Yöntem makalesi

Bölgeye Özgü Bağırsakla Lenfatik İletişimin Seçici Bozulması İçin Molin Mezenterik Lenfadenektomi

DOI:

10.3791/68696

⸱

30 Aralık 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Yale University School of Medicine, 2Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Section of Rheumatology, Yale University, 4Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, mezenterik lenf düğüm zinciri boyunca dört istasyonun her biri için güvenli ve iyi tolere edilen fare mezenterik lenfadenektomyatı için bir hayatta kalma prosedürünü tanımlar. Bu prosedür, distal kolon, proksimal kolon ve/veya ince bağırsak ile lenfatik iletişimin seçici olarak bozulmasına olanak tanıyacak şekilde uyarlanabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İmmünsüetim ile antijen-tolerans, bağırsak mikroçevresinde ince bir dengedir ve bu süreçte yerel lenf düğümlerinde dolaşımdaki T hücresi priminginin kritik rolü iyi bilinmektedir. T hücresi priminginden sonra, son literatürler, bir organın drenaj lenf düğümünde dolaşmayan T hücrelerinin benzersiz, tekrarsız bir rolünü göstermeye başlamıştır. Bu özellikle bağırsakta geçerli olabilir; burada lenf drenajı oldukça spesifik olarak bilinmektedir. Ancak, bu yerel hücrelerin sistemik fonksiyonel yedekliliğe karşı benzersiz etkisini gerçekten anlamak için, bilim camiasının bu düğümleri izole etmek ve seçici olarak bozmak için iyi tanımlanmış bir prosedüre ihtiyacı vardır. Burada anlatılan bir hayatta kalma prosedürü, mezenterik lenf düğümü zincirindeki dört istasyonun her birinde güvenli ve iyi tolere edilen fare mezenterik lenfadenektomi için bir sağlıktır. Bu prosedür, distal kolon, proksimal kolon ve/veya ince bağırsak ile lenfatik iletişimin seçici olarak bozulmasına olanak tanıyacak şekilde uyarlanabilir. Detaylı talimatlar, görsel yardımlar, başarıyı artırmak için faydalı ipuçları ve optimal olmayan hayatta kalma için sorun çözme seçenekleri dahildir. Rezeksiyon edilen lenf düğümleri, istenirse daha ileri akış işlemlerine hemen hazırdır. Bu teknik, distal kolon, proksimal kolon ve/veya ince bağırsaktan lenf drenajının seçici bozulmasını gerektiren çalışmalar için en uygun yöntemdir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T hücreleri, adaptif bağışıklıkta başlıca efektör hücre tiplerinden biridir ve enfeksiyonlar, otobağışıklık ve malignite 1,2,3 dahil olmak üzere çeşitli hastalık kategorilerinde tanımlanmış rolleri vardır. T hücresi işlevselliği için kritik bir adım, yerel lenfdüğümleri 4 gibi ikincil lenf organlarında antijen sunan hücrelerin üç fazlı primingidir. Modern tıpta, çoklu organ sistemlerinde uygun onkolojik rezeksiyonun temel noktalarından biri bir derecede lokal numune almayı veya en bloc lenf düğümrezeksiyonunu içerir 5,6,7,8. Örneğin, kolon kanserinde, uzlaşı kılavuzları, uzun vadeli sağkalma ile aydın bir korelasyon nedeniyle 12 lenf nodunun çıkarılıp iyileştirici niyetli rezeksiyonlaincelenmesini önermektedir 6,7. Ancak, yerel lenf düğümleri gerçekten cezasız şekilde rezek edilebilir mi? Fare üzerinde yapılan son çalışmalar, tümör drenaj lenf düğümünün, tümör mikroçevresinde gerçekleşen terminal farklılaşma ve T hücresi tükenmesinden korunabilecek antitümör T hücresi öncüllerirezervuarı içerdiğini göstermiştir 9,10,11. Bu, böyle kritik bir nüfusun kaldırılmasının devam eden bağışıklık gözetim yeteneklerini zayıflatabileceğini gösterir.

