Yöntem makalesi

Protein Düzenekleri Arasındaki Dinamik Değişimi Analiz Etmek için FRET Seyreltme Testi

DOI:

10.3791/68678

⸱

19 Eylül 2025

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology and the Institute for Collaborative Biotechnologies, University of California, Santa Barbara

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, reflektin A1'in saflaştırılması ve kovalent etiketlenmesinin yanı sıra, yaşın bir fonksiyonu olarak protein düzenekleri arasındaki dinamik reflektin proteini değişimini karakterize etmek için bir FRET seyreltme testini açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kafadanbacaklılarda ayarlanabilir yanardönerlik için moleküler itici güç olarak, reflektin A1 proteininin ayarlanabilir faz davranışı, biyomalzeme mühendisliğinin odak noktası olmaya devam ediyor. Reflektin A1'in tuz konsantrasyonunu ve protein net yük yoğunluğunu modüle etmek, proteini sıvı-sıvı faz ayrımına ara ürünler olarak dinamik düzenekler oluşturmaya yönlendirir. Reflektin düzenekleri, proteinin katyonik, Coulombik itmesinin yük nötralizasyonunun derecesi ile boyut olarak sınırlı olsa da, başlangıçta çevreleyen çözeltiden monomerler veya oligomerler ile dinamik değişim halindedir. Dinamik ışık saçılımı (DLS) ve protein konsantrasyonu deneyleri ile birlikte, yansıma A1 düzenekleri ile seyreltik bir faz arasındaki iki yönlü protein akışını karakterize etmek için yeni bir floresan rezonans enerji transferi (FRET) seyreltme testi kullanıldı. Bu FRET seyreltme testi, protein düzeneklerinin içine ve dışına tek yönlü ve iki yönlü protein akışı arasında ayrım yapar ve bu nedenle düzenek oluşumu sırasında uygulanabilir. Dinamik ve kinetik olarak tutuklanmış protein düzenekleri arasında ayrım yapmak, biyofiziksel kökenlerini anlamak için çok önemlidir ve bu yeni FRET seyreltme testi, diğer protein düzeneklerinin biyofiziksel araştırmalarını desteklemek için uyarlanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Loliginid kalamarında ayarlanabilir yanardönerliğe, iridosit hücrelerindeki 1,2,3 reflektin proteinleri aracılık eder. İridositler, ışığı açıya ve dalga boyuna bağlı bir şekilde yansıtan protein yoğun Bragg lamel yığınları oluşturan geniş ve düzenli membran istilaları içerir 1,4,5,6. Asetilkolin ile tetiklenen bir sinyal kaskadı, katyonik reflektin proteinlerinin 1,2,7 fosforilasyonu ile sonuçlanır, protein içi ve proteinler arası elektrostatik itmeyi azaltır ve Bragg lamellerindeki reflektinlerin yoğunlaşmasını 10-50 nm hidrodinamik yarıçaplı parçacıklardan yoğun bir sıvı kondensata 3,8,9 yönlendirir. Reflectin A1 in vitro boyutları, protein net yük yoğunluğu 10,11,12 tarafından hassas bir şekilde ayarlanan, boyuta dayanıklı10+ nm yarıçaplı düzenekler oluşturur ve bu ayarlanabilir kolloidal davranış, reflektin bazlı ayarlanabilir biyofotonik malzemelerin tasarımında biyomühendislikte çok fazla ilgi toplamıştır 13,14,15,16,17,18. Yakın zamanda, NaCl'nin, hidrofobik etkinin enerjik katkısını entropik olarak artırarak ve alternatif katyonik bağlayıcıların19 itici yüklerini tarayarak A1 düzeneğini ve LLPS'yi (Sıvı-Sıvı faz ayrımı) yansıttığı gösterilmiştir.

Protein yoğun sıvı benzeri kondensatlar için, yoğun faz ve seyreltik faz arasındaki dinamik değişim, tam damlacık FRAP (Fotoağartma Sonrası Floresan Geri Kazanımı)20 kullanılarak kolayca analiz edilebilir; nanometre ölçekli protein düzenekleri için benzer bir tahlil gereklidir. LLPS19,21,22'nin ara ürünleri olarak fizyolojik olarak ilgili protein düzeneklerinin son raporları, düzenek dinamiklerini ve düzenekler ile bir arada var olan seyreltik faz arasındaki dinamik alışverişi sorgulamak için eşdeğer yöntemlere ihtiyaç duyulduğunu öne sürdü. Protein kümeleri, durdurulmuş spinodal ayrışma ile üretilen kinetik olarak tutuklanmış cam benzeri kolloidleri, seyreltik fazdan monomerleri veya oligomerleri değiştiren dinamik denge düzeneklerini ve yarı kararlı kümeleri 23,24,25,26,27 içerebilir. Bu nedenle yaşa bağlı protein düzeneği dinamikleri, daha karmaşık faz davranışı bağlamında protein düzeneklerinin oluşumunu yönlendiren fiziksel süreçleri anlamanın anahtarıdır.

