarama birikimi elde edin. Değişken sayaç listesini (vclist) CPMG döngüsünün istenen toplam süresine (T_CPMG) göre ayarlayın. Burada T_CPMG=8 ms için 2 döngü ve T_CPMG=800 ms için 200 döngü seçildi.
      5. Biri protein içeren numune (4 mM D-mannoz ve 80 μM CVN) ve diğeri serbest D-mannoz (4 mM D-mannoz) için olmak üzere iki adet ¹H-CPMG deneyi yapın.
      6. efp (üstel çarpma ve ardından Fourier dönüşümü ve faz düzeltmesi) veya sinm (90° kaydırılan sinüs çarpması, SSB=2) ve ardından fp (Fourier dönüşümü ve faz düzeltmesi) komutu aracılığıyla her T_CPMG için ¹H spektrumunu çizin. Pencere işlevini en iyi işleme stratejisine göre ayarlayın.
         NOT: Bu deneyde sinm ve fp kullanılmıştır. 1^. seri, 8 ms'lik bir T_CPMG'ye sahip spektrum olacaktır (vclist'te birinci) ve 2^{. seri,} 800 ms (vclist'te ikinci) olacaktır. İşlenmiş ¹H-spektrumu Şekil 3'te çizilmiştir.
      7. Denklem 3 aracılığıyla CPMG bölümünü (Q) hesaplayın.
         ​
2. Protein bazlı deneyler
   1. Numune hazırlama
      1. 50 mM NaCl ve% 5 döteryum oksit (_D2O) ile desteklenmiş sodyum fosfat tamponunda (pH 7.4) eşit şekilde 436 μM ¹⁵N etiketli CVN içeren 600 μL'lik bir numune hazırlayın. D-mannozu numuneye 60 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar titre edin. Titrasyon için 5 mm'lik bir NMR tüpü kullanın.
   2. Rezonans ataması (isteğe bağlı doğrulama adımı)
      1. Daha önce bildirilen kimyasal kayma değerlerini³⁴ kullanarak çözeltideki serbest CVN atamasını onaylayın. Aşağıdaki üçlü rezonans spektrumlarını edinin: HNCO, HNCA, HNCACB ve CBCACONH 35,36,37.
         NOT: Bu deneyler yalnızca atamayı doğrulamaya yarar ve bu protokolün birincil amacı kimyasal kaydırma ataması olmadığı için gösterilmez.
   3. Proteinin kimyasal kayma pertürbasyonu ile D-mannozun CVN üzerindeki bağlanmasının haritalanması
      1. 298 K'da ¹⁵N etiketli CVN'den ¹H-15 N HSQC spektrumu elde edin. Aşağıdaki nihai konsantrasyonlara ulaşmak için D-mannoz ekleyerek bir titrasyon gerçekleştirin: 0, 1, 2, 5, 10, 20, 40 ve 60 mM.
      2. ^Brukerstandart kütüphanesindeki faza duyarlı FHSQCF3GPPH darbe dizisini kullanarak 1 ^H-15N Fast-HSQC deneyini kurun. Aşağıdaki parametreleri kullanın:
         Zaman alanı (TD): 1 H ve 15 N boyutlarında 1024 × ¹⁴⁰karmaşık nokta.
         Spektral genişlik (SW): ¹H boyutunda 16.0274 ppm (9615.385 Hz) ve 34 N boyutunda 2067.119 ppm ( ¹⁵Hz).
         Taşıyıcı frekansı: 4.7 ppm (¹H) ve 119 ppm (¹⁵N).
         Tarama sayısı: 128.
      3. Aşağıdaki denklemi kullanarak kimyasal kayma pertürbasyonunu (Δδ) hesaplayın:
         