Farelerde bağırsak lenf drenajının mezenterik lenf düğüm zinciri boyunca oldukça uzmanlaşmış olduğu bilinmektedir; örneğin, proksimal kolon neredeyse tamamen birinci lenf düğümü istasyonu tarafından, ince bağırsaklar ikinci/üçüncü istasyon tarafından, distal kolon ise ağırlıklı olarak dördüncü lenf düğümüistasyonu 12 tarafından boşalmıştır (Şekil 1, Ek Şekil 1). Bu nedenle, bağırsak segmentleri ile lenfatikler arasındaki doğrudan iletişim, bu düğümlerin hedefli ablasyonuyla bozulabilir. Lenf düğümleri ile dokular arasındaki trafiki engellemek için FTY720 gibi S1P reseptör agonistleri ve integrin blokajı yaygın olarak kullanılır; ancak bu ilaçlar genel olarak insan ticaretini engeller ve bu nedenle belirli lenf düğümlerininkatkısını incelemek için kullanılamaz 13,14. Ancak, daha geniş bilim topluluğunun bağırsak lenf düğümlerindeki bağışıklık etkileşimlerinin yerel etkisini inceleme yeteneği, her istasyon için iyi tanımlanmış bir cerrahi rezeksiyonun olmaması nedeniyle sınırlıdır. Bu boşluk göz önünde bulundurularak her düğüm istasyonunda fare mezenterik lenfadenektomisi için bir hayatta kalma prosedürü geliştirildi ve burada anlatıldı. Bu prosedürün genel amacı, ameliyat sonrası hayatta kalma ve toleransı yüksek olan farelerde mezenterik lenf düğüm istasyonlarının güvenli ve güvenilir bir şekilde eksizyonunu sağlamaktır.

Bu prosedür test edilmiş ve genç ve yetişkin yaşındaki farelerde birden fazla suşta (örneğin, Balb/c, C57BL/6J, 129S4) kolayca uygulanabilir, ancak erişilebilir ve kolayca tanımlanabilir lenf düğümlerine olan ihtiyaç nedeniyle sınırlıdır. Bu nedenle, fare modelleri veya genotiplerle (örneğin, limfotoksin alfa eksikliği olan fareler) normalden daha küçük veya fark edilmeyen lenf düğümlerine sahip genotiplerle birleşmek için uygun olmayabilir.15 Ayrıca, yaşlı farelerde (>15 haftalık) daha fazla visseral yağlanma eğilimi vardır, bu da lenf düğümlerinin tanımlanması ve izolasyonunu zorlaştırır ve bu bir kontrendikasyon olmasa da başarı/prosedür sınırlayıcı olabilir. Bu sınırlamaların yanı sıra, mezenterik lenfadenektomi lenf düğümlerinin son derece kontrollü ve seçici bir şekilde perturbasyonu sunar. Bu prosedür, lenf düğümlerinin ve bunlara bağlı yerleşik bağışıklık hücrelerinin lokal etkisi ile bağırsak segmentleri (örneğin, proksimal kolon, distal kolon, ince bağırsak) üzerindeki etkileşimleri hakkında soruları çözmek için en uygun olacaktır.

figure-introduction-1
Şekil 1: Mezenterik lenf düğüm zincirindeki istasyonların anatomik işaretleri.(A) Etiketlenmemiş ve (B) Dört ana mezenterik lenf düğümü istasyonunun yerinde tasviri. Proksimal kolon drenajı ağırlıklı olarak 1. istasyondan, ince bağırsak ağırlıklı olarak 2/3. istasyondan ve distal kolon ağırlıklı olarak 4. istasyondan geçer. (DC= distal kolon, ICV= ileokolik damarlar, PC= proksimal kolon, CEC= çekum, IV/JV= ileal damarlar/jejunal damarlar, SI= ince bağırsak). Ölçek çubukları: 1,5 cm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm prosedürler Yale Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi protokollerine uygun olarak gerçekleştirilir. Bu prosedürü geliştirmek için 8-12 haftalık C57BL/6 suşu, vahşi tip fareler ve yaş/cinsiyet/genotip uyumlu sahte kontroller kullanıldı. Hem erkek hem de dişi fareler dahil edildi. Vücut ağırlığı 18-25 g arasında değişiyordu. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Aletlerin, hayvanların ve ameliyathanenin hazırlanması