Donör florofor etiketli protein düzenekleri ile alıcı-florofor etiketli protein düzenekleri arasındaki etkileşimi analiz eden FRET tabanlı yaklaşımlar, yarı kararlı protein kümelerinin21 dinamiklerini karakterize etmek için kullanılmıştır. Bu kümelerin karıştırılması üzerine, FRET'in ortaya çıkışı, proteinin kümelere21 değişimini ve taşınmasını gösterir. Bununla birlikte, reflectin A1 gibi bazı proteinler için, deney19 süresince sürekli olarak kümeler oluşur ve büyür. Bu tür proteinler için, dinamik olarak durdurulan kümelerin sürekli oluşumu sırasında meydana gelebileceği gibi, proteinin kümeler halinde tek yönlü taşınmasını ve düzenekler arasında proteinin iki yönlü taşınmasını çözen bir yaklaşıma ihtiyaç vardır.

Bir FRET seyreltme yaklaşımı bunu, FRET'teki bir azalmanın düzenekler arasında proteinin iki yönlü taşınmasını ifade ettiği florofor seyreltme (Şekil 1) yoluyla gerçekleştirir. Alıcı-florofor veya donör-florofor ile etiketlenmiş eşit miktarda protein içeren reflektin proteininin protein düzenekleri hazırlandı. Bu ortak etiketli reflektin düzenekleri, etiketlenmemiş reflektin düzenekleri içeren bir çözelti ile seyreltildi ve düzenekler arasındaki dinamik protein değişimi, düzenek yaşının bir fonksiyonu olarak analiz edildi. Bu yöntem, kinetik olarak durdurulan protein kümelerinin sürekli oluşumunu, yarı kararlı kümeler, Ostwald olgunlaşması veya benzeri kabalaştırma süreçleri nedeniyle büyüyen kümeler, füzyonla büyüyen kümeler ve LLPS'nin ara ürünleri olmayan kümeler dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere dinamik kümelerden ayırır. Dinamik ışık saçılımı, nanopartikül izleme analizi (NTA) ve Bradford tahlilleri19,21 gibi ortogonal yöntemler gerektiren bu farklı dinamik değişim mekanizmaları arasında tek başına ayrım yapmaz. Bu protokol, reflektin A1 vahşi tipinin ve tek sistein içeren mutant A1-C232S'nin saflaştırılması, A1-C232S'nin kovalent etiketlenmesi ve FRET seyreltme analizi için yöntemleri açıklar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Protein saflaştırma ve kovalent etiketleme