         D-mannozun varlığında ve yokluğunda CVN arasındaki kimyasal kayma farkları nerede ve nelerdir (Şekil 4A).
         NOT: Faktör 10, proton ve nitrojen boyutları arasındaki spektral genişlik farkını açıklar.
      4. D-mannoz konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak her kalıntı için CSP değerlerini çizerek ayrışma sabitini_(KD) hesaplayın. Elde edilen verileri, aşağıdaki denklemi (5) kullanarak tek bölgeli bir bağlama izotermine sığdırın.
         Denklem 5
         burada [P_T] titrasyonda kullanılan protein konsantrasyonudur (CVN), [P_T] ligand konsantrasyonudur (D-mannoz) ve CSPmax, ligandın yokluğunda ligand ve CSPmin'in doygunluk konsantrasyonundaki CSP'dir.
   4. Proteinin ¹⁵N-R2 pozisyonu aracılığıyla D-mannozun CVN'ye bağlanmasının haritalanması.
      1. 60 mM D-mannozun yokluğunda ve varlığında CVN'nin bireysel kalıntılarının ¹⁵N-R₂ değerlerini ölçün. Tüm deneyleri 298 K'da gerçekleştirin.
      2. Bruker standart kitaplığından faza duyarlı CPMG tabanlı darbe dizisi HSQCT2ETF3GPSI3D kullanarak ¹⁵N-R₂ deneyini ayarlayın. Aşağıdaki parametreleri kullanın:
         Zaman alanı (TD): 1 H ve 15 N boyutlarında 1024 × ¹²⁸karmaşık nokta, sözde boyutta 8 nokta.
         Spektral genişlik (SW): 16.0274 ppm (¹H; 9615.385 Hz) ve 34 ppm (¹⁵N; 2067.119 Hz).
         Taşıyıcı frekansı: 4.7 ppm (¹H) ve 119 ppm (¹⁵N).
         Tarama sayısı: 32. (v) Değişken sayaç listesi: 1, 8, 2, 6, 3, 5, 4 ve 7, sırasıyla 16.96, 135.68, 33.92, 101.76, 50.88, 84.96, 67.84 ve 118.72 ms'lik gevşeme gecikmelerine (T_gevşeme) karşılık gelir.
      3. Pseudo3D spektrumlarını, yazılım eğitimini izleyerek NMRPipe³⁸ kullanarak bir dizi HSQC benzeri ¹H/¹⁵N korelasyon gevşeme spektrumu olarak işleyin (öğreticiye bağlantı için Malzeme Tablosuna bakın).
      4. İşlenmiş spektrumları uygun bir NMR analiz platformuna aktarın (örneğin, CCPNMR³⁹). Tüm spektrumları seçin ve "Yoğunluk Değişikliklerini Takip Et" aracını uygulayın. Her bir çapraz tepe noktasının yoğunluğunu T'nin bir fonksiyonu olarak_{çizin, gevşeyin} ve her kalıntı için ¹⁵N-R2 değeri çıkarmak için bozunmayı mono-üstel bir fonksiyona sığdırın.
      5. 67.84 ms'de HSQC benzeri spektrumların sinyal-gürültü oranından deneysel hatayı hesaplayın. Spektrumun yalnızca gürültü içeren bir bölgesini işleyin ve aşağıdaki komutu kullanarak bir metin dosyasına dönüştürün:
         pipe2txt.tcl ./PROCs/ft/R2_67_84.ft2 > noise67_84.txt"
      6. İstatistiksel yazılım kullanarak gürültü bölgesinin standart sapmasını belirleyin (örneğin, Origin(Pro), Sürüm 2021). Bu değeri gürültü yoğunluğu I_{gürültüsü} olarak tanımlayın.
      7. Aşağıdaki denklemi kullanarak her kalıntı için deneysel hatayı hesaplayın:
         
         NOT: Montaj hatası yerine deneysel hatayı kullanmak önemlidir. Deneysel hata, D-mannozun yokluğunda ve varlığında ¹⁵_N-R2'yi karşılaştırırken yorumlama sınırlarını tanımlar.