  1. Tüm cerrahi aletleri sterilize edin. Ameliyat yüzeyi ve anestezik burun konisi %70 etanol ile temizlendiğinden emin olun.
  2. Aşırı anestezi temizliği için burun konuslu ve emme ile solunan anestezik buharlaştırıcı cihazını kurun. Hayvan vücut sıcaklığını ve malzemelerini uygun ve steril bir konumda korumak için sıcak su dolaşım pediyle çalışma yüzeyi kurun.
    NOT: Bu prosedür ameliyat mikroskobu gerektirmez; Ancak, görselleştirmeyi geliştirmek için bu enstrümanı dahil etmeyi düşünün.
  3. Solun anestezik buharlaştırıcı makineden burun konisi üzerinden (kurumsal onaylı protokollere uygun olarak) %2-3 solunmuş izofluran ile 2 L/dakika oksijen akış hızıyla %2-3 inhalasyon izofluran uygulanarak anestezi başlatın.
    1. Yaklaşık 30-40 nefes hızı dakikada doğrulayarak ve arka ayak sıkışmasına yanıt vermeyerek uygun anestezi düzlemini sağlayın. Anestezi düzlemini periyodik olarak tekrar kontrol edin ve izofluran akış hızını buna göre ayarlayın.
      NOT: Alternatif olarak, enjekte edilebilir bir anestezi de uygundur.
  4. Uygun analjezi ve lokal anestezi için kurum yönergelerine uyun. Örneğin, 3,25 mg/kg buprenorfin XR gibi uzun etkili bir ağrı aljezikini deri altı olarak verin ve planlanan keside deri altına 0,04 mL/5g vücut ağırlığı ile 1mg/mL lidokain solüsyesi verin.
  5. Hayvanı operasyona hazırlayın; sırtüstü pozisyona getirilin, göz kayganlaştırıcısı uygulanın, karın tüylerini koparın veya kesin, karın kısmını povidon/iyot çözeltisi ve %70 etanol ile sterilize edin (Şekil 2A).
  6. Steril eldivenler kullanın ve ameliyat alanına pencere açılan steril perdeler üzerine ürün. İşlem boyunca sterilliği koruyun.

figure-protocol-1
Figüre2: Mezenterik lenfadenektomide büyük prosedürel adımların temsilci görüntüleri. (A) Kopup sterilize edilmiş karın camı. (B) Deri ve linea alba üzerinden 0,5 cm kesi. (C) Mezenterik lenf düğüm zincirinin ileumun sağa, proksimal kolonun sola ve sekumun alt tarafa yönlendirilmesiyle ortaya çıkması. İlk mezenterik lenf düğümü, ileokolik arter (beyaz ok) boyunca yer alır. (D) Kesilmiş mezenterik lenf düğümü (solmuş ok). Ölçek çubukları: 0,5 cm. (E) Ex vivo mezenterik lenf düğümü (beyaz ok; 2,5 mm x 3 mm). Ticks = 1 mm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Mezenterik lenfadenektomi hazırlığı

  1. Ciltten 0,5-1 cm ortada bir kesi yapın. Deriyi karın duvarından kesin ve linea alba tespit edin. Linea alba boyunca 0,5-1 cm uzunluğunda bir kesi açın, periton boşluğuna erişim sağlanabilir (Şekil 4B).
    NOT: 2/3/4 istasyonunun düğümlerine erişimi artırmak için, kesi sefadasını uzatmayı düşünün, ancak kıkırdak xifoid sürecini aşmamak için değil.
  2. Vücut sıcaklığında steril salin peritoneal boşluğa küt uçlu gavaj iğnesi ile aşılayın ve steril perdeleri nemlendirerek bağırsak pozisyonu için hazırlanın. Kesi yoluyla çekumu tespit etmek ve içüstü temizlemek için steril, nemli pamuk uçlu sürüntüler kullanın.
    1. Bağırsağı tutmak için keskin aletler kullanmaktan kaçının, çünkü bu yaralanmaya yol açabilir. Kurumayı önlemek için perdeleri ve bağırsakları periyodik olarak yeniden nemlendirin.
      NOT: genellikle karın bölgesinin sol alt kvadrantında bulunur, ancak herhangi bir dörtrede bulunabilir.
  3. Rezeksiyon için hedef mezenterik lenf düğümü istasyonlarını netleştirin ve aşağıdaki özel talimatları takip edin (örneğin, 3.1-3.4). Anatomik simgeler ve tanımlama için Şekil 1A,B'ye bakınız.