  1. Dönüşüm
    1. Klon reflektin A1 ve reflektin A1 C232S genleri (GenBank KF661517.1) pj411 plazmitlerine yansıtın.
    2. Isı şoku tedavisi kullanılarak plazmitli transfekte Rosetta 2 (DE3) hücreleri28.
    3. Plaka transfekte edilmiş hücreler, 50 μg/mL kanamisin içeren agar üzerine yerleştirildi.
    4. İzole edilmiş bir koloni seçin ve 50 μg/mL kanamisin içeren 5 mL TB'ye (Müthiş Et Suyu) ekleyin ve gece boyunca 250 rpm'de bir çalkalayıcıda 37°C'de inkübe edin.
    5. Dizileme için plazmit izolasyon kiti protokolünü kullanarak plazmitleri izole edin.
  2. Protein ekspresyonu, lizis ve inklüzyon vücut saflaştırması
    1. 50 μg/mL kanamisin ile 1 L LB'ye (Lizojeni Et Suyu) 5 mL kültür ekleyin ve çalkalayarak 37°C'de inkübe edin. 0.6-0.7'lik bir A600'de , 5 mM'lik bir nihai konsantrasyona IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktopiranosid) ekleyerek ekspresyonu indükleyin.
    2. 16 saat sonra, pelet hücreleri 10 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjlendi. Süpernatantı boşaltın ve hücre peletlerini -80 ° C'lik bir dondurucuda dondurun.
    3. Hücre peletinin ilk yeniden süspansiyonundan sonra mL inklüzyon cisimciği saflaştırma reaktifi başına 1 μL (25-29 ünite) benzonaz ve 3-5 KU lizozim ile 20 dakikalık işlem dahil olmak üzere, üreticinin protokolüne göre inklüzyon cisimciği saflaştırma reaktifi kullanarak hücreleri lize edin ve inklüzyon cisimciklerini saflaştırın. Saflaştırılmış inklüzyon gövdeleri koyu kahverengi topaklar olarak görünecektir.
  3. FPLC (Hızlı Protein Sıvı Kromatografisi)
    1. 2 L 8 M üre: %5 v/v asetik asit çözeltisi (Tampon A) ve 1 L 8 M guanidinyum hidroklorür: %5 v/v asetik asit çözeltisi (Tampon B) hazırlayın. Her ikisini de 0,22 μm vakumlu şişe filtresi kullanarak filtreleyin.
      DİKKAT: Guanidinyum hidroklorür ile soluma, göz ve cilt temasından kaçının ve kullanım sırasında uygun KKD (Kişisel Koruyucu Ekipman) kullanın. Özel bir atık kabına atın.
    2. İnklüzyon gövdesi peletlerini 8 M üre: %5 asetik asit çözeltisi içinde manyetik bir karıştırma çubuğu ile kuvvetlice karıştırarak yeniden süspanse edin. Çözüm bulanık görünecektir. Santrifüjü 4 °C'ye önceden soğutun, 18.000 x g'da 4 °C'de 70 dakika santrifüjleyin ve FPLC için süpernatan toplayın. Süpernatan kahverengi ve şeffaf görünecektir.
    3. Aşağıdaki tüm adımlar için 2 mL/dak'lık bir akış hızı kullanarak, katyon değişim kolonunun 10 mL'sini %95 Tampon A, %5 Tampon B'den oluşan 5 kolon hacmi (CV) ile dengeleyin ve numuneyi yükleyin. Bağlanmamış numuneyi 5 CV ile yıkayın, ardından adım gradyanını gerçekleştirin: 5 CV %94 Tampon A/%6 Tampon B, ardından 5 CV %10 Tampon B. Reflectin A1, %10 Tampon B'de ayrıştırır.
    4. SDS-PAGE ile %10 Tampon B'ye ilk adım değişikliğine karşılık gelen fraksiyonların saflığını değerlendirin ve benzerse havuzlayın. Bir santrifüjü 4 °C'ye önceden soğutun ve 15 mL 10 kDa MWCO spin yoğunlaştırıcı kullanarak fraksiyonları 4-5 mL'lik bir nihai hacme konsantre edin.
  4. HPLC (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi)
    1. %0,1 trifloroasetik asit (TFA) ile 2 L 18 mΩ su ve %0,1 TFA ile 2 L asetonitril hazırlayın. Her ikisini de 0,22 μm vakumlu şişe filtresi kullanarak filtreleyin.
      DİKKAT: TFA güçlü bir dumanlı asittir. Uygun KKD giyerek çeker ocakta tutun ve yalnızca cam kullanarak aktarın. Asetonitril ile soluma, göz ve cilt temasından kaçının ve kullanım sırasında uygun KKD kullanın. Özel bir atık kabına atın.
    2. Aşağıdaki tüm adımlar için 1 mL/dak akış hızı kullanarak, C4 kolonunu %85 18 mΩ su, %0,1 TFA ve %15 asetonitril, %0,1 TFA'dan oluşan 5 CV ile dengeleyin.
    3. Akmaya başlayın ve numuneyi enjekte edin. 2 CV akıtın, ardından 5 CV üzerinde %80 asetonitril, %0,1 TFA'ya sabit gradyana başlayın. Reflectin A1 tipik olarak %73 asetonitrilde ayrıştırılır.
    4. Etanol ve kuru buz banyosu kullanılarak 5 mL'lik tüplerde reflektin proteini içeren kabuk dondurma fraksiyonları. Liyofilize edin ve - 80 °C'de saklayın. Protein ince beyaz tabakalar halinde görünecektir.
