Burada, terminal bir prosedür olarak bir vakum pompasına bağlı perkütan intrakardiyak kanülasyon kullanarak domuzdan büyük miktarda kan toplamak için bir yöntem sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
In Vitro Uygulamalar için Domuzdan Büyük Hacimli Kan Alma: İntrakardiyak Kanülasyon ve Vakum Pompasının Terminal Prosedür Olarak Kullanımı
Bu makalede
Özet
Özet
Rutin kan alımı, birçok temel ve uygulamalı araştırma çalışmasında gereklidir. Domuz kanı toplama için birden fazla yöntem iyi tanımlanmıştır. Bunlar, küçük kan hacimlerinin toplanması için kulak damarlarının ve daha büyük kan hacimlerinin toplanması için juguler damarların veya kraniyal vena kava'nın kullanılmasını içerir. Bazı deneyler, analiz veya birincil hücre kültürlerinde kullanım için bir kerede tek bir hayvandan büyük miktarda kan gerektirir ve bu da en iyi şekilde kan kaybı yoluyla elde edilebilir. Birincil hücre kültürü için toplanan kan, hücresel bütünlüğü korumak için taze ve dikkatli bir şekilde işlenmelidir. Kalbe perkütan olarak yerleştirilen geniş delikli intravasküler kateter stile ve verimli, büyük bir verim sağlayan ve hücre lizizini en aza indiren bir vakum pompası kullanarak, cerrahi bir anestezi düzlemi altında domuzdan aseptik olarak kan toplama yöntemini tarif ediyoruz. Bu teknik, bir hayvan üzerinde, cerrahi bir anestezi düzleminde, terminal bir prosedür olarak bir kez gerçekleştirilir ve ağrı veya sıkıntı için minimum risk sağlar.
Giriş
Domuzlar, kardiyovasküler çalışmalardan yara iyileşmesi ve toksikolojiye kadar çeşitli çalışmaların yanı sıra tarıma dayalı araştırma, immünoloji ve hastalık çalışmalarına kadar çeşitli araştırmalarda kullanılmıştır1. Araştırmada toplanan kan, hastalıklar, farmakoloji, genetik, bağışıklık sistemi araştırmaları ve biyobelirteç keşfini incelemek için kullanılabilir. Hücre kültürü, araştırmada yapılan en temel prosedürlerden biridir ve araştırmacıların hücre davranışı ve işlevinin yanı sıra hastalık modelleri ve aşı geliştirme çalışmalarını incelemelerine olanak tanır2. Afrika Domuz Ateşi Virüsü gibi hastalığa neden olan patojenlerin yetiştirilmesi, sıklıkla sıkı aseptik laboratuvar koşulları altında önceden belirlenmiş bir kültür ortamında yapılır. Hastalığın yayılması, sağlıklı, stabil hücreler gerektiren istila, yayılma veya bağlanma yoluyla meydana gelebilir3. İncelenen patojenler, çoğaltılabilecekleri spesifik bir hücre tropizmine sahip olabilir ve büyük miktarda kana sahip olmak, kullanılacak daha fazla miktarda hücre verir.
Tek bir hayvandan yüksek bir hücre verimi elde etmek için, hücresel farklılaşma için, hücre ayrılmasından önce hücre bütünlüğünü korumak için büyük miktarda kan nazikçe toplanmalıdır. Domuzlarda toplam kan hacmi 65 mL/kg 4,5 olarak hesaplanabilir. Büyük hacimli toplama deneyimimize göre, bir hayvandan alınan toplam kan hacminin yaklaşık yarısı geri kazanılabilir. Bu nedenle, 600 pound (273 kg) ağırlığa kadar olan büyük yetişkin domuzlarda 6-8 L'lik bir verim mümkündür. Domuzlarda, kraniyal vena kava, dış juguler ven, kanülasyon yoluyla safen ven veya kalptenperkütan olarak büyük miktarlarda kan toplanabilir 4,5,6. Bununla birlikte, büyük delikli bir kanül ile intrakardiyak kan alımı, hücre lizizi için minimum riskle en büyük kan hacminin verimli bir şekilde toplanmasını sağlar. Ölümcül bir prosedür olarak, bu cerrahi bir anestezi düzlemi altında yapılmalıdır5. Bu makale, bir vakum pompasına 7,8 bağlı geniş delikli bir IV kateter stileti ile kalbe perkütan bir yaklaşım kullanarak domuzdan birkaç litre kan toplamak için bir vakum pompası kullanma yöntemini açıklamaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışma Midwest Veterinerlik Hizmetleri A.Ş. Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu prosedür sırasında IACUC onaylı, birincil ötenazi yöntemi kan kaybı olduğundan, bazı domuzların kan kaybı nedeniyle kalp durması geçirmesi beklenmektedir. Bu meydana geldiğinde, bilateral torakotomi gibi ikincil bir ötenazi yöntemi gerçekleştirilir. Gerekli kan hacmi toplandıktan sonra, ele gelen bir kalp atışı varsa, stile ötenazi solüsyonlu bir şırınga takılır ve birincil ötanazi yöntemi olarak intrakardiyak olarak uygulanır, ardından ikincil bir fiziksel yöntem uygulanır. Domuzlar, Araştırma ve Öğretimde Tarım Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi ve Hayvan Refahı Yasası'na uygun olarak korunur.