3. Mezenterik lenf düğüm istasyonlarının diseksiyonu ve eksizyonu

  1. Birinci lenf düğümü istasyonu (proksimal kolon drenaji; Ek Şekil 1A,B').
    1. Dışa dönük bağırsağı, alt kısımda sekum, yukarıda proksimal kolon ve cerrahın sağ tarafına (hayvanın sol tarafı; Şekil 1A, Şekil 2C).
    2. Kolon boyunca boylamasına uzanan mezenterik lenf düğüm zincirini tanımlayın. Açılı ince uçlu forseps kullanarak, birinci lenf düğümü istasyonunu ileokolik damarlardan uzaklaştırarak bu yapılar arasındaki boşluğa kapalı forseps yerleştirin ve forsepslerin nazikçe açılmasına izin verin.
      1. Forsepsleri çıkarın ve bu manevrayı 2-3 kez veya güvenli bir çıkarma için yeterli bir düzlem oluşturulana kadar tekrarlayın. Büyük kolon kan damarlarına zarar vermekten kaçının (Şekil 3A,B).
        NOT: Eğer ciddi bir kanama yaşanırsa, işlemi iptal edin ve hayvanı insancıl bir şekilde ötenazi yapın (kurum tarafından onaylanmış protokollere uygun olarak).
    3. ISTEĞE BAĞLI: Yakındaki düğümlere yan etkilerin teorik olarak azalması için, lenf düğümü zinciri boyunca (birinci lenf düğümü istasyonuna bir 1mm distal ve bir 1mm proksimal bir dikiş) tek kesintili dikişlerle isteğe bağlı bir dikiş ligasyonu yapılabilir ve iğneyi çalıştırmak için 9-0 siyah monofilament naylon dikişi ve ince uçlu forseps kullanılarak gerçekleştirilir (Şekil 3C,D).
    4. Bağlanmış lenf istasyonunu nazikçe geri çekin ve ince uçlu makas kullanarak hedef lenf düğümü istasyonunu cephaladdan caudad'a çıkarın (Şekil 3E).
      NOT: Çoğu zaman, farelerde ileokolik arteriden lenf düğümünün arka kısmına küçük ama görünür bir beslenme damarı bulunur. Bu damardan gelen kanama, hemostaz sağlanana kadar pamuk uçlu bir sürüntle hafif bir baskı ile kontrol edilebilir.

figure-protocol-2
Figüre3: Mezenterik lenfadenektomi (ilk istasyon) ile ilgili açıklamalı fotoğraflar ve yorumlar. (A) Bağırsağın doğru yönelimi, ilk mezenterik lenf düğümü istasyonunu (beyaz ok) ortaya çıkarır. (B) ileokolik arter (bluearrow) ile düğüm arasında bir düzlem oluşturulur. (C) Lenf düğümünün zirvesine giren beslenme damarlarının (mavi ok) dikiş ligasyonu, ileokolik damarlar hariç tutulurken, bu yapılar arasındaki boşluktan (beyaz ok) çıkarılır. (D) Lenf düğümünün tabanının dikiş ligasyonu yapılır; ileokolik arterin distal dalları yine not edilir ve kaçınılır. (E) Düğüm, daha önce oluşturulmuş doku düzlemi boyunca kesilir, lenf düğümüne doğru yüksek kalır ve dikiş ligasyonları (siyah oklar) bırakılır. (F) Hemostaz doğrulanır, ileokolik arterin distal dalları doğru kan akışını sağlamak için gözlemlenir ve düğümün daha önce yaşadığı boş boşluk (solgun ok) artık düğümden arınmıştır. Ölçek çubukları: 0,5 cm. Bu figürün daha büyük versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