  5. Etiketlenmemiş protein stoğu hazırlama
    1. Buzlu asetik asit ve sodyum asetat trihidrat kullanarak 4 L pH 4, 25 mM asetik asit tamponu (21.05 mM asetik asit, 3.95 mM sodyum asetat trihidrat) hazırlayın. Gerekirse pH'ı 4 M HCl veya 4 M NaOH ile ayarlayın. 0,22 μm vakum filtresi kullanarak filtreleyin.
      DİKKAT: Güçlü asitleri/bazları uygun KKD giyerek kullanın. Konsantre kuvvetli asit veya baza asla su eklemeyin.
    2. Liyofilize reflektin proteini içeren tüpü çözün ve tüp bir buz banyosunda pH 4, 25 mM asetik asit tamponu ile yeniden çözündürün. Tamamen çözünmüş bir protein çözeltisi, görünür bulanıklık veya çökelti olmaksızın renksiz görünecektir.
      1. 10 kDa moleküler ağırlığı kesilmiş diyaliz kaseti kullanılarak, 4 °C'de 12 saatlik iki değişiklik kullanılarak 4 °C'ye önceden soğutulmuş 1000x pH 4, 25 mM asetik asit tamponu numune hacminde resolubilize edilmiş reflektin proteinini diyalize eder.
    3. 100 μM'lik bir nihai protein konsantrasyonu ve en az 150 μL'lik bir nihai hacim elde etmek için numuneyi pH 4, 25 mM'lik bir asetik asit tamponu ile seyreltin. Bir UV-VIS spektrometresi ile absorbansı 280 nm'de ölçün ve protein konsantrasyonunu belirlemek için reflektin A1'in (123.685 M-1 cm-1) molar absorpsiyon katsayısını29 kullanın.
    4. Reflektin protein stoğunu 0,5 mL'lik geçmeli kapaklı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de 7 güne kadar saklayın. Deneylerden hemen önce, santrifüj, protein stokunu 4 °C'de 18.000 x g'da 15 dakika boyunca önceden soğutulmuş bir mikrosantrifüjde yansıtır. 123.540 M-1 cm-1 molar absorpsiyon katsayısını kullanarak reflektin A1 C232S stoğunu benzer şekilde hazırlayın.
  6. Protein etiketleme
    1. 10 mg floresan prob ve pipet karışımı içeren bir şişeye 1 mL kuru dimetil-sülfoksit (DMSO) ekleyerek 10 mg / mL FMTS (floresein-metantiyosülfonat) ve SRMT (sülforhodamin metantiyosülfonat) stoklarını ayrı ayrı hazırlayın.
      DİKKAT: Metanitiyosülfonat reaktiflerinin solunması, göz ve cilt temasından kaçının.
    2. 150 μL'lik bir nihai hacme ve 500 μM FMTS veya SRMT'nin nihai konsantrasyonuna bir pH 4, 25 mM asetik asit tamponuna 10 mg/mL FMTS stoğunun 7,7 μL'sini veya 10 mg/mL SRMT stoğunun 10,4 μL'sini ekleyin. Çözüm bulanık görünecektir. Floresan prob stoklarının geri kalanını -80 °C'de ayırın ve dondurun.
    3. 150 μL 100 μM reflektin protein stoğu ile birleştirin ve iyice pipetleyin. Nihai protein konsantrasyonu 50 μM'dir ve nihai floresan prob konsantrasyonu 500 μM'dir. Çözeltinin bulanıklığı azalacaktır.
    4. Folyoya sarın ve oda sıcaklığında 4 saat, ardından gece boyunca 4 °C'de hafifçe orbital karıştırarak dik olarak inkübe edin. Çözeltinin bulanıklığı değişmemelidir.
    5. Herhangi bir çökelti varsa, kuvvetli pipet karıştırarak yeniden süspanse edin. Çözüm bulanık olacak. 10.000 kDa MWCO santrifüj filtre kullanarak reflektini 100 μL hedef hacme ve 150 μM konsantrasyona konsantre edin.
    6. Bağlanmamış floresan probu çıkarmak ve proteini folyoya sarılmış olarak -80 °C'de saklamak için protein saflaştırmasıyla aynı HPLC ve liyofilizasyon yöntemini kullanın. Etiketlenmemiş protein için aynı yöntemi kullanarak etiketli proteini yeniden çözündürün. Etiketleme derecesini belirleyin.
      NOT: Yeniden çözünür floresan etiketli reflektin proteini, bulanıklık veya çökelme olmadan sarı-yeşil (C199-F) veya koyu kırmızı (C199-R) görünecektir.
  7. Birlikte etiketlenmiş protein stoğu hazırlama
    1. 0,5 mL'lik geçmeli kapaklı bir mikrosantrifüje 27 μL 100 μM A1 protein stoğu ekleyin.
    2. Aynı tüpe 1.5 μL floresein etiketli reflektin A1-C232S (floreseinin amino asit konumunu belirtmek için C199-F olarak anılır) ekleyin.
    3. Aynı tüpe 1.5 μL sülforhodamin etiketli reflektin A1-C232S (floreseinin amino asit pozisyonunu belirtmek için C199-R olarak anılır) ekleyin. Nihai konsantrasyonlar 90 μM A1, 5 μM C199-F ve 5 μM C199-R'dir.
    4. Folyoya sarın ve 4 °C'de 7 güne kadar saklayın.