1. Malzemelerin ve hayvanların hazırlanması (Malzeme Tablosu ve Şekil 1A-C)
- Boruyu paslanmaz çelik çubuklara monte edin ve hortum ucunu kabarcık borusuna takın.
- İki düzensiz metal pipet ve bir cam şişe içeren kauçuk bir tıpa kullanarak boruyu silindir şişeye takın.
NOT: Cam, vakum pompası tarafından oluşturulan kabın çökmesini engeller, ancak basınç altında çökmeyen herhangi bir malzeme kullanılabilir. - Pıhtılaşmayı önlemek için emme borusu ve kateter stiletinden aseptik olarak 10 mL sodyum heparin (1.000 USP / mL) damlatın. Her litre kanda 50 IU / mL'lik bir son konsantrasyon elde etmek ve toplama sırasında kanın pıhtılaşmasını önlemek için her silindir şişeye aseptik olarak 50 mL sodyum heparin (1.000 USP / mL) ekleyin. Hücrelerin zarar görmesini önlemek için vakum pompasının 7 pound'dan fazla çekmeyecek şekilde ayarlandığından emin olun.
2. Anestezi ve hayvan konumlandırma
- Anestezi kombinasyon ilaçlarının gerekli dozunu hesaplamak için işlemden en fazla 24 saat önce hayvanı tartın.
- Telazol (3.0-5.0 mg / kg), ketamin (8-12 mg / kg) ve ksilazin (4.0-6.0 mg / kg) intramüsküler olarak boyuna veya diğer büyük kas göbeğine (ör. epaksiyel kaslar), 30 inçlik bir uzatma seti ve 18 G x 1.5 "iğne kullanarak derin anestezi.
NOT: Büyük domuzlarda, önerilen maksimum IM enjeksiyon hacmi 10 mL'dir, bu nedenle her 10 mL uygulamadan sonra yer değiştirmek gerekebilir9. Biz bu kokteyli seçerken, bu prosedür cerrahi bir anestezi düzlemi üreten herhangi bir IACUC onaylı anestezi protokolü altında gerçekleştirilebilir. - Hayvanın cerrahi anestezi düzleminde (~ 5-8 dakika) olduğu, palpebral refleks, gevşek çene tonusu ve ağrı uyaranlarına yanıt vermediği onaylandıktan sonra, domuzu sağ lateral yaslanacak şekilde bir kaldırma masasına, zemine veya başka bir düz yüzeye yerleştirin.
- Gerekirse, dördüncü ve beşinci interkostal boşluğun yakınında, sadece dirsek noktasına kadar kaudal olarak, kalbin üzerinde bulunan göğüs kafesindeki saçları klipsleyin.
- Varsa, sol ventrikülü tanımlamak için bir ultrason (Şekil 2A) kullanın. Mevcut değilse, sol ventrikül, maksimum impuls8 noktasına medial dördüncü veya beşinci interkostal boşluğa en yakın yerde bulunur.
- Alanı %2 klorheksidin fırçalamaya batırılmış 4 inç x 4 inç gazlı bez süngerler ve %70 izopropil alkole batırılmış 4 inç x 4 inç gazlı bez süngerlerle aseptik olarak ovalayın. Cildi, iki dezenfektan arasında dönüşümlü olarak en az 3 kez olacak şekilde, enjeksiyon noktasından başlayarak ve dışa doğru dönerek dairesel bir şekilde ovarak hazırlayın.