Şekil 1: CVN varlığında D-mannozun kimyasal kayma pertürbasyonu. (A) ^CVNvarlığında D-mannozun 1 ^H-13C-HSQC spektrumu. (B) ^{1 H-13}C-HSQC serbest D-mannoz spektrumu. Spektrumlardaki etiketler, kimyasal kayma atamalarının her birini ve ilgili anomerik konfigürasyonu (α veya β) gösterir. Kırmızı renkli etiketler, bağlı konformasyona atanmış olanlardır ve siyah renkli etiketler, serbest konformasyona atanmış olanlardır. (C) ^{1 H-13}C-HSQC spektrumunun CVN'nin varlığında (yeşil) ve yokluğunda (mavi) süperpozisyonu. (D) Denklem (1)'e göre hesaplanan, gözlemlenen CSP'yi vurgulayan α- ve β-D-mannozun kimyasal yapısı. CSP değerleri yeşil dairelerin altında gösterilir. Kırmızı daire, CVN varlığında kaybolan β-anomerik hidrojeni temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: CVN varlığında D-mannozun doygunluk transfer farkı (STD) spektrumları. (A) Farklı doygunluk frekanslarında elde edilen cinsel yolla bulaşan hastalıklar: -0.59, 0.73 ve 8.1 ppm. (B) Farklı doygunluk sürelerinde elde edilen STD: 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 ve 4 s. (C) Doygunluk süresinin bir fonksiyonu olarak denklem 2'ye göre hesaplanan STD amplifikasyon faktörü (A_STD). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 3: ^CVNvarlığında ve yokluğunda D-mannozun 1 H-R_2'si. (A) CVN'nin yokluğunda (altta) ve varlığında (üstte) 8 ve 800 ms'lik R₂ gevşeme süreleri ile elde edilen bir bağlayıcı ve bir bağlayıcı olmayan için beklenen D-mannoz ¹H-CPMG spektrumlarının temsili. Q, denklem 3'e göre hesaplandı. Etkileşimin yokluğunda (Q ≈ 1), sinyal yoğunlukları, protein olsun ya da olmasın ligandın her iki gevşeme zamanında da benzer kalır. Bağlanma üzerine (Q < 1), protein içeren numune için artan gevşeme ile sinyal yoğunlukları azalır. (B) D-mannozun serbest ve bağlı durumları arasındaki kimyasal değişimin şematik gösterimi. Kimyasal kayma farkının (Δω) ve döviz kuru sabitinin (k_ex = k_açık + k_kapalı) nispi değerlerine bağlı olarak, sistem yavaş, orta veya hızlı değişim rejimlerine düşer. (C)¹CVN varlığında serbest D-mannoz ve D-mannozun H NMR spektrumları, 8 ms ve 800 ms gevşeme sürelerinde sinyal yoğunluklarında farklılıklar gösterir. Spesifik hidrojenler (H_6β, H_3β, H_5α, H_4β) için hesaplanan Q faktörleri gösterilir, daha düşük Q değerleri CVN ile daha güçlü etkileşimleri gösterir ve şekerin bağlanmaya dahil olan bölgelerini tanımlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: D-mannoz bağlanmasında yer alan CVN kalıntılarını ortaya çıkaran kimyasal kayma pertürbasyonu (CSP) analizi. (A) 10 mM (üst) ve 60 mM (alt) konsantrasyonlarda D-mannoz ile titrasyon üzerine CVN'nin omurga amid (^{15 N-1}H) CSP'lerini gösteren çubuk grafikleri. Yatay çizgiler, ortalama CSP'yi ve önemli ölçüde bozulmuş kalıntıları tanımlamak için eşik olarak kullanılan bir veya iki standart sapmayı (av + sd, av + 2 sd) gösterir. (B) Disakkarit Manα1-2Manα (PDB ID: 1IIY⁴⁰) ile komplekslenmiş CVN'nin yapısı üzerine önemli ölçüde bozulmuş kalıntıların haritalanması. CSP'leri av + 2 sd eşiğinin üzerinde olan kalıntılar kırmızı renkle vurgulanır ve av + sd ile av + 2 sd arasındakiler mavi renkle gösterilir. Disakkarit Manα1-2Manα molekülleri, bağlanma konumlarını belirtmek için turuncu renkte gösterilir. (C) D-mannoz konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak CSP'leri temsil eden seçilmiş bağlanma eğrileri. Veriler_{, denklem} 5'e göre, KD'yi tahmin etmek için tek bölgeli bir bağlanma modeli olarak yerleştirildi, bu da bir dizi afinite ortaya çıkardı, D44 en güçlü etkileşimi (K_D = 1.1 ± 0.35 mM) ve E41 en zayıf etkileşimi gösterdi (K_D = 35 ± 29 mM). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: CVN içermeyen ve D-mannoza bağlı ¹⁵N-R2'nin analizi. (A, B) Enine gevşeme oranları (¹⁵N-R2) (A) serbest ve (B) D-mannoza bağlı durumlarında CVN'nin her bir kalıntısı için ölçülmüştür. (C) Kalıntı başına çizilen R₂ değerlerindeki fark (ΔR₂ = R₂^sınır- R₂^serbest). Mavi ve kırmızı çizgiler, ortalamadan sırasıyla bir ve iki standart sapmayı (av ± sd ve av ± 2 sd) temsil eder. Önemli ΔR₂ değerlerine sahip kalıntılar etiketlenir. (D) Disakkarit Manα1-2Manα ile komplekslenmiş CVN yapısı için ΔR₂ değerlerinin eşlenmesi (PDB ID: 1IIY⁴⁰). ΔR₂ av± 2 sd'nin üstünde veya altında olan kalıntılar kırmızı ile gösterilir; AV± SD ve AV± 2 SD arasındakiler mavi renkle gösterilir. D-mannoz molekülleri, bağlanma yerlerini belirtmek için turuncu renkte gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışmada, protein-glikan etkileşimlerini araştırmak için NMR deneyleri sunuldu. Protein-glikan moleküler tanıma, hücre yapışması, göç, proliferasyon ve diğer çeşitli hücresel iletişim biçimlerinin düzenlenmesi dahil olmak üzere hücre dışı matrisi (ECM) içeren çok sayıda biyolojik sürecin temelini oluşturur.