  1. İkinci lenf düğümü istasyonu (orta distal ince bağırsak drenaji)
    1. İnce bağırsağı da nazikçe sökün. Dışa dönük bağırsağı, sek alt tarafta, proksimal kolon üst tarafta ve ince bağırsak cerrahın sağ tarafına (hayvanın sol tarafı; Şekil 1A).
    2. Kolon boyunca boylamasına uzanan mezenterik lenf düğüm zincirini tanımlayın. İkinci istasyon, ileal/jejunal gemilerinin birleştiği noktada başlar (Şekil 1B).
      1. Açılı ince uçlu forseps kullanarak, ikinci lenf düğümünü kolon damarlarından uzakta durarak bu yapılar arasındaki boşluğa kapalı forseps yerleştirin ve forsepslerin nazikçe açılmasına izin verin.
      2. Forsepsleri çıkarın ve bu manevrayı 2-3 kez veya güvenli bir çıkarma için yeterli bir düzlem oluşturulana kadar tekrarlayın. Büyük kolon kan damarlarına zarar vermekten kaçının. Ayrıca, ileal ve jejunal damarlara özellikle dikkat edin; bunlar yaralanmanız durumunda zararlı olur.
        NOT: Eğer ciddi bir kanama yaşanırsa, işlemi iptal edin ve hayvanı insancıl bir şekilde ötenazi yapın.
    3. ISTEĞE BAĞLI: Yakındaki düğümlere yan etkilerin teorik riskini azaltmak için, lenf düğümü zinciri boyunca (biri 1 mm distal ve ikinci lenf düğümü istasyonuna bir 1 mm yakın) tek kesintili dikişlerle opsiyonel bir dikiş ligasyonu yapılabilir (iğneyi sürmek için 9-0 siyah monofilament naylon dikişi ve ince uçlu forseps kullanılarak).
    4. Bağlanmış lenf istasyonunu nazikçe geri çekin ve ince uçlu makasla kullanarak hedef lenf düğümü istasyonunu cephaladdan caudad'a çıkarın (Ek Şekil 2B).
      NOT: Çoğu zaman, farelerde ileokolik arteriden lenf düğümünün arka kısmına küçük ama görünür bir beslenme damarı bulunur. Bu damardan gelen kanama, hemostaz sağlanana kadar pamuk uçlu bir sürüntle hafif bir baskı ile kontrol edilebilir.
  2. İkinci ve üçüncü lenf düğüm istasyonu (proks-orta distal ince bağırsak drenaji; Ek Şekil 1C,D'
    1. İnce bağırsağı nazikçe tamamen arka bağlama (Treitz bağı) noktasına kadar boşaltın. Dışa dönük bağırsağı, sek alt tarafta, proksimal kolon üst tarafta ve ince bağırsak cerrahın sağ tarafına (hayvanın sol tarafı; Şekil 1A).
    2. Kolon boyunca boylamasına uzanan mezenterik lenf düğüm zincirini tanımlayın. İkinci istasyon, ileal/jejunal gemilerinin birleştiği noktada başlar (Şekil 1B).
      1. Açılı ince uçlu forseps kullanarak, ikinci ve üçüncü lenf düğümü istasyonunu kolonik damarlardan uzaklaştırarak bu yapılar arasındaki boşluğa kapalı forseps yerleştirin ve forsepslerin nazikçe açılmasına izin verin.
      2. Forsepsleri çıkarın ve bu manevrayı 2-3 kez veya güvenli bir çıkarma için yeterli bir düzlem oluşturulana kadar tekrarlayın. Büyük kolon kan damarlarına zarar vermekten kaçının. Ayrıca, ileal ve jejunal damarlara özellikle dikkat edin; bunlar yaralanmanız durumunda zararlı olur.
        NOT: Eğer ciddi bir kanama yaşanırsa, işlemi iptal edin ve hayvanı insancıl bir şekilde ötenazi yapın.
    3. ISTEĞE BAĞLI: Yakındaki düğümlere teminat oluşma riskini azaltmak için, lenf düğüm zinciri boyunca (genellikle bir 1 mm distal, iki 1 mm lateral ve ikinci/üçüncü lenf düğüm istasyonlarına bir 1 mm proksimal bir 1 mm yakın) 9-0 siyah monofilament naylon dikişi ve ince uçlu forseps kullanılarak iğneyi çalıştırmak için isteğe bağlı bir dikiş ligasyonu yapılabilir (Ek Şekil 3B, C).
      1. Afferent lenfatik traktlara dikkat edin; bunlar ileal/jejunal damar demetlerinin yüzeyinde yer alır (Ek Şekil 3B). Dikiş ligasyon kurslarının lenfatiklere derinlemesine ve yüzeysel olarak büyük damar yapılarına ulaşmasını sağlamaya dikkat edin; çünkü ileal/jejunal damar demetlerine zarar zarar verebilir.
    4. Bağlanmış lenf istasyonlarının cephaladını nazikçe geri çekin ve ince veya ekstra-ince noktalı makas kullanarak hedef lenf düğüm istasyonlarını kaudaddan sefahalaya doğru çıkarın.
      NOT: Devam etmeden önce, ince bağırsağın pembe ve iyi perfuze olunmuş olduğundan emin olun. Ileal/jejunal damarların tesadüfi ligasyonu iskemik ince bağırsakla sonuçlanır.
  3. Dördüncü lenf düğümü istasyonu (distal kolon drenaji; Ek Şekil 1E,F')
    1. İnce bağırsağı nazikçe tamamen arka bağlama (Treitz bağı) noktasına kadar boşaltın. Dışa dönük bağırsağı, sek alt tarafta, proksimal kolon üst tarafta ve ince bağırsak cerrahın sağ tarafına (hayvanın sol tarafı; Şekil 1A).
    2. Kolon boyunca boylamasına uzanan mezenterik lenf düğüm zincirini tanımlayın. Dördüncü istasyon, distal kolona tam medial ve üçüncü istasyona lateral olarak yer alır (Şekil 1B, Şekil 4A).
      1. Açılı ince uçlu forseps veya ekstra ince uçlu makas kullanarak, dördüncü lenf düğümü istasyonunu kolon damarlarından ve çevresindeki yağdan uzaklaştırarak bu yapılar arasındaki boşluğa kapalı forseps/makas yerleştirerek ve forseps/makas nazikçe açılmasına izin vererek kesin.
      2. Forseps/makas çıkarın ve bu manevrayı 2-3 kez veya güvenli bir eksizyon için yeterli bir düzlem oluşturulana kadar tekrarlayın. Büyük kolon kan damarlarına zarar vermekten kaçının.
        NOT: Eğer ciddi bir kanama yaşanırsa, işlemi iptal edin ve hayvanı insancıl bir şekilde ötenazi yapın.
    3. ISTEĞE BAĞLI: Yakındaki düğümlere teminat riskini azaltmak için, her tanımlanabilir lenf düğümünde (genellikle düğümden 1 mm uzaklıkta) tek kesintili dikişlerle opsiyonel bir dikiş ligasyonu yapılabilir (genellikle düğümden 1 mm uzakta) 9-0 siyah monofilament naylon ve ince uçlu forseps kullanılarak iğneyi sürmek için (Şekil 4B - D).
    4. Bağlanmış lenf istasyonlarının cephaladını nazikçe geri çekin ve ekstra ince noktalı makas kullanarak hedef lenf düğümü istasyonunu kaudad'dan cephalad'a çıkarın (Şekil 4D,E).