2. FRET zaman serisi

  1. Tamponların hazırlanması ve filtrasyon
    1. 500 mL 25 mM 3-(N-morfolino)propansülfonik asit (MOPS) tamponu hazırlayın. 4 M sodyum hidroksiti yavaşça ekleyerek çözeltinin pH'ını 7'ye ayarlayın. 10 mL'lik bir şırınga ve 0,22 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak 10 mL'yi filtreleyin.
  2. Santrifüj proteini
    1. Masa üstü mikrosantrifüjü 4 °C'ye kadar önceden soğutun. Etiketsiz ve birlikte etiketlenmiş reflektin A1 stoklarını 4 °C'de 15 dakika boyunca 18.000 x g'da santrifüjleyin.
  3. Etiketli A1 montajlarını hazırlama
    1. Üç kopya hazırlamak için, 9,6 μL MOPS tamponunu (pH 7, 25 mM) üç adet 0,5 mL'lik geçmeli kapaklı mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
    2. Halihazırda 9,6 μL MOPS tamponu içeren her tüpe 4 μM'lik bir nihai protein konsantrasyonuna kadar 0,4 μL etiketli protein stoğu ekleyin. Yavaşça pipetleyin, tüm numune hacmini aspire ederek ve dağıtarak iki kez karıştırın.
    3. Hemen kalay folyoya sarın ve 25 °C'de inkübatöre yerleştirin. Bu ve sonraki tüm düzenek çözeltileri, inkübasyondan önce veya sonra belirgin bulanıklık veya çökelmeden yoksundur.
  4. Etiketlenmemiş A1 montajlarını hazırlama
    1. Üç kopya hazırlamak için, 38,4 μL MOPS tamponunu üç adet 0,5 mL'lik geçmeli kapaklı mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
    2. Halihazırda 38.4 μL MOPS tamponu içeren her tüpe 4 μM'lik bir nihai protein konsantrasyonuna 1.6 μL reflektin A1 protein stoğu ekleyin. Tüm numune hacmini aspire ederek ve dağıtarak yavaşça pipetle karıştırın.
    3. Hemen kalay folyoya sarın ve 25 °C'de inkübatöre yerleştirin.
  5. Ortak etiketli ve etiketsiz A1 düzeneklerinin zamanlaması ve karıştırılması
    1. Montajların hazırlanmasını aşağıdaki gibi sıralayın: aynı anda ve ayrı ayrı deneysel bir ortak etiketli reflektin ve deneysel bir etiketsiz reflektin montajları hazırlayın. 2.3 ve 2.4 adımlarını tekrarlayın.
    2. İlgili ortak etiketli deneye 40 μL etiketsiz A1 düzeneği deneysel ekleyerek karıştırın ve tüm hacmi iki kez aspire ederek ve dağıtarak karışımı hafifçe pipetleyin. Ölçümler bu adımdan 24 saat sonra yapılacaktır.
    3. Reflectin A1'in MOPS tamponuna (pH 7, 25 mM) seyreltilerek sürülmesi ile etiketli ve etiketsiz düzeneklerin karıştırılması arasındaki süre, montaj yaşıdır. Bu veriler için kullanılan derlemelerin yaşları 0 dakika, 1 dakika, 10 dakika, 30 dakika, 60 dakika, 120 dakika, 180 dakika, 540 dakika, 1080 dakika ve 1620 dakika idi.
  6. Denetim
    1. Pozitif kontrol
      1. A1 ve etiketli protein stoklarından, 80 μM A1 ve 20 μM ortak etiketli protein stoğu olan 20 μL protein stoğu hazırlayın.
      2. 0,5 mL'lik geçmeli kapaklı mikrosantrifüj tüplerine 38,4 μL MOPS tamponu ekleyin, ardından 1,6 μL 80 μM A1/20 μM etiketli protein ekleyin ve pipet karışımını yavaşça aspire ederek ve tüm hacmi dağıtarak iki kez karıştırın. Hemen folyo ile örtün ve 25 °C'de inkübatöre yerleştirin. Toplam 9 örnek için tekrarlayın.
    2. Negatif kontrol
      1. Halihazırda 9,6 μL MOPS tamponu içeren 0,5 mL'lik geçmeli kapaklı bir mikrosantrifüj tüpüne 0,4 μL etiketli stok ekleyin. Tüm numune hacmini aspire ederek ve dağıtarak yavaşça pipetle karıştırın.
      2. 40 μL MOPS tamponu ekleyin ve pipetleyin, tüm numune hacmini aspire ederek ve dağıtarak iki kez karıştırın. Hemen folyo ile örtün ve 25 °C'de inkübatöre yerleştirin. Toplam 9 örnek için tekrarlayın.
  7. Küvet ve tampon boşluğu
    1. Florimetreyi 488 nm'de uyaracak ve 520-700 nm arasında sürekli spektrumları kaydedecek şekilde ayarlayın.
    2. Temiz bir kuvars alt mikro florimetre küvetini 50 μL MOPS tamponu (pH 7, 25 mM) ile doldurun ve ölçün.
    3. Tamponu kaldırın.
  8. Deneyin yapılışı
    NOT: Tüm deneyler, birlikte etiketlenmiş ve etiketsiz yansıtıcı A1 düzeneklerini karıştırdıktan 24 saat sonra kaydedilmelidir. Deney çözeltisinin 50 μL'sini küvete yavaşça pipetleyin ve ölçün.
    1. Numuneyi çıkarın, 500 μL asetik asit tamponu ile durulayın, ardından 500 μL 0.22 μm filtrelenmiş 18 mΩ su ile durulayın. Boş arabellek gerçekleştirin.
  9. Denetim
    1. Kontrolleri hazırladıktan sonra 1440 dk, 1960 dk ve 3060 dk'da ölçün (0 dk, 520 dk ve 1620 dk'lık montaj yaşlarına karşılık gelir). Bu ölçümler protokolün deneysel kısmını tamamlamaktadır.