Burada, zayıf bir bağlayıcı olarak tanımlanan monosakkarit D-mannoz ile çalışmayı seçtik. Amaç, geçici etkileşimleri ölçme yöntemlerini tanımlamak ve bağlanma mekanizmalarını aydınlatmadaki önemini vurgulamaktı. Ligandın etkileşim bölgelerini karakterize etmek için üç farklı ligand tabanlı NMR yaklaşımı kullanılmıştır.

İlk yöntem, CVN varlığında D-mannozun kimyasal kayma pertürbasyonlarının (CSP'ler) değerlendirilmesini içeriyordu. Bu amaçla, CVN'ye göre 50 kat fazla D-mannoz içeren bir numunenin (Şekil 1A) ve aynı tampon koşulları altında serbest D-mannozun (Şekil 1B) 1 H-13 C-HSQC spektrumunu kaydettik. Her iki anomerik konfigürasyon için kimyasal kayma değişiklikleri gözlenmiştir (Şekil 1C). Özellikle, β-D-mannoz için daha büyük bozulmalar tespit edildi, bu da CVN'ye tercihli bağlanmayı düşündürdü.

Çoğu D-mannoz hidrojeni için, CVN varlığında spektrumlarda serbest (mavi) ve bağlı (yeşil) durumlara karşılık gelen iki farklı tepe gözlenmiştir (Şekil 1C). Bu davranış, yavaş bir değişim rejiminin karakteristiğidir (Şekil 3B), her proton için serbest ve bağlı durumlar arasındaki kimyasal kayma farkının (Δω, Hz cinsinden) döviz kurunu aştığını gösterir (kₑₓ = kaçık + kkapalı). Sadece bir hidrojen (H5β) hızlı bir değişim rejimi sergiledi. Ek olarak, α-D-mannozun anomerik protonu için CSP gözlenmedi. Buna karşılık, β-D-mannozun anomerik protonuna karşılık gelen çapraz tepe tespit edilmedi, bu da bağlanma nedeniyle ara değişimi yansıtabilir. Her iki anomerik formun bağlanmasında yer alan hidrojenler Şekil 1D'de özetlenmiştir.

Yürüttüğümüz ikinci ligand tabanlı deney, mikrosaniye zaman ölçeğinde bağlı ve serbest durumlar arasında değiş tokuş yapan ligandlar için çok uygun olan doygunluk transfer farkı (STD) NMR idi. Bu değişim rejimi, proteine göre büyük miktarda ligand ile deneylerin yapılmasına izin verir. Olgumuzda 4 mM D-mannoz ve 80 μM CVN kullandık, bu da 50 kat azı dişi fazlalığına karşılık geliyordu.

STD sonuçları CSP-mannoz verilerini tamamladı. En yüksek ASTD değerlerini sergileyen hidrojen çekirdekleri, H2β, H3β, H4β ve H6β'da belirgin bozulmalar gösteren CSP analizi ile uyumlu olarak β-D-mannoz (Şekil 2C) ile ilişkilendirildi (Şekil 1D). BirSTD, her iki molekülün ¹H nükleer spinleri arasındaki dipolar etkileşimlerin aracılık ettiği, doymuş proteinden (CVN) ligand'a (D-mannoz) manyetizasyon transferinin verimliliğini yansıtır. Bu transfer uzamsal yakınlığa bağlı olduğundan, CVN bağlanma bölgesi ile yakın temas halinde olan D-mannoz protonları için daha yüksek ASTD değerleri beklenmektedir.