figure-protocol-3
Şekil 4: Mezenterik lenfadenektomi (dördüncü istasyon) ile ilgili açıklamalı fotoğraflar ve yorumlar. (A) Doğru bağırsak yönelimi, dördüncü mezenterik lenf düğümü istasyonunu (beyaz oklar) distal kolona medial ve üçüncü istasyona lateral olarak gösterir. (B,C) Düğüm istasyonunun küt diseksiyonundan sonra, her tanımlanabilir düğümde dikiş ligasyonu (siyah ok) yapılır ve tüm lenf düğümü besleyici damarları (mavi oklar) kapsedilir. (D) Düğüm, daha önce oluşturulmuş doku düzlemi boyunca kesilir, lenf düğümlerine doğru yüksek kalır ve dikiş ligasyonları (siyah oklar) bırakılır. (E) Düğüm istasyonunun (beyaz oklar) kesilmesinden sonra hemostaz doğrulanır, dikiş ligasyonları görünür (siyah oklar) ve düğümün daha önce yaşadığı boş boşluk (solmuş oklar) artık düğümden arınmıştır. Ölçek çubukları: 0.2 cm. Bu figürün daha büyük versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Mezenterik lenfadenektomi tamamlanması

  1. Kan akışının sağlam olduğundan emin olmak için ileokolik damarların, ileal damarların ve/veya jejunal damarların distal dallarını gözlemleyin. İyi perfuz edilmiş bağırsak parlak ve pembe, görünür nabızlar var.
    1. Pamuk uçlu sürüntülerle karın içeriğini periton boşluğuna geri döndürün. Geri dönmeden önce bağırsaklardan pamuk, tüy, örtü veya dikiş parçalarını çıkarmaya özen gösterin, çünkü bu ek cerrahi iltihaplanmaya yol açabilir.
    2. Bağırsağın mezenterinin bükülmediğinden emin olun; bağırsağın parlak/pembe (perfüzyon) kaldığından emin olun; donuk/gri/mor (iskemik) değil.
  2. Kapanmadan hemen önce karın bölgesine 1 mL vücut sıcaklığında steril tuzlu süzme vererek duyarsız sıvı kaybı/buharlaşma sağlanır. Karın bölgesini iki katman halinde (karın duvarı ve deri) 6-0 monofilament polipropilen dikişi ile koşu şeklinde kapatın.
  3. Yaraya steril cerrahi yapıştırıcı uygulayın.
    NOT: Alternatif olarak, deri kapanması için kesintili dikişler veya yara klipleri kullanılabilir.

5. Ameliyat sonrası bakım

  1. Hayvanı temiz bir kafese taşıyın; bu kafes yarı açık ve yarı dışarıda, yiyecek ve suya imkansız erişimi olan sıcak su dolaşımı platformunun yarısı üzerinde olur.
  2. Hayvanın anesteziden iyileşmesine izin verin ve sıkıntı belirtilerini yakından izleyin. Hayvanlar uygun davranışlarla (örneğin, artan solunum hızı, kendini düzeltme, yürüyüş, tımar yapma) anesteziden hızlıca iyileşmezse, hayvanı insancıl bir şekilde ötenazi ile gerçekleştirin.
  3. Tüm hayvanlar anesteziden iyileştikten sonra, kafesleri su, yiyecek, yatak takımı ve zenginleştirme materyallerine sunulan hayvan bakım tesisine geri gönderin.
  4. Ameliyat sonrası her 12 saatte bir 3 gün boyunca farelerde ağrı veya sıkıntı belirtileri (örneğin, kambur duruş, azalmış aktivite, azalmış etkileşim, kötü bakım) değerlendirin. Sıkıntı belirtileri gösteren fareleri insancıl bir şekilde ötenazi yapın.
  5. Kalıcı dikiş (örneğin 6-0 monofilament polipropilen gibi) kullanıyorsanız, ameliyat sonrası 10. günde kesileri inceleyin ve kalan dikiş materyalini çıkarın.