3. Veri analizi

  1. Tampon boşluğunun spektrumlarını deneysel spektrumlardan çıkarın.
  2. Em588/Em520 oranını belirleyin.
  3. Her kopya için, üç kopyadan oluşan her grubun ortalamasını ve standart sapmasını belirleyin. Montaj yaşının bir fonksiyonu olarak Em588/Em520'yi çizin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hem donör florofor etiketli protein hem de alıcı florofor etiketli protein içeren reflektin A1 düzeneklerinin etiketlenmemiş reflektin A1 düzenekleri ile seyreltilmesinden sonra, seyreltilmemiş düzeneklere göre 588 nm'de FRET emisyonunda bir başlangıç düşüşü gözlendi (Şekil 2A). 0 dakikalık düzenekler için FRET, pozitif kontrole benzerdi ve 1620 dakikalık düzenekler için FRET (düzenek oluşumu ile etiketlenmemiş ve etiketli reflektin düzeneklerinin karıştırılması arasındaki süre) negatif kont...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Saflaştırma sırasında protein kaybının ortak bir noktası, inklüzyon cisimciği saflaştırma protokolündeki tüm adımlar için inklüzyon cisimciği peletlerinin eksik yeniden süspansiyonu ve saflaştırılmış inklüzyon cisimciklerinin 8 M üre %5 v/v asetik asit içinde nihai olarak yeniden süspansiyonudur. İnklüzyon gövdesinin yeniden çözünürlüğü, 40 mL'lik konik bir tüpte küçük bir manyetik karıştırma çubuğu ile 24 saate kadar kuvvetli karıştırma gerektirebilir. Filtrelerde önemli protein kaybını...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Araştırma, ABD Ordusu Araştırma Ofisi'nden W911NF-19-2-0026 ve W911NF-23-1-0330 hibeleri aracılığıyla İşbirlikçi Biyoteknolojiler Enstitüsü tarafından desteklendi. Bilgilerin içeriği mutlaka Hükümetin konumunu veya politikasını yansıtmaz ve resmi bir onay olduğu sonucuna varılmamalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 μ L kapasiteli mikropipet
2 μ L kapasiteli mikropipet
2-[(5-Floresceinil)aminokarbonil]etil MetantiyosülfonatSanta Cruz BiyoteknolojileriSC-216155 (İngilizce)CAS  351330-42-2
20 μ L kapasiteli mikropipet
200 μ L kapasiteli mikropipet
3-(N-Morfolino)propansülfonik asit, 4-Morfolinpropansülfonik asitSigma-AldrichM1254 SerisiCAS 1132-61-2 (İngilizce)
Asetik asitSigma-AldrichA6283 SerisiCAS 64-19-7 (İngilizce)
AsetonitrilSigma-Aldrich34851-1LCAS 75-05-8 (İngilizce)
Agar tozuCarolina Biyolojik842133CAS 9002-18-0 (İngilizce)
Alüminyum folyo
Amicon Ultra Santrifüj Filtre, 10 kDa MWCOMillipore SigmaUFC5010080,5 ml kapasite
Amicon Ultra Santrifüj Filtre, 10 kDa MWCOMillipore SigmaUFC90100815 ml kapasite
Analitik terazi
BenzonazMillipore-Sigma70664-3CAS 9025-65-4 (İngilizce)
BugBuster Protein Ekstraksiyon ReaktifiMillipore Sigma70584-3