Bir ligand üzerindeki etkileşim bölgelerini haritalamanın bir başka yolu, hidrojen atomlarının enine gevşeme oranlarını (1H-R2) değerlendirmektir (Şekil 3B). 1H-R2 gevşemesi, esas olarak, çoklu gevşeme yolları yoluyla komşu 1H çekirdekleri ile dipolar etkileşimler yoluyla gerçekleşir. Ligandın bir proteine bağlanması üzerine, protein hidrojenlerinin ligandınkine yakınlığı nedeniyle yeni gevşeme yolları ortaya çıkar. Bu ek yollar gevşeme verimliliğini artırarak 1H-R2 değerlerinin artmasına neden olur. Daha yüksek 1HR2 değerlerine katkıda bulunan ek bir faktör, bağlanma sırasında görünen dönme korelasyon süresindeki (τc) artıştır. Küçük, hızlı yuvarlanan bir ligand daha büyük, daha yavaş yuvarlanan bir proteinle etkileşime girdiğinde, etkili τc artar (denklem 7), bu da daha verimli enine gevşemeyi teşvik eder ve daha yüksek gözlenen 1HR2 değerlerine yol açar.

(Denklem 7)

burada görünür rotasyonel korelasyon süresi ve nerede ve sırasıyla kompleks ve ligandın korelasyon süresine karşılık gelir. Tipik olarak, ligandın yüksek 1H-R2 değerlerine sahip daha büyük bir molekül gibi davranması ile sonuçlanır. Görünen korelasyon süresi, ligandın bağlı fbağı ve fserbest molar fraksiyonlarından etkilenir. Fsınırı arttıkça artar ve 1HR2 gevşemesinin artmasına neden olur.

Bağlanma üzerine 1H-R2'deki artışa katkıda bulunan bir başka faktör, serbest ve bağlı durumlar (Rex) arasındaki kimyasal değişimden kaynaklanan katkıdır, bu da görünür enine gevşeme oranını daha da yükseltir (denklem 8).

Rex, aşağıdaki gibi açma/kapama kimyasal değişim rejimine bağlıdır (denklem 9, 10 ve 11):

(Denklem 10)

(Denklem 11)

Döviz kuru kex = kaçık + kkapalıdır, burada Δω ligandın bağlı ve serbest durumu arasındaki kimyasal kayma farkıdır (rad.s-1) ve ρ F ve ρB sırasıyla ligandın serbest ve bağlı durumlarının popülasyonlarıdır (Şekil 3B).

1HR2 haritalama sonuçlarında (Şekil 3C), ligand protonları arasında önemli farklılıklar gözlemlemedik. Tepe noktalarının çoğu değişmeden kaldı, R2 bölümü (Q) Hβ4 dışında 1'e yakındı. Q ~ 1 için olası bir açıklama, ligand protonlarının yavaş değişim rejiminde olduğu gerçeğiyle birlikte düşük bağlanma afinitesidir (yani, küçük ρB) (Şekil 1A, Şekil 3A). Bu koşullar altında, yavaş değişim rejiminde R ex, Δω2 (denklem 9) gibi ikinci dereceden bir terime bağlı olmadığından, kimyasal değişim Rex'in katkısı minimumdur.

Bu üç NMR yönteminin kombinasyonu, farklı fiziksel mekanizmalar yoluyla tamamlayıcı bilgi sağladığı için ligand-protein etkileşimlerini haritalamak için değerlidir. CSP, kimyasal kayma bozulmalarına yansıyan yerel kimyasal ortamdaki değişiklikleri tespit eder. CPMG tabanlı 1HR2 ölçümleri, ligandın dönme serbestliğinin ve serbest ve bağlı durumlar arasındaki değişimin enine gevşeme üzerindeki etkisini rapor eder. STD, ligand ve protein arasındaki doğrudan dipolar etkileşimler hakkında bilgi sağlar ve doymuş proteinden ligand'a manyetizasyon transferi ile sonuçlanır. Bu üç yaklaşımın bütünleşik yorumu, etkileşimin doğası hakkında daha kapsamlı bir anlayış sunar.