6. Lenf düğümü yönetimi

  1. Hemen bir kaldırma testi yapın; kesilen doku 500 μL fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilir. PBS'nin doku çökmesini ve yanlışlıkla rezek edilmiş yağın yüzeceğini gözlemleyerek lenf düğümü eksizyionunu doğrulayın (Şekil 5A).
    NOT: Çıkarılan lenf düğümü istasyonları hemen daha ileri akış işlemlerine girmeye hazırdır.
  2. Canlı hücre teknikleri için, kesilmiş lenf düğümü istasyonlarını hücre kültür ortamına (örneğin, DMEM, RPMI) veya PBS'yi buz üzerine yerleştirin. Planlı histoloji için, kesilmiş lenf düğümü istasyonlarını fiksatif (örneğin, %10 nötr tamponlu formalin, %4 paraformaldehit) içine yerleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu prosedürün doğruluğunu doğrulamak için, 4-6 haftalık, yaş, cinsiyet ve genotiple eşleşen C57BL/6J suş arkadaşına mezenterik lenfadenektomi yapıldı. İşlem süreleri fare başına 5-15 dakika arasında değişiyordu. Tüm fareler işlemi iyi tolere etti ve %100 perioperatif hayatta kalma sağladı. Çıkarılan örnekler buz üzerinde PBS'ye yerleştirildi. Tüm örnekler hemen battı ve düşük yağ içeriği doğrulandı. Çıkarılan örnekler (ve dört ayrı visseral yağ kontrolü) daha sonra 100 μm hücre süzgecind...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada tanımlanan bir hayatta kalma prosedürü, dört düğüm istasyonunun her birinde güvenli ve iyi tolere edilen fare mezenterik lenfadenektomi için uygulanmaktadır. Bu prosedürün en büyük sınırlaması, mezenterik zincir boyunca lenf düğümlerinin ilerlemesi ile maruz bırakma arasındaki dolaylı ilişkidir. İlk lenf düğümü istasyonu tamamen kolayca ve kolayca açığa çıkar. İkinci lenf düğümü istasyonu genellikle görünür ve2. ila 4. istasyonlara maruz kalma, deri/karın duv...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R.A.F., GlaxoSmithKline, Plythera Inc. ve Ventus Therapeutics'e danışmandır. Diğer tüm yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J. Alderman, B. Cadugan, E. Hughes-Picard ve J. Horrocks'a idari yardımları için, C. Hughes'a ise fare koloni yönetimi için teşekkür ediyoruz. H.N.B., Yale Cerrah Bilim İnsanı Eğitim Programı'nın üyesidir ve bu programın kısmen bu projeyi finanse ettiği ve destekleyen bir üyesidir. Bu çalışma ayrıca Howard Hughes Tıp Enstitüsü (R.A.F.) ve Amerikan Cerrahlar Koleji Resident Research Award (H.N.B.'ye) tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anestezi devresiHerhangi birYa da enjekte edilebilir anestezik
BD LSRII akış sitometresi (veya eşdeğeri)BD BiosciencesFACS Diva Software ile donatılmış, (akış sitometrisi için) 
Buprenorfin XRHerhangi birAnaljezi için
Hücre kültürü medyası Herhangi bir(canlı hücre teknikleri için; yani. DMEM veya RPMI)
DAPIBiolegend422801Çalışma yoğunluğu: 15 ug/mL
Etanol (%70 suda)Herhangi birTemizlik için
FITC ile konjuge edilmiş anti-fare CD45.2 (104)Biolegend109806Çalışma yoğunluğu: 5 ug/mL
Forseps: Açılı ince uçlu forsepslerRobozRS-5058Malzeme: Dumoxel; Pattern #5, 45 derece açı; uç boyutu 0.1 X 0.06mm
Penset: İnce uçlu forsepsRobozRS-4960Malzeme: Dumostar; Pattern #1; Uç boyutu: 0.20 X 0.12mm
Penset: İnce uçlu forsepsRobozRS-4966Malzeme: Dumostar, Biyolojik uç; Pattern #3; Uç boyutu: 0.08 x0.04mm
LidokainHerhangi birAnaljezi için
Metal gavaj iğnesiHerhangi bir20/22 kalibre tekrar kullanılabilir düz oral gavaj iğnesi, paslanmaz çelik.
İğne sürücüleriRobozRS-6410Castroviejo iğne tutucu; Düz
OPTIONAL:      İkili/çift boğazlı mikroskop LED ışıklarıHerhangi bir
OPTIONAL: Evans Blue boyasıSigmaE2129-10GIsteğe bağlı lenf izleme için.
OPTIONAL: Çalışma mikroskobuLeicaMZ9.5Leica Mz9.5 stereo baş çalışma mikroskobu
Fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS)Herhangi bir
Povidon/İyot çözeltisiHerhangi birCilt hazırlığı/sterilizasyonu için