3. İntrakardiyak kan alma
- Palpebral refleksi, çene tonusunu ve pedal refleksini kontrol ederek hayvanın cerrahi anestezi düzleminde kaldığını doğrulayın.
NOT: Hayvanın cerrahi anestezi düzleminde kalmasını sağlamak için prosedür boyunca anestezik derinliğin, kalp ve solunum hızlarını kontrol edin. - Stileyi IV kateterden çıkarın. Stileyi sol ventrikülün üzerine yerleştirin ve sol ventriküle yerleştirmek için cilde dik olarak ilerletin (Şekil 2B). Kan stileten dışarı çıkmaya başladığında, onu silindir şişeye bağlı kabarcıklı boru hortumu uç konektörüne takın ve ardından vakum pompasını açın (Şekil 1A ve Şekil 2C).
- Kanın sabit bir akışta aktığını onaylayın. Kan silindir şişeye çekilirken, pıhtı oluşumunu önlemek için kanın antikoagülan ile karışmasına izin vermek için şişeyi hafifçe döndürün.
- 1 L kan toplandıktan sonra, kabarcık tüpünü silindir şişenin yanına sıkıştırmak için kanama durdurucular kullanın. Lastik tıpayı ayırın ve bir sonraki silindir şişeye uygulayın. Kanama durdurucuyu çıkarın ve silindir şişeyi hafifçe döndürürken kanın serbestçe akmasına izin verin.
- Gerekli kan toplanana kadar bu işleme devam edin. Tamamlandığında, fazla kan dökülmesini önlemek için hortumu sıkıştırın ve pompayı kapatın.
- Boru konektörünü kateter stiletinden çıkarın ve sodyum pentobarbital şırıngayı stileye takın. Bir kan parlaması olduğundan emin olmak için şırıngayı geri çekin, ardından ötenazi solüsyonunu enjekte edin. Kalp atışı, solunum, kas tonusu ve reflekslerin yokluğuyla ölümü onaylayın. Ölüm onaylandıktan sonra, iğneyi kalpten çıkarın ve keskin bir kaba koyun.
- Kabarcık tüpünü biyolojik bir atık kabına atın. Bir tüp fırçası kullanarak kalan paslanmaz çelik parçalardan (örn. paslanmaz çelik pipetler, hortum ucu konektörleri) brüt kanı çıkarın ve ardından ileride kullanmak üzere otoklavlayın.
- Temizlenmiş lastik tıpaları, pipetleri, hortum ucu bağlantılarını ve hemostatları yeni bir otoklav poşetine yerleştirin ve bir sonraki kullanımdan önce sterilize edin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kan alımından önce, dişi domuzlar Mycoplasma hyopneumoniae, domuz adenovirüsü, domuz parvovirüsü, domuz koronavirüsleri (bulaşıcı gastroenterit, domuz salgını ishali), domuz hemoaglütinan ensefalomiyelit, domuz üreme ve solunum sendromu, grip grubu A, sirkovirüs 1 ve 2 ve Seneca virüsü A için ön taramadan geçirildi. Bu prosedürü 300-600 lbs ağırlığındaki dişi Yorkshire çapraz domuzlarında defalarca tekrarladık. Kan alımı, küçük domuzlardan 3 L ile daha büyük dişi domuzlardan 8 L...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Buradaki prosedür, dişi domuzların kalbinden bir kerelik büyük miktarda kan toplamak için bir kateter-stilet-vakum pompası tertibatını açıklar. Ağrı ve sıkıntı potansiyeli nedeniyle, bu prosedür sadece cerrahi anestezi düzleminde olan hayvanlarda yapılmalıdır. Anesteziden hareketsizlik, bu prosedürün yeni başlayanlar tarafından öğrenilmesini ve hızlı bir şekilde ustalaşmasını sağlar. Hayvanlardan kan almak için birden fazla damar kullanılabilir. En yaygın ve erişilebilir yollar juguler v...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Plum Adası Hayvan Hastalıkları Merkezi Hayvan Kaynakları Şubesine, hem Hayvan Sağlığı Teknisyenlerine hem de Hayvan Bakımına mükemmel teknik yardım için özellikle teşekkür etmek istiyoruz. Sözleşmeli araştırma organizasyonundaki proje için finansman, NBAF'deki USDA, ARS, Hayvan Kaynakları Birimi tarafından sağlandı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1/8 HP Laboratuvar Modeli Diyafram Pompası & Dash; 115 VAC, maksimum 60 psi | Üs Tedarik Merkezi | 80058845 | |