Şimdiye kadar, ligandın (D-mannoz) bağlanma davranışını haritaladık. Daha sonra, D-mannozun CVN üzerindeki bağlanma bölgesini haritalamak için protein bazlı NMR deneyleri yapıldı. İlk son derece bilgilendirici yaklaşım, çeşitli konsantrasyonlarda D-mannoz içeren bir dizi 1 H-15N HSQC spektrumunun elde edilmesiydi. Bir ligandın (D-mannoz) eklenmesiyle indüklenen 1H ve 15N kimyasal kayma bozulmaları (CSP'ler, denklem (4)), kimyasal ortamdaki ince değişikliklere karşı oldukça hassastır. En büyük bozulma, 10 mM'ye kadar olan D-mannoz konsantrasyonlarında meydana geldi (Şekil 4A, üstte); bununla birlikte, bazı kalıntılar, özellikle Gly2, CSP'de 60 mM D-mannoza kadar önemli bir değişiklik göstermiştir (Şekil 4B, alt).

D-mannozun CVN üzerindeki bağlanma davranışını anlamak için, disakkarit Manα1-2Manα40 ile komplekslenmiş CVN yapısındaki en önemli CSP'leri analiz ettik (Şekil 4B). I40, E41, N42, V43, D44 ve G45 kalıntılarını içeren β zincirinin, daha önce tarif edilen yüksek afiniteli Manα1-2Manα bağlanma bölgesine karşılık geldiği gözlendi. L1, G2, E10 ve R24 kalıntıları da dahil olmak üzere önemli CSP'ler de düşük afiniteli bağlanma bölgesinin yakınında tespit edildi. İlginç bir şekilde, bilinen Manα1-2Manα bağlanma bölgelerinin hiçbiri gözlemlenen CSP'ler tarafından tam olarak tanımlanmamıştır. Olası bir yorum, disakkarit Manα1-2Manα veya yüksek mannoz oligosakkaritten daha küçük olan D-mannozun, bağlanma bölgesinin tamamını kaplayacak kadar büyük olmadığıdır. Sonuç olarak, bağlanması daha düşük afinite ile gerçekleşir.

Bu yorum, D-mannozun tercihen yüksek afiniteli bağlanma bölgesi içindeki β iplikçikteki (40-44) kalıntılara ve düşük afiniteli bölge içindeki L1, G2, E10 ve R24 kalıntılarına, sadece geçici olarak da olsa, bağlandığını göstermektedir. Bu geçici etkileşim aynı zamanda CVN'nin düşük afiniteli (kalıntı 1-39) ve yüksek afiniteli (kalıntı 40-90) alanları arasındaki arayüzde bulunan H90 ve W49 gibi kalıntıları da bozar. Bu gözlemler, D-mannoz bağlanmasının, allosterik yapısal değişiklikleri teşvik ederek veya geçici karşılaşma kompleksleri oluşturarak, iyi tanımlanmış bağlanma bölgelerinden uzak kalıntılarda bozulmalara neden olabileceğini düşündürmektedir.

İkinci olasılık, düşük afiniteli ligandlarla etkileşimleri incelemenin önemli bir avantajını vurgulamaktadır. NMR spektroskopisi, sınır durum popülasyonu düşük olduğunda bile ince kimyasal kayma bozulmalarını ve doygunluk transfer etkilerini yakalayabildiğinden, bu tür geçici, düşük afiniteli etkileşimleri tespit etmek için özellikle uygundur. Bu özellikler, sıkı veya kararlı kompleks oluşumu gerektiren tekniklerle erişilemeyebilecek karşılaşma komplekslerinin ve zayıf bağlanma olaylarının tespit edilmesini sağlar. Bu bağlamda, NMR, doğrudan bağlanma bölgesinin ötesine uzanan değerli yapısal ve dinamik içgörüler sağlar 41,42.

Ayrıca, D-mannoz konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak tek tek kalıntıların CSP'lerini çizerek bağlanma izotermlerini analiz ettik (Şekil 4C). Özellikle, yüksek afiniteli bağlanma bölgesini oluşturan β iplikçik (40-44) içindeki kalıntılar, yaklaşık 7mM'lik bir ortalama KD sergiledi. Bunlar arasında, kalıntı D44, 1.1 ± 0.35 mM'likbir KD ile özellikle daha yüksek bir afinite gösterdi ve bu da ligand bağlanmasında önemli rolünü gösterdi. D-mannoz için gözlenen bağlanma afinitesi, yüksek afinite bölgesinde 139 nM ve düşük afinite 40 bölgesinde 1.47 μM'lik birKD'ye sahip olan disakkarit Manα1-2Manα için bildirilenden yaklaşık5000 kat daha düşüktür.