Makas: Ekstra ince uçlu makaslarRobozRS-5605McPherson-Vannas; 3mm kesici kenar; Curved (istasyon 3/4 düğümleri için)
Makas: İnce uçlu makasRobozRS-5650SCSurecut Castroviejo makası (istasyon 1/2/3 düğümleri için)
Makas: Orta makasRobozRS-5676Noyes; 13mm kesici kenar; düz
Cerrahi yapıştırıcıHerhangi bir3M Vetbond doku yapıştırıcısı
Dikiş: 6-0 mavi monofilament polipropileneksHerhangi bir
Dikiş: 9-0 siyah monofilament naylon dikişHerhangi bir(isteğe bağlı) Ayrıca biraz daha büyük 8-0 modelini de kullanabilirim Boyut dikiş.
Doku fiksasyonuHerhangi bir(planlı histoloji için; yani %10 nötr tamponlu formalin veya %4 paraformaldehit)
Sıcak su dolaşımı ısı pediHerhangi bir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chopp, L., Redmond, C., O'shea, J. J., Schwartz, D. M. From thymus to tissues and tumor: A review of T cell biology. J Allergy Clin Immunol. 151 (1), 81-97 (2023).
  2. Rouiz-Argüelles, A. Autoimmunity: From bench to bedside. Anaya, J. -M. , El Rosario University Press. Colombia. (2013).
  3. Crespo, J., Sun, H., Welling, T. H., Tian, Z., Zou, W. T cell anergy, exhaustion, senescence, and stemness in the tumor microenvironment. Curr Opin Immunol. 25 (2), 214-221 (2013).
  4. Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).
  5. Divi, V., et al. Lymph node count from neck dissection predicts mortality in head and neck cancer. J Clin Oncol. 34 (32), 3892-3897 (2016).
  6. Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: Systematic review. JNCI. 99 (6), 433-441 (2007).
  7. Simoes, P., et al. Lymph node yield in the pathological staging of resected nonmetastatic colon cancer: The more the better. Surg Oncol. 43, 101806(2022).
  8. Resio, B. J., et al. Commission on cancer standards for lymph node sampling and oncologic outcomes after lung resection. Ann Thorac Surg. 119 (2), 308-315 (2025).
  9. Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like CD8 T cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836(2021).
  10. Saddawi-Konefka, R., et al. Lymphatic-preserving treatment sequencing with immune checkpoint inhibition unleashes cdc1-dependent antitumor immunity in HNSCC. Nat Commun. 13, 4298(2022).
  11. Saddawi-Konefka, R., Schokrpur, S., Gutkind, J. S. Let it be: Preserving tumor-draining lymph nodes in the era of immuno-oncology. Cancer Cell. 42 (6), 930-933 (2024).
  12. Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
  13. Brinkmann, V., Pinschewer, D., Chiba, K., Feng, L. Fty720: A novel transplantation drug that modulates lymphocyte traffic rather than activation. Trends Pharmacol Sci. 21 (2), 49-52 (2000).
  14. Mehandru, S., Colombel, J. -F., Juarez, J., Bugni, J., Lindsay, J. O. Understanding the molecular mechanisms of anti-trafficking therapies and their clinical relevance in inflammatory bowel disease. Mucosal Immunol. 16 (6), 859-870 (2023).
  15. Mariathasan, S., et al. Absence of lymph nodes in lymphotoxin-alpha (lt alpha)-deficient mice is due to abnormal organ development, not defective lymphocyte migration. J Inflam. 45 (1), 72-78 (1995).
  16. Kwon, S., Agollah, G. D., Wu, G., Sevick-Muraca, E. M. Spatio-temporal changes of lymphatic contractility and drainage patterns following lymphadenectomy in mice. PLoS One. 9 (8), e106034(2014).
  17. Blum, K. S., Proulx, S. T., Luciani, P., Leroux, J. -C., Detmar, M. Dynamics of lymphatic regeneration and flow patterns after lymph node dissection. Breast Cancer Res Treat. 139 (1), 81-86 (2013).
  18. Shaikh, H., et al. Mesenteric lymph node transplantation in mice to study immune responses of the gastrointestinal tract. Front Immunol. 12, 689896(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ba rsak mm nos rveyansT H cresi PriminglemesiLenf Nodu RezeksiyonuLenf Nodu ZinciriAk SitometrisiS t r LigasyonuAbdominal CerrahiCD45 Pozitif H creler

İlgili makaleler