Cary Eclipse Floresan SpektrometresiCary-Tutulma
Cary Eclipse Yazılımı
Corning 50 ml santrifüj tüpleriMillipore-SigmaCLS430829
Tek kullanımlık şırıngalar, Luer-Lok 10 mLCole-ParmerUX-12915-02 (İngilizce)
DMSO'nunSigma-AldrichD8418 SerisiCAS 67-68-5 (İngilizce)
Kuru Buz
Çift pompalı FPLC sistemi
Çift pompalı HPLC sistemi
EtanolMillipore SigmaEX0280-3CAS 64-17-5
Yerde duran santrifüj rotoru 500 ml flakon kapasitesi
Zemin ayakta santrifüj 
Dondurucu, -80&derece; C
Davlumbaz
Guanidin hidroklorürTermo BilimselAAA135430B50-01-1
HiTrap SP HP katyon değişim kromatografi kolonuCytiva17115101
Hidroklorik asitSigma-Aldrich258148-25MLCAS 7647-01-0 (İngilizce)
Kuvöz
İzopropil β-D-1-tiogalaktopiranosidSigma-AldrichI6758-1G
Kanamisin sülfatSigma-AldrichK1637 SerisiCAS 25389-94-0 (İngilizce)
Liyofilizatör
LizozimTermo Bilimsel90082
Manyetik karıştırma çubuğu
Manyetik karıştırma plakası
Mikro pH elektrodu S7Metler Toledo51343160
Sıcaklık kontrollü mikrosantrifüj
Millex PVDF şırınga filtresiKırlangıçSLGVR33RS0.22 μ m, 33 mm çap.
Milli-Q Millipak FiltreMillipore SigmaMPGP002A1
Milli-Q UltraPure Su Arıtma SistemiMillipore Sigma
NaClTermo BilimselAA12314A9CAS 7647-14-5 (İngilizce)
Nalgene santrifüj şişeleri, stil 3120Millipore-SigmaB1283-4EA SerisiBakterileri peletlemek için
Orbital lab  İnkübatörlü çalkalayıcı
Kişisel bilgisayar
Petri kaplarıSigma-AldrichP5731-500EA Serisi
PJ411 plazmitDNA 2.0
Protein LoBind  Konik BorularEppendorf BelediyesiEP301083025 ml kapasite
Protein LoBind  Mikrosantrifüj TüpleriEppendorf BelediyesiEP0224311020,5 ml kapasite
Pyrex şaşkın Erlenmeyer şişesi 1.000 mlMillipore-SigmaCLS44501Bakteri kültürlerini inkübe etmek için
Pyrex Griffin kapları 2.000 mLMillipore-SigmaCLS10002LTüm tampon ve çözelti hazırlığı için 
Pyrex yuvarlak ortam saklama şişeleri 1.000 mlMillipore-SigmaCLS13951LTüm tampon ve çözelti hazırlığının saklanması için vakumlu şişe filtreleriyle kullanın
Qiaprep Spin Miniprep KitiQiagen27104
Buzdolabı
Rosetta 2(DE3) Yetkin HücrelerNovagen71397-3
Slide-a-lyzer Diyaliz Kasetleri 10K MWCOTermo BilimselPI663830,5 ml kapasite
Sodyum asetat trihidratSigma-AldrichS8625 SerisiCAS 6131-90-4 (İngilizce)
Sodyum hidroksitSigma-Aldrich567530-250GMCAS 1310-73-2 (İngilizce)
Steritop Vakumlu Şişe Üstü FiltreMillipore SigmaS2GPT05RE0.22 μ m steril filtre
Alt mikroküvet, 50 uL kapasiteStarna Hücreleri16.40F-Q-10/Z15
sülforhodamin metantiyosülfonatSanta Cruz BiyoteknolojileriSC-220172CAS  386229-71-6
Trifloroasetik asitSigma-Aldrich106232-25GCAS 407-25-0
TriptonSpectrum Kimyasal T1333 Serisi
ÜreTermo BilimselAAA123600ECAS 57-13-6 (İngilizce)
UV-VIS spektrometresi
Maya ÖzüGibco211929