CVN üzerindeki D-mannoz bağlanma bölgesini haritalamak için kullanılan başka bir yaklaşım, ligandın yokluğunda (Şekil 5A) ve varlığında (Şekil 5B) 15N-R2 gevşeme oranlarının ölçülmesiydi. Bağlamanın etkilerini vurgulamak için, olarak tanımlanan ΔR2 değerlerini (Şekil 5C) hesapladık ve her iki koşuldan deneysel hatanın yayılmasını dikkate aldık. Bu analiz, dinamik NMR verilerini yorumlarken ölçüm belirsizliğini tahmin etmenin önemini vurgulamaktadır.

Ligand ilavesi üzerine 15N-R2'deki değişiklikler çeşitli nedenlerle meydana gelebilir. R2'deki bir artış, kompleksin daha yüksek τc'sinden veya ligand ile açma-kapama dengesinden kaynaklanan konformasyonel ve kimyasal değişim katkılarından (Rex) kaynaklanabilir. Tersine,R2'de azalmalar da gözlenebilir. Ligand bağlanmasının konformasyonel bir seçim mekanizmasını takip ettiği durumlarda, Rex genellikle ligand ilavesi üzerine azalır ve bu da azalan değişim dinamiklerini yansıtır.

Bu nedenle, yayılan deneysel hatayı aşan hem pozitif hem de negatif ΔR2 değerleri, ligand bağlanmasında yer alan bölgeleri tanımlamak için kullanılabilir.

Ligand konsantrasyonu, bu verilerin yorumlanmasında bir diğer kritik faktördür. Doymuş konsantrasyonlarda, bağlanma, konformasyonel ve kimyasal değişim katkılarını baskılama eğilimindedir, bu da Rex'te bir azalmaya ve sonuç olarak daha küçükR2 değerlerine yol açar. Bu koşullar altında, CSP'ler de tipik olarak maksimum değerlerine ulaşır. Buna karşılık, alt doygunluk konsantrasyonlarında, önemli bir ligand açma-kapama dengesi vardır, bu da Rex'in yükselmesine ve CSP'lerin ara değerlerine ulaşılmasına neden olur. Hem ΔR2 hem de CSP verileri analiz edilirken bu konsantrasyona bağlı etkiler dikkate alınmalıdır.

D-mannozun CVN'ye bağlanma davranışını daha iyi anlamak için, CVN-Manα1-2Manα disakkarit kompleks yapısı bağlamında en önemli ΔR2 değişikliklerini gösteren kalıntıları analiz ettik (Şekil 5D). Kalıntılar C58, R59, K74 ve R76, belirginΔR2 değerleri sergiledi ve Manα1-2Manα için yüksek afiniteli bağlanma bölgesine karşılık geldi. Ek olarak, F4, C8, R24, G27, G28, A92 ve G96 kalıntıları da önemli ΔR2 gösterdi ve düşük afiniteli bağlanma bölgesinin bir parçası.

İlginç bir şekilde, ΔR2 analizi, CSP'lerden elde edilenlere tamamlayıcı bilgiler sağladı ve her iki bağlanma bölgesi ile D-mannoz etkileşimlerine dair bağımsız kanıtlar sundu.

Bilinen bağlanma bölgelerinden uzakta bulunan diğer kalıntılarda da ΔR2 değişiklikleri gözlemledik. Bu kalıntılar esas olarak proteinin merkezi bölgesinin yakınında, yüksek ve düşük afiniteli alanlar arasındaki arayüzde bulunur (Şekil 5C). Makul bir yorum, D-mannoz bağlanmasının ince allosterik yapısal yeniden düzenlemelere neden olduğudur. Alternatif olarak, gözlemlenen etkiler, ligand tanıma sırasında ilk karşılaşma kompleksinin bir parçasını oluşturan geçici etkileşimleri yansıtabilir.

Yazarlar rekabet eden çıkarları olmadığını beyan ederler.