| 10 G x 6 iğne üzerine kateter | Covetrus Kuzey Amerika Veterinerlik Malzemeleri | 024616 | |
| 50 mL şırınga, luer kilidi | Fisher Scientific | 13-689-8 | |
| Aquasonic 100 ultrason jel mavi | Orta Batı Veterinerlik Tedariki | 001.02109.2 | |
| Argyl kabarcık borusu, İletken Olmayan (¼ ") | Fisher Scientific | NC2282605 (Satıcı kataloğu # 8888280412) | |
| Klorheksidin Q Scrub %2 | Orta Batı Veterinerlik Tedariki | 562.30804.3 | |
| Corning Tek Kullanımlık Silindirli Şişeler. | Fisher Scientific | 06-413 | |
| Corning PYREX dar ağızlı ağır hizmet camı Erlenmeyer şişesi veya benzeri emiyor ve emiyor; | Fisher Scientific | 10-040F | |
| Eisco naylon test tüpü fırçası | Fisher Scientific | S13962 | |
| Fisher markası iki delikli kauçuk stoperler | Fisher Scientific | Boyuta ve nbsp'ye bağlıdır; | |
| Ketamin (10 mg/mL) | Orta Batı Veterinerlik Tedariki | 275.22100.3 | |
| MLL'den 6 mm hortum ucuna (paslanmaz çelik) ve nbsp; | Cadence Science | 6547IND | |
| MLL'den 8mm hortum ucuna (paslanmaz çelik) & nbsp; | Cadence Science | 6549IND | |
| MVet gazlı bez sünger dokumamış 4 x 4 4 ply | Orta Batı Veterinerlik Tedariki | 000.30156.2 | |
| MVet izopropil alkolü %70 | Orta Batı Veterinerlik Tedariki | 000.50054.3 | |
| MVet Kelly, hemostatik pensler düz 5.5" | Orta Batı Veterinerlik Tedariki | 000.36800.2 | |
| Sodyum Heparin (1000 U/mL) | Orta Batı Veterinerlik Tedariki | 191.46701.3 | |
| Sodyum Pentobarbital (390 mg/mL) | Orta Batı Veterinerlik Tedariki | 749.20000.3 | |
| Paslanmaz çelik pipetler; | Hobi Lobisi | 1893635 | |
| Telazol (100 mg/mL) | Orta Batı Veterinerlik Tedariki | 275.40000.3 | |
| Ksilazin (100 mg/mL) | Orta Batı Veterinerlik Tedariki | 310.01150.3 |
Kaynaklar
- Almond, G. W. Research applications using pigs. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 12 (3), 707-716 (1996).
- Sageritz, C. P., Vallier, L. Cell culture. Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. , 151-172 (2017).
- Mothes, W., Sherer, N. M., Jin, J., Zhong, P. Virus cell-to-cell transmission. Virol. J. 84 (17), 8360-8368 (2010).
- Stærk, K., Langhorn, L., Palarasah, Y., Andersen, T. E. A method for collecting high numbers of blood samples in standard vacuum tubes from non-heparinized pigs. Lab Anim. 57 (3), 336-340 (2023).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
- Schwartz, W. L., Smallwood, J. E. Collection of blood from swine. N Z Vet J. 25 (9), 237-238 (1977).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. J Vis Exp. (130), e55852(2017).
- Calvert, G. D., Scott, P. J., Sharpe, D. N. Percutaneous cardiac puncture in domestic pigs. Aust Vet J. 53 (7), 337-339 (1977).
- Costea, R., Ioana, E., Pavel, E. Pig sedation and anesthesia for medical research. J Animals. 13 (24), 3807(2023).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3: Appendix 3B. , (2001).
- Veterinary ergonomic guidelines. , American Veterinary Medical Association. https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/veterinary-ergonomic-guidelines (2025).
- Velazquez-Salinas, L., et al. Confirming the absence of parental African swine fever virus as a potential contaminant of recombinant live attenuated ASF vaccines. Biologicals. 83, 101685(2023).
- Soleimani, S. A review of the establishment of the seed lot system in the production of biological products and its importance. Arch Razi Inst. 77 (6), 2023-2035 (2022).
- Anil, M. H., Whittington, P. E., McKinstry, J. L. The effect of the sticking method on the welfare of slaughter pigs. Meat Sci. 55 (3), 315-319 (2000).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