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeMartini, D. G., Izumi, M., Weaver, A. T., Pandolfi, E., Morse, D. E. Structures, organization, and function of reflectin proteins in dynamically tunable reflective cells. J Biol Chem. 290 (24), 15238-15249 (2015).
  2. Izumi, M., et al. Changes in reflectin protein phosphorylation are associated with dynamic iridescence in squid. J R Soc Interface. 7 (44), 549-560 (2010).
  3. Tao, A. R., et al. The role of protein assembly in dynamically tunable bio-optical tissues. Biomaterials. 31 (5), 793-801 (2010).
  4. Ghoshal, A., DeMartini, D. G., Eck, E., Morse, D. E. Optical parameters of the tunable Bragg reflectors in squid. J R Soc Interface. 10 (85), 20130386(2013).
  5. Ghoshal, A., DeMartini, D. G., Eck, E., Morse, D. E. Experimental determination of refractive index of condensed reflectin in squid iridocytes. J R Soc Interface. 11 (95), 20140106(2014).
  6. Ghoshal, A., Eck, E., Gordon, M., Morse, D. E. Wavelength-specific forward scattering of light by Bragg-reflective iridocytes in giant clams. J R Soc Interface. 13 (120), 20160285(2016).
  7. Mäthger, L. M., Collins, T. F. T., Lima, P. A. The role of muscarinic receptors and intracellular Ca2+ in the spectral reflectivity changes of squid iridophores. J Exp Biol. 207 (11), 1759-1769 (2004).
  8. Morse, D. E., Taxon, E. Reflectin needs its intensity amplifier: Realizing the potential of tunable structural biophotonics. Appl Phys Lett. 117 (22), 220501(2020).
  9. Hanlon, R. T., Cooper, K. M., Budelmann, B. U., Pappas, T. C. Physiological color change in squid iridophores. Cell Tissue Res. 259, 3-14 (1990).
  10. Levenson, R., et al. Calibration between trigger and color: Neutralization of a genetically encoded coulombic switch and dynamic arrest precisely tune reflectin assembly. J Biol Chem. 294 (45), 16804-16815 (2019).
  11. Levenson, R., Bracken, C., Bush, N., Morse, D. E. Cyclable condensation and hierarchical assembly of metastable reflectin proteins, the drivers of tunable biophotonics. J Biol Chem. 291 (8), 4058-4068 (2016).
  12. Levenson, R., et al. Protein charge neutralization is the proximate driver dynamically tuning a nanoscale Bragg reflector. bioRxiv. 9, (2021).
  13. Tobin, C. M., et al. Reversible and size-controlled assembly of reflectin proteins using a charged azobenzene photoswitch. Chem Sci. 15, 13279-13289 (2024).
  14. Loke, J. J., Hoon, S., Miserez, A. Cephalopod-mimetic tunable photonic coatings assembled from quasi-monodispersed reflectin protein nanoparticles. ACS Appl Mater Interfaces. 14 (18), 21436-21452 (2022).
  15. Kramer, R. M., Crookes-Goodson, W. J., Naik, R. R. The self-organizing properties of squid reflectin protein. Nat Mater. 6 (7), 533-538 (2007).
  16. Xu, C., Stiubianu, G. T., Gorodetsky, A. A. Adaptive infrared-reflecting systems inspired by cephalopods. Science. 359 (6383), 1495-1500 (2018).
  17. Ordinario, D. D., et al. Bulk protonic conductivity in a cephalopod structural protein. Nat Chem. 6 (7), 596-602 (2014).
  18. Ordinario, D. D., et al. Protochromic devices from a cephalopod structural protein. Adv Opt Mater. 5 (20), 1600751(2017).
  19. Gordon, R., et al. Charge screening and hydrophobicity drive progressive assembly and liquid-liquid phase separation of reflectin protein. J Biol Chem. 301 (3), 108277(2025).
  20. Bracha, D., Walls, M. T., Brangwynne, C. P. Probing and engineering liquid-phase organelles. Nat Biotechnol. 37 (12), 1435-1445 (2019).
  21. Kar, M., et al. Phase separating RNA binding proteins form heterogeneous distributions of clusters in subsaturated solutions. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2202222119(2022).
  22. Lan, C., et al. Quantitative real-time in-cell imaging reveals heterogeneous clusters of proteins prior to condensation. Nat Commun. 14 (1), 4831(2023).
  23. Vekilov, P. G. The two-step mechanism of nucleation of crystals in solution. Nanoscale. 2 (11), 2346(2010).
  24. Gibaud, T., Schurtenberger, P. A closer look at arrested spinodal decomposition in protein solutions. J Phys Condens Matter. 21 (32), 322201(2009).
  25. Cardinaux, F., Gibaud, T., Stradner, A., Schurtenberger, P. Interplay between spinodal decomposition and glass formation in proteins exhibiting short-range attractions. Phys Rev Lett. 99 (11), 118301(2007).
  26. Sciortino, F., Mossa, S., Zaccarelli, E., Tartaglia, P. Equilibrium cluster phases and low-density arrested disordered states: The role of short-range attraction and long-range repulsion. Phys Rev Lett. 93 (5), 055701(2004).
  27. Segrè, P., Prasad, V., Schofield, A., Weitz, D. Glass-like kinetic arrest at the colloidal-gelation transition. Phys Rev Lett. 86 (26), 6042-6045 (2001).
  28. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  29. Gill, S. C., Von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).
  30. Lychko, I., Soares, C. L., Dias, A. M. G. C., Roque, A. C. A. A scalable method to purify reflectins from inclusion bodies. Sep Purif Technol. 315, 123736(2023).
  31. Berliner, L. J., Grunwald, J., Hankovszky, H. O., Hideg, K. A novel reversible thiol-specific spin label: Papain active site labeling and inhibition. Anal Biochem. 119 (2), 450-455 (1982).
  32. Kenyon, G. L., Bruice, T. W. Novel sulfhydryl reagents. Methods Enzymol. 47, 407-430 (1977).
  33. Renault, K., Fredy, J. W., Renard, P. Y., Sabot, C. Covalent modification of biomolecules through maleimide-based labeling strategies. Bioconjug Chem. 29 (8), 2497-2513 (2018).
  34. Northrop, B. H., Frayne, S. H., Choudhary, U. Thiol-maleimide "click" chemistry: Evaluating the influence of solvent, initiator, and thiol on the reaction mechanism, kinetics, and selectivity. Polym Chem. 6 (18), 3415-3430 (2015).
  35. Stauffer, D. A., Karlin, A. Electrostatic potential of the acetylcholine binding sites in the nicotinic receptor probed by reactions of binding-site cysteines with charged methanethiosulfonates. Biochemistry. 33 (22), 6840-6849 (1994).
  36. Bressloff, P. C. Active suppression of Ostwald ripening: Beyond mean-field theory. Phys Rev E. 101 (4), 042804(2020).
  37. Berry, J., Brangwynne, C. P., Haataja, M. Physical principles of intracellular organization via active and passive phase transitions. Rep Prog Phys. 81 (4), 046601(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Reflektin A1S v S v Faz Ayr mTuz KonsantrasyonuY k Yo unlu uDinamik I k Sa lmasProtein Ak sBiyofiziksel nceleme

İlgili makaleler